KR20210143230A - 뉴클레오티드 서열을 편집하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20210143230A
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dna
sequence
complex
strand
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KR1020217033700A
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데이빗 알. 류
앤드루 비토 안잘론
페이턴 랜돌프
제임스 넬슨
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더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
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Abstract

본 개시내용은 뉴클레오티드 변화 및/또는 표적화된 돌연변이유발의 혼입을 가능하게 하는 표적 DNA 분자 (예를 들어, 게놈)의 프라임 편집을 수행하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 뉴클레오티드 변화는 단일-뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 임의의 전이 또는 임의의 전환), 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있다. 보다 특히, 본 개시내용은 PEgRNA로 명명되는 변형된 가이드 RNA에 의해 특이적 DNA 서열로 가이드되는, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. PEgRNA는, 편집될 표적화된 내인성 DNA 서열의 가닥에 상동이지만 목적하는 1개 이상의 뉴클레오티드 변화를 함유하고 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의한 합성 후에 표적 DNA 분자 내로 혼입되는 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하는 DNA 합성 주형 서열을 제공하는 연장된 부분을 포함하도록 (표준 가이드 RNA에 비해) 변경되었다. 또한, 특히 트리뉴클레오티드 반복부 축소 질환의 치료, 표적화된 펩티드 태그의 설치, 보호 돌연변이의 설치를 통한 프리온 질환의 치료, RNA의 기능 및 발현을 제어하기 위한 RNA 태그의 설치를 위한 RNA-코딩 유전자의 조작, 정교한 유전자 라이브러리를 구축하기 위한 프라임 편집의 사용, 이뮤노에피토프를 단백질 내로 삽입하기 위한 프라임 편집의 사용, 유도성 이량체화 도메인을 단백질 표적 내로 삽입하기 위한 프라임 편집의 사용, 및 전달 방법을 비롯한, 프라임 편집을 활용하는 다양한 방법이 본원에 개시된다.

Description

뉴클레오티드 서열을 편집하기 위한 방법 및 조성물
정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 U01AI142756, RM1HG009490, R01EB022376 및 R35GM118062 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
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병원성 단일 뉴클레오티드 돌연변이는 일부 추정에 따르면 유전적 성분이 존재하는 인간 질환의 대략 50%에 기여한다7. 불행하게도, 이들 유전 장애를 갖는 환자에 대한 치료 옵션은 수십년의 유전자 요법 탐구8에도 불구하고 극히 제한적인 것으로 남아있다. 아마도 이러한 치료 과제에 대한 가장 경제적인 해결책은 환자 게놈 내의 단일 뉴클레오티드 돌연변이의 직접적 교정이며, 이는 질환의 근본 원인을 다룰 것이고, 지속적인 이익을 제공할 가능성이 있다. 이러한 전략은 이전에 생각할 수 없었지만, CRISPR/Cas 시스템9의 출현에 의해 야기된 게놈 편집 능력에서의 최근의 개선은 이제 이러한 치료 접근법을 도달할 수 있는 범위 내로 가져왔다. 표적 DNA 서열에 상보적인 ~20개의 뉴클레오티드를 함유하는 가이드 RNA (gRNA) 서열의 간단한 설계에 의해, 거의 모든 고려가능한 게놈 부위가 CRISPR 연관 (Cas) 뉴클레아제1,2에 의해 특이적으로 접근될 수 있다. 지금까지, 여러 단량체 박테리아 Cas 뉴클레아제 시스템이 확인되었고, 게놈 편집 적용10을 위해 적합화되었다. 이러한 Cas 뉴클레아제의 자연적 다양성은, 증가하는 조작된 변이체11-14의 집합물과 함께, 새로운 게놈 편집 기술을 개발하기 위한 비옥한 기반을 제공한다.
CRISPR을 사용한 유전자 파괴는 이제 성숙한 기술이지만, 인간 게놈 내의 단일 염기 쌍의 정밀 편집은 주요 과제로 남아있다3. 상동성 지정 복구 (HDR)는 목적하는 편집을 코딩하는 공여자 DNA 복구 주형을 사용하여 이중 가닥 파괴 (DSB)의 부위에서 DNA 서열을 삽입, 교정 또는 교환하기 위해 인간 세포 및 다른 유기체에서 오랫동안 사용되어 왔다15. 그러나, 전통적인 HDR은 대부분의 인간 세포 유형, 특히 비-분열 세포에서 매우 낮은 효율을 갖고, 경쟁 비-상동 말단 연결 (NHEJ)은 삽입-결실 (indel) 부산물을 우세하게 유도한다16. 다른 문제는 DSB의 생성에 관한 것이며, 이는 표적 유전자좌에서 큰 염색체 재배열 및 결실을 일으킬 수 있거나17, 또는 p53 축을 활성화시켜 성장 정지 및 아폽토시스를 유도할 수 있다18,19.
이들 HDR의 결점을 다루는 여러 접근법이 탐구되어 왔다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 공여자에 의한 단일 가닥 DNA 파괴 (닉)의 복구는 indel 형성을 감소시키는 것으로 밝혀졌지만, 목적하는 복구 생성물의 수율은 여전히 낮다20. 다른 전략은 소분자 및 생물학적 시약을 사용하여 NHEJ보다는 HDR 쪽으로 복구를 편향시키려 시도한다21-23. 그러나, 이들 방법의 유효성은 세포-유형 의존성일 가능성이 있고, 정상 세포 상태의 교란은 바람직하지 않은 예측불가능한 효과를 유도할 수 있다.
최근에, 본 발명자들은 데이비드 리우(David Liu) 교수 등의 주도로, DSB를 생성하지 않으면서 또는 HDR에 의존하지 않으면서 표적 뉴클레오티드를 편집하는 기술로서 염기 편집을 개발하였다4-6,24-27. Cas-융합된 데아미나제 효소에 의한 DNA 염기의 직접적 변형은 매우 높은 효율로 짧은 표적 윈도우 (~5-7개 염기)에서, C·G에서 T·A로의 또는 A·T에서 G·C로의 염기 쌍 전환을 가능하게 한다. 그 결과, 염기 편집제는 과학계에 의해 신속하게 채택되었다. 그러나, 하기 인자는 정밀 게놈 편집에 대한 그의 일반성을 제한한다: (1) 표적 윈도우 내의 비-표적 C 또는 A 염기의 "방관자 편집"이 관찰됨; (2) 표적 뉴클레오티드 생성물 혼합물이 관찰됨; (3) 표적 염기는 PAM 서열의 15±2개 뉴클레오티드 상류에 위치해야 함; 및 (5) 작은 삽입 및 결실 돌연변이의 복구는 가능하지 않음.
따라서, 임의의 목적하는 단일 뉴클레오티드 변화를 유연하게 도입할 수 있고/거나 염기 쌍 삽입 또는 결실 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과의 염기 쌍 삽입 또는 결실)을 설치할 수 있고/거나 표적 부위에서의 뉴클레오티드 서열을 높은 특이성 및 효율로 변경 또는 변형시킬 수 있는 프로그램가능한 편집제의 개발은 CRISPR에 기초한 게놈 편집 기술의 범주 및 치료 잠재력을 실질적으로 확장시킬 것이다.
본 발명은 "프라임 편집"으로 불리는 게놈 편집을 위한 전적으로 새로운 플랫폼을 기재한다. 프라임 편집은 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 ("napDNAbp") (이는 폴리머라제와 회합하여 (즉, 융합 단백질의 형태로 또는 달리 napDNAbp와 트랜스로 제공됨) 작동함)을 사용하여 명시된 DNA 부위 내로 새로운 유전자 정보를 직접 기록하는 다목적의 정확한 게놈 편집 방법이며, 여기서 프라임 편집 시스템은 표적 부위를 명시하고 또한 가이드 RNA 상에 (예를 들어, 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA의 내부 부분에) 조작된 연장부 (DNA 또는 RNA)에 의해 대체 DNA 가닥의 형태로 목적하는 편집의 합성의 주형이 되는 프라임 편집 (PE) 가이드 RNA ("PEgRNA")로 프로그램화된다. 목적하는 편집 (예를 들어, 단일 핵염기 치환)을 함유하는 대체 가닥은 (목적하는 편집을 포함하는 것을 제외하고는) 편집될 표적 부위의 내인성 가닥과 동일한 서열을 공유한다. DNA 복구 및/또는 복제 기구를 통해, 표적 부위의 내인성 가닥은 목적하는 편집을 함유하는 새로 합성된 대체 가닥에 의해 대체된다. 일부 경우에, 프라임 편집은 "검색-및-대체" 게놈 편집 기술로서 생각될 수 있으며, 이는 프라임 편집제가, 본원에 기재된 바와 같이, 편집될 목적하는 표적 부위를 검색하고 위치를 찾아낼 뿐만 아니라, 동시에, 상응하는 표적 부위 내인성 DNA 가닥 대신에 설치된 목적하는 편집을 함유하는 대체 가닥을 코딩하기 때문이다.
본 개시내용의 프라임 편집제는, 부분적으로, 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT) 또는 "프라임 편집"의 메카니즘이 (예를 들어, 도 1a-1f의 다양한 실시양태에 도시된 바와 같이) 높은 효율 및 유전적 유연성으로 정밀 CRISPR/Cas-기반 게놈 편집을 수행하기 위해 활용 또는 적합화될 수 있다는 발견에 관한 것이다. TPRT는 이동성 DNA 요소, 예컨대 포유동물 비-LTR 레트로트랜스포손 및 박테리아 그룹 II 인트론에 의해 자연적으로 사용된다28,29. 본 발명자들은 본원에서 Cas 단백질-리버스 트랜스크립타제 융합체 또는 관련 시스템을 사용하여 가이드 RNA에 의해 특이적 DNA 서열을 표적화하고, 표적 부위에서 단일 가닥 닉을 생성하고, 닉킹된 DNA를 가이드 RNA와 통합된 조작된 리버스 트랜스크립타제 주형의 역전사를 위한 프라이머로서 사용하였다. 그러나, 상기 개념이 DNA 폴리머라제 성분으로서 리버스 트랜스크립타제를 사용하는 프라임 편집제로 시작되지만, 본원에 기재된 프라임 편집제는 리버스 트랜스크립타제로 제한되는 것이 아니라, 실질적으로 임의의 DNA 폴리머라제의 사용을 포함할 수 있다. 실제로, 본 출원은 전반에 걸쳐 "리버스 트랜스크립타제"를 사용한 프라임 편집제를 언급할 수 있지만, 리버스 트랜스크립타제는 프라임 편집으로 작동할 수 있는 DNA 폴리머라제의 단지 한 유형인 것으로 본원에 제시된다. 따라서, 본 명세서가 "리버스 트랜스크립타제"를 언급할 때마다, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 리버스 트랜스크립타제 대신에 임의의 적합한 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다는 것을 인지하여야 한다. 따라서, 한 측면에서, 프라임 편집제는 Cas9 (또는 등가의 napDNAbp)를 포함할 수 있으며, 이는 그것을 표적 DNA 내의 상보적 프로토스페이서에 어닐링하는 스페이서 서열을 함유하는 특수화된 가이드 RNA (즉, PEgRNA)와 회합시킴으로써 DNA 서열을 표적화하도록 프로그램화된다. 특수화된 가이드 RNA는 또한 표적 부위에서 상응하는 내인성 DNA 가닥을 대체하는데 사용되는 목적하는 유전자 변경을 함유하는 DNA의 대체 가닥을 코딩하는 연장부의 형태로 새로운 유전자 정보를 함유한다. PEgRNA로부터 표적 DNA로 정보를 전달하기 위해, 프라임 편집의 메카니즘은 DNA의 한 가닥 내의 표적 부위를 닉킹하여 3'-히드록실 기를 노출시키는 것을 수반한다. 이어서, 노출된 3'-히드록실 기를 사용하여 표적 부위 내로 직접 PEgRNA 상의 편집-코딩 연장부의 DNA 중합을 프라이밍할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 편집을 함유하는 대체 가닥의 중합을 위한 주형을 제공하는 연장부는 RNA 또는 DNA로부터 형성될 수 있다. RNA 연장부의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예컨대, 리버스 트랜스크립타제)일 수 있다. DNA 연장부의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다.
본원에 개시된 프라임 편집제에 의해 형성된 새로 합성된 가닥 (즉, 목적하는 편집을 함유하는 대체 DNA 가닥)은 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 결실 또는 삽입 또는 그의 조합)의 포함을 제외하고는 게놈 표적 서열에 상동일 것이다 (즉, 그와 동일한 서열을 가질 것임). DNA의 새로 합성된 (또는 대체) 가닥은 또한 단일 가닥 DNA 플랩으로서 지칭될 수 있으며, 이는 상보적 상동 내인성 DNA 가닥과의 혼성화에 대해 경쟁함으로써 상응하는 내인성 가닥을 대체할 것이다. 특정 실시양태에서, 시스템은 오류-유발 리버스 트랜스크립타제 효소 (예를 들어, Cas9 도메인과의 융합 단백질로서 제공되거나 또는 Cas9 도메인에 대해 트랜스로 제공됨)의 사용과 조합될 수 있다. 오류-유발 리버스 트랜스크립타제 효소는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성 동안 변경을 도입할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제를 이용하여 표적 DNA에 뉴클레오티드 변화를 도입할 수 있다. 시스템과 함께 사용되는 오류-유발 리버스 트랜스크립타제에 따라, 변화는 무작위 또는 비-무작위일 수 있다.
혼성화된 중간체 (내인성 DNA 가닥에 혼성화된 리버스 트랜스크립타제에 의해 합성된 단일 가닥 DNA 플랩을 포함함)의 분해는 생성된 내인성 DNA의 대체 플랩의 제거 (예를 들어, 5' 단부 DNA 플랩 엔도뉴클레아제인 FEN1을 사용함), 합성된 단일 가닥 DNA 플랩의 표적 DNA에 대한 라이게이션, 및 세포 DNA 복구 및/또는 복제 과정의 결과로서 목적하는 뉴클레오티드 변화의 동화를 포함할 수 있다. 주형화된 DNA 합성은 삽입 및 결실을 포함한 임의의 뉴클레오티드의 변형을 위한 단일 뉴클레오티드 정밀도를 제공하기 때문에, 이러한 접근법의 범주는 매우 넓고, 기초 과학 및 요법에서 무수한 적용에 사용될 수 있을 것으로 예측된다.
한 측면에서, 본 명세서는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 융합 단백질은 연장된 가이드 RNA의 존재 하에 표적-프라이밍된 역전사에 의해 게놈 편집을 수행할 수 있다.
특정 실시양태에서, napDNAbp는 닉카제 활성을 갖는다. napDNAbp는 또한 Cas9 단백질 또는 그의 기능적 등가물, 예컨대 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)일 수 있다.
특정 실시양태에서, napDNAbp는 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은 연장된 가이드 RNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함한다.
다른 실시양태에서, 연장된 가이드 RNA에 복합체화된 융합 단백질의 결합은 R-루프를 형성한다. R-루프는 (i) 연장된 가이드 RNA 및 표적 가닥을 포함하는 RNA-DNA 하이브리드 및 (ii) 상보적 비-표적 가닥을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상보적 비-표적 가닥은 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 리버스 트랜스크립타제 프라이밍 서열을 형성한다.
다양한 실시양태에서, 연장된 가이드 RNA는 (a) 가이드 RNA 및 (b) 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함한다. RNA 연장부는 (i) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 역전사 주형 서열, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 역전사 주형 서열은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩할 수 있으며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함한다.
다양한 실시양태에서, RNA 연장부는 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 혼성화함으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에 인접하고 유리 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열을 대체하는다. 특정 실시양태에서, 대체된 5' 단부를 갖는 내인성 DNA는 세포에 의해 절제된다.
다양한 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구는 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성한다.
다양한 다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 PAM 서열의 약 -4 내지 +10인 편집 윈도우에 설치된다.
또 다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 닉 부위의 약 -5 내지 +5 또는 닉 부위의 약 -10 내지 +10 또는 닉 부위의 약 -20 내지 +20 또는 닉 부위의 약 -30 내지 +30 또는 닉 부위의 약 -40 내지 +40 또는 닉 부위의 약 -50 내지 +50 또는 닉 부위의 약 -60 내지 +60 또는 닉 부위의 약 -70 내지 +70 또는 닉 부위의 약 -80 내지 +80 또는 닉 부위의 약 -90 내지 +90 또는 닉 부위의 약 -100 내지 +100 또는 닉 부위의 약 -200 내지 +200인 편집 윈도우에 설치된다.
다양한 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호(SEQ ID NO): 18의 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 다른 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 26-39, 42-61, 75-76, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 (Cas9); (SpCas9); 서열식별번호: 77-86 (CP-Cas9); 서열식별번호: 18-25 및 87-88 (SpCas9); 및 서열식별번호: 62-72 (Cas12) 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 개시된 융합 단백질 및/또는 조성물의 리버스 트랜스크립타제는 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700-716, 739-742 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700-716, 739-742 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은, 예를 들어 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제 서열일 수 있고, 서열은 재조합일 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 단백질은 다양한 구조적 구성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 구조 NH2-[napDNAbp]-[리버스 트랜스크립타제]-COOH; 또는 NH2-[리버스 트랜스크립타제]-[napDNAbp]-COOH를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다.
다양한 실시양태에서, 링커 서열은 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 링커 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 표적 DNA 내로 혼입되는 목적하는 뉴클레오티드 변화는 단일 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 전이 또는 전환), 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실일 수 있다.
특정 경우에, 삽입은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
특정의 다른 경우에, 결실은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 가이드 RNA 및 적어도 1개의 RNA 연장부를 포함하는 연장된 가이드 RNA를 제공한다. RNA 연장부는 가이드 RNA의 3' 말단에 위치할 수 있다. 다른 실시양태에서, RNA 연장부는 가이드 RNA의 5'에 위치할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RNA 연장부는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치할 수 있지만, 그러나 연장된 부분의 분자내 위치하는 것이 프로토스페이서의 기능을 방해하지 않는 것이 바람직하다.
다양한 실시양태에서, 연장된 가이드 RNA는 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있다. 표적 DNA 서열은 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함할 수 있으며, 여기서 가이드 RNA는 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성한다.
연장된 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, 적어도 1개의 RNA 연장부는 역전사 주형 서열을 포함할 수 있다. 다양한 다른 실시양태에서, RNA 연장부는 역전사 프라이머 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, RNA 연장부는 RNA 연장부를 가이드 RNA에 연결하는 링커 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, RNA 연장부는 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 150개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
다른 실시양태에서, 역전사 주형 서열은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 역전사 프라이머 결합 부위 서열은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
다른 실시양태에서, 임의적인 링커 또는 스페이서 서열은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
연장된 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, 역전사 주형 서열은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩할 수 있으며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에서 내인성 단일 가닥 DNA를 대체할 수 있다. 닉 부위에서 대체된 내인성 단일 가닥 DNA는 5' 단부를 가질 수 있고, 내인성 플랩을 형성할 수 있으며, 이는 세포에 의해 절제될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 5' 단부 내인성 플랩의 절제는 생성물 형성을 구동하는 것을 도울 수 있으며, 이는 5' 단부 내인성 플랩의 제거가 단일 가닥 3' DNA 플랩의 상응하는 상보적 DNA 가닥에 대한 혼성화 및 단일 가닥 3' DNA 플랩에 의해 운반된 목적하는 뉴클레오티드 변화의 표적 DNA 내로의 혼입 또는 동화를 촉진하기 때문이다.
연장된 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구는 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성한다.
특정 실시양태에서, PEgRNA는 서열식별번호: 131, 222, 394, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 738, 2997, 2998, 2999, 3000, 3001, 3002, 3003, 3004, 3005, 3006, 3007, 3008, 3009, 3010, 3011, 3012, 3013, 3014, 3015, 3016, 3017, 3018, 3019, 3020, 3021, 3022, 3023, 3024, 3025, 3026, 3027, 3028, 3029, 3030, 3031, 3032, 3033, 3034, 3035, 3036, 3037, 3038, 3039, 3040, 3041, 3042, 3043, 3044, 3045, 3046, 3047, 3048, 3049, 3050, 3051, 3052, 3053, 3054, 3055, 3056, 3057, 3058, 3059, 3060, 3061, 3062, 3063, 3064, 3065, 3066, 3067, 3068, 3069, 3070, 3071, 3072, 3073, 3074, 3075, 3076, 3077, 3078, 3079, 3080, 3081, 3082, 3083, 3084, 3085, 3086, 3087, 3088, 3089, 3090, 3091, 3092, 3093, 3094, 3095, 3096, 3097, 3098, 3099, 3100, 3101, 3102, 3103, 3113, 3114, 3115, 3116, 3117, 3118, 3119, 3120, 3121, 3305, 3306, 3307, 3308, 3309, 3310, 3311, 3312, 3313, 3314, 3315, 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3636, 3637, 3638, 3639, 3640, 3641, 3642, 3643, 3644, 3645, 3646, 3647, 3648, 3649, 3650, 3651, 3652, 3653, 3654, 3655, 3656, 3657, 3658, 3659, 3660, 3661, 3662, 3663, 3664, 3665, 3666, 3667, 3668, 3669, 3670, 3671, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3755, 3756, 3757, 3758, 3759, 3760, 3761, 3762, 3763, 3764, 3765, 3766, 3767, 3768, 3769, 3770, 3771, 3772, 3773, 3774, 3775, 3776, 3777, 3778, 3779, 3780, 3781, 3782, 3783, 3784, 3785, 3786, 3787, 3788, 3789, 3790, 3791, 3792, 3793, 3794, 3795, 3796, 3797, 3798, 3799, 3800, 3801, 3802, 3803, 3804, 3805, 3806, 3807, 3808, 3809 및 3810 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 명세서는 본원에 기재된 융합 단백질 및 상기 기재된 임의의 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 명세서는 napDNAbp 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 제공한다. napDNAbp는 Cas9 닉카제일 수 있거나, 또는 서열식별번호: 42-57 (Cas9 닉카제) 및 65 (AsCas12a 닉카제)의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42-57 (Cas9 닉카제) 및 65 (AsCas12a 닉카제) 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열일 수 있다.
복합체를 수반하는 다양한 실시양태에서, 연장된 가이드 RNA는 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 트랜스로 제공될 수 있으며, 즉 복합체 자체와 상이한 공급원으로부터 제공될 수 있다. 예를 들어, 리버스 트랜스크립타제는 복합체를 갖는 동일한 세포에 리버스 트랜스크립타제를 별개로 코딩하는 별개의 벡터를 도입함으로써 제공될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 특정의 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 napDNAbp를 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 리버스 트랜스크립타제를 코딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 연장된 가이드 RNA, 임의의 역전사 주형 서열 또는 임의의 역전사 프라이머 부위 또는 임의의 임의적인 링커 서열을 코딩할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 벡터는 napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 코딩하기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 개별적으로 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 연장된 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 벡터는 napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제 및 동일한 또는 별개의 벡터 상의 연장된 가이드 RNA를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 융합 단백질, napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 벡터로 형질전환될 수 있다. 이들 유전 요소는 동일한 벡터 상에 또는 상이한 벡터 상에 포함될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 napDNAbp, 융합 단백질, 리버스 트랜스크립타제 및 연장된 가이드 RNA 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질 및 제약상 허용되는 부형제. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 임의의 연장 가이드 RNA 및 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 임의의 연장 가이드 RNA를 본원에 기재된 임의의 융합 단백질 및 제약상 허용되는 부형제와 조합하여 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 napDNAbp, 융합 단백질, 리버스 트랜스크립타제 및 연장된 가이드 RNA 중 하나 이상을 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 다양한 성분은 1종 이상의 제약 조성물 내로 분리될 수 있다. 예를 들어, 제1 제약 조성물은 융합 단백질 또는 napDNAbp를 포함할 수 있고, 제2 제약 조성물은 리버스 트랜스크립타제를 포함할 수 있고, 제3 제약 조성물은 연장된 가이드 RNA를 포함할 수 있다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 융합 단백질, napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제 및 연장된 가이드 RNA를 포함한 1종 이상의 성분을 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 키트는 또한 벡터, 세포, 및 본원에 개시된 임의의 융합 단백질, napDNAbp 또는 리버스 트랜스크립타제를 포함한 폴리펩티드의 단리된 제제를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 개시된 물질의 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 방법은 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법에 관한 것이다. 방법은 먼저 이중 가닥 DNA 서열을 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하고, 연장된 가이드 RNA는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 역전사 주형 서열을 포함한다. 이어서, 방법은 비-표적 가닥 상의 이중 가닥 DNA 서열을 닉킹함으로써 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 것을 포함한다. 이어서, 방법은 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 역전사 주형 서열에 혼성화시킴으로써 리버스 트랜스크립타제 도메인을 프라이밍하는 것을 포함한다. 이어서, 방법은 3' 단부로부터 DNA의 가닥을 중합시킴으로써 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 것을 포함한다. 이어서, 방법은 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 DNA 분자를 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 napDNAbp를 표적 유전자좌로 표적화하는 가이드 RNA와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 가이드 RNA는 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열을 포함하는 것인, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법을 제공한다. 이어서, 방법은 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성한 다음, 노출된 3' 단부를 RT 주형 서열에 혼성화시켜 역전사를 프라이밍하는 것을 포함한다. 이어서, RT 주형 서열에 기초하여 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩이 리버스 트랜스크립타제에 의해 합성되거나 중합된다. 마지막으로, 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화가 상응하는 내인성 DNA 내로 혼입되어, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 내인성 DNA 가닥을 대체하는 단계는 (i) 단일 가닥 DNA 플랩을 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥에 혼성화시켜 서열 미스매치를 생성시키는 단계; (ii) 내인성 DNA 가닥을 절제하는 단계; 및 (iii) 미스매치를 복구시켜 DNA의 양쪽 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 목적하는 생성물을 형성하는 단계를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 단일 뉴클레오티드 치환 (예를 들어 전이 또는 전환 변화), 결실 또는 삽입일 수 있다. 예를 들어, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환일 수 있다.
다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 삽입인 목적하는 뉴클레오티드 변화를 도입한다. 특정 경우에, 삽입은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
다른 실시양태에서, 방법은 결실인 목적하는 뉴클레오티드 변화를 도입한다. 특정의 다른 경우에, 결실은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
다양한 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 질환-연관 유전자를 교정한다. 질환-연관 유전자는 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관될 수 있다. 다른 실시양태에서, 질환-연관 유전자는 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 뉴클레아제 기능상실 Cas9 (dCas9), Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 활성 Cas9인 napDNAbp를 갖는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제는 단일 융합 단백질로서 코딩되기 보다는, 별개의 구축물로 제공될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 napDNAbp에 대해 트랜스로 (융합 단백질로 보다는) 제공될 수 있다.
방법을 수반하는 다양한 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 26-61, 75-76, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 (Cas9); (SpCas9); 서열식별번호: 77-86 (CP-Cas9); 서열식별번호: 18-25 및 87-88 (SpCas9); 및 서열식별번호: 62-72 (Cas12)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. napDNAbp는 또한 서열식별번호: 26-61, 75-76, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 (Cas9); (SpCas9); 서열식별번호: 77-86 (CP-Cas9); 서열식별번호: 18-25 및 87-88 (SpCas9); 및 서열식별번호: 62-72 (Cas12) 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법을 수반하는 다양한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700-716, 739-742 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 리버스 트랜스크립타제는 또한 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700-716, 739-742 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법은 서열식별번호: 131, 222, 394, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 738, 2997, 2998, 2999, 3000, 3001, 3002, 3003, 3004, 3005, 3006, 3007, 3008, 3009, 3010, 3011, 3012, 3013, 3014, 3015, 3016, 3017, 3018, 3019, 3020, 3021, 3022, 3023, 3024, 3025, 3026, 3027, 3028, 3029, 3030, 3031, 3032, 3033, 3034, 3035, 3036, 3037, 3038, 3039, 3040, 3041, 3042, 3043, 3044, 3045, 3046, 3047, 3048, 3049, 3050, 3051, 3052, 3053, 3054, 3055, 3056, 3057, 3058, 3059, 3060, 3061, 3062, 3063, 3064, 3065, 3066, 3067, 3068, 3069, 3070, 3071, 3072, 3073, 3074, 3075, 3076, 3077, 3078, 3079, 3080, 3081, 3082, 3083, 3084, 3085, 3086, 3087, 3088, 3089, 3090, 3091, 3092, 3093, 3094, 3095, 3096, 3097, 3098, 3099, 3100, 3101, 3102, 3103, 3113, 3114, 3115, 3116, 3117, 3118, 3119, 3120, 3121, 3305, 3306, 3307, 3308, 3309, 3310, 3311, 3312, 3313, 3314, 3315, 3316, 3317, 3318, 3319, 3320, 3321, 3322, 3323, 3324, 3325, 3326, 3327, 3328, 3329, 3330, 3331, 3332, 3333, 3334, 3335, 3336, 3337, 3338, 3339, 3340, 3341, 3342, 3343, 3344, 3345, 3346, 3347, 3348, 3349, 3350, 3351, 3352, 3353, 3354, 3355, 3356, 3357, 3358, 3359, 3360, 3361, 3362, 3363, 3364, 3365, 3366, 3367, 3368, 3369, 3370, 3371, 3372, 3373, 3374, 3375, 3376, 3377, 3378, 3379, 3380, 3381, 3382, 3383, 3384, 3385, 3386, 3387, 3388, 3389, 3390, 3391, 3392, 3393, 3394, 3395, 3396, 3397, 3398, 3399, 3400, 3401, 3402, 3403, 3404, 3405, 3406, 3407, 3408, 3409, 3410, 3411, 3412, 3413, 3414, 3415, 3416, 3417, 3418, 3419, 3420, 3421, 3422, 3423, 3424, 3425, 3426, 3427, 3428, 3429, 3430, 3431, 3432, 3433, 3434, 3435, 3436, 3437, 3438, 3439, 3440, 3441, 3442, 3443, 3444, 3445, 3446, 3447, 3448, 3449, 3450, 3451, 3452, 3453, 3454, 3455, 3479, 3480, 3481, 3482, 3483, 3484, 3485, 3486, 3487, 3488, 3489, 3490, 3491, 3492, 3493, 3522, 3523, 3524, 3525, 3526, 3527, 3528, 3529, 3530, 3531, 3532, 3533, 3534, 3535, 3536, 3537, 3538, 3539, 3540, 3549, 3550, 3551, 3552, 3553, 3554, 3555, 3556, 3628, 3629, 3630, 3631, 3632, 3633, 3634, 3635, 3636, 3637, 3638, 3639, 3640, 3641, 3642, 3643, 3644, 3645, 3646, 3647, 3648, 3649, 3650, 3651, 3652, 3653, 3654, 3655, 3656, 3657, 3658, 3659, 3660, 3661, 3662, 3663, 3664, 3665, 3666, 3667, 3668, 3669, 3670, 3671, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3755, 3756, 3757, 3758, 3759, 3760, 3761, 3762, 3763, 3764, 3765, 3766, 3767, 3768, 3769, 3770, 3771, 3772, 3773, 3774, 3775, 3776, 3777, 3778, 3779, 3780, 3781, 3782, 3783, 3784, 3785, 3786, 3787, 3788, 3789, 3790, 3791, 3792, 3793, 3794, 3795, 3796, 3797, 3798, 3799, 3800, 3801, 3802, 3803, 3804, 3805, 3806, 3807, 3808, 3809 및 3810의 뉴클레오티드 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PEgRNA의 사용을 포함할 수 있다. 방법은 3' 단부에 RNA 연장부를 포함하는 연장된 가이드 RNA의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 RNA 연장부는 역전사 주형 서열을 포함한다.
방법은 5' 단부에 RNA 연장부를 포함하는 연장된 가이드 RNA의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 RNA 연장부는 역전사 주형 서열을 포함한다.
방법은 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하는 연장된 가이드 RNA의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 RNA 연장부는 역전사 주형 서열을 포함한다.
방법은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이인 1개 이상의 RNA 연장부를 갖는 연장된 가이드 RNA의 사용을 포함할 수 있다.
상기 개념 및 하기 논의된 추가의 개념은, 본 개시내용이 이와 관련하여 제한되지 않기 때문에, 임의의 적합한 조합으로 배열될 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 추가로, 본 개시내용의 다른 이점 및 신규 특색은 첨부 도면과 함께 고려되는 경우에 다양한 비제한적 실시양태의 하기 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 이들 도면 중 하나 이상을 본원에 제시된 구체적 실시양태의 상세한 설명과 함께 조합하여 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1a는 연장된 가이드 RNA 분자와 복합체를 이룬 Cas9 단백질에 융합된 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 단일 뉴클레오티드 변화 및/또는 삽입 및/또는 결실을 DNA 분자 (예를 들어, 게놈) 내로 도입하기 위한 예시적인 과정의 개략도를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 3' 단부에서 연장되어 리버스 트랜스크립타제 주형 서열을 포함한다. 개략도는 가이드 RNA (gRNA)와 복합체를 이룬 Cas9 닉카제에 융합된 리버스 트랜스크립타제 (RT)가 DNA 표적 부위에 결합하고 표적 뉴클레오티드에 인접한 PAM-함유 DNA 가닥을 닉킹하는 방법을 보여준다. RT 효소는 gRNA로부터의 DNA 합성을 위한 프라이머로서 닉킹된 DNA를 사용하며, 이는 목적하는 편집을 코딩하는 새로운 DNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 사용된다. 제시된 편집 과정은 표적-프라이밍된 역전사 편집 (TRT 편집) 또는 동등하게, "프라임 편집"으로 지칭될 수 있다.
도 1b는 도 1a에서와 동일한 표현을 제공하되, 예외로 프라임 편집제 복합체가 보다 일반적으로 [napDNAbp]-[P]:PEgRNA 또는 [P]-[napDNAbp]:PEgRNA로 나타내어지며, 여기서 "P"는 임의의 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 지칭하고, "napDNAbp"는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (예를 들어, SpCas9)을 지칭하고, "PEgRNA"는 프라임 편집 가이드 RNA를 지칭하고, "]-["는 임의적인 링커를 지칭한다. 다른 곳, 예를 들어 도 3a-3g에 기재된 바와 같이, PEgRNA는 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 5' 연장 아암을 포함한다. 제시되지 않았지만, PEgRNA의 연장 아암 (즉, 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함함)은 DNA 또는 RNA일 수 있는 것으로 고려된다. 이 구성에서 고려되는 특정한 폴리머라제는 DNA 합성 주형의 성질에 좌우될 것이다. 예를 들어, DNA 합성 주형이 RNA이면, 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)이다. DNA 합성 주형이 DNA이면, 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다.
도 1c는 연장된 가이드 RNA 분자와 복합체를 이룬 Cas9 단백질에 융합된 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 단일 뉴클레오티드 변화 및/또는 삽입 및/또는 결실을 DNA 분자 (예를 들어, 게놈) 내로 도입하기 위한 예시적인 과정의 개략도를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 5' 단부에서 연장되어 리버스 트랜스크립타제 주형 서열을 포함한다. 개략도는 가이드 RNA (gRNA)와 복합체를 이룬 Cas9 닉카제에 융합된 리버스 트랜스크립타제 (RT)가 DNA 표적 부위에 결합하고 표적 뉴클레오티드에 인접한 PAM-함유 DNA 가닥을 닉킹하는 방법을 보여준다. RT 효소는 gRNA로부터의 DNA 합성을 위한 프라이머로서 닉킹된 DNA를 사용하며, 이는 목적하는 편집을 코딩하는 새로운 DNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 사용된다. 제시된 편집 과정은 표적-프라이밍된 역전사 편집 (TRT 편집) 또는 동등하게, "프라임 편집"으로 지칭될 수 있다.
도 1d는 도 1c에서와 동일한 표현을 제공하되, 예외로 프라임 편집제 복합체가 보다 일반적으로 [napDNAbp]-[P]:PEgRNA 또는 [P]-[napDNAbp]:PEgRNA로 나타내어지며, 여기서 "P"는 임의의 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 지칭하고, "napDNAbp"는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (예를 들어, SpCas9)을 지칭하고, "PEgRNA"는 프라임 편집 가이드 RNA를 지칭하고, "]-["는 임의적인 링커를 지칭한다. 다른 곳, 예를 들어 도 3a-3g에 기재된 바와 같이, PEgRNA는 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 3' 연장 아암을 포함한다. 제시되지 않았지만, PEgRNA의 연장 아암 (즉, 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함함)은 DNA 또는 RNA일 수 있는 것으로 고려된다. 이 구성에서 고려되는 특정한 폴리머라제는 DNA 합성 주형의 성질에 좌우될 것이다. 예를 들어, DNA 합성 주형이 RNA이면, 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)이다. DNA 합성 주형이 DNA이면, 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 다양한 실시양태에서, PEgRNA는 DNA-기반 DNA 합성 주형이 혼입되도록 조작 또는 합성될 수 있다.
도 1e는 합성된 DNA 단일 가닥 (목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함함)이 분해되어 목적하는 뉴클레오티드 변화가 DNA 내로 혼입되도록 하는 방법의 예시적인 과정을 도시하는 개략도이다. 제시된 바와 같이, 편집된 가닥 (또는 "돌연변이유발 가닥")의 합성 후에, 내인성 가닥과의 평형, 내인성 가닥의 플랩 절단 및 라이게이션은 미스매칭된 DNA 듀플렉스의 분해 후에 내인성 DNA 복구 및/또는 복제 과정의 작용을 통해 DNA 편집의 혼입을 유도한다.
도 1f는 "대향 가닥 닉킹"이 도 1e의 분해 방법 내로 혼입되어 복귀 생성물에 비해 목적하는 생성물의 형성을 구동하는 것을 도울 수 있음을 보여주는 개략도이다. 대향 가닥 닉킹에서, 제2 Cas9/gRNA 복합체를 사용하여, 초기 닉킹된 가닥으로부터의 대향 가닥 상에 제2 닉을 도입한다. 이는 내인성 세포 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 유도하여 비편집된 가닥 (즉, 제2 닉 부위를 함유하는 가닥)을 우선적으로 대체한다.
도 1g는 연장된 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 사용하여 단일 뉴클레오티드 변화 및/또는 삽입 및/또는 결실을 표적 유전자좌의 DNA 분자 (예를 들어, 게놈) 내로 도입하기 위한 예시적인 과정의 또 다른 개략도를 제공한다. 이 과정은 프라임 편집의 실시양태로 지칭될 수 있다. 연장된 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, gRNA는 napDNAbp가 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA 가닥 (R-루프 가닥 또는 PAM-함유 가닥 또는 비-표적 DNA 가닥 또는 프로토스페이서 가닥) 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의해), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 특정 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥에 상응하는 DNA의 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않는 가닥에서 생성된다. 단계 (c)에서, 3' 단부 DNA 가닥은 역전사를 프라이밍하기 위해 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 특정 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 RT 프라이밍 서열에 혼성화한다. 단계 (d)에서, 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 가이드 RNA의 3' 단부를 향해 DNA의 단일 가닥을 합성하는 리버스 트랜스크립타제가 도입된다. 이는 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 염기 변화, 삽입 또는 결실 또는 그의 조합)를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 다른 가닥 상의 상보적 서열에 침입하고 혼성화하였을 때 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써, 목적하는 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 과정은 또한 도 1f에 예시된 바와 같이 제2 가닥 닉킹에 의해 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 이 과정은 하기 유전자 변화: 전환, 전이, 결실 및 삽입 중 적어도 하나 이상을 도입할 수 있다.
도 1h는 본원에 기재된 프라임 편집 과정으로 가능한 유전자 변화의 유형을 도시하는 개략도이다. 프라임 편집에 의해 달성가능한 뉴클레오티드 변화의 유형은 결실 (짧은 및 긴 결실 포함), 단일-뉴클레오티드 변화 (전이 및 전환 포함), 역위 및 삽입 (짧은 및 긴 결실 포함)을 포함한다.
도 1i는 PE3b (PE3b = PE2 프라임 편집제 융합 단백질 + PEgRNA + 제2 가닥 닉킹 가이드 RNA)에 의해 예시된 시간적 제2 가닥 닉킹을 도시하는 개략도이다. 시간적 제2 가닥 닉킹은 목적하는 편집된 생성물의 형성을 용이하게 하기 위한 제2 가닥 닉킹의 변형이다. "시간적"이라는 용어는 목적하는 편집이 편집 가닥에 설치된 후에만 비편집 가닥에 대한 제2-가닥 닉이 발생한다는 사실을 지칭한다. 이는 이중 가닥 DNA 파괴로 이어지는 양쪽 가닥 상의 공동 닉을 피한다.
도 1j는 napDNAbp (예를 들어, SpCas9 닉카제)를 임의의 프로그램가능한 뉴클레아제 도메인, 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로 대체하는, 본원에서 고려되는 프라임 편집의 변형을 도시한다. 따라서, 적합한 뉴클레아제가 반드시 핵산 표적화 분자 (예컨대 가이드 RNA)에 의해 "프로그램화"될 필요는 없고, 오히려 DNA-결합 도메인, 예컨대 특히 뉴클레아제의 특이성을 규정함으로써 프로그램화될 수 있는 것으로 고려된다. napDNAbp 모이어티를 사용한 프라임 편집에서와 같이, 이러한 대안적 프로그램가능한 뉴클레아제는 표적 DNA의 1개의 가닥만이 절단되도록 변형되는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 바람직하게는 닉카제로서 기능해야 한다. 프로그램가능한 뉴클레아제 (예를 들어, ZFN 또는 TALEN)가 선택되면, 추가의 기능성을 시스템 내로 조작하여 그가 프라임 편집-유사 메카니즘에 따라 작동하도록 할 수 있다. 예를 들어, 프로그램가능한 뉴클레아제는 RNA 또는 DNA 연장 아암을 그에 (예를 들어, 화학적 링커를 통해) 커플링시킴으로써 변형될 수 있으며, 여기서 연장 아암은 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 DNA 합성 주형을 포함한다. 프로그램가능한 뉴클레아제는 또한 폴리머라제에 (예를 들어, 화학적 또는 아미노산 링커를 통해) 커플링될 수 있으며, 이의 성질은 연장 아암이 DNA인지 또는 RNA인지에 좌우될 것이다. RNA 연장 아암의 경우에, 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)일 수 있다. DNA 연장 아암의 경우에, 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, Pol I, Pol II 또는 Pol III를 포함한 원핵 폴리머라제, 또는 Pol a, Pol b, Pol g, Pol d, Pol e 또는 Pol z를 포함한 진핵 폴리머라제)일 수 있다. 시스템은 또한 프로그램가능한 뉴클레아제에 대한 융합체로서 부가되거나 또는 트랜스로 부가되어 반응을 전체로서 용이하게 하기 위한 다른 기능성을 포함할 수 있다 (예를 들어, (a) 절단 부위에서 DNA를 풀어내어 3' 단부를 갖는 절단 가닥을 프라이머로서 이용가능하게 만드는 헬리카제, (b) 절단 가닥 상의 내인성 가닥을 제거하도록 도와 합성된 가닥으로 내인성 가닥을 대체하는 쪽으로 반응을 구동하는 플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1), 또는 (c) 대향 가닥 상에 제2 부위 닉을 생성하여, 비-편집된 가닥의 선호되는 세포 복구를 통해 합성 복구의 통합을 구동하는 것을 도울 수 있는 nCas9:gRNA 복합체). napDNAbp에 의한 프라임 편집과 유사한 방식으로, 그 외의 다른 프로그램가능한 뉴클레아제를 갖는 이러한 복합체를 사용하여 관심 편집을 보유하는 DNA의 새로 합성된 대체 가닥을 합성한 다음, DNA의 표적 부위 내로 영구적으로 설치할 수 있다.
도 1k는, 한 실시양태에서, 프라임 편집에 의해 편집될 수 있는 표적 DNA의 해부학적 특색을 도시한다. 표적 DNA는 "비-표적 가닥" 및 "표적 가닥"을 포함한다. 표적-가닥은 PAM 부위 (이 경우에, 정규 SpCas9-기반 프라임 편집제에 의해 인식되는 NGG)를 인식하는 프라임 편집제 복합체의 PEgRNA의 스페이서에 어닐링되는 가닥이다. 표적 가닥은 또한 "비-PAM 가닥" 또는 "비-편집 가닥"으로 지칭될 수 있다. 대조적으로, 비-표적 가닥 (즉, 프로토스페이서 및 NGG의 PAM 서열을 함유하는 가닥)은 "PAM-가닥" 또는 "편집 가닥"으로 지칭될 수 있다. 다양한 실시양태에서, PE 복합체의 닉 부위는 PAM-가닥 상의 프로토스페이서 내에 존재할 것이다 (예를 들어, SpCas9-기반 PE에 의한 경우). 닉의 위치는 PE를 형성하는 특정한 Cas9의 특징일 것이다. 예를 들어, SpCas9-기반 PE에 의한 경우에, 포스포디에스테르 결합 내의 닉 부위는 염기 3 (PAM 서열의 위치 1에 대해 "-3" 위치)과 4 (PAM 서열의 위치 1에 대해 "-4" 위치) 사이이다. 프로토스페이서 내의 닉 부위는 유리 3' 히드록실 기를 형성하고, 이는 하기 도면에서 보이는 바와 같이, PEgRNA의 연장 아암의 프라이머 결합 부위와 복합체화되고, PEgRNA의 연장 아암의 DNA 합성 주형에 의한 DNA 코드의 단일 가닥의 중합을 시작하는 기질을 제공한다. 이 중합 반응은 5'에서 3' 방향으로 PE 융합 단백질의 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 촉매된다. 중합은 gRNA 코어에 도달하기 전에 종결되어 (예를 들어, 중합 종결 신호, 또는 PE의 중합 활성을 종결시키는 기능을 하는 2차 구조의 포함에 의해), 닉킹된 PAM 가닥의 원래 3' 히드록실 기로부터 연장된 단일 가닥 DNA 플랩을 생성한다. DNA 합성 주형은 PAM 가닥 상의 닉 부위에 바로 이어지는 DNA의 내인성 5'-단부 단일 가닥에 상동인 단일 가닥 DNA를 코딩하고, 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 염기 치환, 삽입, 결실, 역위)를 포함한다. 목적하는 편집의 위치는 PAM 가닥 상의 닉 부위의 하류에 하기 임의의 위치에 있을 수 있으며, 이는 (닉 부위의 하류 위치에 대해) 위치 +1, +2, +3, +4 (PAM 부위의 시작), +5 (PAM 부위의 위치 2), +6 (PAM 부위의 위치 3), +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15, +16, +17, +18, +19, +20, +21, +22, +23, +24, +25, +26, +27, +28, +29, +30, +31, +32, +33, +34, +35, +36, +37, +38, +39, +40, +41, +42, +43, +44, +45, +46, +47, +48, +49, +50, +51, +52, +53, +54, +55, +56, +57, +58, +59, +60, +61, +62, +63, +64, +65, +66, +67, +68, +69, +70, +71, +72, +73, +74, +75, +76, +77, +78, +79, +80, +81, +82, +83, +84, +85, +86, +87, +88, +89, +90, +91, +92, +93, +94, +95, +96, +97, +98, +99, +100, +101, +102, +103, +104, +105, +106, +107, +108, +109, +110, +111, +112, +113, +114, +115, +116, +117, +118, +119, +120, + 121, +122, +123, +124, +125, +126, +127, +128, +129, +130, +131, +132, +133, +134, +135, +136, +137, +138, +139, +140, +141, +142, +143, +144, +145, +146, +147, +148, +149 또는 +150 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 3' 단부 단일 가닥 DNA (관심 편집을 함유함)가 내인성 5' 단부 단일 가닥 DNA를 대체하면, DNA 복구 및 복제 과정은 PAM 가닥 상의 편집 부위의 영구적 설치, 및 이어서 편집 부위에 존재할 비-PAM 가닥 상의 미스매치의 교정을 유발할 것이다. 이러한 방식으로, 편집은 표적 DNA 부위 상의 DNA 양쪽 가닥으로 연장될 것이다. "편집된 가닥" 및 "비-편집된" 가닥에 대한 언급은 단지 PE 메카니즘에 수반되는 DNA의 가닥을 서술하도록 의도되는 것으로 인지될 것이다. "편집된 가닥"은 닉 부위의 바로 하류의 5' 단부 단일 가닥 DNA를 목적하는 편집을 함유하는 합성된 3' 단부 단일 가닥 DNA로 대체함으로써 처음 편집되는 가닥이다. "비-편집된" 가닥은 편집된 가닥과의 가닥 쌍이지만, 이는 또한 그 자체가 복구 및/또는 복제를 통해 편집되어 편집된 가닥, 특히 관심 편집에 상보적이 된다.
도 1l은 표적 DNA, 프라임 편집제 복합체의 해부학적 특색 및 PEgRNA와 표적 DNA 사이의 상호작용을 보여주는 프라임 편집의 메카니즘을 도시한다. 먼저, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제) 및 napDNAbp (예를 들어, SpCas9 닉카제, 예를 들어 HNH 뉴클레아제 도메인 내의 탈활성화 돌연변이 (예를 들어, H840A) 또는 RuvC 뉴클레아제 도메인 내의 탈활성화 돌연변이 (D10A)를 갖는 SpCas9)를 갖는 융합 단백질을 포함하는 프라임 편집제는 편집될 표적 DNA를 갖는 DNA 및 PEgRNA와 복합체화된다. PEgRNA는 스페이서, gRNA 코어 (일명 gRNA 스캐폴드 또는 gRNA 백본) (이는 napDNAbp에 결합함), 및 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 3' 단부, 5' 단부 또는 PEgRNA 분자 내의 어딘가에 있을 수 있다. 제시된 바와 같이, 연장 아암은 PEgRNA의 3' 단부에 있다. 연장 아암은 3'에서 5' 방향으로 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형 (관심 편집 및 PAM 가닥 상의 닉 부위에 바로 이어지는 5' 단부 단일 가닥 DNA와 상동인 상동성의 영역 (즉, 상동성 아암) 둘 다를 포함함)을 포함한다. 제시된 바와 같이, 닉이 도입되어 닉 부위의 바로 상류에 유리 3' 히드록실 기를 생성하면, PAM 가닥 상의 닉 부위의 바로 상류에 있는 영역은 "프라이머 결합 부위"로 지칭되는 연장 아암의 3' 단부에서 상보적 서열에 어닐링되어, 이용가능한 3' 히드록실 단부를 갖는 짧은 이중 가닥 영역을 생성하고, 이는 프라임 편집제 복합체의 폴리머라제에 대한 기질을 형성한다. 이어서, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)는 3' 히드록실 단부로부터 연장 아암의 단부까지 DNA의 가닥으로서 중합시킨다. 단일 가닥 DNA의 서열은 새로운 DNA를 합성하기 위해 폴리머라제에 의해 "판독"되는 연장 아암의 부분 (즉, 프라이머 결합 부위 제외)인 DNA 합성 주형에 의해 코딩된다. 이러한 중합은 초기 닉 부위의 원래 3' 히드록실 단부의 서열을 효과적으로 연장시킨다. DNA 합성 주형은 목적하는 편집뿐만 아니라 PAM 가닥 상의 닉 부위의 바로 하류의 DNA의 내인성 단일 가닥에 상동인 영역을 포함하는 DNA의 단일 가닥을 코딩한다. 다음으로, DNA의 코딩된 3' 단부 단일 가닥 (즉, 3' 단일 가닥 DNA 플랩)은 PAM 가닥 상의 닉 부위의 바로 하류의 DNA의 상응하는 상동 내인성 5'-단부 단일 가닥을 대체하여, 5'-단부 단일 가닥 DNA 플랩을 갖는 DNA 중간체를 형성하고, 이는 세포에 의해 (예를 들어, 플랩 엔도뉴클레아제에 의해) 제거된다. 내인성 5'-단부 단일 가닥 DNA 플랩의 상보체에 어닐링하는 3'-단부 단일 가닥 DNA 플랩은 5' DNA 플랩이 제거된 후에 내인성 가닥에 라이게이션된다. 이제 어닐링되고 라이게이션된 3' 단부 단일 가닥 DNA 플랩 내의 목적하는 편집은 상보체 가닥과의 미스매치를 형성하며, 이는 DNA 복구 및/또는 복제 라운드를 겪음으로써, 양쪽 가닥 상에 목적하는 편집을 영구적으로 설치한다.
도 2는 본원에 기재된 프라임 편집제에 사용될 수 있는 3종의 Cas 복합체 (SpCas9, SaCas9 및 LbCas12a) 및 그의 PAM, gRNA 및 DNA 절단 특색을 보여준다. 도면은 SpCas9, SaCas9 및 LbCas12a를 포함하는 복합체에 대한 설계를 보여준다.
도 3a-3f는 조작된 5' 프라임 편집제 gRNA (도 3a), 3' 프라임 편집제 gRNA (도 3b) 및 분자내 연장부 (도 3c)에 대한 설계를 보여준다. 연장된 가이드 RNA (또는 연장된 gRNA)는 또한 본원에서 PEgRNA 또는 "프라임 편집 가이드 RNA"로 지칭될 수 있다. 도 3d 및 도 3e는 각각 3' 및 5' 프라임 편집제 gRNA (PEgRNA)의 추가의 실시양태를 제공한다. 도 3f는 3' 단부 프라임 편집제 가이드 RNA와 표적 DNA 서열 사이의 상호작용을 예시한다. 도 3a-3c의 실시양태는 3', 5' 및 분자내 버전의 연장된 부분에서 역전사 주형 서열 (즉 또는 보다 넓게는 나타낸 바와 같은 DNA 합성 주형으로 지칭되며, 이는 RT가 프라임 편집제의 맥락에서 사용될 수 있는 유일한 1가지 유형의 폴리머라제이기 때문임), 프라이머 결합 부위 및 임의적인 링커 서열의 예시적인 배열, 뿐만 아니라 스페이서 및 코어 영역의 일반적 배열을 도시한다. 개시된 프라임 편집 과정은 이들 연장된 가이드 RNA의 구성으로 제한되지는 않는다. 도 3d의 실시양태는 본원에서 고려된 예시적인 PEgRNA의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3종의 주요 성분 요소, 즉: 스페이서, gRNA 코어 및 3' 단부에서의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 추가로, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한 추가로, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변형을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 임의의 다른 영역 내에 또는 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다. PEgRNA는, 특정 실시양태에서, 2차 RNA 구조, 예컨대 비제한적으로 헤어핀, 스템/루프, 토 루프, RNA-결합 단백질 동원 도메인 (예를 들어, MS2cp 단백질을 동원하고 이에 결합하는 MS2 압타머)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 2차 구조는 스페이서, gRNA 코어 또는 연장 아암 내에, 특히 e1 및/또는 e2 변형제 영역 내에 위치할 수 있다. 2차 RNA 구조에 추가로, PEgRNA는 (예를 들어, e1 및/또는 e2 변형제 영역 내에) 화학적 링커 또는 폴리(N) 링커 또는 테일을 포함할 수 있으며, 여기서 "N"은 임의의 핵염기일 수 있다. 일부 실시양태에서 (예를 들어, 도 72(c)에 제시된 바와 같이), 화학적 링커는 sgRNA 스캐폴드 또는 코어의 역전사를 방지하는 기능을 할 수 있다. 추가로, 특정 실시양태에서 (예를 들어, 도 72(c) 참조), 연장 아암 (3)은 RNA 또는 DNA로 구성될 수 있고/거나, 1개 이상의 핵염기 유사체 (예를 들어, 온도 탄력성과 같은 기능성을 부가할 수 있음)를 포함할 수 있다. 또한 추가로, 연장 아암 (3)의 배향은 자연적인 5'에서 3' 방향일 수 있거나 또는 3'에서 5' 방향의 반대 배향으로 합성될 수 있다 (전체 PEgRNA 분자의 배향에 대해). 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 napDNAbp와의 융합체로서 구현되거나 또는 목적하는 편집을 포함하는 목적하는 주형-코딩된 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하기 위한 별개의 모이어티로서 트랜스로 제공되어 구현될 수 있는 프라임 편집에 사용하기 위해, 연장 아암의 핵산 물질 (즉, DNA 또는 RNA)의 성질에 따라 적절한 DNA 폴리머라제를 선택할 수 있을 것임을 주목한다. 예를 들어, 연장 아암이 RNA이면, DNA 폴리머라제는 리버스 트랜스크립타제 또는 임의의 다른 적합한 RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 그러나, 연장 아암이 DNA이면, DNA 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 다양한 실시양태에서, DNA 폴리머라제의 제공은, 예를 들어 RNA-단백질 동원 도메인 (예를 들어, PEgRNA 상에 (예를 들어, e1 또는 e2 영역에 또는 다른 곳에) 설치된 MS2 헤어핀 및 DNA 폴리머라제에 융합된 MS2cp 단백질, 이에 의해 DNA 폴리머라제를 PEgRNA로 공동-국재화함)의 사용을 통해 트랜스로 이루어질 수 있다. 추가로, 프라이머 결합 부위는 일반적으로 목적하는 편집을 포함하는 생성된 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하기 위해 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 사용되는 주형의 일부를 형성하지 않는다는 것을 주목한다. 따라서, "DNA 합성 주형"의 명칭은 편집을 함유하는 목적하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩 및 프라임 편집 DNA 합성의 3' 단일 가닥 DNA 가닥 생성물에 의해 대체되는 5' 내인성 단일 가닥 DNA 플랩에 대한 상동성의 영역을 코딩하기 위해 DNA 폴리머라제에 의해 주형으로서 사용되는 연장 아암 (3)의 영역 또는 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, DNA 합성 주형은 "편집 주형" 및 "상동성 아암", 또는 예를 들어 편집 주형 전후의 1개 이상의 상동성 아암을 포함한다. 편집 주형은 작게는 단일 뉴클레오티드 치환일 수 있거나, 또는 DNA의 삽입 또는 역위일 수 있다. 추가로, 편집 주형은 또한 결실을 포함할 수 있으며, 이는 목적하는 결실을 함유하는 상동성 아암을 코딩함으로써 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, DNA 합성 주형은 또한 e2 영역 또는 그의 한 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, e2 영역이 DNA 폴리머라제 활성의 종결을 유발하는 2차 구조를 포함한다면, e2 영역의 임의의 부분이 DNA로 실제로 코딩되기 전에 DNA 폴리머라제 기능이 종결될 가능성이 있다. e2 영역의 일부 또는 심지어 전부가 DNA로 코딩되는 것이 또한 가능하다. e2의 얼마나 많은 부분이 주형으로서 실제로 사용되는지는 그의 구성 및 그 구성이 DNA 폴리머라제 기능을 방해하는지 여부에 좌우될 것이다.
도 3e의 실시양태는 본원에서 고려되는 또 다른 PEgRNA의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3종의 주요 성분 요소, 즉: 스페이서, gRNA 코어 및 3' 단부에서의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 추가로, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한 추가로, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변형을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 임의의 다른 영역 내에 또는 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다. PEgRNA는, 특정 실시양태에서, 2차 RNA 구조, 예컨대 비제한적으로 헤어핀, 스템/루프, 토 루프, RNA-결합 단백질 동원 도메인 (예를 들어, MS2cp 단백질을 동원하고 이에 결합하는 MS2 압타머)을 포함할 수 있다. 이들 2차 구조는 PEgRNA 분자 내 어느 곳에든 위치할 수 있다. 예를 들어, 이러한 2차 구조는 스페이서, gRNA 코어 또는 연장 아암 내에, 특히 e1 및/또는 e2 변형제 영역 내에 위치할 수 있다. 2차 RNA 구조에 추가로, PEgRNA는 (예를 들어, e1 및/또는 e2 변형제 영역 내에) 화학적 링커 또는 폴리(N) 링커 또는 테일을 포함할 수 있으며, 여기서 "N"은 임의의 핵염기일 수 있다. 일부 실시양태에서 (예를 들어, 도 72(c)에 제시된 바와 같이), 화학적 링커는 sgRNA 스캐폴드 또는 코어의 역전사를 방지하는 기능을 할 수 있다. 추가로, 특정 실시양태에서 (예를 들어, 도 72(c) 참조), 연장 아암 (3)은 RNA 또는 DNA로 구성될 수 있고/거나, 1개 이상의 핵염기 유사체 (예를 들어, 온도 탄력성과 같은 기능성을 부가할 수 있음)를 포함할 수 있다. 또한 추가로, 연장 아암 (3)의 배향은 자연적인 5'에서 3' 방향일 수 있거나 또는 3'에서 5' 방향의 반대 배향으로 합성될 수 있다 (전체 PEgRNA 분자의 배향에 대해). 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 napDNAbp와의 융합체로서 구현되거나 또는 목적하는 편집을 포함하는 목적하는 주형-코딩된 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하기 위한 별개의 모이어티로서 트랜스로 제공되어 구현될 수 있는 프라임 편집에 사용하기 위해, 연장 아암의 핵산 물질 (즉, DNA 또는 RNA)의 성질에 따라 적절한 DNA 폴리머라제를 선택할 수 있을 것임을 주목한다. 예를 들어, 연장 아암이 RNA이면, DNA 폴리머라제는 리버스 트랜스크립타제 또는 임의의 다른 적합한 RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 그러나, 연장 아암이 DNA이면, DNA 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 다양한 실시양태에서, DNA 폴리머라제의 제공은, 예를 들어 RNA-단백질 동원 도메인 (예를 들어, PEgRNA 상에 (예를 들어, e1 또는 e2 영역에 또는 다른 곳에) 설치된 MS2 헤어핀 및 DNA 폴리머라제에 융합된 MS2cp 단백질, 이에 의해 DNA 폴리머라제를 PEgRNA로 공동-국재화함)의 사용을 통해 트랜스로 이루어질 수 있다. 추가로, 프라이머 결합 부위는 일반적으로 목적하는 편집을 포함하는 생성된 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하기 위해 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 사용되는 주형의 일부를 형성하지 않는다는 것을 주목한다. 따라서, "DNA 합성 주형"의 명칭은 편집을 함유하는 목적하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩 및 프라임 편집 DNA 합성의 3' 단일 가닥 DNA 가닥 생성물에 의해 대체되는 5' 내인성 단일 가닥 DNA 플랩에 대한 상동성의 영역을 코딩하기 위해 DNA 폴리머라제에 의해 주형으로서 사용되는 연장 아암 (3)의 영역 또는 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, DNA 합성 주형은 "편집 주형" 및 "상동성 아암", 또는 예를 들어 편집 주형 전후의 1개 이상의 상동성 아암을 포함한다. 편집 주형은 작게는 단일 뉴클레오티드 치환일 수 있거나, 또는 DNA의 삽입 또는 역위일 수 있다. 추가로, 편집 주형은 또한 결실을 포함할 수 있으며, 이는 목적하는 결실을 함유하는 상동성 아암을 코딩함으로써 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, DNA 합성 주형은 또한 e2 영역 또는 그의 한 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, e2 영역이 DNA 폴리머라제 활성의 종결을 유발하는 2차 구조를 포함한다면, e2 영역의 임의의 부분이 DNA로 실제로 코딩되기 전에 DNA 폴리머라제 기능이 종결될 가능성이 있다. e2 영역의 일부 또는 심지어 전부가 DNA로 코딩되는 것이 또한 가능하다. e2의 얼마나 많은 부분이 주형으로서 실제로 사용되는지는 그의 구성 및 그 구성이 DNA 폴리머라제 기능을 방해하는지 여부에 좌우될 것이다.
도 3f의 개략도는 전형적인 PEgRNA와 이중 가닥 DNA의 표적 부위의 상호작용 및 관심 유전자 변화를 함유하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩의 동반 생성을 도시한다. 이중 가닥 DNA는 3'에서 5' 배향의 상단 가닥 (즉, 표적 가닥) 및 5'에서 3' 방향의 하단 가닥 (즉, PAM 가닥 또는 비-표적 가닥)으로 제시된다. 상단 가닥은 "프로토스페이서"의 상보체 및 PAM 서열의 상보체를 포함하며, PEgRNA의 스페이서에 의해 표적화되고 이에 어닐링되는 가닥이기 때문에 "표적 가닥"으로 지칭된다. 상보적 하단 가닥은 PAM 서열 (예를 들어, NGG) 및 프로토스페이서를 함유하기 때문에 "비-표적 가닥" 또는 "PAM 가닥" 또는 "프로토스페이서 가닥"으로 지칭된다. 제시되지는 않았지만, 도시된 PEgRNA는 프라임 편집제 융합 단백질의 Cas9 또는 등가 도메인과 복합체화될 것이다. 개략도에 제시된 바와 같이, PEgRNA의 스페이서는 표적 가닥 상의 프로토스페이서의 상보적 영역에 어닐링된다. 이러한 상호작용은 스페이서 RNA와 프로토스페이서 DNA의 상보체 사이에 DNA/RNA 하이브리드로서 형성되고, 프로토스페이서에 R 루프의 형성을 유도한다. 본원의 다른 곳에 교시된 바와 같이, Cas9 단백질 (제시되지 않음)은 이어서 제시된 바와 같은 비-표적 가닥에 닉을 유도한다. 이어서, 이는 *z*에 따라 프라이머 결합 부위에서 PEgRNA의 3' 단부와 상호작용하는 닉 부위의 바로 상류의 3' ssDNA 플랩 영역의 형성을 유도한다. ssDNA 플랩의 3' 단부 (즉, 리버스 트랜스크립타제 프라이머 서열)는 PEgRNA 상의 프라이머 결합 부위 (A)에 어닐링함으로써, 리버스 트랜스크립타제를 프라이밍한다. 이어서, 리버스 트랜스크립타제 (예를 들어, Cas9 구축물에 부착된 융합 단백질로서 시스로 제공되거나 또는 트랜스로 제공됨)는 DNA 합성 주형 (편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C) 포함)에 의해 코딩되는 DNA의 단일 가닥을 중합시킨다. 중합은 연장 아암의 5' 단부 쪽으로 계속된다. ssDNA의 중합된 가닥은, 다른 곳에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 도 1g에 제시된 바와 같이), 내인성 DNA를 침입하고, 상응하는 내인성 가닥 (이는 내인성 DNA의 5' 단부 DNA 플랩으로서 제거됨)을 대체하며, 자연 발생 DNA 복구/복제 라운드를 통해 목적하는 뉴클레오티드 편집 (단일 뉴클레오티드 염기 쌍 변화, 결실, 삽입 (전체 유전자 포함))을 설치하는 ssDNA 3' 단부 플랩을 형성한다.
도 3g는 본원에서 고려되는 프라임 편집의 또 다른 실시양태를 도시한다. 특히, 상단 개략도는 링커에 의해 연결된 napDNAbp (예를 들어, SpCas9) 및 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)의 융합 단백질을 포함하는 프라임 편집제 (PE)의 한 실시양태를 도시한다. PE는 PEgRNA의 gRNA 코어에 결합함으로써 PEgRNA와 복합체를 형성한다. 제시된 실시양태에서, PEgRNA에는 3' 단부에서 시작하여 프라이머 결합 부위 (PBS)에 이어서 DNA 합성 주형을 포함하는 3' 연장 아암이 장착되어 있다. 하단 개략도는 "트랜스 프라임 편집제 (tPE)"로 지칭되는 프라임 편집제의 변이체를 도시한다. 이 실시양태에서, DNA 합성 주형 및 PBS는 PEgRNA로부터 탈커플링되고, RNA-단백질 동원 도메인 (예를 들어, MS2 헤어핀)을 포함하는 트랜스 프라임 편집제 RNA 주형 ("tPERT")으로 지칭되는 별개의 분자 상에 제시된다. PE 그 자체는 RNA-단백질 동원 도메인을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단백질인 rPERT 동원 단백질 ("RP")에 대한 융합체를 포함하도록 추가로 변형된다. RNA-단백질 동원 도메인이 MS2 헤어핀인 예에서, 상응하는 rPERT 동원 단백질은 MS2 태그부착 시스템의 MS2cp일 수 있다. MS2 태그부착 시스템은 MS2 박테리오파지 코트 단백질 ("MCP" 또는 "MS2cp")과 파지의 게놈에 존재하는 스템-루프 또는 헤어핀 구조, 즉 "MS2 헤어핀" 또는 "MS2 압타머"의 천연 상호작용에 기초한다. 트랜스 프라임 편집의 경우에, 도 3h에 도시된 예에 제시된 바와 같이, RP-PE:gRNA 복합체는 적절한 RNA-단백질 동원 도메인을 갖는 tPERT를 "동원"하여 PE:gRNA 복합체와 공동-국재화함으로써, 프라임 편집에 사용하기 위한 PBS 및 DNA 합성 주형을 트랜스로 제공한다.
도 3h는 트랜스 프라임 편집의 과정을 도시한다. 이러한 실시양태에서, 트랜스 프라임 편집제는 MS2cp 단백질 (즉, MS2 압타머를 인식하고 이에 결합하는 동원 단백질의 유형)에 융합되고 sgRNA (즉, PEgRNA와 대조적으로 표준 가이드 RNA)와 복합체화된 "PE2" 프라임 편집제 (즉, Cas9(H840A) 및 변이체 MMLV RT의 융합체)를 포함한다. 트랜스 프라임 편집제는 표적 DNA에 결합하고, 비표적 가닥을 닉킹한다. MS2cp 단백질은 tPERT 분자 상의 RNA-단백질 동원 도메인과의 특이적 상호작용을 통해 tPERT를 트랜스로 동원한다. tPERT는 트랜스 프라임 편집제와 공동-국재화됨으로써, 3' 단부를 갖고 DNA 합성 주형에 의해 코딩되는 목적하는 유전자 정보를 함유하는 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하기 위해 리버스 트랜스크립타제 폴리머라제에 의해 사용하기 위한 PBS 및 DNA 합성 주형 기능을 트랜스로 제공한다.
도 4a-4e는 시험관내 TPRT 검정 (즉, 프라임 편집 검정)을 나타낸다. 도 4a는 RT 효소에 의한 형광 표지된 DNA 기질 gRNA 주형화된 연장의 개략도 (PAGE)이다. 도 4b는 사전-닉킹된 기질, dCas9 및 합성 주형 길이가 상이한 5'-연장된 gRNA를 사용한 TPRT (즉, 프라임 편집)를 보여준다. 도 4c는 Cas9의 부재 하에 사전-닉킹된 DNA 기질과의 RT 반응을 보여준다. 도 4d는 Cas9(H840A) 및 5'-연장된 gRNA를 사용한 전체 dsDNA 기질에 대한 TPRT (즉, 프라임 편집)를 보여준다. 도 4e는 사전-닉킹된 및 전체 dsDNA 기질을 사용한 3'-연장된 gRNA 주형을 보여준다. 모든 반응은 M-MLV RT에 의한다.
도 5는 합성 주형 길이가 다양한 5'-연장된 gRNA를 사용한 시험관내 검증을 보여준다. 형광 표지된 (Cy5) DNA 표적을 기질로서 사용하고, 이 실험 세트에서 사전-닉킹하였다. 이들 실험에 사용된 Cas9는 촉매 기능상실 Cas9 (dCas9)이고, 사용된 RT는 슈퍼스크립트 III이며, 이는 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 유래된 상업용 RT이다. dCas9:gRNA 복합체를 정제된 성분으로부터 형성하였다. 이어서, 형광 표지된 DNA 기질을 dNTP 및 RT 효소와 함께 첨가하였다. 37℃에서 1시간의 인큐베이션 후에, 반응 생성물을 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 분석하였다. 겔 영상은 원래 DNA 가닥이 역전사 주형의 길이와 일치하는 길이로 연장된 것을 보여준다.
도 6은 합성 주형 길이가 다양한 5'-연장된 gRNA를 사용한 시험관내 검증을 보여주며, 이는 도 5에 제시된 것과 밀접하게 유사하다. 그러나, DNA 기질은 이 실험 세트에서 사전-닉킹되지 않는다. 이들 실험에 사용된 Cas9는 Cas9 닉카제 (SpyCas9 H840A 돌연변이체)이고, 사용된 RT는 슈퍼스크립트 III이며, 이는 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 유래된 상업용 RT이다. 반응 생성물을 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 분석하였다. 겔에 제시된 바와 같이, 닉카제는 표준 gRNA가 사용되는 경우에 DNA 가닥을 효율적으로 절단한다 (gRNA_0, 레인 3).
도 7은 3' 연장이 DNA 합성을 지지하고 Cas9 닉카제 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 사전-닉킹된 기질 (흑색 화살표)은 dCas9 또는 Cas9 닉카제가 사용될 때 RT 생성물로 거의-정량적으로 전환된다 (레인 4 및 5). RT 생성물 (적색 화살표)로의 50% 초과의 전환이 전체 기질 (레인 3)에서 관찰된다. Cas9 닉카제 (SpyCas9 H840A 돌연변이체), 촉매 기능상실 Cas9 (dCas9) 및 슈퍼스크립트 III (몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 유래된 상업용 RT)이 사용된다.
도 8은 RT 반응이 시스의 gRNA (동일한 복합체에 결합됨)와 우선적으로 발생하는지 여부를 결정하는데 사용된 이중 색상 실험을 나타낸다. 5'-연장된 및 3'-연장된 gRNA에 대해 2개의 별개의 실험을 수행하였다. 생성물을 PAGE에 의해 분석하였다. 생성물 비는 (Cy3시스/Cy3트랜스) / (Cy5트랜스/Cy5시스)로서 계산하였다.
도 9a-9d는 플랩 모델 기질을 나타낸다. 도 9a는 플랩-지정 돌연변이유발을 위한 이중-FP 리포터를 보여준다. 도 9b는 HEK 세포에서의 정지 코돈 복구를 보여준다. 도 9c는 플랩 복구 후 서열분석된 효모 클론을 보여준다. 도 9d는 인간 세포에서의 상이한 플랩 특색의 시험을 보여준다.
도 10은 플라스미드 기질에 대한 프라임 편집을 나타낸다. 효모 (에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)) 발현을 위해 이중-형광 리포터 플라스미드를 구축하였다. 효모에서의 이러한 구축물의 발현은 GFP만을 생성한다. 시험관내 프라임 편집 반응은 점 돌연변이를 도입하고, 모 플라스미드 또는 시험관내 Cas9(H840A) 닉킹된 플라스미드를 효모 내로 형질전환시킨다. 콜로니가 형광 영상화에 의해 가시화된다. 효모 이중-FP 플라스미드 형질전환체가 제시된다. 모 플라스미드 또는 시험관내 Cas9(H840A) 닉킹된 플라스미드를 형질전환시키는 것은 녹색 GFP 발현 콜로니만을 생성한다. 5'-연장된 또는 3'-연장된 gRNA와의 프라임 편집 반응은 녹색과 황색 콜로니의 혼합을 생성한다. 후자는 GFP 및 mCherry 둘 다를 발현한다. 더 많은 황색 콜로니가 3'-연장된 gRNA에서 관찰된다. 정지 코돈을 함유하지 않는 양성 대조군이 또한 제시된다.
도 11은 도 10에서의 실험과 유사한 플라스미드 기질에 대한 프라임 편집을 보여주지만, 정지 코돈에 점 돌연변이를 설치하는 대신에, 프라임 편집은 프레임시프트 돌연변이를 복구하고 하류 mCherry의 합성을 가능하게 하는 단일 뉴클레오티드 삽입 (좌측) 또는 결실 (우측)을 설치한다. 실험 둘 다는 3' 연장된 gRNA를 사용하였다.
도 12는 생어 서열분석에 의해 특징화된, 플라스미드 기질에 대한 프라임 편집의 편집 생성물을 보여준다. TRT 형질전환으로부터의 개별 콜로니를 선택하고, 생어 서열분석에 의해 분석하였다. 정확한 편집은 선택 콜로니를 서열분석함으로써 관찰되었다. 녹색 콜로니는 원래 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 함유한 반면, 황색 콜로니는 프라임 편집 gRNA에 의해 설계된 정확한 돌연변이를 함유하였다. 다른 점 돌연변이 또는 indel은 관찰되지 않았다.
도 13은 새로운 프라임 편집 기술에 대한 잠재적 범주가 제시되고 데아미나제-매개 염기 편집제 기술과 비교된다는 것을 보여준다.
도 14는 인간 세포에서의 편집의 개략도를 보여준다.
도 15는 gRNA에서의 프라이머 결합 부위의 연장을 나타낸다.
도 16은 인접한 표적화를 위한 말단절단된 gRNA를 보여준다.
도 17a-17c는 인간 배아 신장 (HEK) 세포에서의 성분의 형질감염 후 표적 뉴클레오티드에서의 % T에서 A로의 전환을 나타내는 그래프이다. 도 17a는 Cas9(H840A) 닉카제에 대한 야생형 MLV 리버스 트랜스크립타제의 N-말단 융합체 (32개-아미노산 링커)를 사용한 결과를 제시하는 데이터를 보여준다. 도 17b는 도 17a와 유사하지만, RT 효소의 C-말단 융합체에 대한 것이다. 도 17c는 도 17a와 유사하지만, MLV RT와 Cas9 사이의 링커가 32개 아미노산 대신 60개 아미노산 길이이다.
도 18은 고처리량 앰플리콘 서열분석에 의한 HEK3 부위에서의 고순도 T에서 A로의 편집을 보여준다. 서열분석 분석의 결과는 편집된 세포의 가장 풍부한 유전자형을 디스플레이한다.
도 19는 indel 비율 (오렌지색 막대)과 함께 표적 뉴클레오티드에서의 편집 효율 (청색 막대)을 보여준다. WT는 야생형 MLV RT 효소를 지칭한다. 돌연변이체 효소 (M1 내지 M4)는 우측에 열거된 돌연변이를 함유한다. 편집 비율을 게놈 DNA 앰플리콘의 고처리량 서열분석에 의해 정량화하였다.
도 20은 단일 가닥 닉이 표적 뉴클레오티드에 근접하여 상보적 DNA 가닥에 도입된 경우의 표적 뉴클레오티드의 편집 효율을 보여준다. 표적 뉴클레오티드로부터 다양한 거리에서의 닉킹을 시험하였다 (삼각형). 표적 염기 쌍에서의 편집 효율 (청색 막대)이 indel 형성 비율 (오렌지색 막대)과 함께 제시된다. "부재" 예는 상보적 가닥 닉킹 가이드 RNA를 함유하지 않는다. 편집 비율을 게놈 DNA 앰플리콘의 고처리량 서열분석에 의해 정량화하였다.
도 21은 목적하는 T에서 A로의 전환 돌연변이 및 다른 주요 게놈 편집 부산물의 일반적 부재를 보여주는 프로세싱된 고처리량 서열분석 데이터를 나타낸다.
도 22는 연장된 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 사용하여 표적 유전자좌 상에서 오류-유발 리버스 트랜스크립타제에 의해 표적화된 돌연변이유발을 수행하기 위한, 즉 오류-유발 RT에 의해 프라임 편집을 수행하기 위한 예시적인 과정의 개략도를 제공한다. 이 과정은 표적화된 돌연변이유발을 위한 프라임 편집의 실시양태로 지칭될 수 있다. 연장된 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, gRNA는 napDNAbp가 돌연변이유발될 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의해), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 특정 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥에 상응하는 DNA의 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않는 가닥에서 생성된다. 단계 (c)에서, 3' 단부 DNA 가닥은 역전사를 프라이밍하기 위해 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 특정 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 RT 프라이밍 서열에 혼성화한다. 단계 (d)에서, DNA의 돌연변이유발된 단일 가닥을 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 가이드 RNA의 3' 단부를 향해 합성하는 오류-유발 리버스 트랜스크립타제가 도입된다. 예시적인 돌연변이는 별표 "*"로 표시된다. 이는 목적하는 돌연변이유발된 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 돌연변이유발된 영역이 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩 (돌연변이유발된 영역을 포함함)의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 다른 가닥 상의 상보적 서열에 침입하고 혼성화하였을 때 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써, 목적하는 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 과정은 또한 도 1f에 예시된 바와 같이 제2 가닥 닉킹에 의해 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 내인성 DNA 복구 및/또는 복제 과정 후에, 돌연변이유발된 영역은 DNA 유전자좌의 DNA의 양쪽 가닥 내로 혼입된다.
도 23은 트리뉴클레오티드 반복 서열을 축소시키기 위한 gRNA 설계 및 TPRT 게놈 편집 (즉, 프라임 편집)에 의한 트리뉴클레오티드 반복부 축소의 개략도이다. 트리뉴클레오티드 반복부 확장은 헌팅톤병, 유약 X 증후군 및 프리드라이히 운동실조를 포함한 다수의 인간 질환과 연관된다. 가장 흔한 트리뉴클레오티드 반복부는 CAG 트리플렛을 함유하지만, GAA 트리플렛 (프리드라이히 운동실조) 및 CGG 트리플렛 (유약 X 증후군)이 또한 발생한다. 확장에 대한 소인이 유전되거나 또는 이미 확장된 모 대립유전자를 획득하는 것은 질환을 획득할 가능성을 증가시킨다. 병원성 트리뉴클레오티드 반복부 확장은 프라임 편집을 사용하여 가설적으로 교정될 수 있다. 반복 영역의 상류 영역은 RNA-가이드된 뉴클레아제에 의해 닉킹되고, 이어서 건강한 수의 반복부 (이는 특정한 유전자 및 질환에 의존함)를 함유하는 새로운 DNA 가닥의 합성을 프라이밍하는데 사용될 수 있다. 반복 서열 후에, 반복부의 다른 단부 (적색 가닥)에 인접한 서열의 정체에 매칭되는 짧은 상동성 스트레치가 부가된다. 새로 합성된 가닥의 침입 및 내인성 DNA의 새로 합성된 플랩으로의 후속 대체는 축소된 반복 대립유전자를 유도한다.
도 24는 프라임 편집에 의한 정확한 10개-뉴클레오티드 결실을 보여주는 개략도이다. HEK3 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 닉 부위 뒤 10개-뉴클레오티드 결실을 코딩하는 역전사 주형으로 설계하였다. 형질감염된 HEK 세포에서의 편집 효율을 앰플리콘 서열분석을 사용하여 평가하였다.
도 25는 내인성 게놈 유전자좌에서의 펩티드 태그부착 유전자에 대한 gRNA 설계 및 TPRT 게놈 편집 (즉, 프라임 편집)에 의한 펩티드 태그부착을 보여주는 개략도이다. FlAsH 및 ReAsH 태그부착 시스템은 다음 2가지 부분을 포함한다: (1) 형광단-이중비소 프로브 및 (2) 서열 FLNCCPGCCMEP (서열식별번호: 1)에 의해 예시되는 테트라시스테인 모티프를 함유하는 유전자 코딩된 펩티드. 세포 내에서 발현되는 경우에, 테트라시스테인 모티프를 함유하는 단백질은 형광단-비소 프로브로 형광 표지될 수 있다 (참고문헌: [J. Am. Chem. Soc., 2002, 124 (21), pp 6063-6076. DOI: 10.1021/ja017687n] 참조). "소르태깅(sortagging)" 시스템은 표지된 펩티드 프로브를 적합한 펩티드 기질을 함유하는 단백질에 공유 접합시키는 박테리아 소르타제 효소를 사용한다 (참고문헌: [Nat. Chem. Biol. 2007 Nov;3(11):707-8. DOI: 10.1038/nchembio.2007.31] 참조). FLAG-태그 (DYKDDDDK (서열식별번호: 2)), V5-태그 (GKPIPNPLLGLDST (서열식별번호: 3)), GCN4-태그 (EELLSKNYHLENEVARLKK (서열식별번호: 4)), HA-태그 (YPYDVPDYA (서열식별번호: 5)) 및 Myc-태그 (EQKLISEEDL (서열식별번호: 6))는 면역검정을 위한 에피토프 태그로서 통상적으로 사용된다. 파이-클램프는 펜타플루오로-방향족 기질로 표지될 수 있는 펩티드 서열 (FCPF)을 코딩한다 (참고문헌: [Nat. Chem. 2016 Feb;8(2):120-8. doi: 10.1038/nchem.2413]).
도 26a는 His6-태그 및 FLAG-태그의 게놈 DNA 내로의 정확한 설치를 보여준다. HEK3 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 18-nt His-태그 삽입 또는 24-nt FLAG-태그 삽입을 코딩하는 역전사 주형으로 설계하였다. 형질감염된 HEK 세포에서의 편집 효율을 앰플리콘 서열분석을 사용하여 평가하였다. FLAG-태그의 전체 24-nt 서열은 보이는 프레임의 외부에 있다는 것을 주목한다 (서열분석으로 전체 및 정확한 삽입을 확인함). 도 26b는 (a) 단백질을 가용성 또는 불용성으로 만드는 것, (b) 단백질의 세포 국재화를 변화시키거나 추적하는 것, (c) 단백질의 반감기를 연장시키는 것, (d) 단백질 정제를 용이하게 하는 것, 및 (e) 단백질의 검출을 용이하게 하는 것을 포함하는, 단백질/펩티드 태그부착을 수반하는 다양한 적용을 약술하는 개략도를 보여준다.
도 27은 프리온 질환의 진행을 방지하거나 중지시키는 보호 돌연변이를 PRNP에 설치하는 것에 의한 프라임 편집의 개관을 보여준다. PEgRNA 서열은 좌측 (즉, sgRNA 스캐폴드의 5')에서 서열식별번호: 351 및 우측 (즉, sgRNA 스캐폴드의 3')에서 서열식별번호: 3864에 상응한다.
도 28a는 RNA 모티프를 코딩하는 서열의 PE-기반 삽입의 개략도이다. 도 28b는 잠재적으로 삽입될 수 있는 일부 예시 모티프 및 그의 기능의 목록 (총체적은 아님)이다.
도 29a는 프라임 편집제의 도시이다. 도 29b는 PE에 의해 지시된 게놈, 플라스미드 또는 바이러스 DNA에 대한 가능한 변형을 보여준다. 도 29c는 펩티드 루프의 라이브러리를 PEgRNA의 라이브러리를 통해 명시된 단백질 (이 경우에 GFP) 내로 삽입하기 위한 예시 계략도를 보여준다. 도 29d는 상이한 PEgRNA를 사용한 가능한 프로그램가능한 코돈 결실 또는 단백질의 N- 또는 C-말단의 말단절단의 예를 보여준다. 결실은 프레임시프트 돌연변이의 최소 생성과 함께 발생하는 것으로 예측될 것이다.
도 30은 연속 진화 시스템, 예컨대 PACE에서의 코돈의 반복적 삽입에 대한 가능한 개략도를 보여준다.
도 31은 gRNA 코어, 표적화된 유전자의 서열과 매칭되는 ~20nt 스페이서, 면역원성 에피토프 뉴클레오티드 서열을 갖는 역전사 주형 및 표적화된 유전자의 서열과 매칭되는 프라이머 결합 부위를 보여주는 조작된 gRNA의 예시이다.
도 32는 내인성 또는 외래 게놈 DNA 내로 공지된 면역원성 에피토프를 삽입하기 위한 수단으로서 프라임 편집을 사용하여 상응하는 단백질의 변형을 생성하는 것을 보여주는 개략도이다.
도 33은 프라이머 결합 서열 삽입을 위한 PEgRNA 설계, 및 오프-타겟 편집을 결정하기 위해 프라임 편집을 사용한 게놈 DNA 내로의 프라이머 결합 삽입을 보여주는 개략도이다. 이러한 실시양태에서, 프라임 편집은 살아있는 세포, 조직 또는 동물 모델 내부에서 수행된다. 제1 단계로서, 적절한 PEgRNA를 설계한다. 상단 개략도는 이러한 측면에서 사용될 수 있는 예시적인 PEgRNA를 보여준다. PEgRNA 내의 스페이서 ("프로토스페이서"로 표지됨)는 게놈 표적의 가닥 중 하나에 상보적이다. PE:PEgRNA 복합체 (즉, PE 복합체)는 코딩된 프라이머 결합 서열 및 절단 부위의 바로 하류의 영역 (적색)에 상보적인 상동성 영역 (PEgRNA의 상동성 아암에 의해 코딩됨)을 함유하는 단일 가닥 3' 단부 플랩을 닉 부위에 설치한다. 플랩 침입 및 DNA 복구/복제 과정을 통해, 합성된 가닥은 DNA 내로 혼입되어 프라이머 결합 부위를 설치한다. 이러한 과정은 목적하는 게놈 표적에서 발생할 수 있지만, 또한 오프-타겟 방식으로 PEgRNA와 상호작용할 수 있는 다른 게놈 부위에서도 발생할 수 있다 (즉, PEgRNA는 의도된 게놈 부위가 아닌 다른 게놈 부위에 대한 스페이서 영역의 상보성으로 인해 PE 복합체를 다른 오프-타겟 부위로 가이드함). 따라서, 프라이머 결합 서열을 목적하는 게놈 표적뿐만 아니라 게놈 내 다른 곳의 오프-타겟 게놈 부위에 설치할 수도 있다. 의도된 게놈 표적 부위 및 오프-타겟 게놈 부위 둘 다에서의 이들 프라이머 결합 부위의 삽입을 검출하기 위해, 게놈 DNA (PE-후)를 단리하고, 단편화하고, 어댑터 뉴클레오티드 (적색으로 제시됨)에 라이게이션할 수 있다. 이어서, 프라이머 결합 부위가 PE에 의해 삽입된 온-타겟 및 오프-타겟 게놈 DNA 영역을 증폭시키기 위해 어댑터 및 삽입된 프라이머 결합 서열에 어닐링하는 PCR 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. 이어서, 고처리량 서열분석을 수행하고, 서열 정렬을 수행하여 온-타겟 부위 또는 오프-타겟 부위에서 PE-삽입된 프라이머 결합 서열의 삽입 지점을 확인할 수 있다.
도 34는 PE에 의한 유전자의 정확한 삽입을 보여주는 개략도이다.
도 35a는 천연 인슐린 신호전달 경로를 보여주는 개략도이다. 도 35b는 FK1012에 의해 제어되는 FKBP12-태그부착된 인슐린 수용체 활성화를 보여주는 개략도이다.
도 36은 소분자 단량체를 보여준다. 참조: 범핑된 FK506 모방체 (2)107
도 37은 소분자 이량체를 보여준다. 참조: FK1012 495,96; FK1012 5108; FK1012 6107; AP1903 7107; 시클로스포린 A 이량체 898; FK506-시클로스포린 A 이량체 (FkCsA) 9100.
도 38a-38f는 시험관내 및 효모 세포에서의 프라임 편집 및 실행가능성 연구의 개관을 제공한다. 도 38a는 유형별로 분류된, 클린바(ClinVar) (2019년 7월 액세스)에서의 75,122종의 공지된 병원성 인간 유전자 변이체를 보여준다. 도 38b는 프라임 편집 복합체가 조작된 리버스 트랜스크립타제 도메인에 융합되고 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)와 복합체화된, RNA-가이드된 DNA-닉킹 도메인, 예컨대 Cas9 닉카제를 함유하는 프라임 편집제 (PE) 단백질로 이루어진다는 것을 보여준다. PE:PEgRNA 복합체는 표적 DNA 부위에 결합하고, 표적 부위의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 전 또는 후의 광범위한 DNA 위치에서 매우 다양한 정확한 DNA 편집을 가능하게 한다. 도 38c는 DNA 표적 결합시에, PE:PEgRNA 복합체가 PAM-함유 DNA 가닥을 닉킹하는 것을 보여준다. 생성된 유리 3' 단부는 PEgRNA의 프라이머-결합 부위에 혼성화한다. 리버스 트랜스크립타제 도메인은 PEgRNA의 RT 주형을 사용하여 프라이머 연장을 촉매함으로써, 목적하는 편집을 함유하는 새로 합성된 DNA 가닥 (3' 플랩)을 생성한다. 편집된 3' 플랩과 원래 DNA를 함유하는 비편집된 5' 플랩 사이의 평형, 이어서 세포 5' 플랩 절단 및 라이게이션, 및 DNA 복구 또는 복제로 헤테로듀플렉스 DNA를 분해하는 것은, 안정하게 편집된 DNA를 생성한다. 도 38d는 5'-Cy5 표지된 PAM 가닥을 함유하는 사전-닉킹된 dsDNA 기질, dCas9 및 상업용 M-MLV RT 변이체 (RT, 슈퍼스크립트 III)를 사용한 시험관내 5'-연장된 PEgRNA 프라이머 연장 검정을 보여준다. dCas9를 다양한 길이의 RT 주형을 함유하는 PEgRNA와 복합체화한 다음, 표시된 성분과 함께 DNA 기질에 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 변성 우레아 PAGE에 의해 분석하고, Cy5 형광에 대해 가시화하였다. 도 38e는 dCas9 또는 Cas9 H840A 닉카제와 사전-복합체화된 3'-연장된 PEgRNA 및 사전-닉킹된 또는 비-닉킹된 5'-Cy5-표지된 dsDNA 기질을 사용하여 도 38d에서와 같이 수행된 프라이머 연장 검정을 보여준다. 도 38f는 시험관내에서 PEgRNA, Cas9 닉카제 및 RT로 편집된 GFP-mCherry 융합 리포터 플라스미드로 형질전환된 효모 콜로니를 보여준다. GFP와 mCherry 사이의 넌센스 또는 프레임시프트 돌연변이를 함유하는 플라스미드를, 전환 돌연변이, 1-bp 삽입 또는 1-bp 결실을 통해 mCherry 번역을 회복시키는 5'-연장된 또는 3'-연장된 PEgRNA로 편집하였다. GFP 및 mCherry 이중-양성 세포 (황색)는 성공적인 편집을 반영한다.
도 39a-39d는 PE1 및 PE2에 의한 인간 세포에서의 게놈 DNA의 프라임 편집을 조여준다. 도 39a는 PEgRNA가 스페이서 서열, sgRNA 스캐폴드, 및 프라이머-결합 부위 (녹색) 및 역전사 (RT) 주형 (자주색) (이는 편집된 염기(들) (적색)를 함유함)을 함유하는 3' 연장부를 함유한다는 것을 보여준다. 프라이머-결합 부위는 닉킹 부위의 바로 상류에서 PAM-함유 DNA 가닥에 혼성화한다. RT 주형은 코딩된 편집을 제외하고는 닉의 하류 DNA 서열에 상동이다. 도 39b는 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제에 융합된 Cas9 H840A 닉카제 (PE1) 및 다양한 프라이머-결합 부위 길이의 PEgRNA를 사용한 HEK293T 세포 내 HEK3 부위에서의 T·A에서 A·T로의 전환 편집의 설치를 보여준다. 도 39c는 PE2에서의 조작된 오중돌연변이체 M-MLV 리버스 트랜스크립타제 (D200N, L603W, T306K, W313F, T330P)의 사용이 HEK293T 세포 내 5개 게놈 부위에서의 프라임 편집 전환 효율 및 HEK3에서의 작은 삽입 및 작은 결실 편집을 실질적으로 개선시킨다는 것을 보여준다. 도 39d는 HEK293T 세포 내 5개 게놈 부위에서의 다양한 RT 주형 길이에 의한 PE2 편집 효율의 비교이다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 40a-40c는 PE3 및 PE3b 시스템이 비-편집된 가닥을 닉킹하여 프라임 편집 효율을 증가시킨다는 것을 보여준다. 도 40a는 PE3에 의한 프라임 편집의 개관이다. 편집된 가닥의 초기 합성 후에, DNA 복구는 편집을 함유하는 새로 합성된 가닥을 제거하거나 (3' 플랩 절제) 또는 원래 게놈 DNA 가닥을 제거할 것이다 (5' 플랩 절제). 5' 플랩 절제는 1개의 편집된 가닥 및 1개의 비-편집된 가닥을 함유하는 DNA 헤테로듀플렉스를 남긴다. 미스매치 복구 기구 또는 DNA 복제는 헤테로듀플렉스를 분해하여 편집된 또는 비-편집된 생성물을 제공할 수 있다. 비-편집된 가닥을 닉킹하는 것은 그 가닥의 복구를 선호하여, 목적하는 편집을 함유하는 안정한 듀플렉스 DNA의 우선적인 생성을 유발한다. 도 40b는 PE3-매개된 프라임 편집 효율 및 indel 형성에 대한 상보적 가닥 닉킹의 효과를 보여준다. "부재"는 상보적 가닥을 닉킹하지 않는 PE2 대조군을 지칭한다. 도 40c는 PE2 (상보적 가닥 닉 부재), PE3 (일반적 상보적 가닥 닉) 및 PE3b (편집-특이적 상보적 가닥 닉)를 사용한 편집 효율의 비교이다. 모든 편집 수율은 분류 없이 모든 처리된 세포 중에서 의도된 편집을 함유하고 indel을 함유하지 않는 총 서열분석 판독물의 백분율을 반영한다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 41a-41k는 HEK293T 세포 내 7개의 내인성 인간 게놈 유전자좌에서 PE3에 의한 표적화된 삽입, 결실 및 모든 12가지 유형의 점 돌연변이를 보여준다. 도 41a는 10-nt RT 주형을 사용한 HEK3 부위의 위치 +1 내지 +8 (PEgRNA-유도된 닉의 위치를 위치 +1과 -1 사이로서 카운팅하여)의 모든 12가지 유형의 단일-뉴클레오티드 전이 및 전환 편집을 보여주는 그래프이다. 도 41b는 34-nt RT 주형을 사용한 HEK3 부위에서의 긴-범위 PE3 전환 편집을 보여주는 그래프이다. 도 41c-41h는 (도 41c) RNF2, (도 41d) FANCF, (도 41e) EMX1, (도 41f) RUNX1, (도 41g) VEGFA 및 (도 41h) DNMT1에 대한 프라임 편집 윈도우 내의 다양한 위치에서의 모든 12가지 유형의 전이 및 전환 편집을 보여주는 그래프이다. 도 41i는 7개의 내인성 게놈 유전자좌에서의 PE3에 의한 표적화된 1- 및 3-bp 삽입 및 1- 및 3-bp 결실을 보여주는 그래프이다. 도 41j는 HEK3 표적 부위에서의 5 내지 80 bp의 표적화된 정확한 결실을 보여주는 그래프이다. 도 41k는 3개의 내인성 게놈 유전자좌에서의 삽입 및 결실, 삽입 및 점 돌연변이, 결실 및 점 돌연변이, 및 이중 점 돌연변이의 조합 편집을 보여주는 그래프이다. 모든 편집 수율은 분류 없이 모든 처리된 세포 중에서 의도된 편집을 함유하고 indel을 함유하지 않는 총 서열분석 판독물의 백분율을 반영한다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 42a-42h는 프라임 편집 및 염기 편집, 및 공지된 Cas9 오프-타겟 부위에서의 Cas9 및 PE3에 의한 오프-타겟 편집의 비교를 보여준다. 도 42a는 HEK293T 세포 내 내인성 HEK3, FANCF 및 EMX1 부위에서의 PE2, PE3, BE2max 및 BE4max에 대한 동일한 표적 뉴클레오티드에서의 총 C·G에서 T·A로의 편집 효율을 보여준다. 도 42b는 도 42a에서의 처리로부터의 indel 빈도를 보여준다. 도 42c는 HEK3, FANCF 및 EMX1에서의 PE2, PE3, BE2max 및 BE4max에 대한 정확한 C·G에서 T·A로의 편집 (방관자 편집 또는 indel 부재)의 편집 효율을 보여준다. EMX1의 경우, 3개의 표적화된 뉴클레오티드에서의 C·G에서 T·A로의 전환의 모든 가능한 조합의 정확한 PE 조합 편집이 또한 제시된다. 도 42d는 HEK3 및 FANCF에서의 PE2, PE3, ABEdmax 및 ABEmax에 대한 총 A·T에서 G·C로의 편집 효율을 보여준다. 도 42e는 HEK3 및 FANCF에 대한 방관자 편집 또는 indel이 없는 정확한 A·T에서 G·C로의 편집 효율을 보여준다. 도 42f는 도 42d에서의 처리로부터의 indel 빈도를 보여준다. 도 42g는 4개의 온-타겟 및 16개의 공지된 오프-타겟 부위에서의 Cas9 뉴클레아제에 대한 HEK293T 세포에서의 평균 삼중 편집 효율 (indel을 갖는 서열분석 판독물 백분율)을 보여준다. 검사된 16개의 오프-타겟 부위는 4개의 온-타겟 부위 각각에 대해 이전에 보고된 상위 4개의 오프-타겟 부위118,159였다. 각각의 온-타겟 부위에 대해, Cas9를 sgRNA 또는 동일한 프로토스페이서를 인식하는 각각 4개의 PEgRNA와 쌍형성시켰다. 도 42h는 (도 42g)에서의 각각의 PEgRNA와 쌍형성된 PE2 또는 PE3에 대한 HEK293T 세포에서의 평균 삼중 온-타겟 및 오프-타겟 편집 효율 및 indel 효율 (하기 괄호 안)을 보여준다. 온-타겟 편집 수율은 분류 없이 모든 처리된 세포 중에서 의도된 편집을 함유하고 indel을 함유하지 않는 총 서열분석 판독물의 백분율을 반영한다. 오프-타겟 편집 수율은 프라임 편집과 일치하는 오프-타겟 유전자좌 변형을 반영한다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 43a-43i는 다양한 인간 세포주 및 1차 마우스 피질 뉴런에서의 프라임 편집, 병원성 전환, 삽입 또는 결실 돌연변이의 설치 및 교정, 및 프라임 편집과 HDR의 비교를 보여준다. 도 43a는 HEK293T 세포에서의 HBB 내 병원성 E6V 돌연변이의 설치 (T·A에서 A·T로의 전환을 통함) 및 교정 (A·T에서 T·A로의 전환을 통함)을 보여주는 그래프이다. 야생형 HBB 또는 PEgRNA PAM을 파괴하는 침묵 돌연변이를 함유하는 HBB로의 교정이 제시된다. 도 43b는 HEK293T 세포에서의 병원성 HEXA 1278+TATC 대립유전자의 설치 (4-bp 삽입을 통함) 및 교정 (4-bp 결실을 통함)을 보여주는 그래프이다. 야생형 HEXA 또는 PEgRNA PAM을 파괴하는 침묵 돌연변이를 함유하는 HEXA로의 교정이 제시된다. 도 43c는 G·C에서 T·A로의 전환을 통한 HEK293T 세포에서의 PRNP 내 보호 G127V 변이체의 설치를 보여주는 그래프이다. 도 43d는 K562 (백혈병성 골수 세포), U2OS (골육종 세포) 및 HeLa (자궁경부암 세포)를 포함한 다른 인간 세포주에서의 프라임 편집을 보여주는 그래프이다. 도 43e는 이중 분할-인테인 PE3 렌티바이러스 시스템을 사용한 마우스 1차 피질 뉴런의 DNMT1 내 G·C에서 T·A로의 전환 돌연변이의 설치를 보여주는 그래프이며, 여기서 N-말단 절반은 N-인테인에 및 P2A 자기-절단 펩티드를 통해 GFP-KASH에 융합된 Cas9 (1-573)이고, C-말단 절반은 PE2의 나머지에 융합된 C-인테인이다. PE2 절반은 성숙 뉴런에 고도로 특이적인 인간 시냅신 프로모터로부터 발현된다. 분류 값은 GFP-양성 핵으로부터의 편집 또는 indel을 반영하는 반면, 비분류 값은 모든 핵으로부터의 것이다. 도 43f는 HEK293T 세포 내 내인성 게놈 유전자좌에서의 PE3과 Cas9-매개 HDR의 편집 효율의 비교이다. 도 43g는 K562, U2OS 및 HeLa 세포 내 내인성 게놈 유전자좌에서의 PE3과 Cas9-매개 HDR의 편집 효율의 비교이다. 도 43h는 HEK293T, K562, U2OS 및 HeLa 세포에서의 PE3과 Cas9-매개 HDR의 indel 부산물 생성의 비교이다. 도 43i는 PE3에 의한 HEK293T 세포에서의 His6 태그 (18 bp), FLAG 에피토프 태그 (24 bp) 또는 연장된 LoxP 부위 (44 bp)의 표적화된 삽입을 보여준다. 모든 편집 수율은 모든 처리된 세포 중 의도된 편집을 함유하고 indel을 함유하지 않는 총 서열분석 판독물의 백분율을 반영한다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 44a-44g는 형광 표지된 DNA 기질을 사용한 시험관내 프라임 편집 검증 연구를 보여준다. 도 44a는 dCas9, 5'-연장된 PEgRNA 및 5'-Cy5-표지된 DNA 기질을 사용한 전기영동 이동성 변화 검정을 보여준다. PEgRNA 1 내지 5는 스페이서와 PBS 사이의 15-nt 링커 서열 (PEgRNA 1의 경우 링커 A, PEgRNA 2 내지 5의 경우 링커 B), 5-nt PBS 서열 및 7 nt (PEgRNA 1 및 2), 8 nt (PEgRNA 3), 15 nt (PEgRNA 4) 및 22 nt (PEgRNA 5)의 RT 주형을 함유한다. PEgRNA는 도 44e 및 44f에 사용된 것이고; 전체 서열은 표 2A-2C에 열거된다. 도 44b는 5'-연장된 및 3'-연장된 PEgRNA를 사용한 Cas9 H840A의 시험관내 닉킹 검정을 보여준다. 도 44c는 5'-연장된 및 3'-연장된 PEgRNA를 사용한 HEK293T 세포 내 HEK3에서의 Cas9-매개 indel 형성을 보여준다. 도 44d는 프라임 편집 시험관내 생화학적 검정의 개관을 보여준다. 5'-Cy5-표지된 사전-닉킹된 및 비-닉킹된 dsDNA 기질을 시험하였다. sgRNA, 5'-연장된 PEgRNA 또는 3'-연장된 PEgRNA를 dCas9 또는 Cas9 H840A 닉카제와 사전-복합체화한 다음, dsDNA 기질, M-MLV RT 및 dNTP와 합하였다. 반응을 37℃에서 1시간 동안 진행시킨 후, 변성 우레아 PAGE에 의해 분리하고, Cy5 형광에 의해 가시화하였다. 도 44e는 5'-연장된 PEgRNA, 사전-닉킹된 DNA 기질 및 dCas9를 사용한 프라이머 연장 반응이 RT 생성물로의 유의한 전환을 유도한다는 것을 보여준다. 도 44f는 도 44b에서와 같은 5'-연장된 PEgRNA를 비-닉킹된 DNA 기질 및 Cas9 H840A 닉카제와 함께 사용한 프라이머 연장 반응을 보여준다. 생성물 수율은 사전-닉킹된 기질과 비교하여 크게 감소된다. 도 44g는 3'-PEgRNA를 사용한 시험관내 프라이머 연장 반응이 변성 우레아 PAGE에 의해 단일 겉보기 생성물을 생성한다는 것을 보여준다. RT 생성물 밴드를 절제하고, 겔로부터 용리시킨 다음, dGTP 또는 dATP를 사용한 말단 트랜스퍼라제 (TdT)에 의한 단독중합체 테일링에 적용하였다. 테일링된 생성물을 폴리-T 또는 폴리-C 프라이머에 의해 연장시키고, 생성된 DNA를 서열분석하였다. 생어 트레이스는 gRNA 스캐폴드로부터 유래된 3개의 뉴클레오티드가 역전사되었다는 것을 나타낸다 (DNA 생성물에 최종 3' 뉴클레오티드로서 부가됨). 포유동물 세포 프라임 편집 실험에서, PEgRNA 스캐폴드 삽입은 시험관내에서보다 훨씬 더 드물며 (도 56a-56d), 이는 잠재적으로 테더링된 리버스 트랜스크립타제가 Cas9-결합된 가이드 RNA 스캐폴드에 접근할 수 없는 것 및/또는 PEgRNA 스캐폴드 서열을 함유하는 3' 플랩의 미스매칭된 3' 단부의 세포 절제에 기인한다.
도 45a-45g는 시험관내 프라임 편집 반응으로부터의 3' DNA 플랩의 효모 내 세포 복구를 보여준다. 도 45a는 이중 형광 단백질 리포터 플라스미드가 인-프레임 정지 코돈, +1 프레임시프트 또는 -1 프레임시프트를 코딩하는 표적 부위에 의해 분리된 GFP 및 mCherry 오픈 리딩 프레임을 함유한다는 것을 보여준다. 프라임 편집 반응을 Cas9 H840A 닉카제, PEgRNA, dNTP 및 M-MLV 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 시험관내에서 수행한 다음, 효모 내로 형질전환시켰다. 비편집된 플라스미드를 함유하는 콜로니는 GFP를 생산하지만, mCherry는 생산하지 않는다. 편집된 플라스미드를 함유하는 효모 콜로니는 GFP 및 mCherry 둘 다를 융합 단백질로서 생산한다. 도 45b는 GFP와 mCherry 사이에 정지 코돈을 함유하는 리포터 플라스미드 (비편집된 음성 대조군, 상단) 또는 GFP와 mCherry 사이에 정지 코돈 또는 프레임시프트를 함유하지 않는 리포터 플라스미드 (사전-편집된 양성 대조군, 하단)로 형질전환된 효모 콜로니에 대한 GFP 및 mCherry 형광의 오버레이를 보여준다. 도 45c-45f는 시험관내 프라임 편집 반응 생성물로 형질전환된 효모 콜로니로부터의 mCherry 및 GFP 형광의 가시화를 보여준다. 도 45c는 도 45d에 제시된 바와 같은 3'-연장된 PEgRNA 또는 5'-연장된 PEgRNA를 사용한 T·A에서 A·T로의 전환을 통한 정지 코돈 교정을 보여준다. 도 45e는 3'-연장된 PEgRNA를 사용한 1-bp 결실을 통한 +1 프레임시프트 교정을 보여준다. 도 45f는 3'-연장된 PEgRNA를 사용한 1-bp 삽입을 통한 -1 프레임시프트 교정을 보여준다. 도 45g는 도 45b에서의 GFP-단독 콜로니 및 도 45c에서의 GFP 및 mCherry 이중-양성 콜로니로부터 단리된 플라스미드로부터의 생어 DNA 서열분석 트레이스를 보여준다.
도 46a-46f는 PE1을 사용한 정확한 편집 대 indel 생성을 보여준다. 도 46a는 10-nt RT 주형 및 8-17 nt 범위의 PBS 서열을 함유하는 PEgRNA를 사용한 HEK3의 +1 위치에서의 PE1에 의한 T·A에서 A·T로의 전환 편집 효율 및 indel 생성을 보여준다. 도 46b는 13-nt RT 주형 및 9-17 nt 범위의 PBS 서열을 함유하는 PEgRNA를 사용한 EMX1의 +5 위치에서의 PE1에 의한 G·C에서 T·A로의 전환 편집 효율 및 indel 생성을 보여준다. 도 46c는 17-nt RT 주형 및 8-17 nt 범위의 PBS 서열을 함유하는 PEgRNA를 사용한 FANCF의 +5 위치에서의 PE1에 의한 G·C에서 T·A로의 전환 편집 효율 및 indel 생성을 보여준다. 도 46d는 11-nt RT 주형 및 9-17 nt 범위의 PBS 서열을 함유하는 PEgRNA를 사용한 RNF2의 +1 위치에서의 PE1에 의한 C·G에서 A·T로의 전환 편집 효율 및 indel 생성을 보여준다. 도 46e는 13-nt RT 주형 및 7-15 nt 범위의 PBS 서열을 함유하는 PEgRNA를 사용한 HEK4의 +2 위치에서의 PE1에 의한 G·C에서 T·A로의 전환 편집 효율 및 indel 생성을 보여준다. 도 46f는 13-nt PBS 및 10-nt RT 주형을 사용한 HEK3 부위에서의 PE1-매개 +1 T 결실, +1 A 삽입 및 +1 CTT 삽입을 보여준다. PEgRNA의 서열은 도 39c에서 사용된 것이다 (표 3A-3R 참조). 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 47a-47s는 프라임 편집을 위한 M-MLV RT 변이체의 평가를 보여준다. 도 47a는 이 도면에 사용된 프라임 편집제 변이체에 대한 약어를 보여준다. 도 47b는 HEK3 유전자좌에서 PE1에 의한 표적화된 삽입 및 결실 편집을 보여준다. 도 47c-47h는 M-MLV RT 변이체를 함유하는 18종의 프라임 편집제 구축물을 도 47c에 제시된 바와 같은 HEK3에서의 +2 G·C에서 C·G로의 전환 편집, 도 47d에 제시된 바와 같은 HEK3에서의 24-bp FLAG 삽입, 도 47e에 제시된 바와 같은 RNF2에서의 +1 C·G에서 A·T로의 전환 편집, 도 47f에 제시된 바와 같은 EMX1에서의 +1 G·C에서 C·G로의 전환 편집, 도 47g에 제시된 바와 같은 HBB에서의 +2 T·A에서 A·T로의 전환 편집 및 도 47h에 제시된 바와 같은 FANCF에서의 +1 G·C에서 C·G로의 전환 편집을 설치하는 그의 능력에 대해 비교한 것을 보여준다. 도 47i-47n은 M-MLV 변이체를 함유하는 4종의 프라임 편집제 구축물을 독립적 실험의 제2 라운드에서 도 47c-47h에 제시된 편집을 설치하는 그의 능력에 대해 비교한 것을 보여준다. 도 47o-47s는 5개의 게놈 유전자좌에서 다양한 PBS 길이를 사용한 PE2 편집 효율을 보여준다. 도 47o는 HEK3에서의 +1 T·A에서 A·T로의 변이를 보여준다. 도 47p는 EMX1에서의 +5 G·C에서 T·A로의 변이를 보여준다. 도 47q는 FANCF에서의 +5 G·C에서 T·A로의 변이를 보여준다. 도 47r은 RNF2에서의 +1 C·G에서 A·T로의 변이를 보여준다. 도 47s는 HEK4에서의 +2 G·C에서 T·A로의 변이를 보여준다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 48a-48c는 PEgRNA PBS 및 RT 주형 서열의 설계 특색을 보여준다. 도 48a는 RT 주형 길이의 함수로서 HEK293T 세포 내 VEGFA에서의 PE2-매개 +5 G·C에서 T·A로의 전환 편집 효율 (청색 선)을 보여준다. Indel (회색 선)이 비교를 위해 플롯팅되어 있다. 그래프 아래의 서열은 PEgRNA에 의한 합성을 위해 주형화된 마지막 뉴클레오티드를 보여준다. G 뉴클레오티드 (PEgRNA에서 C에 의해 주형화됨)가 강조되고; C에서 끝나는 RT 주형은 프라임 편집 효율을 최대화하기 위해 PEgRNA 설계 동안 피해야 한다. 도 48b는 도 48a에서와 같은 DNMT1에 대한 +5 G·C에서 T·A로의 전환 편집 및 indel을 보여준다. 도 48c는 도 48a에서와 같은 RUNX1에 대한 +5 G·C에서 T·A로의 전환 편집 및 indel을 보여준다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 49a-49b는 세포 생존율에 대한 PE2, PE2 R110S K103L, Cas9 H840A 닉카제 및 dCas9의 효과를 보여준다. HEK293T 세포를 HEK3-표적화 PEgRNA 플라스미드와 함께 PE2, PE2 R110S K103L, Cas9 H840A 닉카제 또는 dCas9를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포 생존율을 셀타이터-글로 2.0 검정 (프로메가(Promega))을 사용하여 3일 동안 형질감염 후 24시간마다 측정하였다. 도 49a는 형질감염 후 1, 2 또는 3일에 발광에 의해 측정된 생존율을 보여준다. 값 및 오차 막대는 각각 기술적 삼중으로 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.e.m.을 반영한다. 도 49b는 +5 G에서 A로의 편집을 코딩하는 HEK3-표적화 PEgRNA 플라스미드와 함께, PE2, PE2 R110S K103L, Cas9 H840A 닉카제 또는 dCas9에 대한 퍼센트 편집 및 indel을 보여준다. 편집 효율은 도 49a에서 생존율을 검정하는데 사용된 세포와 함께 처리된 세포로부터 형질감염 후 제3일에 측정하였다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 50a-50b는 다양한 PEgRNA에 의한 PE3-매개 HBB E6V 교정 및 HEXA 1278+TATC 교정을 보여준다. 도 50a는 PE3에 의한 HEK293T 세포에서의 HBB E6V 대립유전자의 교정에 대한 14개 PEgRNA의 스크린을 보여준다. 평가된 모든 PEgRNA는 HBB E6V 대립유전자를 임의의 침묵 PAM 돌연변이의 도입 없이 다시 야생형 HBB로 전환시킨다. 도 50b는 PE3 또는 PE3b에 의한 HEK293T 세포에서의 HEXA 1278+TATC 대립유전자의 교정에 대한 41개 PEgRNA의 스크린을 보여준다. 이들 HEXA 표지된 PEgRNA는 PAM을 파괴하고 침묵 돌연변이를 남기는 이동된 4-bp 결실에 의해 병원성 대립유전자를 교정한다. 이들 HEXA 표지된 PEgRNA는 병원성 대립유전자를 다시 야생형으로 교정한다. "b"로 끝나는 항목은 PEgRNA와 조합하여 편집-특이적 닉킹 sgRNA를 사용한다 (PE3b 시스템). 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 51a-51f는 인간 세포주에서의 PE3 활성, 및 PE3과 Cas9-개시 HDR의 비교를 나타낸다. 도 51a에 제시된 바와 같은 HEK293T 세포, 도 51b에 제시된 바와 같은 K562 세포, 도 51c에 제시된 바와 같은 U2OS 세포 및 도 51d에 제시된 바와 같은 HeLa 세포에서 PE3 및 Cas9-개시된 HDR에 대한 정확한 편집 (indel 부재) 생성 효율 및 indel 빈도. 각각의 괄호친 편집 비교는 PE3 및 Cas9-개시된 HDR에 의해 동일한 편집을 설치한다. 비-표적화 대조군은 비-표적 유전자좌를 표적화하는 PEgRNA 및 PE3이다. 도 51e는 야생형 Cas9 HDR 실험과 비교하여 비-표적화 PEgRNA+PE3 및 dCas9+sgRNA를 사용한 대조군 실험을 보여주며, 이는 겉보기 HDR 효율을 인위적으로 상승시키는 공통 오염물인 ssDNA 공여자 HDR 주형이 도 51a-51d에서의 HDR 측정치에 기여하지 않는다는 것을 확인시켜 준다. 도 51f는 PE3 또는 Cas9-개시된 HDR에 의한 편집 후 K562 세포로부터 단리된 게놈 DNA 샘플로부터의 예시 HEK3 부위 대립유전자 표를 보여준다. 대립유전자를 일루미나 MiSeq 상에서 서열분석하고, CRISPResso2178로 분석하였다. 이 영역으로부터의 참조 HEK3 서열은 상단에 있다. 비-표적화 PEgRNA 음성 대조군, PE3을 사용한 HEK3에서의 +1 CTT 삽입 및 Cas9-개시된 HDR을 사용한 HEK3에서의 +1 CTT 삽입에 대한 대립유전자 표가 제시된다. 대립유전자 빈도 및 상응하는 일루미나 서열분석 판독물 카운트가 각각의 대립유전자에 대해 제시된다. 빈도 ≥0.20%로 관찰된 모든 대립유전자가 제시된다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 52a-52d는 클린바 데이터베이스에서의 병원성 삽입, 중복, 결실 및 indel의 길이별 분포를 보여준다. 클린바 변이체 요약을 2019년 7월 15일에 NCBI로부터 다운로드하였다. 보고된 삽입, 결실 및 중복의 길이는 참조 및 대안적 대립유전자, 변이체 출발 및 정지 위치, 또는 변이체 명칭에서의 적절한 확인 정보를 사용하여 계산하였다. 상기 정보 중 어느 것도 보고하지 않은 변이체는 분석에서 제외하였다. 보고된 indel (참조 게놈에 비해 삽입 및 결실 둘 다를 포함하는 단일 변이체)의 길이는 참조와 대안적 대립유전자 사이의 최상의 쌍별 정렬에서 미스매치 또는 갭의 수를 결정함으로써 계산하였다.
도 53a-53b는 GFP-양성 세포 분류에 대한 FACS 게이팅 예를 보여준다. 하기는 HEXA 1278+TATC 및 HBB E6V HEK293T 세포주를 생성하는데 사용된 분류 전략을 약술하는 원래 배치 분석 파일의 예이다. 셀 소터 소프트웨어 v. 3.0.5를 사용하여 소니 LE-MA900 세포측정기 상에서 영상 데이터를 생성하였다. 그래픽 1은 GFP를 발현하지 않는 세포에 대한 게이팅 플롯을 보여준다. 그래픽 2는 HBB E6V HEK293T 세포주를 단리하는데 사용된 P2A-GFP-발현 세포의 예시 분류를 보여준다. HEK293T 세포를 초기에 FSC-A/BSC-A (게이트 A)를 사용하여 집단에 대해 게이팅한 다음, FSC-A/FSC-H (게이트 B)를 사용하여 싱글렛에 대해 분류하였다. 살아있는 세포를 DAPI-음성 세포의 게이팅에 의해 분류하였다 (게이트 C). 음성-대조군 세포의 경우보다 높은 GFP 형광 수준을 갖는 세포를 형광색소로서 EGFP를 사용하여 분류하였다 (게이트 D). 도 53a는 HEK293T 세포 (GFP-음성)를 보여준다. 도 53b는 PE2-P2A-GFP를 발현하는 세포에 대한 FACS 게이팅의 대표적인 플롯을 보여준다. 도 53c는 HEXA 1278+TATC 동형접합체 HEK293T 세포에 대한 유전자형을 보여준다. 도 53d는 HBB E6V 동형접합체 HEK293T 세포주에 대한 대립유전자 표를 보여준다.
도 54는 PEgRNA 클로닝 절차를 요약한 개략도이다.
도 55a-55g는 PEgRNA 설계의 개략도이다. 도 55a는 도메인이 표지된 (좌측) 및 도메인이 게놈 부위에서 nCas9에 결합된 (우측) PEgRNA의 간단한 다이어그램을 보여준다. 도 55b는 활성을 증가시킬 것으로 예상되는 PEgRNA에 대한 다양한 유형의 변형을 보여준다. 도 55c는 프로모터 선택 및 5', 3' 프로세싱 및 종결을 통해 보다 긴 RNA의 전사를 증가시키는 PEgRNA에 대한 변형을 보여준다. 도 55d는 스캐폴드 변형의 예인 P1 시스템의 연장을 보여준다. 도 55e는 주형 영역 내에 또는 PEgRNA 내의 다른 곳에 합성 변형의 혼입이 활성을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다. 도 55f는 주형 내 설계된 최소 2차 구조의 혼입이 보다 길고 보다 억제성인 2차 구조의 형성을 방지할 수 있다는 것을 보여준다. 도 55g는 PEgRNA의 3' 단부에서 RNA 요소에 의해 앵커링된 제2 주형 서열을 갖는 분할 PEgRNA를 보여준다 (좌측). PEgRNA의 5' 또는 3' 단부에의 요소의 혼입은 RT 결합을 증진시킬 수 있다.
도 56a-56d는 표적 유전자좌 내로의 PEgRNA 스캐폴드 서열의 혼입을 보여준다. HTS 데이터를 도 60a-60b에 기재된 바와 같이 PEgRNA 스캐폴드 서열 삽입에 대해 분석하였다. 도 56a는 EMX1 유전자좌에 대한 분석을 보여준다. RT 주형에 인접한 삽입 내에 1개 이상의 PEgRNA 스캐폴드 서열 뉴클레오티드를 함유하는 총 서열분석 판독물의 % (좌측); 명시된 길이의 PEgRNA 스캐폴드 서열 삽입을 함유하는 총 서열분석 판독물의 백분율 (중간); 및 X 축 상에 명시된 길이를 포함하여 그까지의 PEgRNA 삽입의 누적 총 백분율이 제시된다. 도 56b는 FANCF를 제외하고는 도 56a와 동일한 것을 보여준다. 도 56c는 HEK3을 제외하고는 도 56a에서와 동일한 것을 보여준다. 도 56d는 RNF2에 대한 것을 제외하고는 도 56a와 동일한 것을 보여준다. 값 및 오차 막대는 3개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 57a-57i는 트랜스크립톰-전반 RNA 존재비에 대한 PE2, PE2-dRT 및 Cas9 H840A 닉카제의 효과를 보여준다. PE2, PE2-dRT 또는 Cas9 H840A 닉카제 및 PRNP-표적화 또는 HEXA-표적화 PEgRNA를 발현하는 HEK293T 세포로부터 단리된, 리보솜 RNA가 고갈된, 세포 RNA의 분석. 14,410개의 유전자 및 14,368개의 유전자에 상응하는 RNA가 각각 PRNP 및 HEXA 샘플에서 검출되었다. 도 57a-57f는 (도 57a) PRNP-표적화 PEgRNA를 사용한 PE2 대 PE2-dRT, (도 57b) PRNP-표적화 PEgRNA를 사용한 PE2 대 Cas9 H840A, (도 57c) PRNP-표적화 PEgRNA를 사용한 PE2-dRT 대 Cas9 H840A, (도 57d) HEXA-표적화 PEgRNA를 사용한 PE2 대 PE2-dRT, (도 57e) HEXA-표적화 PEgRNA를 사용한 PE2 대 Cas9 H840A, (도 57f) HEXA-표적화 PEgRNA를 사용한 PE2-dRT 대 Cas9 H840A를 비교하는, 각각의 RNA에 대한 전사체 존재비의 log2-배수 변화 대 -log10 FDR-조정된 p-값을 디스플레이하는 볼케이노 플롯을 보여준다. 적색 점은 통계적으로 유의한 상대 존재비의 ≥2배 변화를 보여주는 유전자를 나타낸다 (FDR-조정된 p < 0.05). 도 57g-57i는 (도 57g) PE2 대 PE2-dRT, (도 57h) PE2 대 Cas9 H840A, 및 (도 57i) PE2-dRT 대 Cas9 H840A에 대한 PRNP 및 HEXA 샘플을 비교하는 상향조절 및 하향조절 전사체 (≥2배 변화)의 벤 다이어그램이다.
도 58은 뉴런 핵 분류에 대한 대표적인 FACS 게이팅을 보여준다. 핵을 다이사이클 루비 신호, FSC/SSC 비, SSC-폭/SSC-높이 비 및 GFP/다이사이클 비에 기초하여 순차적으로 게이팅하였다.
도 59a-59f는 골든 게이트 조립에 의해 3'-연장된 PEgRNA를 포유동물 U6 발현 벡터 내로 클로닝하기 위한 프로토콜을 보여준다. 도 59a는 클로닝 개관을 보여준다. 도 59b는 '단계 1: pU6-PEgRNA-GG-벡터 플라스미드를 소화시킨다 (성분 1)'를 보여준다. 도 59c는 '단계 2 및 3: 올리고뉴클레오티드 부분을 정렬하고 어닐링한다 (성분 2, 3 및 4)'을 보여준다. 도 59d는 '단계 2.b.ii.: sgRNA 스캐폴드 인산화 (인산화된 올리고뉴클레오티드를 구입한 경우 불필요)'를 보여준다. 도 59e는 '단계 4: PEgRNA 조립'을 보여준다. 도 59f는 '단계 5 및 6: 조립된 플라스미드의 형질전환'을 보여준다. 도 59g는 PEgRNA 클로닝 프로토콜을 요약한 다이어그램을 보여준다.
도 60a-60b는 PEgRNA 스캐폴드 통합을 정량화하기 위한 파이썬(Python) 스크립트를 보여준다. 맞춤형 파이썬 스크립트를 생성하여 표적 게놈 유전자좌에서의 PEgRNA 삽입을 특징화하고 정량화하였다. 스크립트는 참조 서열 (가이드 RNA 스캐폴드 서열)로부터 취한 증가하는 길이의 텍스트 스트링을 fastq 파일 내의 서열분석 판독물에 반복적으로 매칭시키고, 검색 질의에 매칭되는 서열분석 판독물의 수를 카운팅한다. 각각의 연속적인 텍스트 스트링은 가이드 RNA 스캐폴드 서열의 추가의 뉴클레오티드에 상응한다. 정확한 길이 적분 및 명시된 길이까지의 누적 적분을 이러한 방식으로 계산하였다. 참조 서열의 시작부에, sgRNA의 짧은 절편의 정렬 및 정확한 카운팅을 보장하기 위해 리버스 트랜스크립타제에 의해 합성된 새로운 DNA 가닥의 3' 단부의 5 내지 6개의 염기가 포함된다.
도 61은 SaCas9(N580A)-MMLV RT HEK3+6 C>A에 대해 명시된 편집을 갖는 총 서열분석 판독물의 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 정확한 편집뿐만 아니라 indel에 대한 값이 제시된다.
도 62a-62b는 프라임 편집에 의한 정확한 위치에서의 목적하는 편집의 효율적인 설치를 위한 프로토스페이서의 중요성을 보여준다. 도 62a는 다양한 HEK3 유전자좌에 대해 표적 T·A 염기 쌍이 A·T로 전환된 총 서열분석 판독물의 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 도 62b는 이를 보여주는 서열 분석이다.
도 63은 PAM 편집에서 SpCas9 PAM 변이체를 보여주는 그래프이다 (N=3). 표적화된 PAM 편집을 갖는 총 서열분석 판독물의 퍼센트가 SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT (여기서 NGA > NTA) 및 SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RT (여기서 NGCG > NTCG)에 대해 제시된다. 사용된 PEgRNA 프라이머 결합 부위 (PBS) 길이, RT 주형 (RT) 길이 및 PE 시스템이 열거된다.
도 64는 PE를 사용한 게놈 내로의 다양한 부위-특이적 레콤비나제 (SSR) 표적의 도입을 보여주는 개략도이다. (a)는 프라임 편집제에 의한 레콤비나제 표적 서열의 삽입의 일반적 개략도를 제공한다. (b)는 어떻게 PE에 의해 삽입된 단일 SSR 표적이 DNA 공여자 주형의 게놈 통합을 위한 부위로서 사용될 수 있는지를 보여준다. (c)는 어떻게 SSR 표적 부위의 탠덤 삽입이 게놈의 부분을 결실시키는데 사용될 수 있는지를 보여준다. (d)는 어떻게 SSR 표적 부위의 탠덤 삽입이 게놈의 부분을 역전시키는데 사용될 수 있는지를 보여준다. (e)는 어떻게 2개의 원위 염색체 영역에서의 2개의 SSR 표적 부위의 삽입이 염색체 전위를 유발할 수 있는지를 보여준다. (f)는 어떻게 게놈 내 2개의 상이한 SSR 표적 부위의 삽입이 DNA 공여자 주형으로부터의 카세트를 교환하는데 사용될 수 있는지를 보여준다. 추가의 세부사항에 대해서는 실시예 17을 참조한다.
도 65는 1) 인간 세포 게놈 내 SSR 표적 부위의 PE-매개 합성 및 2) GFP 발현 마커를 포함하는 DNA 공여자 주형을 통합하기 위한 상기 SSR 표적 부위의 사용을 보여준다. 성공적으로 통합되면, GFP는 세포가 형광을 발하도록 한다. 추가의 세부사항에 대해서는 실시예 17을 참조한다.
도 66은 각각의 프라임 편집제 절반 단백질의 단부 또는 시작부에 위치한 분할-인테인 절반의 자기-스플라이싱 작용을 통해 전체 프라임 편집제로서 재생하는 2개의 PE 절반 단백질로서 제공되는 프라임 편집제의 한 실시양태를 도시한다.
도 67은 폴리펩티드 서열로부터의 인테인 제거 및 N-말단과 C-말단의 엑스테인 서열 사이의 펩티드 결합의 재형성의 메카니즘을 도시한다. (a)는 각각 인테인 서열의 절반을 함유하는 2개의 절반 단백질의 일반적 메카니즘을 도시하며, 이들 단백질은 세포 내에서 접촉하는 경우에 완전-기능적 인테인을 생성하고, 이는 이어서 자기-스플라이싱 및 절제를 겪는다. 절제 과정은 N-말단 단백질 절반 (또는 "N 엑스테인")과 C-말단 단백질 절반 (또는 "C 엑스테인") 사이의 펩티드 결합의 형성을 유발하여 N 엑스테인 및 C 엑스테인 부분을 포함하는 전체 단일 폴리펩티드를 형성한다. 다양한 실시양태에서, N 엑스테인은 분할 프라임 편집제의 융합 단백질의 N-말단 절반에 상응할 수 있고, C 엑스테인은 분할 프라임 편집제의 C-말단 절반에 상응할 수 있다. (b)는 인테인 절제 및 N 엑스테인 절반 (적색 절반)과 C 엑스테인 절반 (청색 절반)을 연결하는 펩티드 결합의 재형성의 화학적 메카니즘을 보여준다. 분할 인테인 (즉, 분할 인테인 구성에서 N 인테인 및 C 인테인)의 절제는 또한 트랜스로 제공되는 2개의 개별 성분의 스플라이싱 작용을 수반하기 때문에 "트랜스 스플라이싱"으로 지칭될 수 있다.
도 68a는 링커에서의 SpPE (서열식별번호: 762)의 두 분할 인테인 절반의 전달이 HEK293T 세포 내로 공동-형질감염될 경우에 3개의 시험 유전자좌에서 활성을 유지한다는 것을 입증한다.
도 68b는 SaPE2의 두 분할 인테인 절반 (예를 들어, 서열식별번호: 443 및 서열식별번호: 450)의 전달이 HEK293T 세포 내로 공동-형질감염될 경우에 전장 SaPE2 (서열식별번호: 134)의 활성을 재현한다는 것을 입증한다. 따옴표로 표시된 잔기는 인테인 트랜스 스플라이싱 반응에 중요한 SaCas9 내 아미노산 741-743 (C-말단 엑스테인의 제1 잔기)의 서열이다. 'SMP'는 본 발명자들이 또한 'CFN' 컨센서스 스플라이싱 서열로 돌연변이시킨 천연 잔기이다. 컨센서스 서열은 프라임 편집 백분율에 의해 측정시 최고 재구성을 생성하는 것으로 제시된다.
도 68c는 다양한 개시된 PE 리보핵단백질 복합체 (고농도의 PE2, 고농도의 PE3 및 저농도의 PE3)가 이러한 방식으로 전달될 수 있다는 것을 보여주는 데이터를 제공한다.
도 69는 PANCE에서의 PE 유효성을 결정하기 위한 박테리오파지 플라크 검정을 보여준다. 플라크 (어두운 원형)는 이. 콜라이를 성공적으로 감염시킬 수 있는 파지를 나타낸다. L-람노스 농도의 증가는 PE 발현의 증가 및 플라크 형성의 증가를 유발한다. 플라크의 서열분석은 PE-설치된 게놈 편집의 존재를 밝혀내었다.
도 70a-70i는 프라임 편집을 위해 PEgRNA 및 닉킹-sgRNA를 설계하기 위한 단계별 지침의 예시로서 편집된 표적 서열의 예를 제공한다. 도 70a: 단계 1. 표적 서열 및 편집을 정의한다. 목적하는 편집 (점 돌연변이, 삽입, 결실 또는 그의 조합)의 위치 주위에 집중된 표적 DNA 영역 (~200bp)의 서열을 검색한다. 도 70b: 단계 2. 표적 PAM의 위치를 찾아낸다. 편집 위치에 근접한 PAM을 확인한다. 양쪽 가닥에서 PAM을 확실히 찾아낸다. 편집 위치에 근접한 PAM이 바람직하지만, 편집 위치로부터 ≥ 30 nt에 닉을 배치하는 PAM 및 프로토스페이서를 사용하여 편집을 설치하는 것이 가능하다. 도 70c: 단계 3. 닉 부위를 위치시킨다. 고려되는 각각의 PAM에 대해, 상응하는 닉 부위를 확인한다. Sp Cas9 H840A 닉카제의 경우, 절단은 PAM-함유 가닥에서 NGG PAM에 대해 5'의 세번째 및 네번째 염기 사이에서 일어난다. 모든 편집된 뉴클레오티드는 닉 부위의 3'에 존재해야 하고, 따라서 적절한 PAM은 PAM-함유 가닥 상의 표적 편집에 대해 5'에 닉을 배치해야 한다. 하기 제시된 예에서, 2종의 가능한 PAM이 존재한다. 단순성을 위해, 나머지 단계는 PAM 1만을 사용한 PEgRNA의 설계를 입증할 것이다. 도 70d: 단계 4. 스페이서 서열을 설계한다. Sp Cas9의 프로토스페이서는 PAM-함유 가닥 상의 NGG PAM에 대해 5'의 20개 뉴클레오티드에 상응한다. 효율적인 Pol III 전사 개시는 G가 제1 전사된 뉴클레오티드일 것을 요구한다. 프로토스페이서의 제1 뉴클레오티드가 G인 경우에, PEgRNA에 대한 스페이서 서열은 단순히 프로토스페이서 서열이다. 프로토스페이서의 제1 뉴클레오티드가 G가 아닌 경우에, PEgRNA의 스페이서 서열은 G에 이어서 프로토스페이서 서열이 후속한다. 도 70e: 단계 5. 프라이머 결합 부위 (PBS)를 설계한다. 출발 대립유전자 서열을 사용하여, PAM-함유 가닥 상의 DNA 프라이머를 확인한다. DNA 프라이머의 3' 단부는 닉 부위의 바로 상류에 있는 뉴클레오티드이다 (즉, Sp Cas9의 경우 NGG PAM에 대해 5'의 네번째 염기). PE2 및 PE3과 함께 사용하기 위한 일반적 설계 원리로서, DNA 프라이머에 대해 12 내지 13개 뉴클레오티드의 상보성을 함유하는 PEgRNA 프라이머 결합 부위 (PBS)가 ~40-60% GC 함량을 함유하는 서열에 대해 사용될 수 있다. 낮은 GC 함량을 갖는 서열의 경우에, 보다 긴 (14- 내지 15-nt) PBS가 시험되어야 한다. 보다 높은 GC 함량을 갖는 서열의 경우에, 보다 짧은 (8- 내지 11-nt) PBS가 시험되어야 한다. 최적의 PBS 서열은 GC 함량에 상관없이 실험적으로 결정되어야 한다. 길이-p PBS 서열을 설계하기 위해, 출발 대립유전자 서열을 사용하여 PAM-함유 가닥에서 닉 부위의 5'의 첫번째 p 뉴클레오티드의 역 상보체를 취한다. 도 70f: 단계 6. RT 주형을 설계한다. RT 주형은 설계된 편집 및 편집에 인접한 서열에 대한 상동성을 코딩한다. 최적의 RT 주형 길이는 표적 부위에 기초하여 달라진다. 짧은-범위 편집 (위치 +1 내지 +6)의 경우, 짧은 (9 내지 12 nt), 중간 (13 내지 16 nt), 및 긴 (17 내지 20 nt) RT 주형을 시험하는 것이 권장된다. 긴-범위 편집 (위치 +7 및 그 초과)의 경우, 충분한 3' DNA 플랩 상동성을 허용하기 위해 편집 위치를 지나 적어도 5개의 nt (바람직하게는 10개 이상의 nt) 연장된 RT 주형을 사용하는 것이 권장된다. 긴-범위 편집의 경우, 여러 RT 주형은 기능적 설계를 확인하기 위해 스크리닝되어야 한다. 보다 큰 삽입 및 결실 (≥5 nt)을 위해, RT 주형 내로의 보다 큰 3' 상동성 (~20 nt 이상)의 혼입이 권장된다. 편집 효율은 전형적으로 RT 주형이 역전사된 DNA 생성물에서 마지막 뉴클레오티드로서 G의 합성 (PEgRNA의 RT 주형에서의 C에 상응함)을 코딩하는 경우에 손상된다. 많은 RT 주형이 효율적인 프라임 편집을 지지하기 때문에, RT 주형을 설계할 때 최종 합성된 뉴클레오티드로서 G를 회피하는 것이 권장된다. 길이-r RT 주형 서열을 설계하기 위해, 목적하는 대립유전자 서열을 사용하고, 원래 PAM을 함유하는 가닥에서 닉 부위의 3'의 첫번째 r 뉴클레오티드의 역 상보체를 취한다. SNP 편집과 비교하여, 동일한 길이의 RT 주형을 사용한 삽입 또는 결실 편집은 동일한 상동성을 함유하지 않을 것임을 주목한다. 도 70g: 단계 7. 전체 PEgRNA 서열을 조립한다. PEgRNA 성분을 하기 순서 (5'에서 3')로: 스페이서, 스캐폴드, RT 주형 및 PBS로 연결한다. 도 70h: 단계 8. PE3에 대한 닉킹-sgRNA의 설계. 편집의 상류 및 하류의 비-편집된 가닥 상에서 PAM을 확인한다. 최적의 닉킹 위치는 고도로 유전자좌-의존적이고, 실험적으로 결정되어야 한다. 일반적으로, PEgRNA-유도된 닉에 걸친 위치에 대해 5'의 40 내지 90개 뉴클레오티드에 배치된 닉은 보다 높은 편집 수율 및 보다 적은 indel을 유도한다. 닉킹 sgRNA는 출발 대립유전자에서 20-nt 프로토스페이서와 매칭되는 스페이서 서열을 가지며, 여기서 프로토스페이서가 G로 시작되지 않는 경우 5'-G가 부가된다. 도 70i: 단계 9. PE3b 닉킹-sgRNA의 설계. PAM이 상보적 가닥에 존재하고 그의 상응하는 프로토스페이서가 편집을 위해 표적화된 서열과 중첩되는 경우에, 이러한 편집은 PE3b 시스템에 대한 후보일 수 있다. PE3b 시스템에서, 닉킹-sgRNA의 스페이서 서열은 출발 대립유전자가 아닌 목적하는 편집된 대립유전자의 서열과 매칭된다. PE3b 시스템은 편집된 뉴클레오티드(들)가 닉킹-sgRNA 프로토스페이서의 시드 영역 (PAM에 인접한 ~10개의 nt) 내에 속할 때 효율적으로 작동한다. 이는 편집된 가닥의 설치 후까지 상보적 가닥의 닉킹을 방지하여, 표적 DNA에의 결합에 대한 PEgRNA와 sgRNA 사이의 경쟁을 방지한다. PE3b는 또한 양쪽 가닥 상의 동시 닉의 생성을 피하고, 따라서 높은 편집 효율을 유지하면서 indel 형성을 유의하게 감소시킨다. PE3b sgRNA는 필요한 경우에 5' G를 부가하여 목적하는 대립유전자에서 20-nt 프로토스페이서와 매칭되는 스페이서 서열을 가져야 한다.
도 71a는 3' 단부에서 "UUU"로 종결되고 토루프 요소를 함유하지 않는 SpCas9 PEgRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 보여준다 (상단). 도면의 하단 부분은 동일한 SpCas9 PEgRNA 분자를 도시하지만, "UUU" 3' 단부 바로 앞에 서열 5'-"GAAANNNNN"-3'가 삽입된 토루프 요소를 함유하도록 추가로 변형된다. "N"은 임의의 핵염기일 수 있다.
도 71b는 실시예 18의 결과를 보여주며, 이는 HEK 세포 또는 EMX 세포에서의 프라임 편집의 효율이 PEgRNA 함유 토루프 요소를 사용하여 증가되는 반면, indel 형성의 퍼센트는 크게 변화되지 않는다는 것을 입증한다.
도 72는 프라임 편집에 사용될 수 있는 대안적 PEgRNA 구성을 도시한다. (a)는 프라임 편집의 PE2:PEgRNA 실시양태를 도시한다. 이러한 실시양태는 PEgRNA (도 1a-1i 및/또는 도 3a-3e에 또한 기재된 바와 같음)와 복합체화된 PE2 (Cas9 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질)를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 역전사를 위한 주형은 sgRNA 상의 3' 연장 아암 내로 혼입되어 PEgRNA를 만들고, DNA 폴리머라제 효소는 Cas9에 직접 융합된 리버스 트랜스크립타제 (RT)이다. (b)는 MS2cp-PE2:sgRNA + tPERT 실시양태를 도시한다. 이러한 실시양태는 MS2 박테리오파지 코트 단백질 (MS2cp)에 추가로 융합되어 MS2cp-PE2 융합 단백질을 형성하는 PE2 융합체 (Cas9 + 리버스 트랜스크립타제)를 포함한다. 프라임 편집을 달성하기 위해, MS2cp-PE2 융합 단백질은 복합체를 DNA 내의 특이적 표적 부위에 표적화하는 sgRNA와 복합체화된다. 이어서, 실시양태는 PEgRNA 대신에 별개의 분자 상에 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 DNA 합성 주형을 제공함으로써 작동하는 트랜스 프라임 편집 RNA 주형 ("tPERT"), 즉 MS2 압타머 (스템 루프)가 또한 장착된 tPERT의 도입을 포함한다. MS2cp 단백질은 분자의 MS2 압타머에 결합함으로써 tPERT를 동원한다. (c)는 핵산 분자의 화학적 합성에 대한 공지된 방법을 통해 달성될 수 있는 PEgRNA에 대한 대안적 설계를 도시한다. 예를 들어, 화학적 합성은 프라임 편집에 사용하기 위한 하이브리드 RNA/DNA PEgRNA 분자를 합성하는데 사용될 수 있으며, 여기서 하이브리드 PEgRNA의 연장 아암은 RNA 대신에 DNA이다. 이러한 실시양태에서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 리버스 트랜스크립타제 대신에 사용되어 프라임 편집에 의해 형성된 목적하는 유전자 변화를 포함하는 3' DNA 플랩을 합성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 연장 아암은 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)가 주형으로서 sgRNA 스캐폴드 또는 백본을 사용하는 것을 방지하는 화학적 링커를 포함하도록 합성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 연장 아암은 PEgRNA 분자의 전체 배향에 대해 역배향을 갖는 DNA 합성 주형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 5'에서 3' 배향이고 연장부가 sgRNA 스캐폴드의 3' 단부에 부착된 PEgRNA에 대해 제시된 바와 같이, DNA 합성 주형은 반대 방향, 즉 3'에서 5' 방향으로 배향된다. 이러한 실시양태는 gRNA의 3' 단부에 위치한 연장 아암을 갖는 PEgRNA 실시양태에 유리할 수 있다. 연장 아암의 배향을 역전시킴으로써, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의한 DNA 합성은 그것이 연장 아암의 새로 배향된 5'에 도달하면 종결될 것이고, 따라서 주형으로서 gRNA 코어를 사용할 위험이 없을 것이다.
도 73은 tPERT 및 MS2 동원 시스템 (일명 MS2 태그부착 기술)을 사용한 프라임 편집을 나타낸다. 프라임 편집제 단백질 (PE2)을 표적 유전자좌로 표적화하는 sgRNA는 프라이머 결합 부위 (13-nt 또는 17-nt PBS), His6 태그 삽입 및 상동성 아암을 코딩하는 RT 주형, 및 MS2 압타머 (tPERT 분자의 5' 또는 3' 단부에 위치함)를 함유하는 tPERT와 조합되어 발현된다. 프라임 편집제 단백질 (PE2) 또는 PE2의 N-말단에 대한 MS2cp의 융합체를 사용하였다. 이전에 개발된 PE3 시스템에서와 같이, 상보적-가닥 닉킹 sgRNA의 존재 또는 부재 하에 편집을 수행하였다 (x-축에서 각각 표지 "PE2+닉" 또는 "PE2"로 지정됨). 이는 또한 본원에서 "제2-가닥 닉킹"으로 지칭되고 정의된다.
도 74는 트랜스의 리버스 트랜스크립타제의 MS2 압타머 발현 및 MS2 압타머 시스템에 의한 그의 동원을 나타낸다. PEgRNA는 2개의 sgRNA 스캐폴드 헤어핀 중 하나 내로 삽입된 MS2 RNA 압타머를 함유한다. 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제는 MS2 코트 단백질 (MCP)에 대한 N-말단 또는 C-말단 융합체로서 발현된다. 편집은 HEK293T 세포 내 HEK3 부위에서 이루어진다.
도 75는 다양한 세포주에서의 상이한 표적 부위에 걸친 PE2, PE2-말단절단, PE3 및 PE3-말단절단의 효율 (즉, "명시된 편집 또는 indel을 갖는 총 서열분석 판독물의 %)을 비교하는 막대 그래프를 제공한다. 데이터는 말단절단된 RT 변이체를 포함하는 프라임 편집제가 대략 비-말단절단된 RT 단백질을 포함하는 프라임 편집제만큼 효율적이었음을 보여준다.
도 76은 실시예 20의 인테인-분할 프라임 편집제의 편집 효율을 나타낸다. HEK239T 세포를 전장 PE2 또는 인테인-분할 PE2, PEgRNA 및 닉킹 가이드 RNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 컨센서스 서열 (C 말단 엑스테인의 대부분의 아미노-말단 잔기)이 표시된다. 2개의 부위에서의 편집 퍼센트가 제시된다: HEK3 +1 CTT 삽입 및 PRNP +6 G에서 T로. n=3 독립적 형질감염을 반복한다. 실시예 20을 참조한다.
도 77은 실시예 20의 인테인-분할 프라임 편집제의 편집 효율을 나타낸다. P0 마우스에게 ICV 주사에 의해 SpPE3 절반당 5E10vg 및 소량 1E10의 핵-국재화된 GFP:KASH의 전달시 벌크 피질 및 GFP+ 하위집단에서의 표적화된 심층 서열분석에 의해 편집을 평가하였다. 편집제 및 GFP를 EFS 프로모터와 함께 AAV9에 패키징하였다. 마우스를 주사 3주 후에 수거하고, GFP+ 핵을 유동 세포측정법에 의해 단리하였다. 개별 데이터 포인트가 제시되며, 조건당 1-2마리의 마우스를 분석한 것이다. 실시예 20을 참조한다.
도 78은 실시예 20의 인테인-분할 프라임 편집제의 편집 효율을 나타낸다. 구체적으로, 본 도면은 실시예 20에서 사용된 AAV 분할-SpPE3 구축물을 도시한 것이다. SpPE3-N 및 SpPE3-C를 개별적으로 발현하는 AAV 입자에 의한 공동-형질도입은 PE3 활성을 재현한다. N-말단 게놈은 닉킹 sgRNA를 발현하는 U6-sgRNA 카세트를 함유하고, C-말단 게놈은 PEgRNA를 발현하는 U6-PEgRNA 카세트를 함유한다는 것을 주목한다. 실시예 20을 참조한다.
도 79는 실시예 21에서 논의된 바와 같은 특정의 최적화된 링커의 편집 효율을 보여준다. 특히, 데이터는 전이, 전환, 삽입 및 결실 편집을 위한 대표적인 PEgRNA에 대해 HEK3, EMX1, FANCF, RNF2 유전자좌에서, 현재 링커를 갖는 PE2 구축물 (PE2 - 백색 박스로 나타냄)의 편집 효율을 표시된 바와 같은 서열로 대체된 링커를 갖는 다양한 버전과 비교한 것을 보여준다. 대체 링커는 "1x SGGS", "2x SGGS", "3x SGGS", "1x XTEN", "링커 부재", "1x Gly", "1x Pro", "1x EAAAK", "2x EAAAK" 및 "3x EAAAK"로 지칭된다. 편집 효율은 PE2의 "대조군" 편집 효율 대비 막대 그래프 포맷으로 측정된다. PE2의 링커는 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (서열식별번호: 127)이다. 모든 편집을 PE3 시스템 (즉 이는 PE2 편집 구축물 플러스 최적의 2차 sgRNA 닉킹 가이드의 첨가를 지칭함)의 맥락에서 행하였다. 실시예 21을 참조한다.
도 80. PE2 대비 평균 배수 효능을 취하면 제시된 그래프가 산출되며, 이는 1x XTEN 링커 서열의 사용이 편집 효율을 평균 1.14배 개선시킨다는 것을 나타낸다 (n=15). 실시예 21을 참조한다.
도 81은 실시예 22에 기재된 바와 같이 상이한 프로모터로부터의 PEgRNA의 전사 수준을 도시한다.
도 82는 실시예 22에 도시된 바와 같이, 비변형된 PEgRNA 대비 PEgRNA 구조 상의 상이한 유형의 변형이 편집 효율에 대해 미치는 영향을 도시한다.
도 83은 HEK3 유전자의 표적화된 편집, 구체적으로 닉 부위에 대해 위치 +1에서의 10 nt 삽입의 삽입을 표적화하고, PE3을 사용하는 PE 실험을 도시한다. 실시예 22를 참조한다.
도 84a는 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암 (RT 주형 + 프라이머 결합 부위)을 갖는 예시적인 PEgRNA를 도시하며, 이는 PEgRNA의 3' 단부에서 UCU 링커를 통해 커플링된 tRNA 분자로 변형된다. tRNA는 다양한 전사후 변형을 포함한다. 그러나, 상기 변형은 요구되지 않는다.
도 84b는 PEgRNA 구조를 변형시키는데 사용될 수 있는 tRNA의 구조를 도시한다. 실시예 22를 참조한다. P1은 길이가 가변적일 수 있다. P1은 PEgRNA-tRNA 융합체의 RNAseP 프로세싱을 방지하는 것을 돕기 위해 연장될 수 있다.
도 85는 FANCF 유전자의 표적화된 편집, 구체적으로 닉 부위에 대해 위치 +5에서 G에서 T로의 전환을 특이적으로 표적화하고, PE3 구축물을 사용하는 PE 실험을 도시한다. 실시예 22를 참조한다.
도 86은 HEK3 유전자의 표적화된 편집, 구체적으로 닉 부위에 대해 위치 +1에서의 71 nt FLAG 태그 삽입의 삽입을 표적화하고, PE3 구축물을 사용하는 PE 실험을 도시한다. 실시예 22를 참조한다.
도 87은 pegRNA가 1412Adel을 설치한 N2A 세포에서의 스크린으로부터의 결과를 프라이머 결합 부위 (PBS) 길이 및 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 길이에 관한 세부사항과 함께 제시한다. (indel의 존재 및 부재 하에 제시됨). 실시예 23을 참조한다.
도 88은 pegRNA가 1412Adel을 설치한 N2A 세포에서의 스크린으로부터의 결과를 프라이머 결합 부위 (PBS) 길이 및 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 길이에 관한 세부사항과 함께 제시한다. (indel의 존재 및 부재 하에 제시됨). 실시예 23을 참조한다.
도 89는 pegRNA 및 닉킹 gRNA에 대한 편집제의 농도를 변화시키면서, 건강한 HSC에서 β-글로빈 유전자 내의 프록시 유전자좌 및 HEK3에서의 편집의 결과를 도시한다. 실시예 23을 참조한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 통상의 기술자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 제공한다: [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에 사용된 하기 용어는 달리 명시되지 않는 한 이들에게 부여된 의미를 갖는다.
안티센스 가닥
유전학에서, 이중 가닥 DNA 내의 절편의 "안티센스" 가닥은 주형 가닥이고, 이는 3'에서 5' 배향으로 진행하는 것으로 간주된다. 대조적으로, "센스" 가닥은 5'에서 3'로 진행하는 이중 가닥 DNA 내의 절편이며, 이는 3'에서 5'로 진행하는 DNA의 안티센스 가닥 또는 주형 가닥에 상보적이다. 단백질을 코딩하는 DNA 절편의 경우에, 센스 가닥은 mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA의 가닥이며, 이는 전사 동안 안티센스 가닥을 그의 주형으로서 취하고, 결국 (전형적으로, 항상은 아님) 단백질로의 번역을 겪는다. 따라서, 안티센스 가닥은 나중에 단백질로 번역되는 RNA를 담당하는 반면, 센스 가닥은 mRNA의 것과 거의 동일한 구성을 갖는다. dsDNA의 각각의 절편에 대해, 판독하는 방향에 따라 센스 및 안티센스의 2개의 세트가 존재할 가능성이 있다는 것 (센스 및 안티센스는 시각이 상대적이기 때문에)을 주목한다. 궁극적으로, dsDNA의 한 절편 중 어느 가닥이 센스 또는 안티센스로 지칭되는지를 좌우하는 것은 유전자 생성물 또는 mRNA이다.
이중특이적 리간드
본원에 사용된 용어 "이중특이적 리간드" 또는 "이중특이적 모이어티"는 2종의 상이한 리간드-결합 도메인에 결합하는 리간드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 소분자 화합물 또는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, 리간드-결합 도메인은 펩티드 태그로서 단백질 상에 설치될 수 있는 "이량체화 도메인"이다. 다양한 실시양태에서, 각각 동일하거나 상이한 이량체화 도메인을 포함하는 2종의 단백질은 이중특이적 리간드에 대한 각각의 이량체화 도메인의 결합을 통해 이량체화되도록 유도될 수 있다. 본원에 사용된 "이중특이적 리간드"는 동등하게 "이량체화의 화학적 유도제" 또는 "CID"를 지칭할 수 있다.
Cas9
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어, Cas9의 활성 또는 불활성 DNA 절단 도메인 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 지칭한다. 본원에 사용된 "Cas9 도메인"은 Cas9의 활성 또는 불활성 절단 도메인 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질 단편이다. "Cas9 단백질"은 전장 Cas9 단백질이다. Cas9 뉴클레아제는 또한 때때로 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)-연관 뉴클레아제로 지칭된다. CRISPR은 이동성 유전 요소 (바이러스, 전위가능 요소 및 접합 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 이전의 이동성 요소에 상보적인 서열 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사 및 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, 프리-crRNA의 정확한 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 도메인을 요구한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱을 위한 가이드로서의 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 핵산내부분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 핵산내부분해적으로 절단된 다음, 핵산외부분해적으로 3'-5' 트리밍된다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 둘 다의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 내로 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)]을 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 CRISPR 반복 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식하여 자기 대 비-자기 구별을 돕는다. Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). Cas9 오르토로그는 에스. 피오게네스(S. pyogenes) 및 에스. 써모필루스(S. thermophilus)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종에서 기재되어 있다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737]에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 DNA 절단 도메인을 부분적으로 손상 또는 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이를 포함한다.
뉴클레아제-불활성화된 Cas9 도메인은 상호교환가능하게 "dCas9" 단백질 (뉴클레아제-"기능상실" Cas9의 경우)로 지칭될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 도메인 (또는 그의 단편)을 생성하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28;152(5):1173-83] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2개의 서브도메인, 즉 HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면, RuvC1 서브도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이들 서브도메인 내의 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다 (Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)). 일부 실시양태에서, Cas9의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질은 다음 2개의 Cas9 도메인 중 하나를 포함한다: (1) Cas9의 gRNA 결합 도메인; 또는 (2) Cas9의 DNA 절단 도메인. 일부 실시양태에서, Cas9 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로 지칭된다. Cas9 변이체는 Cas9 또는 그의 단편에 대한 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas9 변이체는 야생형 Cas9 (예를 들어 서열식별번호: 18의 SpCas9)에 대해 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.8% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 야생형 Cas9 (예를 들어 서열식별번호: 18의 SpCas9)와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 서열식별번호: 18 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하여, 단편은 야생형 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 18의 SpCas9)의 상응하는 단편에 대해 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 18의 SpCas9)의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%이다.
cDNA
용어 "cDNA"는 RNA 주형으로부터 카피된 DNA의 가닥을 지칭한다. cDNA는 RNA 주형에 상보적이다.
원형 순열체
본원에 사용된 용어 "원형 순열체"는 단백질의 아미노산 서열에 나타나는 아미노산의 순서의 변화를 수반하는 단백질의 구조적 구성의 변화인 원형 순열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9)를 지칭한다. 다시 말해서, 원형 순열체는 야생형 대응물과 비교하여 N- 및 C-말단이 변경된 단백질이며, 예를 들어 단백질의 야생형 C-말단 절반이 새로운 N-말단 절반이 된다. 원형 순열 (또는 CP)은 본질적으로, 그의 서열을 상이한 위치에서 분할하여 새로운 인접한 N- 및 C-말단을 생성하면서 동시에 그의 N- 및 C-말단을 종종 펩티드 링커와 연결하는, 단백질의 1차 서열의 위상 재배열이다. 그 결과는, 상이한 연결성을 갖지만 종종 동일한 전체 유사한 3차원 (3D) 형상을 가질 수 있고, 가능하게는 감소된 단백질분해 감수성, 개선된 촉매 활성, 변경된 기질 또는 리간드 결합 및/또는 개선된 열안정성을 포함한 개선된 또는 변경된 특징을 포함할 수 있는 단백질 구조이다. 원형 순열체 단백질은 자연에서 발생할 수 있다 (예를 들어, 콘카나발린 A 및 렉틴). 추가로, 원형 순열은 번역후 변형의 결과로서 발생할 수 있거나 또는 재조합 기술을 사용하여 조작될 수 있다.
원형 순열 Cas9
용어 "원형 순열 Cas9"는 그의 N- 및 C-말단이 국소적으로 재배열된, 원형 순열체로서 발생한 임의의 Cas9 단백질 또는 그의 변이체를 지칭한다. 이러한 원형 순열 Cas9 단백질 ("CP-Cas9") 또는 그의 변이체는 가이드 RNA (gRNA)와 복합체화되는 경우 DNA에 결합하는 능력을 보유한다. 문헌 [Oakes et al., "Protein Engineering of Cas9 for enhanced function," Methods Enzymol, 2014, 546:491-511 and Oakes et al., "CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification," Cell, January 10, 2019, 176: 254-267]을 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용은 임의의 이전에 공지된 CP-Cas9를 고려하거나 또는 생성된 원형 순열 단백질이 가이드 RNA (gRNA)와 복합체화되는 경우 DNA에 결합하는 능력을 보유하는 한, 새로운 CP-Cas9를 사용한다. 예시적인 CP-Cas9 단백질은 서열식별번호: 77-86이다.
CRISPR
CRISPR은 원핵생물을 침입한 바이러스에 의한 이전 감염의 조각(snippets)을 나타내는 박테리아 및 고세균에서의 DNA 서열 (즉, CRISPR 클러스터)의 패밀리이다. DNA의 조각은 유사한 바이러스에 의한 후속 공격으로부터 DNA를 검출하고 파괴하기 위해 원핵 세포에 의해 사용되고, CRISPR-연관 단백질 (Cas9 및 그의 상동체 포함) 및 CRISPR-연관 RNA의 어레이와 함께 원핵 면역 방어 시스템을 효과적으로 구성한다. 사실상, CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사 및 프로세싱된다. 특정 유형의 CRISPR 시스템 (예를 들어, 유형 II CRISPR 시스템)에서, 프리-crRNA의 정확한 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 요구한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱을 위한 가이드로서의 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 RNA에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 핵산내부분해적으로 절단한다. 구체적으로, crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 핵산내부분해적으로 절단된 다음, 핵산외부분해적으로 3'-5' 트리밍된다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 둘 다의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 - 가이드 RNA 내로 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)]을 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 CRISPR 반복 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식하여 자기 대 비-자기 구별을 돕는다. CRISPR 생물학, 뿐만 아니라 Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). Cas9 오르토로그는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필루스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종에서 기재되어 있다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737]에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다.
특정 유형의 CRISPR 시스템 (예를 들어, 유형 II CRISPR 시스템)에서, 프리-crRNA의 정확한 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 요구한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱을 위한 가이드로서의 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 RNA에 상보적인 선형 또는 원형 핵산 표적을 핵산내부분해적으로 절단한다. 구체적으로, crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 핵산내부분해적으로 절단된 다음, 핵산외부분해적으로 3'-5' 트리밍된다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 둘 다의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 실시양태를 단일 RNA 종-가이드 RNA 내로 혼입하도록 조작될 수 있다.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자, tracr (트랜스-활성화 CRISPR) 서열 (예를 들어 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr 메이트 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복부" 및 tracrRNA-프로세싱된 부분 직접 반복부를 포괄함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭됨), 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 코딩하는 서열을 포함한, CRISPR-연관 ("Cas") 유전자의 발현에 수반되거나 또는 그의 활성을 지시하는 전사체 및 다른 요소를 집합적으로 지칭한다. 시스템의 tracrRNA는 가이드 RNA 상에 존재하는 tracr 메이트 서열에 (완전히 또는 부분적으로) 상보적이다.
DNA 합성 주형
본원에 사용된 용어 "DNA 합성 주형"은 목적하는 편집을 함유하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하기 위해 프라임 편집제의 폴리머라제에 의해 주형 가닥으로서 이용되고, 이어서 프라임 편집의 메카니즘을 통해 표적 부위에서 DNA의 상응하는 내인성 가닥을 대체하는 PEgRNA의 연장 아암의 영역 또는 부분을 지칭한다. 다양한 실시양태에서, DNA 합성 주형은 도 3a (5' 연장 아암을 포함하는 PEgRNA의 맥락에서), 도 3b (3' 연장 아암을 포함하는 PEgRNA의 맥락에서), 도 3c (내부 연장 아암의 맥락에서), 도 3d (3' 연장 아암의 맥락에서), 및 도 3e (5' 연장 아암의 맥락에서)에 제시된다. DNA 합성 주형을 포함한 연장 아암은 DNA 또는 RNA로 구성될 수 있다. RNA의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)일 수 있다. DNA의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 다양한 실시양태에서 (예를 들어, 도 3d-3e에 도시된 바와 같이), DNA 합성 주형 (4)은 "편집 주형" 및 "상동성 아암", 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 e2의 모두 또는 부분을 포함할 수 있다. 즉, e2 영역의 성질 (예를 들어, 헤어핀, 토루프 또는 스템/루프 2차 구조를 포함하는지 여부)에 따라, 폴리머라제는 또한 e2 영역 중 어느 것도 코딩하지 않을 수 있거나, 일부 또는 모두를 코딩할 수 있다. 상기 또 다른 방식으로, 3' 연장 아암의 경우에, DNA 합성 주형 (3)은 프라이머 결합 부위 (PBS)의 5' 단부로부터, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의한 DNA의 단일 가닥의 합성을 위한 주형으로서 작동할 수 있는 gRNA 코어의 3' 단부까지 걸쳐 있는 연장 아암 (3)의 부분을 포함할 수 있다. 5' 연장 아암의 경우에, DNA 합성 주형 (3)은 PEgRNA 분자의 5' 단부로부터 편집 주형의 3' 단부까지 걸쳐 있는 연장 아암 (3)의 부분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, DNA 합성 주형은 3' 연장 아암 또는 5' 연장 아암을 갖는 PEgRNA의 프라이머 결합 부위 (PBS)를 배제한다. 본원에 기재된 특정 실시양태 (예를 들어, 도 71a)는 편집 주형 및 상동성 아암을 포함하는 "RT 주형", 즉 DNA 합성 동안 주형으로서 실제로 사용되는 PEgRNA 연장 아암의 서열을 지칭한다. 용어 "RT 주형"은 용어 "DNA 합성 주형"과 동등하다.
트랜스 프라임 편집 (예를 들어, 도 3g 및 도 3h)의 경우에, 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 DNA 합성 주형은 트랜스 프라임 편집제 RNA 주형 (tPERT)으로 지칭되는 개별 분자 내로 조작될 수 있다.
이량체화 도메인
용어 "이량체화 도메인"은 이중특이적 리간드의 결합 모이어티에 결합하는 리간드-결합 도메인을 지칭한다. "제1" 이량체화 도메인은 이중특이적 리간드의 제1 결합 모이어티에 결합하고, "제2" 이량체화 도메인은 동일한 이중특이적 리간드의 제2 결합 모이어티에 결합한다. 제1 이량체화 도메인이 (예를 들어, 본원에 논의된 바와 같은 PE를 통해) 제1 단백질에 융합되고, 제2 이량체화 도메인이 (예를 들어, 본원에 논의된 바와 같은 PE를 통해) 제2 단백질에 융합되는 경우에, 제1 및 제2 단백질은 이중특이적 리간드의 존재 하에 이량체화되며, 여기서 이중특이적 리간드는 제1 이량체화 도메인에 결합하는 적어도 하나의 모이어티 및 제2 이량체화 도메인에 결합하는 적어도 또 다른 모이어티를 갖는다.
하류
본원에 사용된 용어 "상류" 및 "하류"는 5'에서 3' 방향으로 배향되는 핵산 분자 (단일 가닥이든 이중 가닥이든)에 위치한 적어도 2개의 요소의 선형 위치를 정의하는 상대성 용어이다. 특히, 제1 요소는 핵산 분자에서 제2 요소의 상류에 있으며, 여기서 제1 요소는 제2 요소에 대해 5'인 어딘가에 위치한다. 예를 들어, SNP가 닉 부위의 5' 측면 상에 있는 경우에 SNP는 Cas9-유도된 닉 부위의 상류에 있다. 반대로, 제1 요소는 핵산 분자에서 제2 요소의 하류에 있으며, 여기서 제1 요소는 제2 요소에 대해 3'인 어딘가에 위치한다. 예를 들어, SNP가 닉 부위의 3' 측면 상에 있는 경우에 SNP는 Cas9-유도된 닉 부위의 하류에 있다. 핵산 분자는 DNA (이중 또는 단일 가닥), RNA (이중 또는 단일 가닥), 또는 DNA와 RNA의 하이브리드일 수 있다. 분석은 단일 가닥 핵산 분자 및 이중 가닥 분자에 대해 동일하며, 이는 용어 상류 및 하류가 이중 가닥 분자의 어느 가닥이 고려되는지를 선택할 필요가 있다는 것을 제외하고는 핵산 분자의 단일 가닥만을 언급하기 때문이다. 종종, 적어도 2개의 요소의 위치적 상대성을 결정하는데 사용될 수 있는 이중 가닥 DNA의 가닥은 "센스" 또는 "코딩" 가닥이다. 유전학에서, "센스" 가닥은 5'에서 3'로 진행하는 이중 가닥 DNA 내의 절편이며, 이는 3'에서 5'로 진행하는 DNA의 안티센스 가닥 또는 주형 가닥에 상보적이다. 따라서, 예로서, SNP 핵염기는 SNP 핵염기가 센스 또는 코딩 가닥 상의 프로모터의 3' 측면 상에 존재하는 경우에 게놈 DNA (이중 가닥임) 내의 프로모터 서열의 "하류"에 있다.
편집 주형
용어 "편집 주형"은 폴리머라제, 예를 들어 DNA-의존성 DNA 폴리머라제, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 합성된 단일 가닥 3' DNA 플랩에서 목적하는 편집을 코딩하는 연장 아암의 부분을 지칭한다. 본원에 기재된 특정 실시양태 (예를 들어, 도 71a)는 편집 주형 및 상동성 아암 둘 다를 함께 지칭하는 "RT 주형", 즉 DNA 합성 동안 주형으로서 실제로 사용되는 PEgRNA 연장 아암의 서열을 지칭한다. 용어 "RT 편집 주형"은 또한 용어 "DNA 합성 주형"과 동등하지만, 여기서 RT 편집 주형은 리버스 트랜스크립타제인 폴리머라제를 갖는 프라임 편집제의 사용을 반영하고, DNA 합성 주형은 임의의 폴리머라제를 갖는 프라임 편집제의 사용을 보다 광범위하게 반영한다.
유효량
본원에 사용된 용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 도출하기에 충분한 생물학적 활성제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 프라임 편집제 (PE)의 유효량은 표적 부위 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 게놈을 편집하기에 충분한 편집제의 양을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 프라임 편집제 (PE), 예를 들어 닉카제 Cas9 도메인 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질의 유효량은 융합 단백질에 의해 특이적으로 결합되고 편집되는 표적 부위의 편집을 유도하기에 충분한 융합 단백질의 양을 지칭할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 작용제, 예를 들어 융합 단백질, 뉴클레아제, 하이브리드 단백질, 단백질 이량체, 단백질 (또는 단백질 이량체) 및 폴리뉴클레오티드의 복합체, 또는 폴리뉴클레오티드의 유효량은 다양한 인자, 예를 들어 목적하는 생물학적 반응, 예를 들어 편집될 특정 대립유전자, 게놈 또는 표적 부위, 표적화될 세포 또는 조직, 및 사용될 작용제에 따라 달라질 수 있다.
오류-유발 리버스 트랜스크립타제
본원에 사용된 용어 "오류-유발" 리버스 트랜스크립타제 (또는 보다 넓게는, 임의의 폴리머라제)는 자연 발생하거나 또는 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 오류율보다 더 적은 오류율을 갖는 또 다른 리버스 트랜스크립타제 (예를 들어, 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제)로부터 유래된 리버스 트랜스크립타제 (또는 보다 넓게는, 임의의 폴리머라제)를 지칭한다. 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 오류율은 15,000 (더 높음) 내지 27,000개 (더 낮음)에서 1개의 오류 범위인 것으로 보고되어 있다. 15,000개 중 1개의 오류율은 6.7 x 10-5의 오류율에 상응한다. 27,000개 중 1개의 오류율은 3.7 x 10-5의 오류율에 상응한다. 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Boutabout et al. (2001) "DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1," Nucleic Acids Res 29(11):2217-2222]을 참조한다. 따라서, 본 출원의 목적상, 용어 "오류 유발"은 15,000개 핵염기 혼입에서 1개의 오류 초과 (6.7 x 10-5 이상), 예를 들어 14,000개 핵염기에서 1개의 오류 (7.14 x 10-5 이상), 13,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (7.7 x 10-5 이상), 12,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (7.7 x 10-5 이상), 11,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (9.1 x 10-5 이상), 10,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (1 x 10-4 또는 0.0001 이상), 9,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00011 이상), 8,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00013 이상), 7,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00014 이상), 6,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00016 이상), 5,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.0002 이상), 4,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00025 이상), 3,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00033 이상), 2,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00050 이상), 또는 1,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.001 이상), 또는 500개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.002 이상), 또는 250개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.004 이상)인 오류율을 갖는 RT를 지칭한다.
엑스테인
본원에 사용된 용어 "엑스테인"은 인테인이 플랭킹되어 있는 폴리펩티드 서열을 지칭하고, 단백질 스플라이싱 과정 동안 또 다른 엑스테인에 라이게이션되어 성숙한 스플라이싱된 단백질을 형성한다. 전형적으로, 인테인은 인테인이 그 자신의 절제를 촉매할 때 함께 라이게이션되는 2개의 엑스테인 서열이 플랭킹되어 있다. 따라서, 엑스테인은 mRNA에서 발견되는 엑손과 유사한 단백질이다. 예를 들어, 인테인을 포함하는 폴리펩티드는 구조 엑스테인(N) - 인테인 - 엑스테인(C)의 것일 수 있다. 인테인의 절제 및 2개의 엑스테인의 스플라이싱 후, 생성된 구조는 엑스테인(N) - 엑스테인(C) 및 유리 인테인이다. 다양한 구성에서, 엑스테인은 각각 분할-인테인에 융합된 별개의 단백질 (예를 들어, Cas9 또는 PE 융합 단백질의 절반)일 수 있으며, 여기서 분할 인테인의 절제는 엑스테인 서열들이 함께 스플라이싱되도록 유발한다.
연장 아암
용어 "연장 아암"은 리버스 트랜스크립타제에 대한 프라이머 결합 부위 및 편집 주형을 포함한, 여러 기능을 제공하는 PEgRNA의 뉴클레오티드 서열 성분을 지칭한다. 일부 실시양태, 예를 들어 도 3d에서, 연장 아암은 가이드 RNA의 3' 단부에 위치한다. 다른 실시양태, 예를 들어 도 3e에서, 연장 아암은 가이드 RNA의 5' 단부에 위치한다. 일부 실시양태에서, 연장 아암은 또한 상동성 아암을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 연장 아암은 하기 성분을 5'에서 3' 방향으로 포함한다: 상동성 아암, 편집 주형 및 프라이머 결합 부위. 리버스 트랜스크립타제의 중합 활성이 5'에서 3' 방향으로 존재하기 때문에, 상동성 아암, 편집 주형 및 프라이머 결합 부위의 바람직한 배열은 5'에서 3' 방향으로 존재하여, 리버스 트랜스크립타제가 어닐링된 프라이머 서열에 의해 프라이밍되면, 상보적 주형 가닥으로서 편집 주형을 사용하여 DNA의 단일 가닥을 중합시킨다. 추가의 세부사항, 예컨대 연장 아암의 길이는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
연장 아암은 또한, 예를 들어 도 3g (상단)에 제시된 바와 같이, 일반적으로 2개의 영역: 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 DNA 합성 주형을 포함하는 것으로 기재될 수 있다. 프라이머 결합 부위는 프라임 편집제 복합체에 의해 닉킹될 때 표적 부위의 내인성 DNA 가닥으로부터 형성된 프라이머 서열에 결합하여, 내인성 닉킹된 가닥 상의 3' 단부를 노출시킨다. 본원에 설명된 바와 같이, PEgRNA의 연장 아암 상의 프라이머 결합 부위에 대한 프라이머 서열의 결합은 노출된 3' 단부 (즉, 프라이머 서열의 3')를 갖는 듀플렉스 영역을 생성하고, 이는 이어서 폴리머라제가 DNA 합성 주형의 길이를 따라 노출된 3' 단부로부터 DNA의 단일 가닥을 중합시키기 시작하기 위한 기질을 제공한다. 단일 가닥 DNA 생성물의 서열은 DNA 합성 주형의 상보체이다. 중합은 중합이 종결될 때까지 DNA 합성 주형 (또는 연장 아암)의 5'를 향해 계속된다. 따라서, DNA 합성 주형은 프라임 편집제 복합체의 폴리머라제에 의해 단일 가닥 DNA 생성물 (즉, 목적하는 유전자 편집 정보를 함유하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩)로 코딩되고 궁극적으로 PE-유도된 닉 부위의 바로 하류에 위치하는 표적 부위의 상응하는 내인성 DNA 가닥을 대체하는 연장 아암의 부분을 나타낸다. 이론에 얽매이지는 않지만, DNA 합성 주형의 중합은 종결 사건까지 연장 아암의 5' 단부를 향해 계속된다. 중합은 (a) PEgRNA의 5' 말단에 도달하는 것 (예를 들어, DNA 폴리머라제가 단순히 주형으로부터 진행하는 5' 연장 아암의 경우), (b) 통과할 수 없는 RNA 2차 구조 (예를 들어, 헤어핀 또는 스템/루프)에 도달하는 것, 또는 (c) 복제 종결 신호, 예를 들어 폴리머라제를 차단 또는 억제하는 특이적 뉴클레오티드 서열, 또는 핵산 위상 신호, 예컨대 슈퍼코일드 DNA 또는 RNA에 도달하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방식으로 종결될 수 있다.
플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)
본원에 사용된 용어 "플랩 엔도뉴클레아제"는 5' 단일 가닥 DNA 플랩의 제거를 촉매하는 효소를 지칭한다. 이들은 DNA 복제를 비롯한 세포 과정 동안 형성된 5' 플랩의 제거를 프로세싱하는 자연 발생 효소이다. 본원에 기재된 프라임 편집 방법은 프라임 편집 동안 표적 부위에 형성된 내인성 DNA의 5' 플랩을 제거하기 위해 내인성으로 공급된 플랩 엔도뉴클레아제 또는 트랜스로 제공된 것을 이용할 수 있다. 플랩 엔도뉴클레아제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Patel et al., "Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends," Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519, Tsutakawa et al., "Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily," Cell, 2011, 145(2): 198-211, 및 Balakrishnan et al., "Flap Endonuclease 1," Annu Rev Biochem, 2013, Vol 82: 119-138] (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 발견될 수 있다. 예시적인 플랩 엔도뉴클레아제는 하기 아미노산 서열로 나타내어질 수 있는 FEN1이다:
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기능적 등가물
용어 "기능적 등가물"은 제1 생체분자와 기능상 등가이지만 구조상 반드시 등가인 것은 아닌 제2 생체분자를 지칭한다. 예를 들어, "Cas9 등가물"은 Cas9와 동일하거나 실질적으로 동일한 기능을 갖지만 반드시 동일한 아미노산 서열을 갖는 것은 아닌 단백질을 지칭한다. 본 개시내용의 문맥에서, 본 명세서는 전반에 걸쳐 "단백질 X 또는 그의 기능적 등가물"을 언급한다. 이러한 문맥에서, 단백질 X의 "기능적 등가물"은 등가의 기능을 보유하는 단백질 X의 임의의 상동체, 파라로그, 단편, 자연 발생, 조작된, 돌연변이된 또는 합성 버전을 포괄한다.
융합 단백질
본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 적어도 2종의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드를 지칭한다. 1종의 단백질은 융합 단백질의 아미노-말단 (N-말단) 부분에 또는 카르복시-말단 (C-말단) 단백질에 위치하며, 따라서 각각 "아미노-말단 융합 단백질" 또는 "카르복시-말단 융합 단백질"을 형성할 수 있다. 단백질은 상이한 도메인, 예를 들어 핵산 결합 도메인 (예를 들어, 표적 부위에 대한 단백질의 결합을 지시하는 Cas9의 gRNA 결합 도메인) 및 핵산 절단 도메인 또는 핵산 편집 단백질의 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 예는 리버스 트랜스크립타제에 대한 Cas9 또는 그의 등가물을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생산될 수 있으며, 이는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질에 특히 적합하다. 재조합 단백질 발현 및 정제를 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 기재된 것을 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
관심 유전자 (GOI)
용어 "관심 유전자" 또는 "GOI"는 관심 생체분자 (예를 들어, 단백질 또는 RNA 분자)를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 관심 단백질은 임의의 세포내 단백질, 막 단백질 또는 세포외 단백질, 예를 들어 핵 단백질, 전사 인자, 핵 막 수송체, 세포내 소기관 연관 단백질, 막 수용체, 촉매 단백질 및 효소, 치료 단백질, 막 단백질, 막 수송 단백질, 신호 전달 단백질 또는 면역학적 단백질 (예를 들어, IgG 또는 다른 항체 단백질) 등을 포함할 수 있다. 관심 유전자는 또한 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 안티센스 RNA, 가이드 RNA, 마이크로RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA) 및 세포-유리 RNA (cfRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 RNA 분자를 코딩할 수 있다.
가이드 RNA ("gRNA")
본원에 사용된 용어 "가이드 RNA"는 대부분 통상적으로 CRISPR-Cas9의 Cas 단백질과 회합되고 Cas9와 회합되어, Cas9 단백질을 가이드 RNA의 프로토스페이서 서열에 대한 상보성을 포함하는 DNA 분자 내의 특이적 서열로 지시하는 가이드 핵산의 특정한 유형이다. 그러나, 이 용어는 또한 자연 발생이든 비-자연 발생이든 (예를 들어, 조작된 것이든 재조합이든), Cas9 등가물, 상동체, 오르토로그 또는 파라로그와 회합하고, 달리 Cas9 등가물을 특이적 표적 뉴클레오티드 서열에 국재화하도록 프로그램화하는 등가의 가이드 핵산 분자를 포괄한다. Cas9 등가물은 Cpf1 (유형-V CRISPR-Cas 시스템), C2c1 (유형 V CRISPR-Cas 시스템), C2c2 (유형 VI CRISPR-Cas 시스템) 및 C2c3 (유형 V CRISPR-Cas 시스템)을 포함한 임의의 유형의 CRISPR 시스템 (예를 들어, 유형 II, V, VI)으로부터의 다른 napDNAbp를 포함할 수 있다. 추가의 Cas-등가물은 문헌 [Makarova et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector," Science 2016; 353(6299)]에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 가이드 RNA의 예시적인 서열 및 구조가 본원에 제공된다. 추가로, 적절한 가이드 RNA 서열을 설계하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 사용된 "가이드 RNA"는 또한 본원에 개시된 프라임 편집 방법 및 조성물에 대해 발명된 "프라임 편집 가이드 RNA" (또는 "PEgRNA")로 지칭되는 변형된 형태의 가이드 RNA와 대조되도록 "전통적인 가이드 RNA"로 지칭될 수 있다.
가이드 RNA 또는 PEgRNA는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 구조적 요소를 포함할 수 있다:
스페이서 서열 - 표적 DNA 내의 프로토스페이서에 결합하는 가이드 RNA 또는 PEgRNA 내의 서열 (약 20개 nt 길이를 가짐).
gRNA 코어 (또는 gRNA 스캐폴드 또는 백본 서열) - Cas9 결합을 담당하는 gRNA 내의 서열을 지칭하며, 이는 Cas9를 표적 DNA로 가이드하는데 사용되는 20 bp 스페이서/표적화 서열을 포함하지 않음.
연장 아암 - 프라이머 결합 부위 및 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 통해 관심 유전적 변화를 함유하는 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하는 DNA 합성 주형 서열을 포함하는, PEgRNA의 3' 단부 또는 5' 단부에서의 단일 가닥 연장부, 이는 이어서 상응하는 내인성 가닥을 대체함으로써 내인성 DNA 내로 통합되어, 목적하는 유전적 변화를 설치함.
전사 종결인자 - 가이드 RNA 또는 PEgRNA는 분자의 3'에 전사 종결 서열을 포함할 수 있음.
상동성 아암
용어 "상동성 아암"은 내인성 가닥을 대체함으로써 표적 DNA 부위 내로 통합될, 생성된 리버스 트랜스크립타제-코딩된 단일 가닥 DNA 플랩의 부분을 코딩하는 연장 아암의 부분을 지칭한다. 상동성 아암에 의해 코딩되는 단일 가닥 DNA 플랩의 부분은 표적 DNA 서열의 비-편집된 가닥에 상보적이며, 이는 내인성 가닥의 대체 및 그 자리에서의 단일 가닥 DNA 플랩의 어닐링을 용이하게 함으로써, 편집을 설치한다. 이 성분은 다른 곳에 추가로 정의된다. 상동성 아암은 정의에 의해 본원에 기재된 프라임 편집제의 폴리머라제에 의해 코딩되기 때문에 DNA 합성 주형의 일부이다.
숙주 세포
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본원에 기재된 벡터, 예를 들어 Cas9 또는 Cas9 등가물 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 숙주로서 받고, 복제하고, 발현할 수 있는 세포를 지칭한다.
인테인
본원에 사용된 용어 "인테인"은 모든 생물 도메인으로부터의 유기체에서 발견되는 자가-프로세싱 폴리펩티드 도메인을 지칭한다. 인테인 (개재 단백질)은 단백질 스플라이싱으로 공지된 고유한 자가-프로세싱 사건을 수행하며, 여기서 이는 2개의 펩티드 결합의 절단을 통해 더 큰 전구체 폴리펩티드로부터 그 자신을 절제하고, 이 과정에서 새로운 펩티드 결합의 형성을 통해 플랭킹되어 있는 엑스테인 (외부 단백질) 서열을 라이게이션한다. 이러한 재배열은 인테인 유전자가 다른 단백질-코딩 유전자 내에 인 프레임으로 포매되어 발견되기 때문에 번역후에 (또는 가능하게는 공동-번역으로) 일어난다. 또한, 인테인-매개된 단백질 스플라이싱은 자발적이고; 이는 외부 인자 또는 에너지 공급원을 필요로 하지 않으며, 단지 인테인 도메인의 폴딩만을 필요로 한다. 이 과정은 또한 시스-단백질 스플라이싱으로도 공지되어 있으며, 이는 "분할 인테인"에 의한 트랜스-단백질 스플라이싱의 자연적 과정과 대조된다. 인테인은 엑스테인으로 공지된 플랭킹 단백질 서열이 공동 융합된 전구체 단백질로부터 그 자신의 절제를 촉매하는 자기-스플라이싱 RNA 인트론과 등가인 단백질이다 (문헌 [Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127 (1994)] 참조) (문헌 [Perler et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1:292-299 (1997); Perler, F. B. Cell 92(1):1-4 (1998); Xu et al., EMBO J. 15(19):5146-5153 (1996)]에서 검토됨).
본원에 사용된 용어 "단백질 스플라이싱"은 전구체 단백질의 내부 영역 (인테인)이 절제되고 단백질의 플랭킹 영역 (엑스테인)이 라이게이션되어 성숙 단백질을 형성하는 과정을 지칭한다. 이러한 자연적 과정은 원핵생물 및 진핵생물 둘 다로부터의 수많은 단백질에서 관찰되었다 (Perler, F. B., Xu, M. Q., Paulus, H. Current Opinion in Chemical Biology 1997, 1, 292-299; Perler, F. B. Nucleic Acids Research 1999, 27, 346-347). 인테인 유닛은 단백질 스플라이싱을 촉매하는데 필요한 필수 성분을 함유하고, 종종 인테인 이동성에 참여하는 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다 (Perler, F. B., Davis, E. O., Dean, G. E., Gimble, F. S., Jack, W. E., Neff, N., Noren, C. J., Thomer, J., Belfort, M. Nucleic Acids Research 1994, 22, 1127-1127). 그러나, 생성된 단백질은 연결되지만, 별개의 단백질로서 발현되지 않는다. 단백질 스플라이싱은 또한 트랜스로 수행되어, 별개의 폴리펩티드 상에 발현된 분할 인테인이 자발적으로 조합되어 단일 인테인을 형성한 다음, 단백질 스플라이싱 과정을 겪어 별개의 단백질에 연결될 수 있다.
단백질 스플라이싱 메카니즘의 설명은 다수의 인테인-기반 적용으로 이어졌다 (미국 특허 번호 5,496,714 (Comb, et al.); 미국 특허 번호 5,834,247 (Comb, et al.); 문헌 [Camarero and Muir, J. Amer. Chem. Soc., 121:5597-5598 (1999); Chong, et al., Gene, 192:271-281 (1997), Chong, et al., Nucleic Acids Res., 26:5109-5115 (1998); Chong, et al., J. Biol. Chem., 273:10567-10577 (1998); Cotton, et al. J. Am. Chem. Soc., 121:1100-1101 (1999); Evans, et al., J. Biol. Chem., 274:18359-18363 (1999); Evans, et al., J. Biol. Chem., 274:3923-3926 (1999); Evans, et al., Protein Sci., 7:2256-2264 (1998); Evans, et al., J. Biol. Chem., 275:9091-9094 (2000); Iwai and Pluckthun, FEBS Lett. 459:166-172 (1999); Mathys, et al., Gene, 231:1-13 (1999); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548 (1998); Muir, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710 (1998); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999); Severinov and Muir, J. Biol. Chem., 273:16205-16209 (1998); Shingledecker, et al., Gene, 207:187-195 (1998); Southworth, et al., EMBO J. 17:918-926 (1998); Southworth, et al., Biotechniques, 27:110-120 (1999); Wood, et al., Nat. Biotechnol., 17:889-892 (1999); Wu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9226-9231 (1998a); Wu, et al., Biochim Biophys Acta 1387:422-432 (1998b); Xu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388-393 (1999); Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc., 120:5591-5592 (1998)). 각각의 참고문헌은 본원에 참조로 포함된다.
리간드-의존성 인테인
본원에 사용된 용어 "리간드-의존성 인테인"은 리간드-결합 도메인을 포함하는 인테인을 지칭한다. 전형적으로, 리간드-결합 도메인은 인테인의 아미노산 서열 내로 삽입되어, 구조 인테인 (N) - 리간드-결합 도메인 - 인테인 (C)을 생성한다. 전형적으로, 리간드-의존성 인테인은 적절한 리간드의 부재 하에 단백질 스플라이싱 활성을 전혀 나타내지 않거나 단지 최소로만 나타내고, 리간드의 존재 하에 단백질 스플라이싱 활성의 현저한 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리간드-의존성 인테인은 리간드의 부재 하에 관찰가능한 스플라이싱 활성을 나타내지 않지만, 리간드의 존재 하에 스플라이싱 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리간드-의존성 인테인은 리간드의 부재 하에 관찰가능한 단백질 스플라이싱 활성을 나타내고, 적절한 리간드의 존재 하에서, 리간드의 부재 하에 관찰된 활성보다 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 150배, 적어도 200배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 1000배, 적어도 1500배, 적어도 2000배, 적어도 2500배, 적어도 5000배, 적어도 10000배, 적어도 20000배, 적어도 25000배, 적어도 50000배, 적어도 100000배, 적어도 500000배 또는 적어도 1000000배 더 큰 단백질 스플라이싱 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 활성의 증가는 적어도 1 자릿수, 적어도 2 자릿수, 적어도 3 자릿수, 적어도 4 자릿수 또는 적어도 5 자릿수에 걸쳐 용량 의존성이며, 이는 리간드의 농도를 조정함으로써 인테인 활성의 미세-조정을 가능하게 한다. 적합한 리간드-의존성 인테인은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 하기 제공된 것 및 공개된 미국 특허 출원 U.S. 2014/0065711 A1; 문헌 [Mootz et al., "Protein splicing triggered by a small molecule." J. Am. Chem. Soc. 2002; 124, 9044-9045; Mootz et al., "Conditional protein splicing: a new tool to control protein structure and function in vitro and in vivo." J. Am. Chem. Soc. 2003; 125, 10561-10569; Buskirk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101, 10505-10510); Skretas & Wood, "Regulation of protein activity with small-molecule-controlled inteins." Protein Sci. 2005; 14, 523-532; Schwartz, et al., "Post-translational enzyme activation in an animal via optimized conditional protein splicing." Nat. Chem. Biol. 2007; 3, 50-54; Peck et al., Chem. Biol. 2011; 18 (5), 619-630] (각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 예시적인 서열은 하기와 같다:
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링커
본원에 사용된 용어 "링커"는 2개의 다른 분자 또는 모이어티를 연결하는 분자를 지칭한다. 링커는 2개의 융합 단백질을 연결하는 링커의 경우에 아미노산 서열일 수 있다. 예를 들어, Cas9는 아미노산 링커 서열에 의해 리버스 트랜스크립타제에 융합될 수 있다. 링커는 또한 2개의 뉴클레오티드 서열을 함께 연결하는 경우에 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 본 경우에, 전통적인 가이드 RNA는 RT 주형 서열 및 RT 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 프라임 편집 가이드 RNA의 RNA 연장부에 스페이서 또는 링커 뉴클레오티드 서열을 통해 연결된다. 다른 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 보다 긴 또는 보다 짧은 링커가 또한 고려된다.
단리된
"단리된"은 자연 상태로부터 변경 또는 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나 또는 비-천연 환경, 예컨대, 예를 들어 숙주 세포에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 단리된 핵산에 의해 코딩된다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 그의 원래 또는 천연 환경 (예를 들어, 자연 발생인 경우에 자연 환경)으로부터 제거되는 본원에 제공된 바와 같은 물질의 특징을 지칭한다. 따라서, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계 내 공존 물질의 일부 또는 모두로부터 인간 개입에 의해 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 따라서, 인공 또는 조작된 물질, 예를 들어 비-자연 발생 핵산 구축물, 예컨대 본원에 기재된 발현 구축물 및 벡터는 또한 단리된 것으로 지칭된다. 물질은 단리되기 위해 정제될 필요는 없다. 따라서, 물질은 벡터의 일부 및/또는 조성물의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물은 사실상 물질이 발견된 환경의 일부가 아니라는 점에서 상기 물질은 여전히 단리된 것일 수 있다.
MS2 태그부착 기술
다양한 실시양태에서 (예를 들어, 도 72-73의 실시양태 및 실시예 19에 도시된 바와 같음), 용어 "MS2 태그부착 기술"은 RNA-단백질 상호작용 도메인, 예를 들어 특이적 헤어핀 구조를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 RNA-결합 단백질과 쌍형성된 "RNA-단백질 상호작용 도메인" (일명 "RNA-단백질 동원 도메인 또는 단백질"로도 공지됨)의 조합을 지칭한다. 이들 유형의 시스템은 표적 부위에 결합된 프라임 편집제 복합체에 다양한 기능성을 동원하기 위해 활용될 수 있다. MS2 태그부착 기술은 MS2 박테리오파지 코트 단백질 ("MCP" 또는 "MS2cp")과 파지의 게놈에 존재하는 스템-루프 또는 헤어핀 구조, 즉 "MS2 헤어핀"의 자연적 상호작용에 기초한다. 프라임 편집의 경우에, MS2 태그부착 기술은 MS2 헤어핀을 프라임 편집에 수반되는 목적하는 RNA 분자 (예를 들어, PEgRNA 또는 tPERT) 내로 도입하는 것을 포함하며, 이는 이어서 그 구조를 인식하고 그에 결합하는 RNA-결합 단백질에 대한 특이적 상호작용가능한 결합 표적을 구성한다. MS2 헤어핀의 경우에, 이는 MS2 박테리오파지 코트 단백질 (MCP)에 의해 인식되고 결합된다. 그리고, MCP가 또 다른 단백질 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제 또는 다른 DNA 폴리머라제)에 융합되면, MS2 헤어핀은 프라임 편집 복합체에 의해 점유된 표적 부위에 트랜스로 그 다른 단백질을 "동원"하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 프라임 편집제는 관심있는 특이적 기능을 프라임 편집제 복합체로 동원하거나 또는 "공동-국재화"하기 위한 임의의 공지된 RNA-단백질 상호작용 도메인을 한 측면으로서 혼입할 수 있다. 다른 모듈 RNA-단백질 상호작용 도메인의 검토는 관련 기술분야에, 예를 들어 문헌 [Johansson et al., "RNA recognition by the MS2 phage coat protein," Sem Virol., 1997, Vol. 8 (3): 176-185; Delebecque et al., "Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies," Science, 2011, Vol. 333:470-474; Mali et al., "Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering," Nat. Biotechnol., 2013, Vol.31: 833-838; 및 Zalatan et al., "Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds," Cell, 2015, Vol.160: 339-350]에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다른 시스템은 PCP 단백질을 특이적으로 동원하는 PP7 헤어핀 및 Com 단백질을 특이적으로 동원하는 "com" 헤어핀을 포함한다. 문헌 [Zalatan et al.]을 참조한다.
MS2 헤어핀 (또는 동등하게 "MS2 압타머"로 지칭됨)의 뉴클레오티드 서열은 GCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCC (서열식별번호: 763)이다.
MCP 또는 MS2cp의 아미노산 서열은 GSASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGEELPVAGWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY (서열식별번호: 764)이다.
MS2 헤어핀 (또는 "MS2 압타머")은 또한 "RNA 이펙터 동원 도메인"의 한 유형 (또는 동등하게 "RNA-결합 단백질 동원 도메인" 또는 간단히 "동원 도메인")으로서 지칭될 수 있으며, 이는 그것이 PEgRNA 또는 tPERT 내로 설치되는 물리적 구조 (예를 들어, 헤어핀)로, 다른 이펙터 기능 (예를 들어, 다양한 기능을 갖는 RNA-결합 단백질, 예컨대 DNA 폴리머라제 또는 다른 DNA-변형 효소)을 이와 같이 변형된 PEgRNA 또는 rPERT로 효과적으로 동원하고, 이에 따라 이펙터 기능을 프라임 편집 기구에 트랜스로 공동-국재화하기 때문이다. 본 출원은 어떠한 방식으로도 임의의 특정한 RNA 이펙터 동원 도메인에 제한되는 것으로 의도되지 않으며, MS2 헤어핀을 포함한 임의의 이용가능한 이러한 도메인을 포함할 수 있다. 실시예 19 및 도 72(b)는 DNA 합성 도메인 (즉, tPERT 분자) 및 PE2에 융합된 MS2cp 단백질을 포함하는 프라임 편집제에 연결된 MS2 압타머의 사용으로 표적 DNA 부위에 결합된 프라임 편집제 복합체 (MS2cp-PE2:sgRNA 복합체) 및 tPERT 분자의 DNA 합성 도메인의 공동-국재화를 유발하는 것을 도시한다.
napDNAbp
본원에 사용된 용어 "핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질" 또는 "napDNAbp" (Cas9가 한 예임)는 RNA:DNA 혼성화를 사용하여 DNA 분자 내의 특이적 서열을 표적화하고 그에 결합하는 단백질을 지칭한다. 각각의 napDNAbp는 적어도 1개의 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)과 회합되며, 이는 napDNAbp를 가이드 핵산 또는 그의 부분 (예를 들어, 가이드 RNA의 프로토스페이서)에 상보적인 DNA 가닥 (즉, 표적 가닥)을 포함하는 DNA 서열에 국재화시킨다. 다시 말해서, 가이드 핵산은 napDNAbp (예를 들어, Cas9 또는 등가물)를 상보적 서열에 국재화시키고 결합하도록 "프로그램화한다".
이론에 얽매이지는 않지만, napDNAbp - 가이드 RNA 복합체의 결합 메카니즘은 일반적으로 R-루프를 형성하여 napDNAbp가 이중 가닥 DNA 표적의 풀림을 유도하고, 그에 의해 napDNAbp에 의해 결합된 영역에서 가닥을 분리하는 단계를 포함한다. 이어서, 가이드 RNA 프로토스페이서는 "표적 가닥"에 혼성화된다. 이는 표적 가닥에 상보적인 "비-표적 가닥"을 대체하여, R-루프의 단일 가닥 영역을 형성한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 1개 이상의 뉴클레아제 활성을 포함하며, 이는 이어서 DNA를 절단하여 다양한 유형의 병변을 남긴다. 예를 들어, napDNAbp는 제1 위치에서 비-표적 가닥을 절단하고/거나 제2 위치에서 표적 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 활성에 따라, 표적 DNA는 절단되어 "이중 가닥 파괴"를 형성할 수 있고, 이에 의해 양쪽 가닥이 절단된다. 다른 실시양태에서, 표적 DNA는 단일 부위에서만 절단될 수 있고, 즉 DNA는 1개의 가닥 상에서 "닉킹"된다. 상이한 뉴클레아제 활성을 갖는 예시적인 napDNAbp는 "Cas9 닉카제" ("nCas9") 및 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 탈활성화된 Cas9 ("기능상실 Cas9" 또는 "dCas9")를 포함한다. 이들 및 다른 napDNAbp에 대한 예시적인 서열이 본원에 제공된다.
닉카제
용어 "닉카제"는 2개의 뉴클레아제 도메인 중 하나가 불활성화된 Cas9를 지칭한다. 이 효소는 표적 DNA의 한 가닥만을 절단할 수 있다.
핵 국재화 서열 (NLS)
용어 "핵 국재화 서열" 또는 "NLS"는, 예를 들어 핵 수송에 의한 세포 핵 내로의 단백질의 유입을 촉진하는 아미노산 서열을 지칭한다. 핵 국재화 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, NLS 서열은 2001년 5월 31일에 WO/2001/038547로서 공개된 2000년 11월 23일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/EP2000/011690 (Plank et al.)에 기재되어 있으며, 그의 내용은 예시적인 핵 국재화 서열의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, NLS는 아미노산 서열 PKKKRKV (서열식별번호: 16) 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (서열식별번호: 17)를 포함한다.
핵산 분자
본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 중합체는 천연 뉴클레오시드 (즉, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시시티딘), 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C5 브로모우리딘, C5 플루오로우리딘, C5 아이오도우리딘, C5 프로피닐 우리딘, C5 프로피닐 시티딘, C5 메틸시티딘, 7 데아자아데노신, 7 데아자구아노신, 8 옥소아데노신, 8 옥소구아노신, O(6) 메틸구아닌, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 디히드로우리딘, 메틸슈도우리딘, 1-메틸 아데노신, 1-메틸 구아노신, N6-메틸 아데노신 및 2-티오시티딘), 화학적으로 변형된 염기, 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화 염기), 삽입된 염기, 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2'-O-메틸시티딘, 아라비노스 및 헥소스), 또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5' N 포스포르아미다이트 연결)를 포함할 수 있다.
PEgRNA
본원에 사용된 용어 "프라임 편집 가이드 RNA" 또는 "PEgRNA" 또는 "연장된 가이드 RNA"는 본원에 기재된 프라임 편집 방법 및 조성물을 구현하기 위한 1개 이상의 추가의 서열을 포함하도록 변형된 특수화된 형태의 가이드 RNA를 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, 프라임 편집 가이드 RNA는 핵산 서열의 1개 이상의 "연장된 영역"을 포함한다. 연장된 영역은 단일 가닥 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 연장된 영역은 전통적인 가이드 RNA의 3' 단부에서 발생할 수 있다. 다른 배열에서, 연장된 영역은 전통적인 가이드 RNA의 5' 단부에서 발생할 수 있다. 또 다른 배열에서, 연장된 영역은 전통적인 가이드 RNA의 분자내 영역에서, 예를 들어 napDNAbp에 회합 및/또는 결합하는 gRNA 코어 영역에서 발생할 수 있다. 연장된 영역은 (a) 편집될 내인성 표적 DNA와 상동이도록 설계되었고, (b) 내인성 표적 DNA 내로 도입 또는 통합될 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 전이, 전환, 결실 또는 삽입)를 포함하는 단일 가닥 DNA를 (프라임 편집제의 폴리머라제에 의해) 코딩하는 "DNA 합성 주형"을 포함한다. 연장된 영역은 또한 다른 기능적 서열 요소, 예컨대 비제한적으로 "프라이머 결합 부위" 및 "스페이서 또는 링커" 서열, 또는 다른 구조적 요소, 예컨대 비제한적으로 압타머, 스템 루프, 헤어핀, 토 루프 (예를 들어, 3' 토루프) 또는 RNA-단백질 동원 도메인 (예를 들어, MS2 헤어핀)을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "프라이머 결합 부위"는 R-루프의 닉킹된 DNA로부터 생성된 3' 단부를 갖는 단일 가닥 DNA 서열에 혼성화하는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, PEgRNA는 도 3a에 의해 나타내어지며, 이는 5' 연장 아암, 스페이서 및 gRNA 코어를 갖는 PEgRNA를 보여준다. 5' 연장부는 5'에서 3' 방향으로 리버스 트랜스크립타제 주형, 프라이머 결합 부위 및 링커를 추가로 포함한다. 제시된 바와 같이, 리버스 트랜스크립타제 주형은 또한 "DNA 합성 주형"으로서 보다 광범위하게 지칭될 수 있으며, 여기서 본원에 기재된 프라임 편집제의 폴리머라제는 RT가 아니라 또 다른 유형의 폴리머라제이다.
특정의 다른 실시양태에서, PEgRNA는 도 3b에 의해 나타내어지며, 이는 5' 연장 아암, 스페이서 및 gRNA 코어를 갖는 PEgRNA를 보여준다. 5' 연장부는 5'에서 3' 방향으로 리버스 트랜스크립타제 주형, 프라이머 결합 부위 및 링커를 추가로 포함한다. 제시된 바와 같이, 리버스 트랜스크립타제 주형은 또한 "DNA 합성 주형"으로서 보다 광범위하게 지칭될 수 있으며, 여기서 본원에 기재된 프라임 편집제의 폴리머라제는 RT가 아니라 또 다른 유형의 폴리머라제이다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 도 3d에 의해 나타내어지며, 이는 5'에서 3' 방향으로 스페이서 (1), gRNA 코어 (2) 및 연장 아암 (3)을 갖는 PEgRNA를 보여준다. 연장 아암 (3)은 PEgRNA의 3' 단부에 있다. 연장 아암 (3)은 5'에서 3' 방향으로 "프라이머 결합 부위" (A), "편집 주형" (B) 및 "상동성 아암" (C)을 추가로 포함한다. 연장 아암 (3)은 또한 3' 및 5' 단부에, 동일한 서열 또는 상이한 서열일 수 있는 임의적인 변형제 영역을 포함할 수 있다. 추가로, PEgRNA의 3' 단부는 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. PEgRNA의 이들 서열 요소는 본원에 추가로 기재되고 정의된다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 도 3e에 의해 나타내어지며, 이는 5'에서 3' 방향으로 연장 아암 (3), 스페이서 (1) 및 gRNA 코어 (2)를 갖는 PEgRNA를 보여준다. 연장 아암 (3)은 PEgRNA의 5' 단부에 있다. 연장 아암 (3)은 3'에서 5' 방향으로 "프라이머 결합 부위" (A), "편집 주형" (B) 및 "상동성 아암" (C)을 추가로 포함한다. 연장 아암 (3)은 또한 3' 및 5' 단부에, 동일한 서열 또는 상이한 서열일 수 있는 임의적인 변형제 영역을 포함할 수 있다. PEgRNA는 또한 3' 단부에 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. PEgRNA의 이들 서열 요소는 본원에 추가로 기재되고 정의된다.
PE1
본원에 사용된 바와 같이, "PE1"은 하기 구조: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(wt)] + 목적하는 PEgRNA를 갖는, Cas9(H840A) 및 야생형 MMLV RT를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 PE 복합체를 지칭하며, 여기서 PE 융합체는 하기와 같이 제시되는 서열식별번호: 123의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00004
설명:
핵 국재화 서열 (NLS) 상단: (서열식별번호: 124), 하단: (서열식별번호: 133)
Cas9(H840A) (서열식별번호: 126)
33개-아미노산 링커 (서열식별번호: 127)
M-MLV 리버스 트랜스크립타제 (서열식별번호: 128).
PE2
본원에 사용된 바와 같이, "PE2"는 하기 구조: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + 목적하는 PEgRNA를 갖는, Cas9(H840A) 및 변이체 MMLV RT를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 PE 복합체를 지칭하며, 여기서 PE 융합체는 하기와 같이 제시되는 서열식별번호: 134의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00005
설명:
핵 국재화 서열 (NLS) 상단: (서열식별번호: 124), 하단: (서열식별번호: 133)
Cas9(H840A) (서열식별번호: 137)
33개-아미노산 링커 (서열식별번호: 127)
M-MLV 리버스 트랜스크립타제 (서열식별번호: 139).
PE3
본원에 사용된 "PE3"은 PE2 플러스 PE2와 복합체화하고 비-편집된 DNA 가닥에 닉을 도입하여 편집된 가닥의 우선적 대체를 유도하는 제2-가닥 닉킹 가이드 RNA를 지칭한다.
PE3b
본원에 사용된 "PE3b"는 PE3을 지칭하지만, 여기서 제2-가닥 닉킹 가이드 RNA는 제2 가닥 닉이 목적하는 편집이 설치될 때까지 도입되지 않도록 시간적 제어를 위해 설계된다. 이는 단지 편집된 가닥에만 매칭되고 원래 대립유전자에는 매칭되지 않는 스페이서 서열을 갖는 gRNA를 설계함으로써 달성된다. 이하에서 PE3b로 지칭되는 이러한 전략을 사용할 때, 프로토스페이서와 비편집된 대립유전자 사이의 미스매치는 PAM 가닥 상의 편집 사건이 일어날 때까지 sgRNA에 의한 닉킹을 불리하게 할 것이다.
PE-짧은 형
본원에 사용된 "PE-짧은 형"은 C-말단이 말단절단된 리버스 트랜스크립타제에 융합된 PE 구축물을 지칭하고, 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00006
설명:
핵 국재화 서열 (NLS) 상단: (서열식별번호: 124), 하단: (서열식별번호: 133)
Cas9(H840A) (서열식별번호: 157)
33개-아미노산 링커 1 (서열식별번호: 127)
M-MLV 말단절단된 리버스 트랜스크립타제
(서열식별번호: 766)
펩티드 태그
용어 "펩티드 태그"는 다양한 목적, 예컨대 가시화, 정제, 가용화 및 분리 등을 위해 단백질의 조작을 용이하게 하는 1개 이상의 기능을 단백질 상에 부여하기 위해 단백질 서열에 유전자 융합된 펩티드 아미노산 서열을 지칭한다. 펩티드 태그는 목적 또는 기능에 의해 카테고리화된 다양한 유형의 태그를 포함할 수 있으며, 이는 "친화성 태그" (단백질 정제를 용이하게 하기 위함), "가용화 태그" (단백질의 적절한 폴딩을 보조하기 위함), "크로마토그래피 태그" (단백질의 크로마토그래피 특성을 변경하기 위함), "에피토프 태그" (고친화도 항체에 결합하기 위함), "형광 태그" (세포 또는 시험관내에서 단백질의 가시화를 용이하게 하기 위함)를 포함할 수 있다.
폴리머라제
본원에 사용된 용어 "폴리머라제"는 뉴클레오티드 가닥을 합성하고 본원에 기재된 프라임 편집제 시스템과 관련하여 사용될 수 있는 효소를 지칭한다. 폴리머라제는 "주형-의존성" 폴리머라제 (즉, 주형 가닥의 뉴클레오티드 염기의 순서에 기초하여 뉴클레오티드 가닥을 합성하는 폴리머라제)일 수 있다. 폴리머라제는 또한 "주형-비의존성" 폴리머라제 (즉, 주형 가닥의 필요 없이 뉴클레오티드 가닥을 합성하는 폴리머라제)일 수 있다. 폴리머라제는 또한 "DNA 폴리머라제" 또는 "RNA 폴리머라제"로 추가로 카테고리화될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 시스템은 DNA 폴리머라제를 포함한다. 다양한 실시양태에서, DNA 폴리머라제는 "DNA-의존성 DNA 폴리머라제" (즉, 주형 분자가 DNA의 가닥임)일 수 있다. 이러한 경우에, DNA 주형 분자는 PEgRNA일 수 있으며, 여기서 연장 아암은 DNA의 가닥을 포함한다. 이러한 경우에, PEgRNA는 RNA 부분 (즉, 스페이서 및 gRNA 코어를 포함한 가이드 RNA 성분) 및 DNA 부분 (즉, 연장 아암)을 포함하는 키메라 또는 하이브리드 PEgRNA로 지칭될 수 있다. 다양한 다른 실시양태에서, DNA 폴리머라제는 "RNA-의존성 DNA 폴리머라제" (즉, 주형 분자가 RNA의 가닥임)일 수 있다. 이러한 경우에, PEgRNA는 RNA이며, 즉 RNA 연장부를 포함한다. 용어 "폴리머라제"는 또한 뉴클레오티드의 중합 (즉, 폴리머라제 활성)을 촉매하는 효소를 지칭할 수 있다. 일반적으로, 효소는 폴리뉴클레오티드 주형 서열에 어닐링된 프라이머 (예를 들어, 예컨대 PEgRNA의 프라이머 결합 부위에 어닐링된 프라이머 서열)의 3'-단부에서 합성을 개시할 것이고, 주형 가닥의 5' 단부를 향해 진행할 것이다. "DNA 폴리머라제"는 데옥시뉴클레오티드의 중합을 촉매한다. DNA 폴리머라제와 관련하여 본원에 사용된 용어 DNA 폴리머라제는 "그의 기능적 단편"을 포함한다. "그의 기능적 단편"은 폴리머라제의 전체 미만의 아미노산 서열을 포괄하고, 적어도 하나의 세트의 조건 하에 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 능력을 보유하는 야생형 또는 돌연변이체 DNA 폴리머라제의 임의의 부분을 지칭한다. 이러한 기능적 단편은 별개의 개체로서 존재할 수 있거나 또는 보다 큰 폴리펩티드, 예컨대 융합 단백질의 구성성분일 수 있다.
프라임 편집
본원에 사용된 용어 "프라임 편집"은 napDNAbp, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제), 및 표적 DNA 서열 내로 혼입되는 목적하는 새로운 유전자 정보를 코딩하기 위한 (또는 유전자 정보를 결실시키기 위한) DNA 합성 주형을 포함하는 특수화된 가이드 RNA를 사용하는 유전자 편집을 위한 신규 접근법을 지칭한다. 프라임 편집의 특정 실시양태는 다른 도면 중에서 도 1a-1h 및 도 72a-72c의 실시양태에 기재된다.
프라임 편집은 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 ("napDNAbp") (이는 폴리머라제와 회합하여 (즉, 융합 단백질의 형태로 또는 달리 napDNAbp와 트랜스로 제공됨) 작동함)을 사용하여 명시된 DNA 부위 내로 새로운 유전자 정보를 직접 기록하는 다목적의 정확한 게놈 편집 방법인 게놈 편집을 위한 전적으로 새로운 플랫폼을 나타내며, 여기서 프라임 편집 시스템은 표적 부위를 명시하고 또한 가이드 RNA 상에 (예를 들어, 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA의 내부 부분에) 조작된 연장부 (DNA 또는 RNA)에 의해 대체 DNA 가닥의 형태로 목적하는 편집의 합성의 주형이 되는 프라임 편집 (PE) 가이드 RNA ("PEgRNA")로 프로그램화된다. 목적하는 편집 (예를 들어, 단일 핵염기 치환)을 함유하는 대체 가닥은 편집될 표적 부위의 내인성 가닥 (닉 부위의 바로 하류)과 동일한 (또는 상동인) 서열을 공유한다 (목적하는 편집을 포함하는 것은 제외함). DNA 복구 및/또는 복제 기구를 통해, 닉 부위의 하류 내인성 가닥은 목적하는 편집을 함유하는 새로 합성된 대체 가닥에 의해 대체된다. 일부 경우에, 프라임 편집은 "검색-및-대체" 게놈 편집 기술로서 생각될 수 있으며, 이는 프라임 편집제가, 본원에 기재된 바와 같이, 편집될 목적하는 표적 부위를 검색하고 위치를 찾아낼 뿐만 아니라, 동시에, 상응하는 표적 부위 내인성 DNA 가닥 대신에 설치된 목적하는 편집을 함유하는 대체 가닥을 코딩하기 때문이다. 본 개시내용의 프라임 편집제는, 부분적으로, 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT) 또는 "프라임 편집"의 메카니즘이 (예를 들어, 도 1a-1f의 다양한 실시양태에 도시된 바와 같이) 높은 효율 및 유전적 유연성으로 정밀 CRISPR/Cas-기반 게놈 편집을 수행하기 위해 활용 또는 적합화될 수 있다는 발견에 관한 것이다. TPRT는 이동성 DNA 요소, 예컨대 포유동물 비-LTR 레트로트랜스포손 및 박테리아 그룹 II 인트론에 의해 자연적으로 사용된다28,29. 본 발명자들은 본원에서 Cas 단백질-리버스 트랜스크립타제 융합체 또는 관련 시스템을 사용하여 가이드 RNA에 의해 특이적 DNA 서열을 표적화하고, 표적 부위에서 단일 가닥 닉을 생성하고, 닉킹된 DNA를 가이드 RNA와 통합된 조작된 리버스 트랜스크립타제 주형의 역전사를 위한 프라이머로서 사용하였다. 그러나, 상기 개념이 DNA 폴리머라제 성분으로서 리버스 트랜스크립타제를 사용하는 프라임 편집제로 시작되지만, 본원에 기재된 프라임 편집제는 리버스 트랜스크립타제로 제한되는 것이 아니라, 실질적으로 임의의 DNA 폴리머라제의 사용을 포함할 수 있다. 실제로, 본 출원은 전반에 걸쳐 "리버스 트랜스크립타제"를 사용한 프라임 편집제를 언급할 수 있지만, 리버스 트랜스크립타제는 프라임 편집으로 작동할 수 있는 DNA 폴리머라제의 단지 한 유형인 것으로 본원에 제시된다. 따라서, 본 명세서가 "리버스 트랜스크립타제"를 언급할 때마다, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 리버스 트랜스크립타제 대신에 임의의 적합한 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다는 것을 인지하여야 한다. 따라서, 한 측면에서, 프라임 편집제는 Cas9 (또는 등가의 napDNAbp)를 포함할 수 있으며, 이는 그것을 표적 DNA 내의 상보적 프로토스페이서에 어닐링하는 스페이서 서열을 함유하는 특수화된 가이드 RNA (즉, PEgRNA)와 회합시킴으로써 DNA 서열을 표적화하도록 프로그램화된다. 특수화된 가이드 RNA는 또한 표적 부위에서 상응하는 내인성 DNA 가닥을 대체하는데 사용되는 목적하는 유전자 변경을 함유하는 DNA의 대체 가닥을 코딩하는 연장부의 형태로 새로운 유전자 정보를 함유한다. PEgRNA로부터 표적 DNA로 정보를 전달하기 위해, 프라임 편집의 메카니즘은 DNA의 한 가닥 내의 표적 부위를 닉킹하여 3'-히드록실 기를 노출시키는 것을 수반한다. 이어서, 노출된 3'-히드록실 기를 사용하여 표적 부위 내로 직접 PEgRNA 상의 편집-코딩 연장부의 DNA 중합을 프라이밍할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 편집을 함유하는 대체 가닥의 중합을 위한 주형을 제공하는 연장부는 RNA 또는 DNA로부터 형성될 수 있다. RNA 연장부의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예컨대, 리버스 트랜스크립타제)일 수 있다. DNA 연장부의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 본원에 개시된 프라임 편집제에 의해 형성된 새로 합성된 가닥 (즉, 목적하는 편집을 함유하는 대체 DNA 가닥)은 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 결실 또는 삽입 또는 그의 조합)의 포함을 제외하고는 게놈 표적 서열에 상동일 것이다 (즉, 그와 동일한 서열을 가질 것임). DNA의 새로 합성된 (또는 대체) 가닥은 또한 단일 가닥 DNA 플랩으로서 지칭될 수 있으며, 이는 상보적 상동 내인성 DNA 가닥과의 혼성화에 대해 경쟁함으로써 상응하는 내인성 가닥을 대체할 것이다. 특정 실시양태에서, 시스템은 오류-유발 리버스 트랜스크립타제 효소 (예를 들어, Cas9 도메인과의 융합 단백질로서 제공되거나 또는 Cas9 도메인에 대해 트랜스로 제공됨)의 사용과 조합될 수 있다. 오류-유발 리버스 트랜스크립타제 효소는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성 동안 변경을 도입할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제를 이용하여 표적 DNA에 뉴클레오티드 변화를 도입할 수 있다. 시스템과 함께 사용되는 오류-유발 리버스 트랜스크립타제에 따라, 변화는 무작위 또는 비-무작위일 수 있다. 혼성화된 중간체 (내인성 DNA 가닥에 혼성화된 리버스 트랜스크립타제에 의해 합성된 단일 가닥 DNA 플랩을 포함함)의 분해는 생성된 내인성 DNA의 대체 플랩의 제거 (예를 들어, 5' 단부 DNA 플랩 엔도뉴클레아제인 FEN1을 사용함), 합성된 단일 가닥 DNA 플랩의 표적 DNA에 대한 라이게이션, 및 세포 DNA 복구 및/또는 복제 과정의 결과로서 목적하는 뉴클레오티드 변화의 동화를 포함할 수 있다. 주형화된 DNA 합성은 삽입 및 결실을 포함한 임의의 뉴클레오티드의 변형을 위한 단일 뉴클레오티드 정밀도를 제공하기 때문에, 이러한 접근법의 범주는 매우 넓고, 기초 과학 및 요법에서 무수한 적용에 사용될 수 있을 것으로 예측된다.
다양한 실시양태에서, 프라임 편집은 표적 DNA 분자 (뉴클레오티드 서열 내의 변화가 도입되는 것이 요구됨)를 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)과 접촉시킴으로써 작동한다. 도 1g를 참조하면, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함하고, 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입 또는 결실)를 코딩한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/연장된 gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, 연장된 gRNA는 napDNAbp가 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의해), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 특정 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥에 상응하는 DNA의 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않는 가닥, 즉 "비-표적 가닥"에서 생성된다. 그러나, 닉은 가닥 중 어느 하나에 도입될 수 있다. 즉, 닉은 R-루프 "표적 가닥" (즉, 연장된 gRNA의 프로토스페이서에 혼성화된 가닥) 또는 "비-표적 가닥" (즉, R-루프의 단일 가닥 부분을 형성하고 표적 가닥에 상보적인 가닥) 내로 도입될 수 있다. 단계 (c)에서, DNA 가닥의 3' 단부 (닉에 의해 형성됨)는 역전사를 프라이밍하기 위해 (즉, "표적-프라이밍된 RT") 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 특정 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 RT 프라이밍 서열, 즉 PEgRNA 상의 "리버스 트랜스크립타제 프라이밍 서열" 또는 "프라이머 결합 부위"에 혼성화한다. 단계 (d)에서, 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 프라임 편집 가이드 RNA의 5' 단부를 향해 DNA의 단일 가닥을 합성하는 리버스 트랜스크립타제 (또는 다른 적합한 DNA 폴리머라제)가 도입된다. DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)는 napDNAbp에 융합될 수 있거나 또는 대안적으로 napDNAbp에 트랜스로 제공될 수 있다. 이는 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 염기 변화, 삽입 또는 결실 또는 그의 조합)를 포함하고, 그 외에는 닉 부위의 또는 그에 인접한 내인성 DNA에 상동인 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 내인성 DNA 서열에 침입하고 혼성화하였을 때 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써, 목적하는 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, 세포 내인성 DNA 복구 및 복제 과정은 미스매칭된 DNA를 분해하여 뉴클레오티드 변화(들)를 혼입시켜 목적하는 변경된 생성물을 형성한다. 과정은 또한 도 1f에 예시된 바와 같이 "제2 가닥 닉킹"에 의해 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 이 과정은 하기 유전자 변화: 전환, 전이, 결실 및 삽입 중 적어도 하나 이상을 도입할 수 있다.
용어 "프라임 편집제 (PE) 시스템" 또는 "프라임 편집제 (PE)" 또는 "PE 시스템" 또는 "PE 편집 시스템"은 napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제, 융합 단백질 (예를 들어, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함함), 프라임 편집 가이드 RNA, 및 융합 단백질 및 프라임 편집 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성을 향해 구동시키는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 제2 가닥 닉킹 성분 (예를 들어, 제2 가닥 sgRNA) 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본원에 기재된 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)를 사용하는 게놈 편집 방법에 수반되는 조성물을 지칭한다.
지금까지 기재된 실시양태에서 PEgRNA는 가이드 RNA (그 자체가 스페이서 서열 및 gRNA 코어 또는 스캐폴드를 포함함) 및 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 5' 또는 3' 연장 아암을 포함하는 단일 분자를 구성하지만 (예를 들어, 도 3d 참조), PEgRNA는 또한 가이드 RNA 및 트랜스 프라임 편집제 RNA 주형 (tPERT)으로 구성된 2개의 개별 분자의 형태를 취할 수 있으며, 이는 본질적으로 동일한 분자 내에 연장 아암 (특히, 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 도메인 포함) 및 RNA-단백질 동원 도메인 (예를 들어, MS2 압타머 또는 헤어핀)을 수용하여, tPERT 동원 단백질 (예를 들어, MS2 압타머에 결합하는 MS2cp 단백질)을 포함하는 변형된 프라임 편집제 복합체로 공동-국재화되거나 동원된다. 프라임 편집에 사용될 수 있는 tPERT의 예로서 도 3g 및 도 3h를 참조한다.
프라임 편집제
용어 "프라임 편집제"는 napDNAbp (예를 들어, Cas9 닉카제) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 본원에 기재된 융합 구축물을 지칭하고, PEgRNA (또는 "연장된 가이드 RNA")의 존재 하에 표적 뉴클레오티드 서열 상에서 프라임 편집을 수행할 수 있다. 용어 "프라임 편집제"는 융합 단백질 또는 PEgRNA와 복합체화되고/거나 제2-가닥 닉킹 sgRNA와 추가로 복합체화된 융합 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라임 편집제는 또한 융합 단백질 (napDNAbp에 융합된 리버스 트랜스크립타제), PEgRNA 및 본원에 기재된 바와 같은 비-편집된 가닥의 제2-부위 닉킹 단계를 지시할 수 있는 정규 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 지칭할 수 있다. 다른 실시양태에서, "프라이머 편집제"의 리버스 트랜스크립타제 성분은 트랜스로 제공될 수 있다.
프라이머 결합 부위
용어 "프라이머 결합 부위" 또는 "PBS"는 연장 아암의 성분으로서 PEgRNA 상에 (전형적으로 연장 아암의 3' 단부에) 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 프라임 편집제에 의한 표적 서열의 Cas9 닉킹 후에 형성된 프라이머 서열에 결합하는 역할을 한다. 다른 곳에 상술된 바와 같이, 프라임 편집제의 Cas9 닉카제 성분이 표적 DNA 서열의 한 가닥을 닉킹하는 경우에, 3'-단부 ssDNA 플랩이 형성되며, 이는 PEgRNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링하여 역전사를 프라이밍하는 프라이머 서열의 역할을 한다. 도 27 및 28은 각각 3' 및 5' 연장 아암 상에 위치하는 프라이머 결합 부위의 실시양태를 보여준다.
프로모터
용어 "프로모터"는 관련 기술분야에 인식되어 있으며, 세포 전사 기구에 의해 인식되고 하류 유전자의 전사를 개시할 수 있는 서열을 갖는 핵산 분자를 지칭한다. 프로모터는 구성적으로 활성 (프로모터가 주어진 세포 맥락에서 항상 활성임을 의미함)일 수 있거나 또는 조건부로 활성 (프로모터가 특이적 조건의 존재 하에서만 활성임을 의미함)일 수 있다. 예를 들어, 조건부 프로모터는 프로모터 내의 조절 요소와 회합된 단백질을 기본 전사 기구에 연결하는 특이적 단백질의 존재 하에서만 또는 억제 분자의 부재 하에서만 활성일 수 있다. 조건부로 활성인 프로모터의 하위부류는 활성을 위해 소분자 "유도제"의 존재를 필요로 하는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터의 예는 아라비노스-유도성 프로모터, Tet-on 프로모터 및 타목시펜-유도성 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 구성적, 조건부 및 유도성 프로모터가 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 통상의 기술자는 본 발명을 수행하는데 유용한 다양한 이러한 프로모터를 확인할 수 있을 것이며, 이와 관련하여 제한은 없다.
프로토스페이서
본원에 사용된 용어 "프로토스페이서"는 PAM (프로토스페이서 인접 모티프) 서열에 인접한 DNA 내의 서열 (~20 bp)을 지칭한다. 프로토스페이서는 가이드 RNA의 스페이서 서열과 동일한 서열을 공유한다. 가이드 RNA는 표적 DNA 상의 프로토스페이서 서열의 상보체 (구체적으로, 그의 한 가닥, 즉 표적 DNA 서열의 "비-표적 가닥"에 비해 "표적 가닥")에 어닐링한다. Cas9가 기능하기 위해, 이는 또한 Cas9 유전자의 박테리아 종에 따라 달라지는 특이적 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 필요로 한다. 에스. 피오게네스로부터 유래된 가장 통상적으로 사용되는 Cas9 뉴클레아제는 비-표적 가닥 상에서, 게놈 DNA 내의 표적 서열의 바로 하류에서 발견되는 NGG의 PAM 서열을 인식한다. 통상의 기술자는 최신 기술의 문헌이 때때로 "프로토스페이서"를 "스페이서"로서 지칭하기 보다는 가이드 RNA 자체 상의 ~20-nt 표적-특이적 가이드 서열로서 지칭한다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 일부 경우에, 본원에 사용된 용어 "프로토스페이서"는 용어 "스페이서"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. "프로토스페이서" 또는 "스페이서"의 출현을 둘러싼 기재의 문맥은 이 용어가 gRNA에 대한 것인지 또는 DNA 표적에 대한 것인지 여부에 관해 독자에게 알리는 것을 도울 것이다.
프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)
본원에 사용된 용어 "프로토스페이서 인접 서열" 또는 "PAM"은 Cas9 뉴클레아제의 중요한 표적화 성분인 대략 2-6개 염기 쌍 DNA 서열을 지칭한다. 전형적으로, PAM 서열은 어느 한 가닥 상에 있고, Cas9 절단 부위의 5'에서 3' 방향으로 하류에 있다. 정규 PAM 서열 (즉, 스트렙토코쿠스 피오게네스의 Cas9 뉴클레아제 또는 SpCas9와 연관된 PAM 서열)은 5'-NGG-3'이며, 여기서 "N"은 임의의 핵염기, 이어서 2개의 구아닌 ("G") 핵염기이다. 상이한 PAM 서열은 상이한 Cas9 뉴클레아제 또는 상이한 유기체로부터의 등가의 단백질과 연관될 수 있다. 추가로, 임의의 주어진 Cas9 뉴클레아제, 예를 들어 SpCas9는 뉴클레아제의 PAM 특이성을 변경시켜 뉴클레아제가 대안적 PAM 서열을 인식하도록 변형될 수 있다.
예를 들어, 서열식별번호: 18의 정규 SpCas9 아미노산 서열과 관련하여, PAM 서열은 (a) PAM 특이성을 NGAN 또는 NGNG로 변경시키는 D1135V, R1335Q 및 T1337R "VQR 변이체", (b) PAM 특이성을 NGAG로 변경시키는 D1135E, R1335Q 및 T1337R "EQR 변이체", 및 (c) PAM 특이성을 NGCG로 변경시키는 D1135V, G1218R, R1335E 및 T1337R "VRER 변이체"를 포함한 1개 이상의 돌연변이를 도입함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 정규 SpCas9의 D1135E 변이체는 여전히 NGG를 인식하지만, 야생형 SpCas9 단백질과 비교하여 더 선택적이다.
또한, 상이한 박테리아 종으로부터의 Cas9 효소 (즉, Cas9 오르토로그)는 다양한 PAM 특이성을 가질 수 있는 것으로 인지될 것이다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 Cas9 (SaCas9)는 NGRRT 또는 NGRRN을 인식한다. 추가로, 네이세리아 메닌기티티스(Neisseria meningitis)로부터의 Cas9 (NmCas)는 NNNNGATT를 인식한다. 또 다른 예에서, 스트렙토코쿠스 써모필리스(Streptococcus thermophilis)로부터의 Cas9 (StCas9)는 NNAGAAW를 인식한다. 또 다른 예에서, 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)로부터의 Cas9 (TdCas)는 NAAAAC를 인식한다. 이들 예는 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 비-SpCas9는 다양한 PAM 서열에 결합하며, 이는 목적하는 표적 절단 부위에 적합한 SpCas9 PAM 서열이 존재하지 않는 경우에 이들은 유용한 것으로 만든다고 추가로 인지될 것이다. 추가로, 비-SpCas9는 이들을 SpCas9보다 더 유용하게 만드는 다른 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9 (SaCas9)는 SpCas9보다 약 1 킬로염기 더 작아서, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 내로 패키징될 수 있다. 추가로, 문헌 [Shah et al., "Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity," RNA Biology, 10(5): 891-899] (이는 본원에 참조로 포함됨)을 참조할 수 있다.
레콤비나제
본원에 사용된 용어 "레콤비나제"는 레콤비나제 인식 서열들 사이의 DNA 단편의 절제, 통합, 역위 또는 교환 (예를 들어, 전위)을 유발하는, 레콤비나제 인식 서열들 사이의 DNA의 재조합을 매개하는 부위-특이적 효소를 지칭한다. 레콤비나제는 다음 2종의 별개의 패밀리로 분류될 수 있다: 세린 레콤비나제 (예를 들어, 레솔바제 및 인버타제) 및 티로신 레콤비나제 (예를 들어, 인테그라제). 세린 레콤비나제의 예는 비제한적으로 Hin, Gin, Tn3, β-six, CinH, ParA, γδ, Bxb1, ΦC31, TP901, TG1, φBT1, R4, φRV1, φFC1, MR11, A118, U153 및 gp29를 포함한다. 티로신 레콤비나제의 예는 비제한적으로 Cre, FLP, R, 람다, HK101, HK022 및 pSAM2를 포함한다. 세린 및 티로신 레콤비나제 명칭은 레콤비나제가 DNA를 공격하기 위해 사용하고 가닥 교환 동안 DNA에 공유 연결되는 보존적 친핵성 아미노산 잔기로부터 유래한다. 레콤비나제는 유전자 녹아웃/녹인의 생성 및 유전자 요법 적용을 포함한 수많은 적용을 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Brown et al., "Serine recombinases as tools for genome engineering." Methods. 2011;53(4):372-9; Hirano et al., "Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration." Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92(2):227-39; Chavez and Calos, "Therapeutic applications of the ΦC31 integrase system." Curr. Gene Ther. 2011;11(5):375-81; Turan and Bode, "Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications." FASEB J. 2011; 25(12):4088-107; Venken and Bellen, "Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and ΦC31 integrase." Methods Mol. Biol. 2012; 859:203-28; Murphy, "Phage recombinases and their applications." Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414; Zhang et al., "Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era." J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2012; 13(7):511-24; Karpenshif and Bernstein, "From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination." DNA Repair (Amst). 2012; 1;11(10):781-8]을 참조하며; 이들 각각의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공된 레콤비나제는 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있는 레콤비나제의 배타적 예는 아닌 것으로 의도된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 새로운 직교 레콤비나제에 대한 데이터베이스를 채굴하거나 또는 정의된 DNA 특이성을 갖는 합성 레콤비나제를 설계함으로써 확장될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Groth et al., "Phage integrases: biology and applications." J. Mol. Biol. 2004; 335, 667-678; Gordley et al., "Synthesis of programmable integrases." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106, 5053-5058] 참조; 각각의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 레콤비나제의 다른 예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 발견되거나 생성되는 어떠한 새로운 레콤비나제도 본 발명의 상이한 실시양태에 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 레콤비나제의 촉매 도메인은 뉴클레아제-불활성화된 RNA-프로그램가능한 뉴클레아제 (예를 들어, dCas9 또는 그의 단편)와 융합되어, 레콤비나제 도메인이 핵산 결합 도메인을 포함하지 않거나 또는 표적 핵산에 결합할 수 없도록 한다 (예를 들어, 이러한 레콤비나제 도메인은 특이적 DNA 결합 활성을 갖지 않도록 조작됨). DNA 결합 활성이 결여된 레콤비나제 및 이를 조작하는 방법은 공지되어 있고, 문헌 [Klippel et al., "Isolation and characterisation of unusual gin mutants." EMBO J. 1988; 7: 3983-3989: Burke et al., "Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948; Olorunniji et al., "Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants." Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191; Rowland et al., "Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome." Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298; Akopian et al., "Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition." Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 8688-8691; Gordley et al., "Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells. J Mol Biol. 2007; 367: 802-813; Gordley et al., "Synthesis of programmable integrases." Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106: 5053-5058; Arnold et al., "Mutants of Tn3 resolvase which do not require accessory binding sites for recombination activity." EMBO J. 1999;18: 1407-1414; Gaj et al., "Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNA sequence specificity." Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(2):498-503; 및 Proudfoot et al., "Zinc finger recombinases with adaptable DNA sequence specificity." PLoS One. 2011;6(4):e19537] (각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, 레솔바제-인버타제 군의 세린 레콤비나제, 예를 들어 Tn3 및 γδ 레솔바제 및 Hin 및 Gin 인버타제는 자율 촉매 및 DNA-결합 도메인을 갖는 모듈 구조를 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Grindley et al., "Mechanism of site-specific recombination." Ann Rev Biochem. 2006; 75: 567-605] 참조, 이의 전체 내용은 참조로 포함됨). 따라서, 이들 레콤비나제의 촉매 도메인은, 예를 들어 어떠한 보조 인자 (예를 들어, DNA 결합 활성)도 필요로 하지 않는 '활성화된' 레콤비나제 돌연변이체의 단리 후 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제-불활성화된 RNA-프로그램가능한 뉴클레아제 (예를 들어, dCas9 또는 그의 단편)와 재조합될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klippel et al., "Isolation and characterisation of unusual gin mutants." EMBO J. 1988; 7: 3983-3989: Burke et al., "Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948; Olorunniji et al., "Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants." Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191; Rowland et al., "Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome." Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298; Akopian et al., "Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition." Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 8688-8691] 참조). 추가적으로, N-말단 촉매 도메인 및 C-말단 DNA 결합 도메인을 갖는 많은 다른 천연 세린 레콤비나제가 공지되어 있고 (예를 들어, phiC31 인테그라제, TnpX 트랜스포사제, IS607 트랜스포사제), 그의 촉매 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 프로그램가능한 부위-특이적 레콤비나제를 조작하기 위해 공동-선택될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Smith et al., "Diversity in the serine recombinases." Mol Microbiol. 2002;44: 299-307] 참조, 이의 전체 내용은 참조로 포함됨). 유사하게, 티로신 레콤비나제 (예를 들어, Cre, λ 인테그라제)의 코어 촉매 도메인은 공지되어 있고, 본원에 기재된 바와 같은 프로그램가능한 부위-특이적 레콤비나제를 조작하기 위해 유사하게 공동-선택될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Guo et al., "Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse." Nature. 1997; 389:40-46; Hartung et al., "Cre mutants with altered DNA binding properties." J Biol Chem 1998; 273:22884-22891; Shaikh et al., "Chimeras of the Flp and Cre recombinases: Tests of the mode of cleavage by Flp and Cre. J Mol Biol. 2000; 302:27-48; Rongrong et al., "Effect of deletion mutation on the recombination activity of Cre recombinase." Acta Biochim Pol. 2005; 52:541-544; Kilbride et al., "Determinants of product topology in a hybrid Cre-Tn3 resolvase site-specific recombination system." J Mol Biol. 2006; 355:185-195; Warren et al., "A chimeric cre recombinase with regulated directionality." Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105:18278-18283; Van Duyne, "Teaching Cre to follow directions." Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Jan 6;106(1):4-5; Numrych et al., "A comparison of the effects of single-base and triple-base changes in the integrase arm-type binding sites on the site-specific recombination of bacteriophage λ." Nucleic Acids Res. 1990; 18:3953-3959; Tirumalai et al., "The recognition of core-type DNA sites by λ integrase." J Mol Biol. 1998; 279:513-527; Aihara et al., "A conformational switch controls the DNA cleavage activity of λ integrase." Mol Cell. 2003; 12:187-198; Biswas et al., "A structural basis for allosteric control of DNA recombination by λ integrase." Nature. 2005; 435:1059-1066; 및 Warren et al., "Mutations in the amino-terminal domain of λ-integrase have differential effects on integrative and excisive recombination." Mol Microbiol. 2005; 55:1104-1112] 참조; 각각의 전체 내용은 참조로 포함됨).
레콤비나제 인식 서열
본원에 사용된 용어 "레콤비나제 인식 서열" 또는 동등하게 "RRS" 또는 "레콤비나제 표적 서열"은 레콤비나제에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열 표적을 지칭하며, 이는 RRS를 갖는 또 다른 DNA 분자와의 가닥 교환을 겪어 레콤비나제 인식 서열들 사이의 DNA 단편의 절제, 통합, 역위 또는 교환을 유발한다.
재조합하다 또는 재조합
핵산 변형 (예를 들어, 게놈 변형)의 문맥에서 용어 "재조합하다" 또는 "재조합"은 2개 이상의 핵산 분자 또는 단일 핵산 분자의 2개 이상의 영역이 레콤비나제 단백질 (예를 들어, 본원에 제공된 본 발명의 레콤비나제 융합 단백질)의 작용에 의해 변형되는 과정을 지칭하는데 사용된다. 재조합은, 특히, 예를 들어 1개 이상의 핵산 분자 내에 또는 그 사이에 핵산의 삽입, 역위, 절제 또는 전위를 유발할 수 있다. 레콤비나제 인식 서열
리버스 트랜스크립타제
용어 "리버스 트랜스크립타제"는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제로서 특징화되는 폴리머라제의 부류를 기재한다. 모든 공지된 리버스 트랜스크립타제는 RNA 주형으로부터 DNA 전사체를 합성하기 위한 프라이머를 필요로 한다. 역사적으로, 리버스 트랜스크립타제는 주로 mRNA를 cDNA로 전사하는데 사용되어 왔으며, 이는 이어서 추가의 조작을 위해 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 조류 골수모구증 바이러스 (AMV) 리버스 트랜스크립타제가 최초로 널리 사용된 RNA-의존성 DNA 폴리머라제였다 (Verma, Biochim. Biophys. Acta 473:1 (1977)). 효소는 5'-3' RNA-지시된 DNA 폴리머라제 활성, 5'-3' DNA-지시된 DNA 폴리머라제 활성 및 RNase H 활성을 갖는다. RNase H는 RNA-DNA 하이브리드에 대한 RNA 가닥에 특이적인 진행성 5' 및 3' 리보뉴클레아제이다 (Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons (1984)). 전사에서의 오류는 리버스 트랜스크립타제에 의해 교정될 수 없으며, 이는 공지된 바이러스 리버스 트랜스크립타제가 교정에 필요한 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있기 때문이다 (Saunders and Saunders, Microbial Genetics Applied to Biotechnology, London: Croom Helm (1987)). AMV 리버스 트랜스크립타제의 활성 및 그의 연관된 RNase H 활성의 상세한 연구는 문헌 [Berger et al., Biochemistry 22:2365-2372 (1983)]에 제시되었다. 분자 생물학에서 광범위하게 사용되는 또 다른 리버스 트랜스크립타제는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 기원하는 리버스 트랜스크립타제이다. 예를 들어, 문헌 [Gerard, G. R., DNA 5:271-279 (1986) 및 Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-258 (1985)]을 참조한다. RNase H 활성이 실질적으로 결여된 M-MLV 리버스 트랜스크립타제가 또한 기재되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,244,797을 참조한다. 본 발명은 임의의 이러한 리버스 트랜스크립타제 또는 그의 변이체 또는 돌연변이체의 사용을 고려한다.
추가로, 본 발명은 오류-유발성인, 즉 오류-유발 리버스 트랜스크립타제 또는 중합 동안 뉴클레오티드의 고충실도 혼입을 지지하지 않는 리버스 트랜스크립타제로 지칭될 수 있는 리버스 트랜스크립타제의 사용을 고려한다. 가이드 RNA와 통합된 RT 주형을 기반으로 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성 동안, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제는 RT 주형 서열과 미스매칭된 1개 이상의 뉴클레오티드를 도입하여, 단일 가닥 DNA 플랩의 오류성 중합을 통해 뉴클레오티드 서열에 변화를 도입할 수 있다. 이어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 합성 동안 도입된 이들 오류는 상응하는 내인성 표적 가닥에 대한 혼성화, 내인성 대체된 가닥의 제거, 라이게이션을 통해 및 이어서 1 라운드 이상의 내인성 DNA 복구 및/또는 서열분석 과정을 통해 이중 가닥 분자 내로 통합된다.
역전사
본원에 사용된 용어 "역전사"는 주형으로서 RNA를 사용하여 DNA 가닥 (즉, 상보적 DNA 또는 cDNA)을 합성하는 효소의 능력을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 역전사는 "오류-유발 역전사"일 수 있으며, 이는 그의 DNA 중합 활성에 있어서 오류-유발성인 특정 리버스 트랜스크립타제 효소의 특성을 지칭한다.
PACE
본원에 사용된 용어 "파지-보조 연속 진화 (PACE)"는 바이러스 벡터로서 파지를 사용하는 연속 진화를 지칭한다. PACE 기술의 일반적 개념은, 예를 들어 2010년 3월 11일에 WO 2010/028347로서 공개된, 2009년 9월 8일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2009/056194; 2012년 6월 28일에 WO 2012/088381로서 공개된, 2011년 12월 22일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2011/066747; 2015년 5월 5일에 허여된 미국 출원, 미국 특허 번호 9,023,594, 2015년 9월 11일에 WO 2015/134121로서 공개된, 2015년 1월 20일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2015/012022 및 2016년 10월 20일에 WO 2016/168631로서 공개된, 2016년 4월 15일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2016/027795에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
파지
용어 "박테리오파지"와 상호교환가능하게 본원에 사용된 용어 "파지"는 박테리아 세포를 감염시키는 바이러스를 지칭한다. 전형적으로, 파지는 유전 물질을 둘러싸는 외부 단백질 캡시드로 이루어진다. 유전 물질은 선형 또는 원형 형태의 ssRNA, dsRNA, ssDNA 또는 dsDNA일 수 있다. 파지 및 파지 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 본원에 제공된 PACE 방법을 수행하는데 유용한 파지의 비제한적 예는 λ (용원), T2, T4, T7, T12, R17, M13, MS2, G4, P1, P2, P4, Phi X174, N4, Φ6 및 Φ29이다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 이용되는 파지는 M13이다. 추가의 적합한 파지 및 숙주 세포는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 본 발명은 상기 측면에서 제한되지 않는다. 추가의 적합한 파지 및 숙주 세포의 예시적인 기재에 대해서는 문헌 [Elizabeth Kutter and Alexander Sulakvelidze: Bacteriophages: Biology and Applications. CRC Press; 1st edition (December 2004), ISBN: 0849313368; Martha R. J. Clokie and Andrew M. Kropinski: Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 1st edition (December, 2008), ISBN: 1588296822; Martha R. J. Clokie and Andrew M. Kropinski: Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 2: Molecular and Applied Aspects (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 1st edition (December 2008), ISBN: 1603275649]; 이들 모두는 적합한 파지 및 숙주 세포의 개시내용뿐만 아니라 이러한 파지의 단리, 배양 및 조작을 위한 방법 및 프로토콜에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
단백질, 펩티드 및 폴리펩티드
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 적어도 3개의 아미노산 길이일 것이다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 개별 단백질 또는 단백질들의 집합을 지칭할 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 내의 아미노산 중 1개 이상은, 예를 들어 화학 물질, 예컨대 탄수화물 기, 히드록실 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 접합, 관능화 또는 다른 변형을 위한 링커 등의 부가에 의해 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 단일 분자일 수 있거나 또는 다분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 단지 자연 발생 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 자연 발생, 재조합 또는 합성 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생산될 수 있으며, 이는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질에 특히 적합하다. 재조합 단백질 발현 및 정제를 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 기재된 것을 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
단백질 스플라이싱
본원에 사용된 용어 "단백질 스플라이싱"은 서열인 인테인 (또는 경우에 따라 분할 인테인)이 아미노산 서열 내로부터 절제되고, 아미노산 서열의 나머지 단편인 엑스테인이 아미드 결합을 통해 라이게이션되어 연속 아미노산 서열을 형성하는 과정을 지칭한다. 용어 "트랜스" 단백질 스플라이싱은 인테인이 분할 인테인이고 이들이 상이한 단백질 상에 위치하는 특이적 경우를 지칭한다.
제2-가닥 닉킹
프라임 편집의 결과로서 형성된 헤테로듀플렉스 DNA (즉, 1개의 편집된 가닥 및 1개의 비-편집된 가닥을 함유함)의 분해는 장기간 편집 결과를 결정한다. 즉, 프라임 편집의 목적은 편집된 가닥을 상보체 내인성 가닥 내로 영구적으로 통합시킴으로써 PE의 중간체로서 형성된 헤테로듀플렉스 DNA (내인성 비-편집된 가닥과 쌍형성된 편집된 가닥)를 분해하는 것이다. "제2-가닥 닉킹"의 접근법은 편집된 가닥의 DNA 분자 내로의 영구적 통합에 유리하게 헤테로듀플렉스 DNA의 분해를 구동하는 것을 돕기 위해 본원에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "제2-가닥 닉킹"의 개념은 제1 닉 (즉, 가이드 RNA의 연장된 부분 상에서의 리버스 트랜스크립타제의 프라이밍에 사용하기 위한 유리 3' 단부를 제공하는 초기 닉 부위)의 하류 위치에, 바람직하게는 비편집된 가닥 상에 제2 닉을 도입하는 것을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 제1 닉 및 제2 닉은 대향 가닥 상에 있다. 다른 실시양태에서, 제1 닉 및 제2 닉은 대향 가닥 상에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 닉은 비-표적 가닥 (즉, R-루프의 단일 가닥 부분을 형성하는 가닥) 상에 있고, 제2 닉은 표적 가닥 상에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 닉은 편집된 가닥 상에 있고, 제2 닉은 비편집된 가닥 상에 있다. 제2 닉은 제1 닉의 적어도 5개 뉴클레오티드 하류 또는 제1 닉의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 하류에 위치할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 닉은 비편집된 가닥 상에 PEgRNA-유도된 닉의 부위로부터 약 5-150개 뉴클레오티드 또는 약 5-140 또는 약 5-130 또는 약 5-120 또는 약 5-110 또는 약 5-100 또는 약 5-90 또는 약 5-80 또는 약 5-70 또는 약 5-60 또는 약 5-50 또는 약 5-40 또는 약 5-30 또는 약 5-20 또는 약 5-10개 떨어져 도입될 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 닉은 PEgRNA-유도된 닉으로부터 14-116개 뉴클레오티드 떨어져 도입된다. 이론에 얽매이지는 않지만, 제2 닉은 세포의 내인성 DNA 복구 및 복제 과정을 비편집된 가닥의 대체 또는 편집을 향해 유도하여, 편집된 서열을 양쪽 가닥 상에 영구적으로 설치하고 PE의 결과로서 형성된 헤테로듀플렉스를 분해한다. 일부 실시양태에서, 편집된 가닥은 비-표적 가닥이고, 비편집된 가닥은 표적 가닥이다. 다른 실시양태에서, 편집된 가닥은 표적 가닥이고, 비편집된 가닥은 비-표적 가닥이다.
센스 가닥
유전학에서, "센스" 가닥은 5'에서 3'로 진행하는 이중 가닥 DNA 내의 절편이며, 이는 3'에서 5'로 진행하는 DNA의 안티센스 가닥 또는 주형 가닥에 상보적이다. 단백질을 코딩하는 DNA 절편의 경우에, 센스 가닥은 mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA의 가닥이며, 이는 전사 동안 안티센스 가닥을 그의 주형으로서 취하고, 결국 (전형적으로, 항상은 아님) 단백질로의 번역을 겪는다. 따라서, 안티센스 가닥은 나중에 단백질로 번역되는 RNA를 담당하는 반면, 센스 가닥은 mRNA의 것과 거의 동일한 구성을 갖는다. dsDNA의 각각의 절편에 대해, 판독하는 방향에 따라 센스 및 안티센스의 2개의 세트가 존재할 가능성이 있다는 것 (센스 및 안티센스는 시각이 상대적이기 때문에)을 주목한다. 궁극적으로, dsDNA의 한 절편 중 어느 가닥이 센스 또는 안티센스로 지칭되는지를 좌우하는 것은 유전자 생성물 또는 mRNA이다.
PEgRNA의 맥락에서, 제1 단계는 PEgRNA 연장 아암으로부터 주형화된, 5'에서 3' 방향으로 배향된 단일 가닥 상보적 DNA (즉, 혼입되는 3' ssDNA 플랩)의 합성이다. 3' ssDNA 플랩이 센스 가닥으로서 간주되어야 하는지 안티센스 가닥으로서 간주되어야 하는지의 여부는 전사 방향에 좌우되며, 이는 DNA의 양쪽 가닥이 전사를 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있다는 것 (그러나 동시에는 아님)이 널리 받아들여지고 있기 때문이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3' ssDNA 플랩 (전체적으로 5'에서 3' 방향으로 진행함)은 코딩 가닥이기 때문에 센스 가닥으로서의 역할을 할 것이다. 다른 실시양태에서, 3' ssDNA 플랩 (전체적으로 5'에서 3' 방향으로 진행함)은 안티센스 가닥 및 이에 따라 전사를 위한 주형으로서의 역할을 할 것이다.
스페이서 서열
가이드 RNA 또는 PEgRNA와 관련하여 본원에 사용된 용어 "스페이서 서열"은 표적 DNA 서열 내의 프로토스페이서 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 함유하는 약 20개 뉴클레오티드의 가이드 RNA 또는 PEgRNA의 부분을 지칭한다. 스페이서 서열은 프로토스페이서 서열에 어닐링하여 표적 부위에서 ssRNA/ssDNA 하이브리드 구조 및 프로토스페이서 서열에 상보적인 내인성 DNA 가닥의 상응하는 R 루프 ssDNA 구조를 형성한다.
대상체
본원에 사용된 용어 "대상체"는 개별 유기체, 예를 들어 개별 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 양, 염소, 소, 고양이 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 척추동물, 양서류, 파충류, 어류, 곤충, 파리 또는 선충류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연구용 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전자 조작된, 예를 들어 유전자 조작된 비-인간 대상체이다. 대상체는 어느 하나의 성별일 수 있고 임의의 발달 단계일 수 있다.
분할 인테인
인테인은 가장 빈번하게는 인접 도메인으로서 발견되지만, 일부는 자연 분할 형태로 존재한다. 이러한 경우에, 2개의 단편은 별개의 폴리펩티드로서 발현되고, 이는 스플라이싱, 소위 단백질 트랜스-스플라이싱이 일어나기 전에 회합되어야 한다.
예시적인 분할 인테인은 2개의 서브유닛, 즉 DnaE-N 및 DnaE-C를 포함하는 Ssp DnaE 인테인이다. 2개의 상이한 서브유닛은 별개의 유전자, 즉 각각 DnaE-N 및 DnaE-C 서브유닛을 코딩하는 dnaE-n 및 dnaE-c에 의해 코딩된다. DnaE는 시네코시스티스(Synechocystis) 종 PCC6803 내의 자연 발생 분할 인테인이고, 각각 DnaE-N 또는 DnaE-C와의 융합체를 포함하는 2개의 별개의 단백질의 트랜스-스플라이싱을 지시할 수 있다.
추가의 자연 발생 또는 조작된 분할-인테인 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 본원에 기재된 전체-인테인 서열 또는 관련 기술분야에서 입수가능한 것으로부터 제조될 수 있다. 분할-인테인 서열의 예는 문헌 [Stevens et al., "A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications," PNAS, 2017, Vol.114: 8538-8543; Iwai et al., "Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme, FEBS Lett, 580: 1853-1858]에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 추가의 분할 인테인 서열은, 예를 들어 WO 2013/045632, WO 2014/055782, WO 2016/069774 및 EP2877490에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 생체내 및 시험관내 트랜스로의 단백질 스플라이싱이 기재되어 있으며 (Shingledecker, et al., Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBO J. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887-15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)), 이는 예를 들어 2개의 개별적으로-발현된 절반으로부터 완전한 PE 융합 단백질의 형성에 관하여 도 66 및 67에 제시된 바와 같이, 기능적 생성물을 형성하기 위해 후속적으로 라이게이션을 거치는 2개의 불활성 단편에 대해 단백질로서의 발현 기회를 제공한다.
표적 부위
용어 "표적 부위"는 본원에 개시된 프라임 편집제 (PE)에 의해 편집되는 핵산 분자 내의 서열을 지칭한다. 표적 부위는 프라임 편집제 (PE) 및 gRNA의 복합체가 결합하는 핵산 분자 내의 서열을 추가로 지칭한다.
tPERT
"트랜스 프라임 편집제 RNA 주형 (tPERT)"에 대한 정의를 참조한다.
시간적 제2-가닥 닉킹
본원에 사용된 용어 "시간적 제2-가닥 닉킹"은 비편집된 가닥에의 제2 닉의 설치가 단지 편집된 가닥에 목적하는 편집이 설치된 후에만 발생하는 것인 제2 가닥 닉킹의 변형을 지칭한다. 이는 이중 가닥 DNA 파괴로 이어질 수 있는 양쪽 가닥 상의 공동 닉을 피한다. 제2-가닥 닉킹 가이드 RNA는 제2 가닥 닉이 목적하는 편집이 설치될 때까지 도입되지 않도록 시간적 제어를 위해 설계된다. 이는 단지 편집된 가닥에만 매칭되고 원래 대립유전자에는 매칭되지 않는 스페이서 서열을 갖는 gRNA를 설계함으로써 달성된다. 이러한 전략을 사용할 때, 프로토스페이서와 비편집된 대립유전자 사이의 미스매치는 PAM 가닥 상의 편집 사건이 일어날 때까지 sgRNA에 의한 닉킹을 불리하게 할 것이다.
트랜스 프라임 편집
본원에 사용된 용어 "트랜스 프라임 편집"은 분할 PEgRNA를 이용하는 프라임 편집의 변형된 형태를 지칭하며, 즉 여기서 PEgRNA는 2개의 별개의 분자: sgRNA 및 트랜스 프라임 편집 RNA 주형 (tPERT)으로 분리된다. sgRNA는 목적하는 게놈 표적 부위에 프라임 편집제를 표적화하는 (또는 보다 일반적으로, 프라임 편집제의 napDNAbp 성분을 표적화하는) 역할을 하는 반면, tPERT는 일단 tPERT가 프라임 편집제 상에 및 tPERT 상에 위치한 결합 도메인의 상호작용에 의해 프라임 편집제에 트랜스로 동원되면 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 새로운 DNA 서열을 표적 유전자좌에 기록하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 결합 도메인은 RNA-단백질 동원 모이어티, 예컨대 tPERT 상에 위치한 MS2 압타머 및 프라임 편집제에 융합된 MS2cp 단백질을 포함할 수 있다. 트랜스 프라임 편집의 이점은 가이드 RNA로부터 DNA 합성 주형을 분리함으로써, 잠재적으로 보다 긴 길이의 주형을 사용할 수 있다는 것이다.
트랜스 프라임 편집의 실시양태는 도 3g 및 3h에 제시된다. 도 3g는 좌측에 트랜스 프라임 편집제 복합체의 조성 ("RP-PE:gRNA 복합체)을 보여주며, 이는 각각의 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제) 및 rPERT 동원 단백질 (예를 들어, MS2sc)에 융합된 napDNAbp를 포함하고 가이드 RNA와 복합체화된다. 도 3g는 추가로 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 서열을 포함하는 PEgRNA의 연장 아암 특색을 포함하는 별개의 tPERT 분자를 보여준다. tPERT 분자는 또한 RNA-단백질 동원 도메인 (이 경우에, 스템 루프 구조이고, 예를 들어 MS2 압타머일 수 있음)을 포함한다. 도 3h에 기재된 과정에 도시된 바와 같이, RP-PE:gRNA 복합체는 표적 DNA 서열에 결합하여 그를 닉킹한다. 이어서, 동원 단백질 (RP)은 tPERT를 동원하여 DNA 표적 부위에 결합된 프라임 편집제 복합체에 공동-국재화시킴으로써, 프라이머 결합 부위가 닉킹된 가닥 상의 프라이머 서열에 결합하게 하고, 후속적으로 폴리머라제 (예를 들어, RT)가 tPERT의 5'까지 DNA 합성 주형에 대해 단일 가닥의 DNA를 합성하게 한다.
tPERT가 RNA-단백질 동원 도메인의 5' 단부 상에 PBS 및 DNA 합성 주형을 포함하는 것으로서 도 3g 및 도 3h에 제시되어 있지만, 다른 구성의 tPERT는 RNA-단백질 동원 도메인의 3' 단부 상에 PBS 및 DNA 합성 주형이 위치하도록 설계될 수 있다. 그러나, DNA의 단일 가닥의 합성이 tPERT의 5' 단부에서 자연적으로 종결될 것이고, 따라서 프라임 편집의 DNA 합성 단계 동안 주형으로서 RNA-단백질 동원 도메인의 임의의 부분을 사용할 위험이 없다는 점에서 5' 연장을 갖는 tPERT가 이점을 갖는다.
트랜스 프라임 편집제 RNA 주형 (tPERT)
본원에 사용된 "트랜스 프라임 편집제 RNA 주형 (tPERT)"은 PEgRNA를 2개의 별개의 분자: 가이드 RNA 및 tPERT 분자로 분리함으로써 작동하는 프라임 편집의 변형된 버전인 트랜스 프라임 편집에 사용되는 성분을 지칭한다. tPERT 분자는 표적 DNA 부위에서 프라임 편집제 복합체와 공동-국재화되어, 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 프라임 편집제로 트랜스로 가져오도록 프로그램화된다. 예를 들어, (1) RP-PE:gRNA 복합체 및 (2) RNA-단백질 동원 도메인에 연결된 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 tPERT를 포함하는 2-성분 시스템을 보여주는 트랜스 프라임 편집제 (tPE)의 실시양태에 대해 도 3g를 참조하며, 여기서 RP-PE:gRNA 복합체의 RP (동원 단백질) 성분은 tPERT를 편집될 표적 부위로 동원함으로써 PBS 및 DNA 합성 주형을 프라임 편집제와 트랜스로 회합시킨다. 상기 또 다른 방식에서, tPERT는 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 PEgRNA의 연장 아암을 (모두 또는 일부) 함유하도록 조작된다.
전이
본원에 사용된 "전이"는 퓨린 핵염기의 상호교환 (A ↔ G) 또는 피리미딘 핵염기의 상호교환 (C ↔ T)을 지칭한다. 이러한 부류의 상호교환은 유사한 형상의 핵염기를 수반한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 표적 DNA 분자에서 1개 이상의 전이를 유도할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한 동일한 표적 DNA 분자에서 전이 및 전환 둘 다를 유도할 수 있다. 이들 변화는 A ↔ G, G ↔ A, C ↔ T 또는 T ↔ C를 수반한다. 왓슨-크릭 쌍형성된 핵염기를 갖는 이중 가닥 DNA의 맥락에서, 전환은 하기 염기 쌍 교환을 지칭한다: A:T ↔ G:C, G:G ↔ A:T, C:G ↔ T:A 또는 T:A ↔ C:G. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 표적 DNA 분자에서 1개 이상의 전이를 유도할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한 동일한 표적 DNA 분자에서 전이 및 전환 둘 다, 뿐만 아니라 결실 및 삽입을 포함한 다른 뉴클레오티드 변화를 유도할 수 있다.
전환
본원에 사용된 "전환"은 퓨린 핵염기와 피리미딘 핵염기 또는 그 반대의 상호교환을 지칭하며, 따라서 유사하지 않은 형상을 갖는 핵염기의 상호교환을 수반한다. 이들 변화는 T ↔ A, T ↔ G, C ↔ G, C ↔ A, A ↔ T, A ↔ C, G ↔ C 및 G ↔ T를 수반한다. 왓슨-크릭 쌍형성된 핵염기를 갖는 이중 가닥 DNA의 맥락에서, 전환은 하기 염기 쌍 교환을 지칭한다: T:A ↔ A:T, T:A ↔ G:C, C:G ↔ G:C, C:G ↔ A:T, A:T ↔ T:A, A:T ↔ C:G, G:C ↔ C:G 및 G:C ↔ T:A. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 표적 DNA 분자에서 1개 이상의 전환을 유도할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한 동일한 표적 DNA 분자에서 전이 및 전환 둘 다, 뿐만 아니라 결실 및 삽입을 포함한 다른 뉴클레오티드 변화를 유도할 수 있다.
치료
용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애 또는 그의 1종 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그의 발병을 지연시키거나 또는 그의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상 개입을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애 또는 그의 1종 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그의 발병을 지연시키거나 또는 그의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상 개입을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 1종 이상의 증상이 발생한 후에 및/또는 질환이 진단된 후에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료는, 예를 들어 증상의 발병을 방지하거나 지연시키거나 또는 질환의 발병 또는 진행을 억제하기 위해 증상의 부재 하에 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 발병 전에 (예를 들어, 증상의 병력에 비추어 및/또는 유전적 또는 다른 감수성 인자에 비추어) 감수성 개체에게 투여될 수 있다. 치료는 또한 증상이 해소된 후에, 예를 들어 그의 재발을 방지하거나 지연시키기 위해 계속될 수 있다.
트리뉴클레오티드 반복 장애
본원에 사용된 "트리뉴클레오티드 반복 장애" (또는 대안적으로, "확장 반복 장애" 또는 "반복부 확장 장애")는 특정 트리뉴클레오티드가 특정 유전자 또는 인트론에서 반복되는 일종의 돌연변이인 "트리뉴클레오티드 반복부 확장"에 의해 유발되는 유전 장애의 세트를 지칭한다. 트리뉴클레오티드 반복은 한 때 게놈에서 흔한 반복인 것으로 생각되었지만, 1990년대에 이들 장애를 명확히 하였다. DNA의 이들 겉보기 '양성' 스트레치는 때때로 확장되어 질환을 유발할 수 있다. 여러 규정된 특색이 트리뉴클레오티드 반복부 확장에 의해 유발된 장애 사이에 공유된다. 첫째로, 돌연변이체 반복은 체세포 및 배선 불안정성 둘 다를 나타내고, 보다 빈번하게는 후속 전달에서 축소되기보다는 확장된다. 둘째로, 보다 이른 연령에서의 발병 및 후속 세대에서의 표현형의 중증도 증가 (예상)는 일반적으로 보다 긴 반복 길이와 상관관계가 있다. 최종적으로, 질환 대립유전자의 모 기원이 종종 예상에 영향을 미칠 수 있으며, 부계 전달이 많은 이들 장애에 대한 보다 큰 확장 위험을 보유한다.
트리플렛 확장은 DNA 복제 동안 슬리피지에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 이들 영역에서의 DNA 서열의 반복적 성질로 인해, DNA 복제 동안 합성되는 모 가닥과 딸 가닥 사이의 상보적 염기 쌍형성을 유지하면서 '루프 아웃' 구조가 형성될 수 있다. 루프 아웃 구조가 딸 가닥 상의 서열로부터 형성되는 경우에, 이는 반복 수의 증가를 유발할 것이다. 그러나, 루프 아웃 구조가 모 가닥 상에 형성되는 경우에는, 반복 수의 감소가 발생한다. 이들 반복의 확장은 감소보다 더 흔한 것으로 보인다. 일반적으로, 확장이 클수록 질환을 유발하거나 질환의 중증도를 증가시킬 가능성이 크다. 이러한 특성이 트리뉴클레오티드 반복 장애에서 나타나는 예상의 특징을 가져온다. 예상은 발병 연령이 감소하는 경향 및 증상의 중증도가 이들 반복의 확장으로 인해 이환 가족의 후속 세대를 통해 증가하는 경향을 기재한다.
뉴클레오티드 반복 장애는 트리플렛 반복이 비-코딩 영역에서 발생하는 것 (즉, 비-코딩 트리뉴클레오티드 반복 장애) 또는 코딩 영역에서 발생하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 특히 유약 X 증후군 (FRAXA), 유약 XE MR (FRAXE), 프리드라이히 운동실조 (FRDA), 근긴장성 이영양증 (DM), 척수소뇌성 운동실조 유형 8 (SCA8) 및 척수소뇌성 운동실조 유형 12 (SCA12)를 포함할 수 있는 뉴클레오티드 반복 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
상류
본원에 사용된 용어 "상류" 및 "하류"는 5'에서 3' 방향으로 배향되는 핵산 분자 (단일 가닥이든 이중 가닥이든)에 위치한 적어도 2개의 요소의 선형 위치를 정의하는 상대성 용어이다. 특히, 제1 요소는 핵산 분자에서 제2 요소의 상류에 있으며, 여기서 제1 요소는 제2 요소에 대해 5'인 어딘가에 위치한다. 예를 들어, SNP가 닉 부위의 5' 측면 상에 있는 경우에 SNP는 Cas9-유도된 닉 부위의 상류에 있다. 반대로, 제1 요소는 핵산 분자에서 제2 요소의 하류에 있으며, 여기서 제1 요소는 제2 요소에 대해 3'인 어딘가에 위치한다. 예를 들어, SNP가 닉 부위의 3' 측면 상에 있는 경우에 SNP는 Cas9-유도된 닉 부위의 하류에 있다. 핵산 분자는 DNA (이중 또는 단일 가닥), RNA (이중 또는 단일 가닥), 또는 DNA와 RNA의 하이브리드일 수 있다. 분석은 단일 가닥 핵산 분자 및 이중 가닥 분자에 대해 동일하며, 이는 용어 상류 및 하류가 이중 가닥 분자의 어느 가닥이 고려되는지를 선택할 필요가 있다는 것을 제외하고는 핵산 분자의 단일 가닥만을 언급하기 때문이다. 종종, 적어도 2개의 요소의 위치적 상대성을 결정하는데 사용될 수 있는 이중 가닥 DNA의 가닥은 "센스" 또는 "코딩" 가닥이다. 유전학에서, "센스" 가닥은 5'에서 3'로 진행하는 이중 가닥 DNA 내의 절편이며, 이는 3'에서 5'로 진행하는 DNA의 안티센스 가닥 또는 주형 가닥에 상보적이다. 따라서, 예로서, SNP 핵염기는 SNP 핵염기가 센스 또는 코딩 가닥 상의 프로모터의 3' 측면 상에 존재하는 경우에 게놈 DNA (이중 가닥임) 내의 프로모터 서열의 "하류"에 있다.
변이체
본원에 사용된 용어 "변이체"는 자연에서 발생하는 것으로부터 벗어난 패턴을 갖는 품질을 나타내는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 예를 들어 변이체 Cas9는 야생형 Cas9 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 잔기에서 1개 이상의 변화를 포함하는 Cas9이다. 용어 "변이체"는 참조 서열과 적어도 75% 또는 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99% 퍼센트 동일성을 갖고 참조 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능적 활성 또는 활성들을 갖는 상동 단백질을 포괄한다. 상기 용어는 또한 참조 서열의 돌연변이체, 말단절단물 또는 도메인을 포괄하며, 이는 참조 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능적 활성 또는 활성들을 나타낸다.
벡터
본원에 사용된 용어 "벡터"는 관심 유전자를 코딩하도록 변형될 수 있고, 숙주 세포 내로 진입하여, 숙주 세포 내에서 돌연변이 및 복제된 다음, 복제된 형태의 벡터를 또 다른 숙주 세포 내로 전달할 수 있는 핵산을 지칭한다. 예시적인 적합한 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 박테리오파지 및 사상 파지 및 접합 플라스미드를 포함한다. 추가의 적합한 벡터는 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
야생형
본원에 사용된 용어 "야생형"은 통상의 기술자에 의해 이해되는 관련 기술분야의 용어이고, 돌연변이체 또는 변이체 형태와 구별되는, 자연에서 발생하는 유기체, 균주, 유전자 또는 특징의 전형적 형태를 의미한다.
5' 내인성 DNA 플랩
본원에 사용된 용어 "5' 내인성 DNA 플랩"은 표적 DNA 내의 PE-유도된 닉 부위의 바로 하류에 위치한 DNA의 가닥을 지칭한다. PE에 의한 표적 DNA 가닥의 닉킹은 닉 부위의 상류 측 상에 3' 히드록실 기 및 닉 부위의 하류 측 상에 5' 히드록실 기를 노출시킨다. 3' 히드록실 기로 끝나는 내인성 가닥은 프라임 편집제의 DNA 폴리머라제를 프라이밍하는데 사용된다 (예를 들어, 여기서 DNA 폴리머라제는 리버스 트랜스크립타제임). 닉 부위의 하류 측 상에 노출된 5' 히드록실 기로 시작하는 내인성 가닥은 "5' 내인성 DNA 플랩"으로 지칭되고, 궁극적으로 제거되며, PEgRNA의 연장부에 의해 코딩되는 새로 합성된 대체 가닥 (즉, "3' 대체 DNA 플랩")에 의해 대체된다.
5' 내인성 DNA 플랩 제거
본원에 사용된 용어 "5' 내인성 DNA 플랩 제거" 또는 "5' 플랩 제거"는 RT-합성된 단일 가닥 DNA 플랩이 내인성 DNA에 경쟁적으로 침입하여 혼성화할 때 형성되는 5' 내인성 DNA 플랩의 제거를 지칭하며, 이 과정에서 내인성 가닥을 대체한다. 이러한 내인성 대체된 가닥을 제거하는 것은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 목적하는 생성물의 형성을 향해 반응을 구동할 수 있다. 세포 자신의 DNA 복구 효소 (예를 들어, 플랩 엔도뉴클레아제, 예컨대 EXO1 또는 FEN1)는 5' 내인성 플랩의 제거 또는 절제를 촉매할 수 있다. 또한, 숙주 세포는 상기 5' 내인성 플랩의 제거를 촉매하는 1종 이상의 효소 (예를 들어, 플랩 엔도뉴클레아제)를 발현하도록 형질전환되어, 상기 과정을 생성물 형성을 향해 구동할 수 있다. 플랩 엔도뉴클레아제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Patel et al., "Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends," Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519 및 Tsutakawa et al., "Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily," Cell, 2011, 145(2): 198-211] (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 찾아볼 수 있다.
3' 대체 DNA 플랩
본원에 사용된 용어 "3' 대체 DNA 플랩" 또는 간단히 "대체 DNA 플랩"은 프라임 편집제에 의해 합성되고 프라임 편집제 PEgRNA의 연장 아암에 의해 코딩되는 DNA의 가닥을 지칭한다. 보다 특히, 3' 대체 DNA 플랩은 PEgRNA의 폴리머라제 주형에 의해 코딩된다. 3' 대체 DNA 플랩은 편집된 서열 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화)도 함유한다는 것을 제외하고는 5' 내인성 DNA 플랩과 동일한 서열을 포함한다. 3' 대체 DNA 플랩은 표적 DNA에 어닐링되어, 5' 내인성 DNA 플랩 (이는 예를 들어 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 예컨대 FEN1 또는 EXO1에 의해 절제될 수 있음)을 대체 또는 교체시킨 다음, 라이게이션되어 3' 대체 DNA 플랩의 3' 단부를 내인성 DNA의 노출된 5' 히드록실 단부 (5' 내인성 DNA 플랩의 절제 후에 노출됨)에 연결함으로써, 포스포포디에스테르 결합을 재형성하고 3' 대체 DNA 플랩을 설치하여 1개의 편집된 가닥 및 1개의 비편집된 가닥을 함유하는 헤테로듀플렉스 DNA를 형성한다. DNA 복구 과정은 헤테로듀플렉스를 분해하여 편집된 가닥 내의 정보를 상보적 가닥에 카피함으로써 편집을 DNA 내에 영구적으로 설치한다. 이러한 분해 과정은 비편집된 가닥을 닉킹함으로써, 즉 본원에 기재된 바와 같은 "제2-가닥 닉킹"에 의해 추가로 구동되어 완료될 수 있다.
특정 실시양태의 상세한 설명
게놈 편집을 위한 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 시스템의 채택은 생명 과학을 혁신시켰다1-3. CRISPR을 사용한 유전자 파괴가 현재 상용화되어 있지만, 단일 뉴클레오티드 편집의 정확한 설치는 다수의 질환-원인 돌연변이를 연구하거나 교정하는데 필요함에도 불구하고 주요 도전과제로 남아있다. 상동성 지정 복구 (HDR)는 이러한 편집을 달성할 수 있지만, 낮은 효율 (종종 <5%), 공여자 DNA 복구 주형에 대한 요건, 및 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB) 형성이라는 유해 효과를 겪는다. 최근에, 데이비드 리우 교수 등의 실험실이 DSB 없이 효율적인 단일 뉴클레오티드 편집을 달성하는 염기 편집을 개발하였다. 염기 편집제 (BE)는 CRISPR 시스템을 염기-변형 데아미나제 효소와 조합하여 표적 C·G 또는 A·T 염기 쌍을 각각 A·T 또는 G·C로 전환시킨다4-6. 전세계적으로 연구자들에 의해 이미 널리 사용되고 있기는 하지만, 현행 BE는 12개의 가능한 염기 쌍 전환 중 단지 4개만을 가능하게 하고, 작은 삽입 또는 결실은 교정할 수 없다. 더욱이, 염기 편집의 표적화 범주는 표적 염기에 인접한 비-표적 C 또는 A 염기의 편집 ("방관자 편집")에 의해 및 PAM 서열이 표적 염기로부터 15±2 bp에 존재해야 한다는 요건에 의해 제한된다. 따라서, 이들 제한을 극복하는 것은 게놈 편집의 기초 연구 및 치료 용도를 크게 확장시킬 것이다.
본 개시내용은 그의 주요 제한을 극복하면서 염기 편집의 많은 이익-즉, 이중 가닥 파괴 및 공여자 DNA 복구 주형의 회피-을 제공하는 새로운 정밀 편집 접근법을 제안한다. 본원에 기재된 제안된 접근법은 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)를 사용하여 표적 게놈 부위에의 편집된 DNA 가닥의 직접 설치를 달성한다. 본원에 논의된 설계에서, CRISPR 가이드 RNA (gRNA)는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열을 보유하도록 조작될 것이다. CRISPR 뉴클레아제 (Cas9)-닉킹된 표적 부위 DNA는 변형된 gRNA 상의 주형 서열의 역전사를 위한 프라이머로서의 역할을 하여, 임의의 목적하는 뉴클레오티드 편집의 직접 혼입을 가능하게 할 것이다.
따라서, 본 발명은 부분적으로 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)의 메카니즘이 (예를 들어, 도 1a-1f의 다양한 실시양태에 도시된 바와 같이) 높은 효율 및 유전적 유연성으로 정밀 CRISPR/Cas-기반 게놈 편집을 수행하기 위해 활용 또는 적합화될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 본 발명자들은 변형된 가이드 RNA ("연장된 가이드 RNA")에 의해 특이적 DNA 서열을 표적화하기 위해 Cas 단백질-리버스 트랜스크립타제 융합체를 사용하고, 표적 부위에 단일 가닥 닉을 생성하고, 닉킹된 DNA를 연장된 가이드 RNA 내로 통합된 조작된 리버스 트랜스크립타제 주형의 역전사를 위한 프라이머로서 사용하는 것을 본원에서 제안하였다. 새로 합성된 가닥은 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 결실 또는 삽입 또는 그의 조합)의 포함을 제외하고는 게놈 표적 서열에 상동일 것이다. DNA의 새로 합성된 가닥은 단일 가닥 DNA 플랩으로서 지칭될 수 있으며, 이는 상보적 상동 내인성 DNA 가닥과의 혼성화에 대해 경쟁함으로써 상응하는 내인성 가닥을 대체할 것이다. 이러한 혼성화된 중간체의 분해는 생성된 내인성 DNA의 대체 플랩의 제거 (예를 들어, 5' 단부 DNA 플랩 엔도뉴클레아제인 FEN1을 사용함), 합성된 단일 가닥 DNA 플랩의 표적 DNA에 대한 라이게이션, 및 세포 DNA 복구 및/또는 복제 과정의 결과로서 목적하는 뉴클레오티드 변화의 동화를 포함할 수 있다. 주형화된 DNA 합성은 단일 뉴클레오티드 정밀도를 제공하기 때문에, 이러한 접근법의 범주는 매우 넓고, 기초 과학 및 요법에서 무수한 적용에 사용될 수 있을 것으로 예측된다.
[1] napDNAbp
본원에 기재된 프라임 편집제 및 트랜스 프라임 편집제는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 포함할 수 있다.
한 측면에서, napDNAbp는 적어도 1개의 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA 또는 PEgRNA)과 회합되거나 복합체화될 수 있으며, 이는 napDNAbp를 가이드 핵산 또는 그의 부분 (예를 들어, DNA 표적의 프로토스페이서에 어닐링되는 가이드 RNA의 스페이서)에 상보적인 DNA 가닥 (즉, 표적 가닥)을 포함하는 DNA 서열에 국재화시킨다. 다시 말해서, 가이드 핵산은 napDNAbp (예를 들어, Cas9 또는 등가물)를 DNA 내의 프로토스페이서의 상보적 서열에 국재화시키고 결합하도록 "프로그램화한다".
임의의 적합한 napDNAbp가 본원에 기재된 프라임 편집제에 사용될 수 있다. 다양한 실시양태에서, napDNAbp는 임의의 유형 II, 유형 V, 또는 유형 VI CRISPR-Cas 효소를 포함한 임의의 부류 2 CRISPR-Cas 시스템일 수 있다. 게놈 편집을 위한 도구로서 CRISPR-Cas의 급속한 개발을 고려할 때, CRISPR-Cas 효소, 예컨대 Cas9 및 Cas9 오르토로그를 기재하고/거나 확인하는데 사용되는 명명법에서 지속적인 개발이 있어왔다. 본 출원은 기존 및/또는 신규일 수 있는 명명법으로 CRISPR-Cas 효소를 언급한다. 통상의 기술자는 기존 (즉, "레거시")이든 또는 새로운 명명법이든, 사용되는 명명법에 기초하여 본 출원에서 언급되는 특정 CRISPR-Cas 효소를 확인할 수 있을 것이다. CRISPR-Cas 명명법은 문헌 [Makarova et al., "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?," The CRISPR Journal, Vol. 1. No. 5, 2018]에 광범위하게 논의되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 본 출원에서 임의의 주어진 경우에 사용된 특정한 CRISPR-Cas 명명법은 어떠한 방식으로든 제한하는 것이 아니며, 통상의 기술자는 어느 CRISPR-Cas 효소가 언급되는지 확인할 수 있을 것이다.
예를 들어, 하기 유형 II, 유형 V, 및 유형 VI 부류 2 CRISPR-Cas 효소는 하기 관련 기술분야-인식의 기존 (즉, 레거시) 및 새로운 명칭을 갖는다. 각각의 이들 효소 및/또는 그의 변이체는 본원에 기재된 프라임 편집제와 함께 사용될 수 있다:
Figure pct00007
* 문헌 [Makarova et al., The CRISPR Journal, Vol. 1, No. 5, 2018] 참조
이론에 얽매이지는 않지만, 본원에 고려된 특정 napDNAbp의 작용 메카니즘은 R-루프를 형성하여 napDNAbp가 이중 가닥 DNA 표적의 풀림을 유도하고, 그에 의해 napDNAbp에 의해 결합된 영역에서 가닥을 분리하는 단계를 포함한다. 이어서, 가이드 RNA 스페이서는 "표적 가닥"에 프로토스페이서 서열에서 혼성화한다. 이는 표적 가닥에 상보적인 "비-표적 가닥"을 대체하며, 이는 R-루프의 단일 가닥 영역을 형성한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 1개 이상의 뉴클레아제 활성을 포함하며, 이는 이어서 DNA를 절단하여 다양한 유형의 병변을 남긴다. 예를 들어, napDNAbp는 제1 위치에서 비-표적 가닥을 절단하고/거나 제2 위치에서 표적 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 활성에 따라, 표적 DNA는 절단되어 "이중 가닥 파괴"를 형성할 수 있고, 이에 의해 양쪽 가닥이 절단된다. 다른 실시양태에서, 표적 DNA는 단일 부위에서만 절단될 수 있고, 즉, DNA는 1개의 가닥 상에서 "닉킹"된다. 상이한 뉴클레아제 활성을 갖는 예시적인 napDNAbp는 "Cas9 닉카제" ("nCas9") 및 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 탈활성화된 Cas9 ("기능상실 Cas9" 또는 "dCas9")를 포함한다.
본원에 개시된 프라임 편집제와 관련하여 사용될 수 있는 다양한 napDNAbp에 대한 하기 설명은 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 프라임 편집제는 정규 SpCas9, 또는 임의의 오르토로그 Cas9 단백질, 또는 임의의 변이체 Cas9 단백질-공지되어 있거나 또는 방향적 진화상 과정 또는 달리 돌연변이유발 과정을 통해 제조 또는 진화될 수 있는 Cas9의 임의의 자연 발생 변이체, 돌연변이체, 또는 달리 조작된 버전 포함-을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, Cas9 또는 Cas9 변이체는 닉카제 활성을 갖고, 즉 표적 DNA 서열의 가닥만을 절단한다. 다른 실시양태에서, Cas9 또는 Cas9 변이체는 불활성 뉴클레아제를 가지며, 즉 "기능상실" Cas9 단백질이다. 사용될 수 있는 다른 변이체 Cas9 단백질은 정규 SpCas9보다 더 작은 분자량을 갖거나 (예를 들어, 보다 용이한 전달을 위함), 또는 변형되거나 재배열된 1차 아미노산 구조를 갖는 (예를 들어, 원형 순열체 포맷) 것이다.
본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 수렴 진화의 결과인 Cas12a (Cpf1) 및 Cas12b1 단백질을 포함한 Cas9 등가물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 napDNAbp (예를 들어, SpCas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물)는 또한 그의 PAM 특이성을 변경/증진시키는 다양한 변형을 함유할 수 있다. 마지막으로, 본 출원은 참조 Cas9 서열, 예컨대 참조 SpCas9 정규 서열 또는 참조 Cas9 등가물 (예를 들어, Cas12a (Cpf1))과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 임의의 Cas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물을 고려한다.
napDNAbp는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)-연관 뉴클레아제일 수 있다. 상기 개략된 바와 같이, CRISPR은 이동성 유전 요소 (바이러스, 전위가능 요소 및 접합 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동성 요소에 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사 및 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, 프리-crRNA의 교정 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 필요로 한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱을 위한 가이드로서의 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 핵산내부분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥이 먼저 핵산내부분해적으로 절단된 다음, 핵산외부분해적으로 3'-5' 트리밍된다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 둘 다의 RNA를 필요로 한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 내로 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek M. et al., Science 337:816-821 (2012)]을 참조하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 표적 서열의 위치에서, 예컨대 표적 서열 내에서 및/또는 표적 서열의 상보체 내에서 하나 또는 양쪽 가닥의 절단을 지시한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개 또는 그 초과의 염기 쌍 내에서 하나 또는 양쪽 가닥의 절단을 지시한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 돌연변이된 napDNAbp가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양쪽 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 napDNAbp를 코딩한다. 예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파르테이트에서 알라닌으로의 치환 (D10A)은 Cas9를 양쪽 가닥을 절단하는 뉴클레아제로부터 닉카제 (단일 가닥을 절단함)로 전환시킨다. Cas9를 닉카제로 만드는 돌연변이의 다른 예는, 비제한적으로, 정규 SpCas9 서열, 또는 다른 Cas9 변이체 또는 Cas9 등가물에서의 등가의 아미노산 위치와 관련하여 H840A, N854A, 및 N863A를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Cas 단백질"은 자연으로부터 수득된 전장 Cas 단백질, 자연 발생 Cas 단백질과 상이한 서열을 갖는 재조합 Cas 단백질, 또는 그럼에도 불구하고 개시된 방법에 필요한 모든 또는 유의한 양의 필수적인 기본 기능, 즉 (i) 표적 DNA에 대한 Cas 단백질의 핵산 프로그램가능한 결합의 보유, 및 (ii) 하나의 가닥 상의 표적 DNA 서열을 닉킹하는 능력을 보유하는 Cas 단백질의 임의의 단편을 지칭한다. 본원에서 고려되는 Cas 단백질은 CRISPR Cas9 단백질, 뿐만 아니라 Cas9 등가물, 변이체 (예를 들어, Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9)) 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그 (자연 발생이든 또는 비-자연 발생 (예를 들어, 조작 또는 재조합)이든)를 포괄하고, Cas12a (Cpf1), Cas12e (CasX), Cas12b1 (C2c1), Cas12b2, Cas12c (C2c3), C2c4, C2c8, C2c5, C2c10, C2c9 Cas13a (C2c2), Cas13d, Cas13c (C2c7), Cas13b (C2c6), 및 Cas13b를 포함한 임의의 부류 2 CRISPR 시스템 (예를 들어, 유형 II, V, VI)으로부터의 Cas9 등가물을 포함할 수 있다. 추가의 Cas-등가물은 문헌 [Makarova et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector," Science 2016; 353(6299) 및 Makarova et al., "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?," The CRISPR Journal, Vol. 1. No. 5, 2018]에 기재되어 있으며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제" 또는 "Cas9 모이어티" 또는 "Cas9 도메인"은 임의의 유기체로부터의 임의의 자연 발생 Cas9, 그의 임의의 자연 발생 Cas9 등가물 또는 기능적 단편, 임의의 유기체로부터의 임의의 Cas9 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그, 및 자연 발생 또는 조작된 Cas9의 임의의 돌연변이체 또는 변이체를 포괄한다. 용어 Cas9는 특별히 제한적인 것으로 의도되지 않으며, "Cas9 또는 등가물"로 지칭될 수 있다. 예시적인 Cas9 단백질은 본원에 추가로 기재되고/거나 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용은 본 발명의 프라임 편집제 (PE)에 사용되는 특정한 Cas9와 관련하여 제한되지 않는다.
본원에 언급된 바와 같이, Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).
Cas9 및 Cas9 등가물의 예는 하기와 같이 제공되지만; 이들 구체적 예는 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용의 프라이머 편집제는 임의의 적합한 Cas9 또는 Cas9 등가물을 포함한, 임의의 적합한 napDNAbp를 사용할 수 있다.
A. 야생형 정규 SpCas9
한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라이머 편집제 구축물은 에스. 피오게네스로부터의 "정규 SpCas9" 뉴클레아제를 포함할 수 있으며, 이는 게놈 조작을 위한 도구로서 널리 사용되어 왔고, 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 효소의 유형 II 하위군으로서 카테고리화된다. 이 Cas9 단백질은 2개의 별개의 뉴클레아제 도메인을 함유하는 대형의, 다중-도메인 단백질이다. 점 돌연변이를 Cas9 내로 도입하여 하나 또는 둘 다의 뉴클레아제 활성을 없앨 수 있으며, 이는 각각, sgRNA-프로그램화된 방식으로 DNA에 결합하는 그의 능력을 여전히 보유하는 닉카제 Cas9 (nCas9) 또는 기능상실 Cas9 (dCas9)를 생성한다. 원칙적으로, 또 다른 단백질 또는 도메인에 융합될 경우, Cas9 또는 그의 변이체 (예를 들어, nCas9)는 단순히 적절한 sgRNA와의 공동-발현에 의해 그러한 단백질을 사실상 모든 DNA 서열에 표적화할 수 있다. 본원에 사용된 정규 SpCas9 단백질은 하기 아미노산 서열을 갖는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 야생형 단백질을 지칭한다:
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
본원에 기재된 프라임 편집제는 정규 SpCas9, 또는 상기 제공된 야생형 Cas9 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 변이체를 포함할 수 있다. 이들 변이체는 하기를 포함하는, 스위스프롯 수탁 번호 Q99ZW2 (서열식별번호: 18) 엔트리로 보고된 임의의 공지된 돌연변이를 포함하는, 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 SpCas9 변이체를 포함할 수 있다:
Figure pct00012
본 개시내용에 사용될 수 있는 다른 야생형 SpCas9 서열은 하기를 포함한다:
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
본원에 기재된 프라임 편집제는 임의의 상기 SpCas9 서열, 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
B. 야생형 Cas9 오르토로그
다른 실시양태에서, Cas9 단백질은 에스. 피오게네스로부터의 정규 Cas9와 상이한 또 다른 박테리아 종으로부터의 야생형 Cas9 오르토로그일 수 있다. 예를 들어, 하기 Cas9 오르토로그가 본 명세서에 기재된 프라임 편집제 구축물과 관련하여 사용될 수 있다. 또한, 하기 오르토로그 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 임의의 변이체 Cas9 오르토로그가 또한 본 발명의 프라임 편집제와 함께 사용될 수 있다.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
본원에 기재된 프라임 편집제는 임의의 상기 Cas9 오르토로그 서열, 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
napDNAbp는 임의의 적합한 상동체 및/또는 오르토로그 또는 자연 발생 효소, 예컨대 Cas9를 포함할 수 있다. Cas9 상동체 및/또는 오르토로그는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필루스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종에서 기재되어 있다. 바람직하게는, Cas 모이어티는 닉카제로서 구성되고 (예를 들어, 돌연변이유발되거나, 재조합적으로 조작되거나, 또는 달리 자연으로부터 수득됨), 즉 표적 이중 가닥의 단일 가닥만을 절단할 수 있다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737]에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성 (예를 들어, 불활성화된) DNA 절단 도메인을 가지며, 즉 Cas9는 닉카제이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 3의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 상기 표에서 Cas9 오르토로그 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
C. 기능상실 Cas9 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 Cas9의 둘 다의 뉴클레아제 도메인, 즉 RuvC 도메인 (비-프로토스페이서 DNA 가닥을 절단함) 및 HNH 도메인 (프로토스페이서 DNA 가닥을 절단함)을 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이로 인해 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 기능상실 Cas9, 예를 들어 기능상실 SpCas9를 포함할 수 있다. 뉴클레아제 불활성화는 코딩된 단백질 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 변이체의 아미노산 서열에서 1개 이상의 치환 및/또는 결실을 발생시키는 1개 이상의 돌연변이로 인한 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "dCas9"는 뉴클레아제-불활성 Cas9 또는 뉴클레아제-기능상실 Cas9, 또는 그의 기능적 단편을 지칭하고, 임의의 유기체로부터의 임의의 자연 발생 dCas9, 그의 임의의 자연 발생 dCas9 등가물 또는 기능적 단편, 임의의 유기체로부터의 임의의 dCas9 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그, 및 자연 발생 또는 조작된 dCas9의 임의의 돌연변이체 또는 변이체를 포괄한다. 용어 dCas9는 특별히 제한적인 것으로 의도되지 않으며, "dCas9 또는 등가물"로 지칭될 수 있다. 예시적인 dCas9 단백질 및 dCas9 단백질을 제조하는 방법은 본원에 추가로 기재되고/거나 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본원에 참조로 포함된다.
다른 실시양태에서, dCas9는 Cas9 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이를 갖는 Cas9 아미노산 서열에 상응하거나, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 그를 포함한다. 다른 실시양태에서, 내인성 Cas9 뉴클레아제 활성의 완전 또는 부분 불활성화를 초래할 수 있는, D10A 및 H840A 이외의 돌연변이를 갖는 Cas9 변이체가 제공된다 (예를 들어, 각각 nCas9 또는 dCas9). 이러한 돌연변이는, 예로서, D10 및 H820에서의 다른 아미노산 치환, 또는 야생형 서열, 예컨대 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1)와 관련하여 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내의 다른 치환 (예를 들어, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및/또는 RuvC1 서브도메인에서의 치환)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9의 변이체 또는 상동체 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9의 변이체 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1 (서열식별번호: 20)))가 제공되며, 이는 NCBI 참조 서열: NC_017053.1과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, NC_017053.1 (서열식별번호: 20)보다 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 아미노산 또는 그 초과만큼 더 짧거나 더 긴 아미노산 서열을 갖는 dCas9의 변이체 (예를 들어, NCBI 참조 서열: NC_017053.1 (서열식별번호: 20)의 변이체)가 제공된다.
한 실시양태에서, 기능상실 Cas9는 Q99ZW2의 정규 SpCas9 서열을 기초로 할 수 있고, D10X 및 H810X (여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있음) 치환 (밑줄 및 볼드체)을 포함하는 하기 서열을 가질 수 있거나, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열식별번호: 40의 변이체일 수 있다.
한 실시양태에서, 기능상실 Cas9는 Q99ZW2의 정규 SpCas9 서열을 기초로 할 수 있고, D10A 및 H810A 치환 (밑줄 및 볼드체)을 포함하는 하기 서열을 가질 수 있거나, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열식별번호: 41의 변이체일 수 있다.
Figure pct00031
Figure pct00032
D. Cas9 닉카제 변이체
한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 Cas9 닉카제를 포함한다. 용어 "Cas9 닉카제" 또는 "nCas9"는 이중 가닥 DNA 분자 표적에 단일 가닥 파괴를 도입할 수 있는 Cas9의 변이체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, Cas9 닉카제는 단일 기능적 뉴클레아제 도메인만을 포함한다. 야생형 Cas9 (예를 들어, 정규 SpCas9)는 2개의 별개의 뉴클레아제 도메인, 즉 RuvC 도메인 (비-프로토스페이서 DNA 가닥을 절단함) 및 HNH 도메인 (프로토스페이서 DNA 가닥을 절단함)을 포함한다. 한 실시양태에서, Cas9 닉카제는 RuvC 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 RuvC 도메인 내의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 아스파르테이트 (D) 10, 히스티딘 (H) 983, 아스파르테이트 (D) 986, 또는 글루타메이트 (E) 762에서의 돌연변이는 RuvC 뉴클레아제 도메인의 기능 상실 돌연변이 및 기능적 Cas9 닉카제의 생성으로서 보고되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Nishimasu et al., "Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA," Cell 156(5), 935-949], 이는 본원에 참조로 포함됨). 따라서, RuvC 도메인 내의 닉카제 돌연변이는 D10X, H983X, D986X, 또는 E762X를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 야생형 아미노산 이외의 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 닉카제는 D10A, 또는 H983A, 또는 D986A, 또는 E762A, 또는 그의 조합일 수 있다.
다양한 실시양태에서, Cas9 닉카제는 RuvC 뉴클레아제 도메인에 돌연변이를 가질 수 있고, 하기 아미노산 서열 중 하나, 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 그의 변이체를 가질 수 있다.
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
또 다른 실시양태에서, Cas9 닉카제는 HNH 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 HNH 도메인 내의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 히스티딘 (H) 840 또는 아스파라긴 (R) 863에서의 돌연변이는 HNH 뉴클레아제 도메인의 기능 상실 돌연변이 및 기능적 Cas9 닉카제의 생성으로서 보고되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Nishimasu et al., "Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA," Cell 156(5), 935-949], 이는 본원에 참조로 포함됨). 따라서, HNH 도메인 내의 닉카제 돌연변이는 H840X 및 R863X를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 야생형 아미노산 이외의 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 닉카제는 H840A 또는 R863A 또는 그의 조합일 수 있다.
다양한 실시양태에서, Cas9 닉카제는 HNH 뉴클레아제 도메인에 돌연변이를 가질 수 있고, 하기 아미노산 서열 중 하나, 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 그의 변이체를 가질 수 있다.
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
일부 실시양태에서, N-말단 메티오닌이 Cas9 닉카제로부터, 또는 본원에 개시되거나 고려되는 임의의 Cas9 변이체, 오르토로그, 또는 등가물로부터 제거된다. 예를 들어, 메티오닌-마이너스 Cas9 닉카제는 하기 서열, 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
E. 다른 Cas9 변이체
기능상실 Cas9 및 Cas9 닉카제 변이체 이외에도, 본원에 사용된 Cas9 단백질은 또한 임의의 야생형 Cas9, 또는 돌연변이체 Cas9 (예를 들어, 기능상실 Cas9 또는 Cas9 닉카제), 또는 단편 Cas9, 또는 원형 순열체 Cas9, 또는 본원에 개시되거나 관련 기술분야에 공지된 Cas9의 다른 변이체를 포함한 임의의 참조 Cas9 단백질과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 다른 "Cas9 변이체"를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 참조 Cas9와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 참조 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하며, 이러한 단편은 야생형 Cas9의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 18)의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다.
일부 실시양태에서, 개시내용은 또한, 그의 기능성을 보유하고 임의의 본원에 개시된 Cas9 단백질의 단편인 Cas9 단편을 활용할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 단편은 적어도 100개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250개, 또는 적어도 1300개 아미노산 길이이다.
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제는 하기와 같이 기재된 Cas9 변이체 중 하나, 또는 임의의 참조 Cas9 변이체와 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 그의 Cas9 변이체를 포함할 수 있다.
F. 작은-크기의 Cas9 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 고려되는 프라임 편집제는 정규 SpCas9 서열보다 더 작은 분자량의 Cas9 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 작은-크기의 Cas9 변이체는 예를 들어 발현 벡터, 나노입자, 또는 다른 전달 수단에 의한 세포로의 전달을 용이하게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 보다 작은-크기의 Cas9 변이체는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 유형 II 효소로서 카테고리화된 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 작은-크기의 Cas9 변이체는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 유형 V 효소로서 카테고리화된 효소를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 보다 작은-크기의 Cas9 변이체는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 유형 VI 효소로서 카테고리화된 효소를 포함할 수 있다.
정규 SpCas9 단백질은 1368개 아미노산 길이이고, 158 킬로달톤의 예측 분자량을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "작은-크기의 Cas9 변이체"는 적어도 1300개 미만의 아미노산, 또는 적어도 1290개 미만의 아미노산, 또는 1280개 미만의 아미노산, 또는 1270개 미만의 아미노산, 또는 1260개 미만의 아미노산, 또는 1250개 미만의 아미노산, 또는 1240개 미만의 아미노산, 또는 1230개 미만의 아미노산, 또는 1220개 미만의 아미노산, 또는 1210개 미만의 아미노산, 또는 1200개 미만의 아미노산, 또는 1190개 미만의 아미노산, 또는 1180개 미만의 아미노산, 또는 1170개 미만의 아미노산, 또는 1160개 미만의 아미노산, 또는 1150개 미만의 아미노산, 또는 1140개 미만의 아미노산, 또는 1130개 미만의 아미노산, 또는 1120개 미만의 아미노산, 또는 1110개 미만의 아미노산, 또는 1100개 미만의 아미노산, 또는 1050개 미만의 아미노산, 또는 1000개 미만의 아미노산, 또는 950개 미만의 아미노산, 또는 900개 미만의 아미노산, 또는 850개 미만의 아미노산, 또는 800개 미만의 아미노산, 또는 750개 미만의 아미노산, 또는 700개 미만의 아미노산, 또는 650개 미만의 아미노산, 또는 600개 미만의 아미노산, 또는 550개 미만의 아미노산, 또는 500개 미만의 아미노산이지만, 적어도 약 400개 초과의 아미노산이고, Cas9 단백질의 요구되는 기능을 보유하는 임의의 Cas9 변이체-자연 발생, 조작, 또는 그 밖의 것-를 지칭한다. Cas9 변이체는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 유형 II, 유형 V, 또는 유형 VI 효소로서 카테고리화된 것을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제는 하기와 같이 기재된 작은-크기의 Cas9 변이체 중 하나, 또는 임의의 참조 작은-크기의 Cas9 단백질과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 그의 Cas9 변이체를 포함할 수 있다.
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
G. Cas9 등가물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 임의의 Cas9 등가물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "Cas9 등가물"은 그의 아미노산 1차 서열 및/또는 그의 3차원 구조가 진화상 관점에서 상이할 수 있고/거나 관련되지 않을 수 있음에도 불구하고 본 발명의 프라임 편집제에서 Cas9와 동일한 기능을 제공하는 임의의 napDNAbp 단백질을 포괄하는 광범위한 용어이다. 따라서, Cas9 등가물은 진화적으로 관련된, 본원에 기재되거나 또는 본원에 포괄되는 임의의 Cas9 오르토로그, 상동체, 돌연변이체, 또는 변이체를 포함하는 한편, Cas9 등가물은 또한 Cas9와 동일하거나 유사한 기능을 갖도록 수렴 진화 과정을 통해 진화될 수 있지만, 아미노산 서열 및/또는 3차원 구조와 관련하여 임의의 유사성을 반드시 갖는 것은 아닌 단백질을 포괄한다. 본원에 기재된 프라임 편집제는 Cas9 등가물이 수렴 진화를 통해 발생한 단백질에 기초할 수 있음에도 불구하고 Cas9와 동일하거나 유사한 기능을 제공할 임의의 Cas9 등가물을 포괄한다. 예를 들어, Cas9가 CRISPR-Cas 시스템의 유형 II 효소를 지칭하는 경우에, Cas9 등가물은 CRISPR-Cas 시스템의 유형 V 또는 유형 VI 효소를 지칭할 수 있다.
예를 들어, Cas12e (CasX)는 보고된 바로는 Cas9와 동일한 기능을 갖지만 수렴 진화를 통해 진화된 Cas9 등가물이다. 따라서, 문헌 [Liu et al., "CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors," Nature, 2019, Vol.566: 218-223]에 기재된 Cas12e (CasX) 단백질은 본원에 기재된 프라임 편집제와 함께 사용되는 것으로 고려된다. 또한, Cas12e (CasX)의 임의의 변이체 또는 변형이 고려될 수 있고, 본 개시내용의 범주 내에 있다.
Cas9는 매우 다양한 종에서 진화된 박테리아 효소이다. 그러나, 본원에 고려되는 Cas9 등가물은 또한 박테리아와 상이한 단일-세포 원핵 미생물의 역 및 계를 구성하는 고세균으로부터 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas9 등가물은 Cas12e (CasX) 또는 Cas12d (CasY)를 지칭할 수 있으며, 이는 예를 들어 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21]에 기재되어 있다. 게놈-분해 메타게놈학을 사용하여, 생물 고세균 역에서 최초로 보고된 Cas9를 포함한 다수의 CRISPR-Cas 시스템이 확인되었다. 이러한 분기성 Cas9 단백질은 거의 연구되지 않은 나노고세균에서 활성 CRISPR-Cas 시스템의 일부로서 발견되었다. 박테리아에서, 2종의 이전에 알려지지 않은 시스템, CRISPR-Cas12e 및 CRISPR-Cas12d가 발견되었으며, 이들은 지금까지 발견된 가장 치밀한 시스템 중의 것이다. 일부 실시양태에서, Cas9는 Cas12e, 또는 Cas12e의 변이체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, Cas9는 Cas12d, 또는 Cas12d의 변이체를 지칭한다. 다른 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질이 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)로서 사용될 수 있고, 이는 본 개시내용의 범주 내에 있다는 것이 인지되어야 한다. 또한, 문헌 [Liu et al., "CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors," Nature, 2019, Vol.566: 218-223]을 참조한다. 이들 Cas9 등가물 중 임의의 것이 고려된다.
일부 실시양태에서, Cas9 등가물은 자연 발생 Cas12e (CasX) 또는 Cas12d (CasY) 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12e (CasX) 또는 Cas12d (CasY) 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 야생형 Cas 모이어티 또는 본원에 제공된 임의의 Cas 모이어티와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 비제한적으로 Cas9 (예를 들어, dCas9 및 nCas9), Cas12e (CasX), Cas12d (CasY), Cas12a (Cpf1), Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), Cas12c (C2c3), 아르고노트, 및 Cas12b1을 포함한다. Cas9와 상이한 PAM 특이성을 갖는 핵산 프로그램가능한 DNA-결합 단백질의 한 예는 프레보텔라(Prevotella) 및 프란시셀라(Francisella) 1로부터의 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (즉, Cas12a (Cpf1))이다. Cas9와 유사하게, Cas12a (Cpf1)도 또한 부류 2 CRISPR 이펙터이지만, 이는 유형 II 하위군보다는 효소의 유형 V 하위군의 구성원이다. Cas12a (Cpf1)는 강건한 DNA 간섭을 매개하는 것으로 제시되어 있고, 특색이 Cas9와 구별된다. Cas12a (Cpf1)는 tracrRNA가 결여된 단일 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이고, 이는 T-풍부 프로토스페이서-인접 모티프 (TTN, TTTN, 또는 YTN)를 이용한다. 또한, Cpf1은 엇갈린 DNA 이중 가닥 파괴를 통해 DNA를 절단한다. 16종의 Cpf1-패밀리 단백질 중에서, 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus) 및 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae)로부터의 2종의 효소는 인간 세포에서 효율적인 게놈-편집 활성을 갖는 것으로 제시된다. Cpf1 단백질은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이전에, 예를 들어 문헌 [Yamano et al., "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA." Cell (165) 2016, p. 949-962]에 기재되었으며; 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas12a, Cas12b1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그의 상동체, 또는 그의 변형된 버전을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 바람직하게는 닉카제 돌연변이 (예를 들어, 서열식별번호: 18의 야생형 Cas9 폴리펩티드의 D10A 돌연변이에 상응하는 돌연변이)를 포함하는 임의의 CRISPR 연관 단백질을 포함할 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, napDNAbp는 하기 단백질 중 임의의 것일 수 있다: Cas9, Cas12a (Cpf1), Cas12e (CasX), Cas12d (CasY), Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), Cas12c (C2c3), GeoCas9, CjCas9, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas14, Csn2, xCas9, SpCas9-NG, 원형 순열 Cas9, 또는 아르고노트 (Ago) 도메인, 또는 그의 변이체.
예시적인 Cas9 등가물 단백질 서열은 하기를 포함할 수 있다:
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 가이드 뉴클레오티드 서열-프로그램가능한 DNA-결합 단백질 도메인으로서 사용될 수 있는 Cas12a (Cpf1) (dCpf1) 변이체를 포함할 수 있다. Cas12a (Cpf1) 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지만, HNH 엔도뉴클레아제 도메인은 갖지 않고, Cas12a (Cpf1)의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인식 로브를 갖지 않는다. Cas12a (Cpf1)의 RuvC-유사 도메인이 둘 다의 DNA 가닥을 절단하는 것을 담당하고, RuvC-유사 도메인의 불활성화가 Cas12a (Cpf1) 뉴클레아제 활성을 불활성화시킨다는 것이 문헌 [Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015] (이는 본원에 참조로 포함됨)에 제시되었다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터이다. 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터는, 비제한적으로, Cas9, Cas12a (Cpf1), Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), 및 Cas12c (C2c3)를 포함한다. 전형적으로, 미생물 CRISPR-Cas 시스템은 부류 1 및 부류 2 시스템으로 나뉜다. 부류 1 시스템은 멀티서브유닛 이펙터 복합체를 갖는 반면, 부류 2 시스템은 단일 단백질 이펙터를 갖는다. 예를 들어, Cas9 및 Cas12a (Cpf1)는 부류 2 이펙터이다. Cas9 및 Cas12a (Cpf1)에 더하여, 3종의 별개의 부류 2 CRISPR-Cas 시스템 (Cas12b1, Cas13a, 및 Cas12c)이 문헌 [Shmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems", Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397]에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
시스템 중 2개, Cas12b1 및 Cas12c의 이펙터는 Cas12a와 관련된 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 제3 시스템인 Cas13a는 2개의 예측 HEPN RNase 도메인을 갖는 이펙터를 함유한다. 성숙 CRISPR RNA의 생산은, Cas12b1에 의한 CRISPR RNA의 생산과는 달리, tracrRNA-비의존적이다. Cas12b1은 DNA 절단을 위해 CRISPR RNA 및 tracrRNA 둘 다에 의존한다. 박테리아 Cas13a는 그의 RNA-활성화된 단일 가닥 RNA 분해 활성과 구별되는 CRISPR RNA 성숙을 위한 고유한 RNase 활성을 보유하는 것으로 제시되었다. 이들 RNase 기능은 서로 상이하고, Cas12a의 CRISPR RNA-프로세싱 거동과 상이하다. 예를 들어, 문헌 [East-Seletsky, et al., "Two distinct RNase activities of CRISPR-Cas13a enable guide-RNA processing and RNA detection", Nature, 2016 Oct 13;538(7624):270-273]을 참조하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 렙토트리키아 샤히이(Leptotrichia shahii)의 Cas13a의 시험관내 생화학적 분석은 Cas13a가 단일 CRISPR RNA에 의해 가이드되고, 상보적 프로토스페이서를 보유하는 ssRNA 표적을 절단하도록 프로그램화될 수 있다는 것을 보여주었다. 2개의 보존된 HEPN 도메인 내의 촉매 잔기는 절단을 매개한다. 촉매 잔기에서의 돌연변이는 촉매 불활성 RNA-결합 단백질을 생성한다. 예를 들어, 문헌 [Abudayyeh et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector", Science, 2016 Aug 5; 353(6299)]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
알리시클로바실루스 아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris) Cas12b1 (AacC2c1)의 결정 구조는 키메라 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)와의 복합체로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Liu et al., "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism", Mol. Cell, 2017 Jan 19;65(2):310-322]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 결정 구조는 또한 3원 복합체로서 표적 DNA에 결합된 알리시클로바실루스 아시도테레스트리스 C2c1로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Yang et al., "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease", Cell, 2016 Dec 15;167(7):1814-1828]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. AacC2c1의 촉매 적격 입체형태는, 표적 및 비-표적 DNA 가닥 둘 다와 함께, 단일 RuvC 촉매 포켓 내에 독립적으로 위치되어 포획되었고, 여기서 C2c1-매개된 절단은 표적 DNA의 엇갈린 7-뉴클레오티드 파괴를 유발한다. C2c1 3원 복합체와 이전에 확인된 Cas9 및 Cpf1 대응물 사이의 구조 비교는 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 사용되는 메카니즘의 다양성을 입증한다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c1, C2c2, 또는 C2c3 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c1 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 Cas13a 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 Cas12c 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), 또는 Cas12c (C2c3) 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), 또는 Cas12c (C2c3) 단백질이다.
H. Cas9 원형 순열체
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제는 Cas9의 원형 순열체를 포함할 수 있다.
용어 "원형 순열 Cas9" 또는 Cas9의 "원형 순열체" 또는 "CP-Cas9"는 Cas9 단백질 (예를 들어, 야생형 Cas9 단백질)의 N-말단 및 C-말단이 국소로 재배열된 것을 의미하는, 원형 순열체 변이체로서 발생하거나 또는 조작되도록 변형된 임의의 Cas9 단백질 또는 그의 변이체를 지칭한다. 이러한 원형 순열 Cas9 단백질 또는 그의 변이체는 가이드 RNA (gRNA)와 복합체화되는 경우에 DNA에 결합하는 능력을 보유한다. 문헌 [Oakes et al., "Protein Engineering of Cas9 for enhanced function," Methods Enzymol, 2014, 546: 491-511 및 Oakes et al., "CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification," Cell, January 10, 2019, 176: 254-267]을 참조하고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용은 임의의 이전에 공지된 CP-Cas9를 고려하거나, 또는 생성된 원형 순열 단백질이 가이드 RNA (gRNA)와 복합체화되는 경우 DNA에 결합하는 능력을 보유하는 한, 새로운 CP-Cas9를 사용한다.
임의의 변이체, 오르토로그, 또는 자연 발생 Cas9 또는 그의 등가물을 포함한 본원에 기재된 Cas9 단백질 중 임의의 것은 원형 순열 변이체로서 재구성될 수 있다.
다양한 실시양태에서, Cas9의 원형 순열체는 하기 구조를 가질 수 있다:
N-말단-[원래의 C-말단] - [임의적인 링커] - [원래의 N-말단]-C-말단.
예로서, 본 개시내용은 정규 에스. 피오게네스 Cas9 (유니프롯KB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1)의 1368개 아미노산 (넘버링은 서열식별번호: 18에서의 아미노산 위치에 기초함))의 하기 원형 순열체를 고려한다:
N-말단-[1268-1368]-[임의적인 링커]-[1-1267]-C-말단;
N-말단-[1168-1368]-[임의적인 링커]-[1-1167]-C-말단;
N-말단-[1068-1368]-[임의적인 링커]-[1-1067]-C-말단;
N-말단-[968-1368]-[임의적인 링커]-[1-967]-C-말단;
N-말단-[868-1368]-[임의적인 링커]-[1-867]-C-말단;
N-말단-[768-1368]-[임의적인 링커]-[1-767]-C-말단;
N-말단-[668-1368]-[임의적인 링커]-[1-667]-C-말단;
N-말단-[568-1368]-[임의적인 링커]-[1-567]-C-말단;
N-말단-[468-1368]-[임의적인 링커]-[1-467]-C-말단;
N-말단-[368-1368]-[임의적인 링커]-[1-367]-C-말단;
N-말단-[268-1368]-[임의적인 링커]-[1-267]-C-말단;
N-말단-[168-1368]-[임의적인 링커]-[1-167]-C-말단;
N-말단-[68-1368]-[임의적인 링커]-[1-67]-C-말단; 또는
N-말단-[10-1368]-[임의적인 링커]-[1-9]-C-말단, 또는 다른 Cas9 단백질 (다른 Cas9 오르토로그, 변이체 등 포함)의 상응하는 원형 순열체.
특정한 실시양태에서, 원형 순열체 Cas9는 하기 구조 (에스. 피오게네스 Cas9 (유니프롯KB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1)의 1368개 아미노산 (넘버링은 서열식별번호: 18에서의 아미노산 위치에 기초함)에 기초함)를 갖는다:
N-말단-[102-1368]-[임의적인 링커]-[1-101]-C-말단;
N-말단-[1028-1368]-[임의적인 링커]-[1-1027]-C-말단;
N-말단-[1041-1368]-[임의적인 링커]-[1-1043]-C-말단;
N-말단-[1249-1368]-[임의적인 링커]-[1-1248]-C-말단; 또는
N-말단-[1300-1368]-[임의적인 링커]-[1-1299]-C-말단, 또는 다른 Cas9 단백질 (다른 Cas9 오르토로그, 변이체 등 포함)의 상응하는 원형 순열체.
또 다른 실시양태에서, 원형 순열체 Cas9는 하기 구조 (에스. 피오게네스 Cas9 (유니프롯KB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1)의 1368개 아미노산 (넘버링은 서열식별번호: 18에서의 아미노산 위치에 기초함)에 기초함)를 갖는다:
N-말단-[103-1368]-[임의적인 링커]-[1-102]-C-말단;
N-말단-[1029-1368]-[임의적인 링커]-[1-1028]-C-말단;
N-말단-[1042-1368]-[임의적인 링커]-[1-1041]-C-말단;
N-말단-[1250-1368]-[임의적인 링커]-[1-1249]-C-말단; 또는
N-말단-[1301-1368]-[임의적인 링커]-[1-1300]-C-말단, 또는 다른 Cas9 단백질 (다른 Cas9 오르토로그, 변이체 등 포함)의 상응하는 원형 순열체.
일부 실시양태에서, 원형 순열체는 직접적으로 또는 링커, 예컨대 아미노산 링커를 사용하여 Cas9의 C-말단 단편을 Cas9의 N-말단 단편에 연결함으로써 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, C-말단 단편은 Cas9의 아미노산 (예를 들어, 아미노산 약 1300-1368)의 C-말단 95% 이상, 또는 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 77-86 중 어느 하나)의 C-말단 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 또는 그 초과에 상응할 수 있다. N-말단 부분은 Cas9의 아미노산 (예를 들어, 아미노산 약 1-1300)의 N-말단 95% 이상, 또는 Cas9의 (예를 들어, 서열식별번호: 18의) N-말단 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 또는 그 초과에 상응할 수 있다.
일부 실시양태에서, 원형 순열체는 직접적으로 또는 링커, 예컨대 아미노산 링커를 사용하여 Cas9의 C-말단 단편을 Cas9의 N-말단 단편에 연결함으로써 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 단편은 Cas9의 아미노산 (예를 들어, 서열식별번호: 18의 아미노산 1012-1368)의 C-말단 30% 이하를 포함하거나 또는 그에 상응한다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 단편은 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 18의 Cas9)의 아미노산의 C-말단 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%를 포함하거나 또는 그에 상응한다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 단편은 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 18의 Cas9)의 C-말단 410개 잔기 이하를 포함하거나 또는 그에 상응한다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 부분은 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 18의 Cas9)의 C-말단 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10개의 잔기를 포함하거나 또는 그에 상응한다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 부분은 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 18의 Cas9)의 C-말단 357, 341, 328, 120, 또는 69개의 잔기를 포함하거나 또는 그에 상응한다.
다른 실시양태에서, 원형 순열체 Cas9 변이체는 서열식별번호: 18의 에스. 피오게네스 Cas9에 기초하여, 하기 방법: (a) 원래의 단백질을 2개의 절반: N-말단 영역 및 C-말단 영역으로 절제하는, Cas9 1차 구조의 내부 아미노산 잔기에 상응하는 원형 순열체 (CP) 부위를 선택하는 것; (b) 원래의 C-말단 영역 (CP 부위 아미노산을 포함함)을 원래의 N-말단 영역에 선행하도록 이동시켜 Cas9 단백질 서열을 변형시킴으로써 (예를 들어, 유전자 조작 기술에 의함), 이제 CP 부위 아미노산 잔기로 시작하는 Cas9 단백질의 새로운 N-말단을 형성하는 것에 기초한 Cas9 1차 구조의 위상 재배열로서 정의될 수 있다. CP 부위는, 예를 들어 나선형-II 도메인, RuvCIII 도메인, 또는 CTD 도메인을 포함한 Cas9 단백질의 임의의 도메인에 위치할 수 있다. 예를 들어, CP 부위는 (서열식별번호: 18의 에스. 피오게네스 Cas9 대비) 원래의 아미노산 잔기 181, 199, 230, 270, 310, 1010, 1016, 1023, 1029, 1041, 1247, 1249, 또는 1282에 위치할 수 있다. 따라서, 일단 N-말단으로 재배치되면, 원래의 아미노산 181, 199, 230, 270, 310, 1010, 1016, 1023, 1029, 1041, 1247, 1249, 또는 1282는 새로운 N-말단 아미노산이 될 것이다. 이들 CP-Cas9 단백질의 명명법은 각각 Cas9-CP181, Cas9-CP199, Cas9-CP230, Cas9-CP270, Cas9-CP310, Cas9-CP1010, Cas9-CP1016, Cas9-CP1023, Cas9-CP1029, Cas9-CP1041, Cas9-CP1247, Cas9-CP1249, 및 Cas9-CP1282로 지칭될 수 있다. 이러한 설명은 서열식별번호: 18로부터 CP 변이체를 제조하는 것으로 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 임의의 Cas9 서열에서 이들 위치에 상응하는 CP 부위에서 또는 다른 CP 부위 전체에서 CP 변이체를 제조하기 위해 구현될 수 있다. 이러한 설명은 어떠한 방식으로든 특이적 CP 부위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실질적으로 임의의 CP 부위를 사용하여 CP-Cas9 변이체를 형성할 수 있다.
서열식별번호: 18의 Cas9에 기초한 예시적인 CP-Cas9 아미노산 서열이 하기 제공되며, 여기서 링커 서열은 밑줄로 표시되고 임의적인 메티오닌 (M) 잔기는 볼드체로 표시된다. 개시내용은 링커 서열을 포함하지 않거나 또는 상이한 링커 서열을 포함하는 CP-Cas9 서열을 제공한다는 것을 인지해야 한다. CP-Cas9 서열은 서열식별번호: 18의 것 이외의 Cas9 서열에 기초할 수 있으며, 본원에 제공된 임의의 예는 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 인지해야 한다. 예시적인 CP-Cas9 서열은 하기와 같다:
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Cas9 원형 순열체는 본원에 기재된 프라임 편집 구축물에 유용할 수 있다. Cas9의 N-말단으로 재배열될 수 있는, 서열식별번호: 18의 Cas9에 기초한 Cas9의 예시적인 C-말단 단편이 하기 제공된다. Cas9의 이러한 C-말단 단편은 예시적인 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 인지해야 한다. 이들 예시적인 CP-Cas9 단편은 하기 서열을 갖는다:
Figure pct00059
I. 변형된 PAM 특이성을 갖는 Cas9 변이체
본 개시내용의 프라임 편집제는 또한 변형된 PAM 특이성을 갖는 Cas9 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면은 그의 3'-단부에 정규 PAM (5'-NGG-3', 여기서 N은 A, C, G, 또는 T임)을 포함하지 않는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 Cas9 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NGG-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NNG-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NNA-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NNC-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NNT-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NGT-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NGA-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NGC-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAA-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAC-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAT-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAG-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다.
제1 아미노산 잔기 (예를 들어, A)에서 제2 아미노산 잔기 (예를 들어, T)로의 본원에 기재된 임의의 아미노산 돌연변이 (예를 들어, A262T)는 또한 제1 아미노산 잔기에서 제2 아미노산 잔기와 유사한 (예를 들어, 보존된) 아미노산 잔기로의 돌연변이를 포함할 수 있음을 인지해야 한다. 예를 들어, 아미노산의 소수성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판)로의 돌연변이는 상이한 소수성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판)를 갖는 제2 아미노산으로의 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 알라닌에서 트레오닌으로의 돌연변이 (예를 들어, A262T 돌연변이)는 또한 알라닌에서 트레오닌과 크기 및 화학적 특성이 유사한 아미노산, 예를 들어 세린으로의 돌연변이일 수 있다. 또 다른 예로서, 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신)의 돌연변이는 상이한 양으로 하전된 측쇄를 갖는 제2 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신)으로의 돌연변이일 수 있다. 또 다른 예로서, 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민)의 돌연변이는 상이한 극성 측쇄를 갖는 제2 아미노산 (예를 들어, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민)으로의 돌연변이일 수 있다. 추가의 유사한 아미노산 쌍은 하기: 페닐알라닌 및 티로신; 아스파라긴 및 글루타민; 메티오닌 및 시스테인; 아스파르트산 및 글루탐산; 및 아르기닌 및 리신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 통상의 기술자는 이러한 보존적 아미노산 치환이 단백질 구조에 대해 미미한 효과를 가질 가능성이 있고, 기능을 손상시키지 않으면서 잘 용인될 가능성이 있음을 인식할 것이다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 트레오닌으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 세린으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 아르기닌으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 리신으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 이소류신으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 알라닌, 발린, 메티오닌, 또는 류신으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 리신으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 아르기닌으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 아스파르트산으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 글루탐산 또는 아스파라긴으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 발린으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 알라닌, 이소류신, 메티오닌, 또는 류신으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 글리신으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 알라닌으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 그러나, 추가의 보존된 아미노산 잔기가 통상의 기술자에 의해 인식될 것이고, 다른 보존된 아미노산 잔기로의 아미노산 돌연변이 중 임의의 것이 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다는 것을 인지해야 한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAA-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 돌연변이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 1에 열거된 클론 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 1에 열거된 클론의 보존적 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 1에 열거된 Cas9 클론 중 어느 하나의 돌연변이의 조합을 포함한다.
표 1: NAA PAM 클론
Figure pct00060
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 1의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 1의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9와 비교하였을 때, 그의 3' 단부에 정규 PAM (5'-NGG-3')을 포함하지 않는 표적 서열에 대해 증가된 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 활성과 비교하였을 때, 적어도 5배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 3' 단부를 갖는 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 2에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 활성과 비교하였을 때, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1,000배, 적어도 5,000배, 적어도 10,000배, 적어도 50,000배, 적어도 100,000배, 적어도 500,000배, 또는 적어도 1,000,000배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 단부는 AAA, GAA, CAA, 또는 TAA 서열에 바로 인접한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAC-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 돌연변이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 2에 열거된 클론 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 2에 열거된 클론의 보존적 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 2에 열거된 Cas9 클론 중 어느 하나의 돌연변이의 조합을 포함한다.
표 2: NAC PAM 클론
Figure pct00061
Figure pct00062
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 2의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 2의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9와 비교하였을 때, 그의 3' 단부에 정규 PAM (5'-NGG-3')을 포함하지 않는 표적 서열에 대해 증가된 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 활성과 비교하였을 때, 적어도 5배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 3' 단부를 갖는 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 활성과 비교하였을 때, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1,000배, 적어도 5,000배, 적어도 10,000배, 적어도 50,000배, 적어도 100,000배, 적어도 500,000배, 또는 적어도 1,000,000배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 단부는 AAC, GAC, CAC, 또는 TAC 서열에 바로 인접한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAT-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 돌연변이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 3에 열거된 클론 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 3에 열거된 클론의 보존적 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 3에 열거된 Cas9 클론 중 어느 하나의 돌연변이의 조합을 포함한다.
표 3: NAT PAM 클론
Figure pct00063
본원에 개시된 프라임 편집제와 관련하여 사용될 수 있는 다양한 napDNAbp에 대한 상기 설명은 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 프라임 편집제는 정규 SpCas9, 또는 임의의 오르토로그 Cas9 단백질, 또는 임의의 변이체 Cas9 단백질-공지되어 있거나 또는 방향적 진화상 과정 또는 달리 돌연변이유발 과정을 통해 제조 또는 진화될 수 있는 Cas9의 임의의 자연 발생 변이체, 돌연변이체, 또는 달리 조작된 버전 포함-을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, Cas9 또는 Cas9 변이체는 닉카제 활성을 갖고, 즉 표적 DNA 서열의 가닥만을 절단한다. 다른 실시양태에서, Cas9 또는 Cas9 변이체는 불활성 뉴클레아제를 가지며, 즉 "기능상실" Cas9 단백질이다. 사용될 수 있는 다른 변이체 Cas9 단백질은 정규 SpCas9보다 더 작은 분자량을 갖거나 (예를 들어, 보다 용이한 전달을 위함), 또는 변형되거나 재배열된 1차 아미노산 구조를 갖는 (예를 들어, 원형 순열체 포맷) 것이다. 본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 수렴 진화의 결과인 Cas12a/Cpf1 및 Cas12b 단백질을 포함한 Cas9 등가물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 napDNAbp (예를 들어, SpCas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물)는 또한 그의 PAM 특이성을 변경/증진시키는 다양한 변형을 함유할 수 있다. 마지막으로, 본 출원은 참조 Cas9 서열, 예컨대 참조 SpCas9 정규 서열 또는 참조 Cas9 등가물 (예를 들어, Cas12a/Cpf1)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 임의의 Cas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물을 고려한다.
특정한 실시양태에서, 확장된 PAM 능력을 갖는 Cas9 변이체는 하기 아미노산 서열을 갖는 SpCas9 (H840A) VRQR (서열식별번호: 87)이며, 서열식별번호: 51의 SpCas9 (H840A) 대비 V, R, Q, R 치환은 밑줄표시된 볼드체로 제시된다. 또한, SpCas9 (H840)에서의 메티오닌 잔기를 SpCas9 (H840A) VRQR에 대해 제거하였다:
Figure pct00064
또 다른 특정한 실시양태에서, 확장된 PAM 능력을 갖는 Cas9 변이체는 하기 아미노산 서열을 갖는 SpCas9 (H840A) VRER이며, 서열식별번호: 51의 SpCas9 (H840A) 대비 V, R, E, R 치환은 밑줄표시된 볼드체로 제시된다. 또한, SpCas9 (H840)에서의 메티오닌 잔기를 SpCas9 (H840A) VRER에 대해 제거하였다:
Figure pct00065
일부 실시양태에서, 비-정규 PAM 서열과 함께 기능하는 napDNAbp는 아르고노트 단백질이다. 이러한 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 한 예는 나트로노박테리움 그레고리(Natronobacterium gregoryi)로부터의 아르고노트 단백질 (NgAgo)이다. NgAgo는 ssDNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다. NgAgo는 이를 그의 표적 부위로 가이드하기 위해 ~24개 뉴클레오티드의 5' 인산화된 ssDNA (gDNA)에 결합하고, 이는 gDNA 부위에서 DNA 이중 가닥 파괴를 만들 것이다. Cas9와 대조적으로, NgAgo-gDNA 시스템은 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)를 필요로 하지 않는다. 뉴클레아제 불활성 NgAgo (dNgAgo)를 사용하는 것은 표적화될 수 있는 염기를 크게 확장시킬 수 있다. NgAgo의 특징화 및 사용은 문헌 [Gao et al., Nat Biotechnol., 2016 Jul;34(7):768-73. PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature. 507(7491) (2014):258-61; 및 Swarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015):5120-9]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 아르고노트 단백질의 원핵 상동체이다. 아르고노트 단백질의 원핵 상동체는 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Makarova K., et al., "Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements", Biol Direct. 2009 Aug 25;4:29. doi: 10.1186/1745-6150-4-29]에 기재되어 있고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 마리니토가 피에조필라(Marinitoga piezophila) 아르고노트 (MpAgo) 단백질이다. CRISPR-연관 마리니토가 피에조필라 아르고노트 (MpAgo) 단백질은 5'-인산화된 가이드를 사용하여 단일 가닥 표적 서열을 절단한다. 5' 가이드는 모든 공지된 아르고노트에 의해 사용된다. MpAgo-RNA 복합체의 결정 구조는 5' 포스페이트 상호작용을 차단하는 잔기를 포함하는 가이드 가닥 결합 부위를 보여준다. 이 데이터는 5'-히드록실화된 가이드에 대한 비정규 특이성을 갖는 아르고노트 하위부류의 진화를 시사한다. 예를 들어, 문헌 [Kaya et al., "A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity", Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Apr 12;113(15):4057-62]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 다른 아르고노트 단백질이 사용될 수 있고, 본 개시내용의 범주 내에 있다는 것을 인지해야 한다.
개시내용의 일부 측면은 상이한 PAM 특이성을 갖는 Cas9 도메인을 제공한다. 전형적으로, Cas9 단백질, 예컨대 에스. 피오게네스로부터의 Cas9 (spCas9)는 특정한 핵산 영역에 결합하기 위해 정규 NGG PAM 서열을 필요로 한다. 이는 게놈 내의 목적하는 염기를 편집하는 능력을 제한할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집 융합 단백질은 정확한 위치에 배치될 필요가 있을 수 있고, 예를 들어 여기서 표적 염기는 PAM의 대략 15개 염기 상류인 4개 염기 영역 (예를 들어, "편집 윈도우") 내에 배치된다. 문헌 [Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 정규 (예를 들어, NGG) PAM 서열을 함유하지 않는 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 Cas9 도메인을 함유할 수 있다. 비-정규 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 관련 기술분야에 기재되어 있고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 비-정규 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 문헌 [Kleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015); 및 Kleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)]에 기재되어 있고; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어, 변경된 PAM 특이성을 갖는 napDNAbp 도메인, 예컨대 하기 아미노산 서열을 갖는, 야생형 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cpf1 (D917, E1006, 및 D1255) (서열식별번호: 74)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 도메인:
Figure pct00066
변경된 PAM 특이성을 갖는 추가의 napDNAbp 도메인, 예컨대 하기 아미노산 서열을 갖는, 야생형 게오바실루스 써모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) Cas9 (서열식별번호: 75)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 도메인:
Figure pct00067
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 정규 (NGG) PAM 서열을 필요로 하지 않는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 아르고노트 단백질이다. 이러한 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 한 예는 나트로노박테리움 그레고리(Natronobacterium gregoryi)로부터의 아르고노트 단백질 (NgAgo)이다. NgAgo는 ssDNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다. NgAgo는 이를 그의 표적 부위로 가이드하기 위해 ~24개 뉴클레오티드의 5' 인산화된 ssDNA (gDNA)에 결합하고, 이는 gDNA 부위에서 DNA 이중 가닥 파괴를 만들 것이다. Cas9와 대조적으로, NgAgo-gDNA 시스템은 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)를 필요로 하지 않는다. 뉴클레아제 불활성 NgAgo (dNgAgo)를 사용하는 것은 표적화될 수 있는 염기를 크게 확장시킬 수 있다. NgAgo의 특징화 및 사용은 문헌 [Gao et al., Nat Biotechnol., 34(7): 768-73 (2016), PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature, 507(7491): 258-61 (2014); 및 Swarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015): 5120-9]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트의 서열이 서열식별번호: 76에서 제공된다.
개시된 융합 단백질은 하기 아미노산 서열을 갖는, 야생형 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트 (서열식별번호: 76)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 napDNAbp 도메인을 포함할 수 있다:
Figure pct00068
또한, 임의의 이용가능한 방법을 이용하여 변이체 또는 돌연변이체 Cas9 단백질을 수득하거나 구축할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어 핵산 또는 아미노산 서열 내의 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로 원래 잔기를 확인한 다음, 서열 내의 잔기의 위치를 확인하고, 새로 치환된 잔기의 정체를 확인하는 것에 의해 본원에 기재된다. 본원에 제공된 아미노산 치환 (돌연변이)을 제조하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 의해 제공된다. 돌연변이는 다양한 카테고리, 예컨대 단일 염기 다형성, 미세중복 영역, indel, 및 역위를 포함할 수 있고, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 돌연변이는 단백질 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이의 정상적인 결과인 "기능 상실" 돌연변이를 포함할 수 있다. 대부분의 기능 상실 돌연변이는 열성이며, 이는 이형접합체에서 제2 염색체 카피가 그의 존재가 돌연변이의 효과를 보상하는 완전 기능적 단백질을 코딩하는 유전자의 비돌연변이된 버전을 보유하기 때문이다. 돌연변이는 또한 정상 상태에서는 달리 존재하지 않는 단백질 또는 세포에 비정상적 활성을 부여하는 것인 "기능 획득" 돌연변이를 포괄한다. 많은 기능 획득 돌연변이는 코딩 영역보다는 조절 서열에 존재하고, 따라서 다수의 결과를 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 1개 이상의 유전자가 잘못된 조직에서 발현되게 할 수 있고, 이들 조직은 정상적으로는 결여되어 있는 기능을 얻는다. 그의 속성으로 인해, 기능 획득 돌연변이는 통상적으로 우성이다.
돌연변이는 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 참조 Cas9 단백질 내로 도입될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 부위-지정 돌연변이유발의 보다 오래된 방법은 단일 가닥 DNA 주형의 단리를 가능하게 하는 벡터, 예컨대 M13 박테리오파지 벡터 내로의 돌연변이시킬 서열의 서브-클로닝에 의존한다. 이들 방법에서, 돌연변이유발 프라이머 (즉, 돌연변이시킬 부위에 어닐링할 수 있지만 돌연변이시킬 부위에 1개 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 보유할 수 있는 프라이머)를 단일 가닥 주형에 어닐링시킨 후, 돌연변이유발 프라이머의 3' 단부로부터 출발하여 주형의 상보체를 중합시킨다. 이어서, 생성된 듀플렉스로 숙주 박테리아를 형질전환시키고, 목적하는 돌연변이에 대해 플라크를 스크리닝한다. 보다 최근에, 부위-지정 돌연변이유발은 단일 가닥 주형을 필요로 하지 않는 이점을 갖는 PCR 방법론을 이용하였다. 또한, 서브클로닝을 필요로 하지 않는 방법이 개발되었다. PCR-기반 부위-지정 돌연변이유발이 수행될 때 여러 이슈가 고려되어야 한다. 첫번째로, 이들 방법에서, 폴리머라제에 의해 도입된 바람직하지 않은 돌연변이의 확장을 방지하기 위해 PCR 사이클의 수를 감소시키는 것이 바람직하다. 두번째로, 반응에서 지속되는 비-돌연변이된 모 분자의 수를 감소시키기 위해 선택이 사용되어야 한다. 세번째로, 단일 PCR 프라이머 세트의 사용을 허용하기 위해 연장-길이 PCR 방법이 바람직하다. 그리고 네번째로, 일부 열안정성 폴리머라제의 비-주형-의존성 말단 연장 활성으로 인해, PCR-생성된 돌연변이체 생성물의 평활-말단 라이게이션 전에 말단-폴리싱 단계를 절차에 혼입시키는 것이 종종 필요하다.
돌연변이는 또한 방향적 진화 과정, 예컨대 파지-보조 연속 진화 (PACE) 또는 파지-보조 비연속 진화 (PANCE)에 의해 도입될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "파지-보조 연속 진화 (PACE)"는 바이러스 벡터로서 파지를 사용하는 연속 진화를 지칭한다. PACE 기술의 일반적 개념은, 예를 들어 2010년 3월 11일에 WO 2010/028347로서 공개된, 2009년 9월 8일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2009/056194; 2012년 6월 28일에 WO 2012/088381로서 공개된, 2011년 12월 22일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2011/066747; 2015년 5월 5일에 허여된 미국 출원, 미국 특허 번호 9,023,594, 2015년 9월 11일에 WO 2015/134121로서 공개된, 2015년 1월 20일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2015/012022, 및 2016년 10월 20일에 WO 2016/168631로서 공개된, 2016년 4월 15일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2016/027795에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 변이체 Cas9는 또한 파지-보조 비-연속 진화 (PANCE)에 의해 수득될 수 있고, 이는 본원에 사용된 바와 같이, 바이러스 벡터로서 파지를 사용하는 비-연속 진화를 지칭한다. PANCE는 새로운 이. 콜라이(E. coli) 숙주 세포를 가로질러 진화시킬 관심 유전자를 함유하는 진화 '선택 파지' (SP)의 연속 플라스크 전달을 사용하여 숙주 이. 콜라이 내부의 유전자는 일정하게 유지되게 하는 한편 SP 내에 함유된 유전자가 연속적으로 진화하게 하는, 신속한 생체내 방향적 진화를 위한 단순화된 기술이다. 연속 플라스크 전달은 오랫동안 미생물의 실험실 진화를 위한 폭넓게 접근가능한 접근법으로서의 역할을 하였고, 보다 최근에는 박테리오파지 진화를 위한 유사한 접근법이 개발되었다. PANCE 시스템은 PACE 시스템보다 더 낮은 엄격도를 특색으로 한다.
Cas9 또는 Cas9 등가물에 관한 상기 언급된 참고문헌 중 임의의 것은, 그렇게 이미 언급되지 않았다면, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
J. 분할 PE 전달을 위한 나뉘어진 napDNAbp 도메인
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 세포 내부에서 (수동 조립에 의해, 또는 분할 인테인 서열을 사용하는 것과 같은 능동 조립에 의해) 재구성된 프라임 편집제로 조립되는 2개 이상의 단편으로서 세포에 전달될 수 있다. 일부 경우에, 자기 조립은 2개 이상의 프라임 편집제 단편이 세포 내부에서 공유적으로 또는 비-공유적으로 회합되어 프라임 편집제를 재구성하는 수동적인 것일 수 있다. 다른 경우에, 자기-조립은 각각의 단편 상에 설치된 이량체화 도메인에 의해 촉매될 수 있다. 이량체화 도메인의 예는 본원에 기재되어 있다. 또 다른 경우에, 자기-조립은 각각의 프라임 편집제 단편 상에 설치된 분할 인테인 서열에 의해 촉매될 수 있다.
분할 PE 전달은 상이한 전달 접근법의 다양한 크기 제약을 다루는데 유리할 수 있다. 예를 들어, 전달 접근법은 바이러스-기반 전달 방법, 메신저 RNA-기반 전달 방법, 또는 RNP-기반 전달 (리보핵단백질-기반 전달)을 포함할 수 있다. 그리고, 각각의 이들 전달 방법은 프라임 편집제를 보다 작은 조각으로 분할함으로써 보다 효율적이고/거나 효과적일 수 있다. 일단 세포 내부로 들어가면, 보다 작은 조각은 기능적 프라임 편집제로 조립될 수 있다. 분할 수단에 따라, 나뉘어진 프라임 편집제 단편은 비-공유 방식 또는 공유 방식으로 재조립되어 프라임 편집제를 재형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 프라임 편집제는 1개 이상의 분할 부위에서 2개 이상의 단편으로 분할될 수 있다. 단편은 (분할되는 것 외에) 비변형될 수 있다. 단편이 세포에 전달되면 (예를 들어, 리보핵단백질 복합체의 직접 전달에 의해 또는 핵산 전달 - 예를 들어, mRNA 전달 또는 바이러스 벡터 기반 전달에 의해), 단편은 공유적으로 또는 비-공유적으로 재회합되어 프라임 편집제를 재구성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프라임 편집제는 1개 이상의 분할 부위에서 2개 이상의 단편으로 분할될 수 있다. 각각의 단편은 이량체화 도메인을 포함하도록 변형될 수 있고, 이에 의해 형성되는 각각의 단편은 이량체화 도메인에 커플링된다. 일단 세포 내에 전달되거나 발현되면, 상이한 단편의 이량체화 도메인은 서로 회합하고 결합하여, 상이한 프라임 편집제 단편을 함께 모아 기능적 프라임 편집제를 재형성한다. 또 다른 실시양태에서, 프라임 편집제 단편은 분할 인테인을 포함하도록 변형될 수 있다. 일단 세포 내에 전달되거나 발현되면, 상이한 단편의 분할 인테인 도메인은 서로 회합하고 결합한 다음, 트랜스-스플라이싱을 겪고, 이는 각각의 단편으로부터 분할-인테인 도메인의 절제, 및 단편 사이의 펩티드 결합의 동반 형성을 유발하며, 그에 의해 프라임 편집제가 복원된다.
한 실시양태에서, 프라임 편집제는 분할-인테인 접근법을 사용하여 전달될 수 있다.
분할 부위의 위치는 napDNAbp 도메인, 폴리머라제 도메인 (예를 들어, RT 도메인), napDNAbp 도메인과 폴리머라제 도메인을 연결하는 링커 도메인 내를 포함한, 프라임 편집제 및 그 안의 임의의 도메인 내의 잔기의 임의의 1개 이상의 쌍 사이에 위치할 수 있다.
도 66에 도시된 한 실시양태에서, 프라임 편집제 (PE)는 napDNAbp 내의 분할 부위에서 나뉘어진다.
특정 실시양태에서, napDNAbp는 하기와 같은 서열식별번호: 18의 정규 SpCas9 폴리펩티드이다:
Figure pct00069
특정 실시양태에서, SpCas9는 서열식별번호: 18의 정규 SpCas9의 잔기 1과 2 사이, 또는 2와 3 사이, 또는 3과 4 사이, 또는 4와 5 사이, 또는 5와 6 사이, 또는 6과 7 사이, 또는 7과 8 사이, 또는 8과 9 사이, 또는 9와 10 사이, 또는 잔기 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 또는 1300-1368 사이의 임의의 위치에 위치하는 잔기의 임의의 2개 쌍 사이에 위치하는 분할 부위에서 2개의 단편으로 분할된다.
특정 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 18의 정규 SpCas9의 위치 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 또는 1300-1368 사이의 임의의 위치에 위치하는 잔기의 임의의 2개의 쌍에 상응하는 잔기의 쌍에 위치하는 분할 부위에서 2개의 단편으로 분할된다.
특정 실시양태에서, SpCas9는 서열식별번호: 18의 정규 SpCas9의 잔기 1과 2 사이, 또는 2와 3 사이, 또는 3과 4 사이, 또는 4와 5 사이, 또는 5와 6 사이, 또는 6과 7 사이, 또는 7과 8 사이, 또는 8과 9 사이, 또는 9와 10 사이, 또는 잔기 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 또는 1300-1368 사이의 임의의 위치에 위치하는 잔기의 임의의 2개 쌍 사이에 위치하는 분할 부위에서 2개의 단편으로 분할된다. 특정 실시양태에서, 분할 부위는 1개 이상의 폴리펩티드 결합 부위 (즉, "분할 부위 또는 분할-인테인 분할 부위")에 위치하고, 분할 인테인에 융합된 다음, 개별적으로-코딩된 융합 단백질로서 세포에 전달된다. 분할-인테인 융합 단백질 (즉, 단백질 절반)이 세포 내에서 발현되면, 단백질은 트랜스-스플라이싱을 거쳐, 연결된 분할-인테인 서열의 동반 제거와 함께 완전한 또는 전체 PE를 형성한다.
예를 들어, 도 66에 제시된 바와 같이, N-말단 엑스테인은 제1 분할-인테인 (예를 들어, N 인테인)에 융합될 수 있고, C-말단 엑스테인은 제2 분할-인테인 (예를 들어, C 인테인)에 융합될 수 있다. N-말단 엑스테인은 C-말단 엑스테인에 융합되어 세포 내에서 N 인테인 및 C 인테인의 자기-회합 시 napDNAbp 도메인 및 폴리머라제 도메인 (예를 들어, RT 도메인)을 포함하는 전체 프라임 편집제 융합 단백질을 재형성하고, 이어서 그의 자기-절제, 및 전체 프라임 편집제 (PE)의 N-말단 엑스테인 및 C-말단 엑스테인 부분 사이의 펩티드 결합의 동반 형성이 이어진다.
분할-인테인을 사용한 분할-PE 전달 전략을 이용하기 위해, 프라임 편집제는 1개 이상의 분할 부위에서 나뉘어져서 프라임 편집제의 적어도 2개의 별개의 절반을 생성할 필요가 있으며, 이들 각각은 각각의 절반이 분할-인테인 서열에 융합되는 경우에 세포 내부에서 재연결될 수 있다.
특정 실시양태에서, 프라임 편집제는 단일 분할 부위에서 분할된다. 특정의 다른 실시양태에서, 프라임 편집제는 2개의 분할 부위, 또는 3개의 분할 부위, 또는 4개의 분할 부위, 또는 그 초과에서 분할된다.
바람직한 실시양태에서, 프라임 편집제는 단일 분할 부위에서 분할되어 프라임 편집제의 2개의 별개의 절반을 생성하고, 이들 각각은 분할 인테인 서열에 융합될 수 있다.
예시적인 분할 인테인은 2개의 서브유닛, 즉 DnaE-N 및 DnaE-C를 포함하는 Ssp DnaE 인테인이다. 2개의 상이한 서브유닛은 별개의 유전자, 즉 각각 DnaE-N 및 DnaE-C 서브유닛을 코딩하는 dnaE-n 및 dnaE-c에 의해 코딩된다. DnaE는 시네코시스티스(Synechocystis) 종 PCC6803의 자연 발생 분할 인테인이고, 각각 DnaE-N 또는 DnaE-C와의 융합체를 포함한 2개의 별개의 단백질의 트랜스-스플라이싱을 지시할 수 있다.
추가의 자연 발생 또는 조작된 분할-인테인 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 또는 본원에 기재된 전체-인테인 서열 또는 관련 기술분야에서 입수가능한 것으로부터 제조될 수 있다. 분할-인테인 서열의 예는 문헌 [Stevens et al., "A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications," PNAS, 2017, Vol.114: 8538-8543; Iwai et al., "Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme, FEBS Lett, 580: 1853-1858]에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 추가의 분할 인테인 서열은, 예를 들어 WO 2013/045632, WO 2014/055782, WO 2016/069774, 및 EP2877490에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 생체내 및 시험관내 트랜스로의 단백질 스플라이싱이 기재되어 있으며 (Shingledecker, et al., Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBO J. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887-15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)), 이는 예를 들어 2개의 개별적으로-발현된 절반으로부터 완전한 PE 융합 단백질의 형성에 관하여 도 66 및 67에 제시된 바와 같이, 기능적 생성물을 형성하기 위해 후속적으로 라이게이션을 거치는 2개의 불활성 단편에 대해 단백질로서의 발현 기회를 제공한다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 연속 진화 방법 (예를 들어, PACE)은 염기 편집제의 제1 부분을 진화시키는데 사용될 수 있다. 제1 부분은 단일 성분 또는 도메인, 예를 들어 Cas9 도메인, 데아미나제 도메인, 또는 UGI 도메인을 포함할 수 있다. 이어서, 개별적으로 진화된 성분 또는 도메인은 분할-인테인 폴리펩티드 도메인과 함께 진화된 부분 및 나머지 비-진화된 부분 둘 다를 개별적으로 발현시킴으로써 세포 내에서 염기 편집제의 나머지 부분에 융합될 수 있다. 제1 부분은 보다 넓게는 본원에 기재된 연속 진화 방법을 사용하여 진화시키는 것을 목적으로 하는 염기 편집제의 임의의 제1 아미노산 부분을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서 제2 부분은 본원의 방법을 사용하여 진화되지 않는 염기 편집제의 나머지 아미노산 부분을 지칭할 것이다. 염기 편집제의 진화된 제1 부분 및 제2 부분은 각각 세포에서 분할-인테인 폴리펩티드 도메인과 함께 발현될 수 있다. 세포의 천연 단백질 스플라이싱 메카니즘은 진화된 제1 부분 및 비-진화된 제2 부분을 재조립하여 단일 융합 단백질 진화된 염기 편집제를 형성할 것이다. 진화된 제1 부분은 단일 융합 단백질의 N- 또는 C-말단 부분을 포함할 수 있다. 유사한 방식으로, 제2 직교 트랜스-스플라이싱 인테인 쌍의 사용은 진화된 제1 부분이 단일 융합 단백질의 내부 부분을 포함하도록 할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 염기 편집제의 진화된 및 비-진화된 성분 중 임의의 것은 세포 내에서 진화된 및 비-진화된 성분을 포함하는 완전한 염기 편집제의 형성을 용이하게 하기 위해 분할-인테인 태그와 함께 발현될 수 있다.
단백질 스플라이싱 과정의 메카니즘은 매우 상세하게 연구되었고 (Chong, et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 22159-22168; Xu, M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153), 보존된 아미노산은 인테인 및 엑스테인 스플라이싱 지점에서 발견되었다 (Xu, et al., EMBO Journal, 1994, 13 5517-522). 본원에 기재된 구축물은 제1 유전자의 5'-말단 (예를 들어, 염기 편집제의 진화된 부분)에 융합된 인테인 서열을 함유한다. 적합한 인테인 서열은 단백질 스플라이싱 요소를 함유하는 것으로 공지된 단백질 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 모든 공지된 인테인을 함유하는 데이터베이스는 월드 와이드 웹에서 찾아볼 수 있다 (Perler, F. B. Nucleic Acids Research, 1999, 27, 346-347). 인테인 서열은 제2 유전자의 3' 단부에서 5' 단부에 융합된다. 이러한 유전자를 특정 소기관으로 표적화하기 위해, 펩티드 신호가 유전자의 코딩 서열에 융합될 수 있다. 제2 유전자 후에, 인테인-유전자 서열은 동일한 세포에서 다중 단백질의 발현을 위해 목적하는 만큼 자주 반복될 수 있다. 다중-인테인 함유 구축물의 경우, 상이한 공급원으로부터의 인테인 요소를 사용하는 것이 유용할 수 있다. 발현될 마지막 유전자의 서열 후에, 전사 종결 서열이 삽입되어야 한다. 한 실시양태에서, 변형된 인테인 스플라이싱 유닛은 인테인으로부터 엑스테인의 절제를 촉매할 수 있을뿐만 아니라 엑스테인의 라이게이션을 방지할 수 있도록 설계된다. 피로코쿠스(Pyrococcus) 종 GB-D DNA 폴리머라제에서의 C-말단 엑스테인 접합부의 돌연변이유발은 엑스테인 및 인테인의 절단을 유도하지만 엑스테인의 후속 라이게이션은 방지하는 변경된 스플라이싱 요소를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (Xu, M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153). 세린 538의 알라닌 또는 글리신으로의 돌연변이는 절단을 유도하였지만 라이게이션은 방지하였다. 다른 인테인 스플라이싱 유닛에서의 등가 잔기의 돌연변이는 또한 인테인에 대한 C-말단 엑스테인 접합부에서의 아미노산의 보존으로 인해 엑스테인 라이게이션을 방지할 것이다. 엔도뉴클레아제 도메인을 함유하지 않는 바람직한 인테인은 미코박테리움 크세노피(Mycobacterium xenopi) GyrA 단백질이다 (Telenti, et al., J. Bacteriol. 1997, 179, 6378-6382). 그 밖의 것이 자연에서 발견되었거나 또는 엔도뉴클레아제 도메인을 엔도뉴클레아제 함유 인테인으로부터 제거함으로써 인공적으로 생성되었다 (Chong, et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 15587-15590). 바람직한 실시양태에서, 인테인은, 미코박테리움 크세노피 GyrA 단백질로부터의 인테인과 같이, 스플라이싱 기능을 수행하는데 필요한 최소 개수의 아미노산으로 이루어지도록 선택된다 (Telenti, A., et al., J. Bacteriol. 1997, 179, 6378-6382). 대안적 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 활성이 없는 인테인, 예컨대 미코박테리움 크세노피 GyrA 단백질로부터의 인테인 또는 엔도뉴클레아제 도메인을 제거하도록 변형된 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) VMA 인테인으로부터 선택된다 (Chong, 1997). 인테인 스플라이싱 유닛의 추가의 변형은 절단 반응의 반응 속도가 변경되도록 하여, 스플라이싱 유닛의 유전자 서열을 단순히 변형시키는 것에 의해 단백질 투여량이 제어되도록 할 수 있다.
인테인은 또한 2개의 개별적으로 전사되고 번역되는 유전자에 의해 코딩된 2개의 단편으로서 존재할 수 있다. 이들 소위 분할 인테인은 자기-회합하고, 단백질-스플라이싱 활성을 트랜스로 촉매한다. 분할 인테인은 다양한 시아노박테리아 및 고세균에서 확인되었지만 (Caspi et al, Mol Microbiol. 50: 1569-1577 (2003); Choi J. et al, J Mol Biol. 556: 1093-1106 (2006.); Dassa B. et al, Biochemistry. 46:322-330 (2007.); Liu X. and Yang J., J Biol Chem. 275:26315-26318 (2003); Wu H. et al., Proc Natl Acad Sci USA. ￡5:9226-9231 (1998.); 및 Zettler J. et al, FEBS Letters. 553:909-914 (2009)), 지금까지 진핵생물에서는 발견되지 않았다. 최근에, 환경 메타게놈 데이터의 생물정보학적 분석은 신규 게놈 배열을 갖는 26개의 상이한 유전자좌를 밝혀내었다. 각각의 유전자좌에서, 보존된 효소 코딩 영역은 분할 인테인에 의해 개재되고, 인테인 서브도메인을 코딩하는 섹션 사이에 자립형 엔도뉴클레아제 유전자가 삽입된다. 이들 중에서, 5개의 유전자좌가 완전히 조립되었다: DNA 헬리카제 (gp41-l, gp41-8); 이노신-5'-모노포스페이트 데히드로게나제 (IMPDH-1); 및 리보뉴클레오티드 리덕타제 촉매 서브유닛 (NrdA-2 및 NrdJ-1). 이러한 파괴된 유전자 조직은 주로 파지에 존재하는 것으로 보인다 (Dassa et al., Nucleic Acids Research. 57:2560-2573 (2009)).
분할 인테인 Npu DnaE는 단백질 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 보고된 최고 속도를 갖는 것으로 특징화되었다. 또한, Npu DnaE 단백질 스플라이싱 반응은 상이한 엑스테인 서열, 6 내지 37℃의 온도, 및 최대 6M의 우레아의 존재와 관련하여 강건하고 고수율인 것으로 간주된다 (Zettler J. et al., FEBS Letters. 553:909-914 (2009); Iwai I. et al., FEBS Letters 550: 1853-1858 (2006)). 예상된 바와 같이, 이들 인테인의 N-도메인에서 Cysl Ala 돌연변이가 도입되었을 때, 초기 N에서 S- 아실 이동이 차단되었고, 따라서 단백질 스플라이싱이 차단되었다. 불행하게도, C-말단 절단 반응도 또한 거의 완전히 억제되었다. N-말단 절단가능한 펩티드 결합에서의 아실 이동에 대한 C-말단 스플라이스 접합부에서의 아스파라긴 고리화의 의존성은 자연 분할 DnaE 인테인 대립유전자에 공통적인 고유한 특성인 것으로 보인다 (Zettler J. et al., FEBS Letters. 555:909-914 (2009)).
단백질 스플라이싱의 메카니즘은 전형적으로 4개의 단계를 갖는다 [29-30]: 1) 상류 펩티드 결합을 파괴하고 N-엑스테인과 인테인의 제1 아미노산 (Cys 또는 Ser)의 측쇄 사이에 에스테르 결합을 형성하는, 인테인 N-말단에서의 N-S 또는 N-O 아실 이동; 2) N-엑스테인을 C-엑스테인의 제1 아미노산 (Cys, Ser, 또는 Thr)의 측쇄에 연결하는 새로운 에스테르 결합을 형성하는, N-엑스테인을 인테인 C-말단으로 재배치하는 에스테르교환; 3) 인테인과 C-엑스테인 사이의 펩티드 결합을 파괴하는 Asn 고리화; 및 4) 에스테르 결합을 N-엑스테인과 C-엑스테인 사이의 펩티드 결합으로 대체하는 S-N 또는 O-N 아실 이동.
분할 인테인에 의해 촉매되는 단백질 트랜스-스플라이싱은 전적으로 단백질 라이게이션을 위한 효소적 방법을 제공한다 [31]. 분할-인테인은 본질적으로 각각 N-인테인 및 C-인테인으로 명명되는 2개의 조각으로 분할된 인접 인테인 (예를 들어 미니-인테인)이다. 분할 인테인의 N-인테인 및 C-인테인은 비-공유적으로 회합되어 활성 인테인을 형성하고, 인접 인테인과 본질적으로 동일한 방식으로 스플라이싱 반응을 촉매할 수 있다. 분할 인테인은 자연에서 발견되었고, 또한 실험실에서 조작되었다 [31-35]. 본원에 사용된 용어 "분할 인테인"은 N-말단 및 C-말단 서열이 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 인테인으로 비-공유적으로 재회합 또는 재구성될 수 있는 별개의 분자가 되도록 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열 사이에 1개 이상의 펩티드 결합 파괴가 존재하는 임의의 인테인을 지칭한다. 임의의 촉매 활성 인테인 또는 그의 단편은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 분할 인테인을 유도하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서 분할 인테인은 진핵 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 박테리아 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 고세균 인테인으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 이와 같이 유래된 분할 인테인은 트랜스-스플라이싱 반응을 촉매하는데 필수적인 아미노산 서열만을 보유할 것이다.
본원에 사용된 "N-말단 분할 인테인 (In)"은 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 임의의 인테인 서열을 지칭한다. 따라서, In은 또한 트랜스-스플라이싱이 발생할 때 스플라이싱되는 서열을 포함한다. In은 자연 발생 인테인 서열의 N-말단 부분의 변형인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, In은, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함이 In을 트랜스-스플라이싱에서 비-기능적으로 만들지 않는 한, 이러한 추가의 아미노산 잔기 및/또는 돌연변이된 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함은 In의 트랜스-스플라이싱 활성을 개선 또는 증진시킨다.
본원에 사용된 "C-말단 분할 인테인 (Ic)"은 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 C-말단 아미노산 서열을 포함하는 임의의 인테인 서열을 지칭한다. 한 측면에서, Ic는 4 내지 7개의 인접 아미노산 잔기를 포함하고, 이 중 적어도 4개의 아미노산은 그가 유래된 인테인의 마지막 β-가닥으로부터의 것이다. 따라서, Ic는 또한 트랜스-스플라이싱이 발생할 때 스플라이싱되는 서열을 포함한다. Ic는 자연 발생 인테인 서열의 C-말단 부분의 변형인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, Ic는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함이 In을 트랜스-스플라이싱에서 비-기능적으로 만들지 않는 한, 이러한 추가의 아미노산 잔기 및/또는 돌연변이된 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함은 Ic의 트랜스-스플라이싱 활성을 개선 또는 증진시킨다.
본 발명의 일부 실시양태에서, Ic 또는 In에 연결된 펩티드는 특히 형광 기, 비오틴, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아미노산 유사체, 비천연 아미노산, 포스페이트 기, 글리코실 기, 방사성동위원소 표지, 및 제약 분자를 포함한 추가의 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, Ic에 연결된 펩티드는 특히 케톤, 알데히드, Cys 잔기 및 Lys 잔기를 포함하는 1개 이상의 화학적 반응성 기를 포함할 수 있다. 분할 인테인의 N-인테인 및 C-인테인은 비-공유적으로 회합되어 활성 인테인을 형성하고, "인테인-스플라이싱 폴리펩티드 (ISP)"가 존재하는 경우에 스플라이싱 반응을 촉매할 수 있다. 본원에 사용된 "인테인-스플라이싱 폴리펩티드 (ISP)"는 Ic, In, 또는 둘 다가 분할 인테인으로부터 제거될 때 남는 분할 인테인의 아미노산 서열의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, In은 ISP를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Ic는 ISP를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ISP는 In에도 Ic에도 공유 연결되지 않은 별개의 펩티드이다.
분할 인테인은 미니-인테인의 구조에서 발견되는 -12개의 보존된 베타-가닥 사이의 비구조화된 루프 또는 개재 아미노산 서열 내의 1개 이상의 분할 부위를 조작함으로써 인접 인테인으로부터 생성될 수 있다 [25-28]. 분할의 생성이 단백질 스플라이싱 활성이 상실되는데 충분한 정도로 인테인, 특히 구조화된 베타-가닥의 구조를 파괴하지 않을 것이라면, 베타-가닥 사이의 영역 내의 분할 부위의 위치에 일부 유연성이 존재할 수 있다.
단백질 트랜스-스플라이싱에서, 하나의 전구체 단백질은 N-엑스테인 부분에 이어 N-인테인으로 이루어지고, 또 다른 전구체 단백질은 C-인테인 부분에 이어 C-엑스테인으로 이루어지고, 트랜스-스플라이싱 반응 (N- 및 C-인테인에 의해 함께 촉매됨)은 2개의 인테인 서열을 절제하고, 2개의 엑스테인 서열을 펩티드 결합으로 연결한다. 효소 반응인 단백질 트랜스-스플라이싱은 매우 낮은 (예를 들어, 마이크로몰) 농도의 단백질로 작용할 수 있고, 생리학적 조건 하에 수행될 수 있다.
[2] 다른 프로그램가능한 뉴클레아제
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 프라임 편집제는 napDNAbp, 예컨대 Cas9 단백질을 포함한다. 이들 단백질은, 가이드 RNA (또는 PEgRNA)의 스페이서 부분에 상보적인 서열을 보유하고 또한 요구되는 PAM 서열을 보유하는 DNA 상의 표적 부위로 Cas9 단백질을 가이드하는 gRNA (또는 경우에 따라 PEgRNA)와 복합체화되는 방식에 의해 "프로그램가능하다". 그러나, 본원에서 고려되는 특정 실시양태에서, napDNAbp는 상이한 유형의 프로그램가능한 단백질, 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제 또는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로 치환될 수 있다.
도 1j는 napDNAbp (예를 들어, SpCas9 닉카제)를 임의의 프로그램가능한 뉴클레아제 도메인, 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로 대체한, 본원에서 고려되는 프라임 편집의 이러한 변경을 도시한다. 따라서, 적합한 뉴클레아제가 반드시 핵산 표적화 분자 (예컨대 가이드 RNA)에 의해 "프로그램화"될 필요는 없고, 오히려 DNA-결합 도메인, 예컨대 특히 뉴클레아제의 특이성을 규정함으로써 프로그램화될 수 있는 것으로 고려된다. napDNAbp 모이어티를 사용한 프라임 편집에서와 같이, 이러한 대안적 프로그램가능한 뉴클레아제는 표적 DNA의 1개의 가닥만이 절단되도록 변형되는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 바람직하게는 닉카제로서 기능해야 한다. 일단 프로그램가능한 뉴클레아제가 선택되면 (예를 들어, ZFN 또는 TALEN), 추가의 기능성을 시스템 내로 조작하여 이것이 프라임 편집-유사 메카니즘에 따라 작동하도록 할 수 있다. 예를 들어, 프로그램가능한 뉴클레아제는 RNA 또는 DNA 연장 아암을 (예를 들어, 화학적 링커를 통해) 그에 커플링시킴으로써 변형될 수 있으며, 여기서 연장 아암은 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 DNA 합성 주형을 포함한다. 프로그램가능한 뉴클레아제는 또한 폴리머라제에 (예를 들어, 화학적 또는 아미노산 링커를 통해) 커플링될 수 있으며, 그의 속성은 연장 아암이 DNA인지 또는 RNA인지에 좌우될 것이다. RNA 연장 아암의 경우에, 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)일 수 있다. DNA 연장 아암의 경우에, 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, Pol I, Pol II, 또는 Pol III를 포함한 원핵 폴리머라제, 또는 Pol a, Pol b, Pol g, Pol d, Pol e, 또는 Pol z를 포함한 진핵 폴리머라제)일 수 있다. 시스템은 또한 프로그램가능한 뉴클레아제에 대한 융합체로서 부가되거나 또는 트랜스로 부가되어 반응을 전체로서 용이하게 하기 위한 다른 기능성을 포함할 수 있다 (예를 들어, (a) 절단 부위에서 DNA를 풀어내어 3' 단부를 갖는 절단 가닥을 프라이머로서 이용가능하게 하는 헬리카제, (b) 절단 가닥 상의 내인성 가닥을 제거하도록 도와 합성된 가닥으로 내인성 가닥을 대체하는 쪽으로 반응을 구동하는 FEN1, 또는 (c) 대향 가닥 상에 제2 부위 닉을 생성하여, 비-편집된 가닥의 선호되는 세포 복구를 통해 합성 복구의 통합을 구동하는 것을 도울 수 있는 nCas9:gRNA 복합체). napDNAbp에 의한 프라임 편집과 유사한 방식으로, 달리 프로그램가능한 뉴클레아제와의 이러한 복합체를 사용하여 관심 편집을 보유하는 DNA의 새로 합성된 대체 가닥을 합성한 다음, 이를 DNA의 표적 부위 내로 영구적으로 설치할 수 있다.
DNA의 표적 부위에 선택적으로 결합하도록 프로그램화될 수 있고, 폴리머라제, 및 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 RNA 또는 DNA 연장 아암을 특이적 닉 부위에 공동-국재화하도록 상기 기재된 방식으로 추가로 변형될 수 있는 대안적 프라임 편집제 시스템을 구축하기 위해 napDNAbp:gRNA 복합체 대신 사용될 수 있는 적합한 대안적 프로그램가능한 뉴클레아제가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 도 1j에 나타내어진 바와 같이, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)는 본원에 기재된 프라임 편집 방법 및 물질의 조성물에서 프로그램가능한 뉴클레아제로서 사용될 수 있다. TALEN은 TAL이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소이다. 이들 시약은 효율적이고, 프로그램가능하고, 특이적인 DNA 절단을 가능하게 하고, 이는 계내 게놈 편집을 위한 강력한 도구를 나타낸다. 전사 활성인자-유사 이펙터 (TALE)는 실제로 임의의 DNA 서열에 결합하도록 신속하게 조작될 수 있다. 본원에 사용된 용어 TALEN은 광범위하고, 또 다른 TALEN으로부터의 보조 없이 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 단량체 TALEN을 포함한다. 용어 TALEN은 또한 함께 작용하여 동일한 부위에서 DNA를 절단하도록 조작된 한 쌍의 TALEN의 하나 또는 둘 다의 구성원을 지칭하는데 사용된다. 함께 작용하는 TALEN은 좌측-TALEN 및 우측-TALEN으로 지칭될 수 있으며, 이는 DNA의 방향성을 지칭한다. 미국 일련 번호 12/965,590; 미국 일련 번호 13/426,991 (미국 특허 번호 8,450,471); 미국 일련 번호 13/427,040 (미국 특허 번호 8,440,431); 미국 일련 번호 13/427,137 (미국 특허 번호 8,440,432); 및 미국 일련 번호 13/738,381을 참조하며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, TALEN은 WO 2015/027134, US 9,181,535, 문헌 [Boch et al., "Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors", Science, vol. 326, pp. 1509-1512 (2009), Bogdanove et al., TAL Effectors: Customizable Proteins for DNA Targeting, Science, vol. 333, pp. 1843-1846 (2011), Cade et al., "Highly efficient generation of heritable zebrafish gene mutations using homo- and heterodimeric TALENs", Nucleic Acids Research, vol. 40, pp. 8001-8010 (2012), 및 Cermak et al., "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting", Nucleic Acids Research, vol. 39, No. 17, e82 (2011)]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
도 1j에 나타낸 바와 같이, 아연 핑거 뉴클레아제도 또한 napDNAbp, 예컨대 Cas9 닉카제 대신 프라임 편집에 사용하기 위한 대안적 프로그램가능한 뉴클레아제로서 사용될 수 있다. TALEN과 마찬가지로, ZFN 단백질은 이들이 닉카제로서 기능하도록 변형될 수 있으며, 즉, 본원에 기재된 프라임 편집제와 함께 사용되는 napDNAbp와 유사한 방식으로 표적 DNA의 오직 1개의 가닥만을 절단하도록 ZFN이 조작될 수 있다. ZFN 단백질은 관련 기술분야에, 예를 들어, 문헌 [Carroll et al., "Genome Engineering with Zinc-Finger Nucleases," Genetics, Aug 2011, Vol. 188: 773-782; Durai et al., "Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells," Nucleic Acids Res, 2005, Vol. 33: 5978-90; 및 Gaj et al., "ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering," Trends Biotechnol. 2013, Vol.31: 397-405]에 광범위하게 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
[3] 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제), 또는 그의 변이체를 포함하며, 이는 napDNAbp 또는 다른 프로그램가능한 뉴클레아제와의 융합 단백질로서 제공될 수 있거나, 또는 트랜스로 제공될 수 있다.
임의의 폴리머라제가 본원에 개시된 프라임 편집제에 사용될 수 있다. 폴리머라제는 야생형 폴리머라제, 기능적 단편, 돌연변이체, 변이체, 또는 말단절단된 변이체 등일 수 있다. 폴리머라제는 진핵, 원핵, 고세균, 또는 바이러스 유기체로부터의 야생형 폴리머라제를 포함할 수 있고/거나, 폴리머라제는 유전자 조작, 돌연변이유발, 방향적 진화-기반 과정에 의해 변형될 수 있다. 폴리머라제는 T7 DNA 폴리머라제, T5 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, 클레나우 단편 DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 III 등을 포함할 수 있다. 폴리머라제는 또한 열안정성일 수 있고, Taq, Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tth, 스토펠 단편, VENT® 및 DEEPVENT® DNA 폴리머라제, KOD, Tgo, JDF3, 및 그의 돌연변이체, 변이체 및 유도체를 포함할 수 있다 (미국 특허 번호 5,436,149; 미국 특허 번호 4,889,818; 미국 특허 번호 4,965,185; 미국 특허 번호 5,079,352; 미국 특허 번호 5,614,365; 미국 특허 번호 5,374,553; 미국 특허 번호 5,270,179; 미국 특허 번호 5,047,342; 미국 특허 번호 5,512,462; WO 92/06188; WO 92/06200; WO 96/10640; 문헌 [Barnes, W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, J.-M, et al., Nuc. Acids Res. 22(15):3259-3260 (1994)] 참조, 이들 각각은 참조로 포함됨). 보다 긴 핵산 분자 (예를 들어, 약 3-5 Kb 길이보다 긴 핵산 분자)의 합성을 위해, 적어도 2종의 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리머라제 중 1종은 3' 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여될 수 있고, 다른 것은 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 이러한 쌍형성은 동일하거나 상이한 폴리머라제를 포함할 수 있다. 3' 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여된 DNA 폴리머라제의 예는 Taq, Tne(엑소-), Tma(엑소-), Pfu(엑소-), Pwo(엑소-), 엑소-KOD 및 Tth DNA 폴리머라제, 및 그의 돌연변이체, 변이체 및 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
바람직하게는, 본원에 개시된 프라임 편집제에 사용가능한 폴리머라제는 "주형-의존성" 폴리머라제이다 (폴리머라제는 프라임 편집 동안 합성 하의 DNA 가닥의 서열을 명시하기 위해 DNA 합성 주형에 의존하도록 의도되기 때문). 본원에 사용된 용어 "주형 DNA 분자"는, 예를 들어 PEgRNA의 DNA 합성 주형의 프라이머 연장 반응에서 DNA 폴리머라제에 의해 상보적 핵산 가닥이 합성되는 핵산의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "주형 의존성 방식"은 프라이머 분자의 주형 의존성 연장 (예를 들어, DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성)을 수반하는 과정을 지칭하는 것으로 의도된다. 용어 "주형 의존성 방식"은 폴리뉴클레오티드의 새로 합성되는 가닥의 서열이 상보적 염기 쌍형성의 널리 공지된 규칙에 의해 좌우되는 RNA 또는 DNA의 폴리뉴클레오티드 합성을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Watson, J. D. et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)] 참조). 용어 "상보적"은 염기-쌍형성을 통한 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 영역 사이 또는 2개의 뉴클레오티드 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 아데닌 뉴클레오티드는 티민 또는 우라실인 뉴클레오티드와 특이적 수소 결합 ("염기 쌍형성")을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, 시토신 뉴클레오티드는 구아닌 뉴클레오티드와 염기 쌍형성을 할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 프라임 편집의 경우에, DNA 합성 주형에 대해 프라임 편집제의 폴리머라제에 의해 합성된 DNA의 단일 가닥은 DNA 합성 주형의 서열에 "상보적"인 것으로 언급된다고 언급될 수 있다.
A. 예시적인 폴리머라제
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 폴리머라제를 포함한다. 개시내용은 임의의 자연 발생 유기체 또는 바이러스로부터 수득되거나, 또는 상업적 또는 비-상업적 공급원으로부터 수득된 임의의 야생형 폴리머라제를 고려한다. 또한, 개시내용의 프라임 편집제에 사용가능한 폴리머라제는 임의의 자연 발생 돌연변이체 폴리머라제, 조작된 돌연변이체 폴리머라제, 또는 기능을 보유하는 말단절단된 변이체를 포함한 다른 변이체 폴리머라제를 포함할 수 있다. 본원에 사용가능한 폴리머라제는 또한 특정 아미노산 치환, 예컨대 본원에 구체적으로 개시된 것을 함유하도록 조작될 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 개시내용의 프라임 편집제에 사용가능한 폴리머라제는 주형-기반 폴리머라제이며, 즉 이들은 주형-의존성 방식으로 뉴클레오티드 서열을 합성한다.
폴리머라제는 뉴클레오티드 가닥을 합성하고 본원에 기재된 프라임 편집제 시스템과 관련하여 사용될 수 있는 효소이다. 폴리머라제는 바람직하게는 "주형-의존성" 폴리머라제 (즉, 주형 가닥의 뉴클레오티드 염기의 순서에 기초하여 뉴클레오티드 가닥을 합성하는 폴리머라제)이다. 특정 구성에서, 폴리머라제는 또한 "주형-비의존성" (즉, 주형 가닥의 필요 없이 뉴클레오티드 가닥을 합성하는 폴리머라제)일 수 있다. 폴리머라제는 또한 "DNA 폴리머라제" 또는 "RNA 폴리머라제"로 추가로 카테고리화될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 시스템은 DNA 폴리머라제를 포함한다. 다양한 실시양태에서, DNA 폴리머라제는 "DNA-의존성 DNA 폴리머라제" (즉, 주형 분자가 DNA의 가닥임)일 수 있다. 이러한 경우에, DNA 주형 분자는 PEgRNA일 수 있으며, 여기서 연장 아암은 DNA의 가닥을 포함한다. 이러한 경우에, PEgRNA는 RNA 부분 (즉, 스페이서 및 gRNA 코어를 포함한 가이드 RNA 성분) 및 DNA 부분 (즉, 연장 아암)을 포함하는 키메라 또는 하이브리드 PEgRNA로 지칭될 수 있다. 다양한 다른 실시양태에서, DNA 폴리머라제는 "RNA-의존성 DNA 폴리머라제" (즉, 주형 분자가 RNA의 가닥임)일 수 있다. 이러한 경우에, PEgRNA는 RNA, 즉 RNA 연장부를 포함하는 RNA이다. 용어 "폴리머라제"는 또한 뉴클레오티드의 중합 (즉, 폴리머라제 활성)을 촉매하는 효소를 지칭할 수 있다. 일반적으로, 효소는 폴리뉴클레오티드 주형 서열에 어닐링된 프라이머 (예를 들어, 예컨대 PEgRNA의 프라이머 결합 부위에 어닐링된 프라이머 서열)의 3'-단부에서 합성을 개시할 것이고, 주형 가닥의 5' 단부쪽으로 진행할 것이다. "DNA 폴리머라제"는 데옥시뉴클레오티드의 중합을 촉매한다. DNA 폴리머라제와 관련하여 본원에 사용된 용어 DNA 폴리머라제는 "그의 기능적 단편"을 포함한다. "그의 기능적 단편"은 폴리머라제의 전체 미만의 아미노산 서열을 포괄하고, 적어도 1종의 세트의 조건 하에 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 능력을 보유하는 야생형 또는 돌연변이체 DNA 폴리머라제의 임의의 부분을 지칭한다. 이러한 기능적 단편은 별개의 개체로서 존재할 수 있거나, 또는 보다 큰 폴리펩티드, 예컨대 융합 단백질의 구성성분일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 박테리오파지로부터의 것일 수 있다. 박테리오파지 DNA 폴리머라제는 일반적으로 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없는데, 이는 이러한 활성이 별개의 폴리펩티드에 의해 코딩되기 때문이다. 적합한 DNA 폴리머라제의 예는 T4, T7, 및 phi29 DNA 폴리머라제이다. 상업적으로 입수가능한 효소는 T4 (다수의 공급원, 예를 들어 에피센터(Epicentre)로부터 입수가능함) 및 T7 (다수의 공급원, 예를 들어 비변형된 것의 경우 에피센터, 및 3'에서 5' 엑소 T7 "시쿼나제" DNA 폴리머라제의 경우 USB로부터 입수가능함)이다.
다른 실시양태에서, 폴리머라제는 고세균 폴리머라제이다. 고세균에서 확인된 2가지 상이한 부류의 DNA 폴리머라제가 존재한다: 1. 패밀리 B/pol I 유형 (피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터의 Pfu의 상동체) 및 2. pol II 유형 (피. 푸리오수스 DP1/DP2 2-서브유닛 폴리머라제의 상동체). 둘 다의 부류로부터의 DNA 폴리머라제는 연관된 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성이 자연 결여되고 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 (교정) 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 적합한 DNA 폴리머라제 (pol I 또는 pol II)는 목적하는 검정 온도와 유사한 최적 성장 온도를 갖는 고세균으로부터 유래될 수 있다.
열안정성 고세균 DNA 폴리머라제는 피로코쿠스(Pyrococcus) 종 (푸리오수스(furiosus), 종 GB-D, 보에시이(woesii), 아비씨(abyssi), 호르코쉬이(horikoshii)), 써모코쿠스(Thermococcus) 종 (코다카라엔시스(kodakaraensis) KOD1, 리토랄리스(litoralis), 종 9 디그리스 노스-7(9 degrees North-7), 종 JDF-3, 고르고나리우스(gorgonarius)), (피로딕티움 오쿨툼(Pyrodictium occultum)), 및 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 단리된다.
폴리머라제는 또한 유박테리아 종으로부터의 것일 수 있다. 유박테리아 DNA 폴리머라제의 3종의 부류, pol I, II, 및 III이 존재한다. Pol I DNA 폴리머라제 패밀리의 효소는 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성을 보유하고, 특정 구성원은 또한 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. Pol II DNA 폴리머라제는 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성이 자연 결여되어 있지만, 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. Pol III DNA 폴리머라제는 세포의 주요 복제 DNA 폴리머라제를 나타내고, 다중 서브유닛으로 구성된다. pol III 촉매 서브유닛은 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있지만, 일부 경우에 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성은 동일한 폴리펩티드에 위치한다.
다양한 상업적으로 입수가능한 Pol I DNA 폴리머라제가 존재하며, 이들 중 일부는 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 없애도록 변형되었다.
적합한 열안정성 pol I DNA 폴리머라제는 써무스(Thermus) 종 및 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 예컨대 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) (Tth) 및 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) (Tma UlTma)를 포함한 다양한 고온성 유박테리아로부터 단리될 수 있다.
상기 열거된 것과 관련된 추가의 유박테리아는 문헌 [Thermophilic Bacteria (Kristjansson, J. K., ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1992]에 기재되어 있다.
본 발명은 그의 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,677,152, 6,479,264 및 6,183,998에 개시된 방법에 따라 화학적으로 변형된 키메라 또는 비-키메라 DNA 폴리머라제를 추가로 제공한다.
상기 열거된 것과 관련된 추가의 고세균 DNA 폴리머라제는 하기 참고문헌에 기재되어 있다: [Archaea: A Laboratory Manual (Robb, F. T. and Place, A. R., eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995 및 Thermophilic Bacteria (Kristjansson, J. K., ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1992].
B. 예시적인 리버스 트랜스크립타제
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 폴리머라제로서 리버스 트랜스크립타제를 포함한다. 개시내용은 임의의 자연 발생 유기체 또는 바이러스로부터 수득되거나, 또는 상업적 또는 비-상업적 공급원으로부터 수득된 임의의 야생형 리버스 트랜스크립타제를 고려한다. 또한, 개시내용의 프라임 편집제에 사용가능한 리버스 트랜스크립타제는 임의의 자연 발생 돌연변이체 RT, 조작된 돌연변이체 RT, 또는 기능을 보유하는 말단절단된 변이체를 포함한 다른 변이체 RT를 포함할 수 있다. RT는 또한 특정 아미노산 치환, 예컨대 본원에 구체적으로 개시된 것을 함유하도록 조작될 수 있다.
리버스 트랜스크립타제는 전형적으로 RNA- 및 DNA-의존성 DNA 중합 활성을 비롯한 3가지 효소적 활성, 및 RNA-DNA 하이브리드에서 RNA의 절단을 촉매하는 RNaseH 활성을 갖는 다기능성 효소이다. 리버스 트랜스크립타제의 일부 돌연변이체는 RNaseH 모이어티를 무력화시켜 mRNA에 대한 의도하지 않은 손상을 방지한다. 주형으로서 mRNA를 사용하여 상보적 DNA (cDNA)를 합성하는 이들 효소가 RNA 바이러스에서 최초로 확인되었다. 후속적으로, 바이러스 입자, 세포 또는 조직으로부터 리버스 트랜스크립타제가 직접 단리 및 정제되었다. (예를 들어, 문헌 [Kacian et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 46: 365-83; Yang et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47: 505-11; Gerard et al., 1975, J. Virol. 15: 785-97; Liu et al., 1977, Arch. Virol. 55 187-200; Kato et al., 1984, J. Virol. Methods 9: 325-39; Luke et al., 1990, Biochem. 29: 1764-69 and Le Grice et al., 1991, J. Virol. 65: 7004-07] 참조, 이들 각각은 참조로 포함됨). 보다 최근에, 열안정성, 충실도 및 활성과 같은 개선된 특성에 대한 연구에서 돌연변이체 및 융합 단백질이 생성되었다. 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 리버스 트랜스크립타제의 야생형, 변이체, 및/또는 돌연변이체 형태 중 임의의 것이 본원에서 고려된다.
리버스 트랜스크립타제 (RT) 유전자 (또는 그 안에 함유된 유전자 정보)는 다수의 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 레트로바이러스로 감염된 진핵 세포로부터, 또는 레트로바이러스 게놈의 부분 또는 전체를 함유하는 다수의 플라스미드로부터 수득될 수 있다. 또한, RT 유전자를 함유하는 메신저 RNA-유사 RNA는 레트로바이러스로부터 수득될 수 있다. RT에 대한 공급원의 예는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV 또는 MLVRT); 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1 (HTLV-1); 소 백혈병 바이러스 (BLV); 라우스 육종 바이러스 (RSV); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV); 효모, 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces), 뉴로스포라(Neurospora), 드로소필라(Drosophila); 영장류; 및 설치류를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Weiss, et al., 미국 특허 번호 4,663,290 (1987); Gerard, G. R., DNA:271-79 (1986); Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-58 (1985); Tanese, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):4944-48 (1985); Roth, M. J., et al., J. Biol. Chem. 260:9326-35 (1985); Michel, F., et al., Nature 316:641-43 (1985); Akins, R. A., et al., Cell 47:505-16 (1986), EMBO J. 4:1267-75 (1985); 및 Fawcett, D. F., Cell 47:1007-15 (1986)]을 참조한다 (각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
야생형 RT
본원에 개시된 프라임 편집제와 함께 사용하기 위한 예시적인 효소는 M-MLV 리버스 트랜스크립타제 및 RSV 리버스 트랜스크립타제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 리버스 트랜스크립타제 활성을 갖는 효소는 상업적으로 입수가능하다. 특정 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 프라임 편집제 (PE) 시스템의 다른 성분에 트랜스로 제공된다. 즉, 리버스 트랜스크립타제는 개별 성분으로서 발현되거나 또는 달리 제공되며, 즉 napDNAbp와의 융합 단백질로서가 아니다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 리버스 트랜스크립타제 및 조류 육종-백혈증 바이러스 (ASLV) 리버스 트랜스크립타제, 예컨대 비제한적으로 라우스 육종 바이러스 (RSV) 리버스 트랜스크립타제, 조류 골수모구증 바이러스 (AMV) 리버스 트랜스크립타제, 조류 적모구증 바이러스 (AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV 리버스 트랜스크립타제, 조류 골수구종증 바이러스 MC29 헬퍼 바이러스 MCAV 리버스 트랜스크립타제, 조류 세망내피증 바이러스 (REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A 리버스 트랜스크립타제, 조류 육종 바이러스 UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV 리버스 트랜스크립타제, 조류 육종 바이러스 Y73 헬퍼 바이러스 YAV 리버스 트랜스크립타제, 라우스 연관 바이러스 (RAV) 리버스 트랜스크립타제, 및 골수모구증 연관 바이러스 (MAV) 리버스 트랜스크립타제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 야생형 리버스 트랜스크립타제가 본원에 기재된 대상 방법 및 조성물에 적합하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
예시적인 야생형 RT 효소는 하기와 같다:
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
변이체 및 오류-유발 RT
리버스 트랜스크립타제는 RNA 주형으로부터 상보적 DNA (cDNA) 가닥을 합성하는데 필수적이다. 리버스 트랜스크립타제는 상이한 생화학적 활성을 나타내는 별개의 도메인으로 구성된 효소이다. 효소는 하기와 같이 RNA 주형으로부터 DNA의 합성을 촉매한다: 어닐링된 프라이머의 존재 하에, 리버스 트랜스크립타제는 RNA 주형에 결합하여 중합 반응을 개시한다. RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성은 상보적 DNA (cDNA) 가닥을 합성하여, dNTP를 혼입시킨다. RNase H 활성은 DNA:RNA 복합체의 RNA 주형을 분해한다. 따라서, 리버스 트랜스크립타제는 (a) RNA/DNA 하이브리드를 인식하고 이에 결합하는 결합 활성, (b) RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성, 및 (c) RNase H 활성을 포함한다. 또한, 리버스 트랜스크립타제는 일반적으로 그의 열안정성, 프로세싱성 (dNTP 혼입 속도), 및 충실도 (또는 오류율)를 비롯한 다양한 속성을 갖는 것으로 간주된다. 본원에서 고려되는 리버스 트랜스크립타제 변이체는 이들 효소적 활성 (예를 들어, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성, RNase H 활성, 또는 DNA/RNA 하이브리드-결합 활성) 또는 효소 특성 (예를 들어, 열안정성, 프로세싱성, 또는 충실도) 중 어느 하나 이상에 영향을 미치거나 이를 변화시키는 리버스 트랜스크립타제에 대한 임의의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 관련 기술분야에서 공공 도메인에서 입수가능하거나, 상업적으로 입수가능하거나, 또는 방향적 진화상 과정 (예를 들어, PACE 또는 PANCE)을 포함한 공지된 돌연변이유발 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 변이체 리버스 트랜스크립타제일 수 있다. 본원에 사용된 "변이체 리버스 트랜스크립타제"는 참조 서열 (예를 들어, 참조 야생형 서열)에 비해 1개 이상의 돌연변이 (단일 돌연변이, 역위, 결실, 삽입, 및 재배열 포함)를 포함하는 임의의 자연 발생 또는 유전자 조작된 변이체를 포함한다. RT는 자연적으로 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성, 리보뉴클레아제 H 활성, 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 비롯한 여러 활성을 갖는다. 집합적으로, 이들 활성은 효소가 단일 가닥 RNA를 이중 가닥 cDNA로 전환시킬 수 있게 한다. 레트로바이러스 및 레트로트랜스포손에서, 이러한 cDNA는 이어서 숙주 게놈 내로 통합될 수 있고, 이로부터 숙주-세포 전사를 통해 새로운 RNA 카피가 제조될 수 있다. 변이체 RT는 이들 활성 중 1종 이상에 영향을 미치는 (이들 활성을 감소 또는 증가시키거나, 또는 이들 활성을 모두 함께 제거하는) 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한, 변이체 RT는 RT를 더 안정하게 또는 덜 안정하게 하고, 응집 경향을 낮추고, 정제 및/또는 검출, 및/또는 특성 또는 특징의 다른 변형을 용이하게 하는 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 리버스 트랜스크립타제 및 조류 육종-백혈증 바이러스 (ASLV) 리버스 트랜스크립타제, 예컨대 비제한적으로 라우스 육종 바이러스 (RSV) 리버스 트랜스크립타제, 조류 골수모구증 바이러스 (AMV) 리버스 트랜스크립타제, 조류 적모구증 바이러스 (AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV 리버스 트랜스크립타제, 조류 골수구종증 바이러스 MC29 헬퍼 바이러스 MCAV 리버스 트랜스크립타제, 조류 세망내피증 바이러스 (REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A 리버스 트랜스크립타제, 조류 육종 바이러스 UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV 리버스 트랜스크립타제, 조류 육종 바이러스 Y73 헬퍼 바이러스 YAV 리버스 트랜스크립타제, 라우스 연관 바이러스 (RAV) 리버스 트랜스크립타제, 및 골수모구증 연관 바이러스 (MAV) 리버스 트랜스크립타제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 리버스 트랜스크립타제로부터 유래된 변이체 리버스 트랜스크립타제가 본원에 기재된 대상 방법 및 조성물에 적합하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
변이체 RT를 제조하는 하나의 방법은 유전자 변형에 의한 (예를 들어, 야생형 리버스 트랜스크립타제의 DNA 서열을 변형시키는 것에 의한) 것이다. DNA 서열의 무작위 돌연변이 뿐만 아니라 표적화된 돌연변이를 허용하는 다수의 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1995) 3.sup.rd Ed. John Wiley & Sons, Inc.] 참조). 또한, 통상적인 방법 및 PCR-기반 방법 둘 다를 포함한 부위-지정 돌연변이유발을 위한 다수의 상업적으로 입수가능한 키트가 존재한다. 예는 퀵체인지(QuikChange) 부위-지정 돌연변이유발 키트 (애질런트(AGILENT)®), Q5® 부위-지정 돌연변이유발 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(NEW ENGLAND BIOLABS)®), 및 진아트(GeneArt)™ 부위-지정 돌연변이유발 시스템 (써모피셔 사이언티픽(THERMOFISHER SCIENTIFIC)®)을 포함한다.
또한, 돌연변이체 리버스 트랜스크립타제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법론에 따라 삽입 돌연변이 또는 말단절단 (N-말단, 내부, 또는 C-말단 삽입 또는 말단절단)에 의해 생성될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어 핵산 또는 아미노산 서열 내의 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로 원래 잔기를 확인한 다음, 서열 내의 잔기의 위치를 확인하고, 새로 치환된 잔기의 정체를 확인하는 것에 의해 본원에 기재된다. 본원에 제공된 아미노산 치환 (돌연변이)을 제조하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 의해 제공된다. 돌연변이는 다양한 카테고리, 예컨대 단일 염기 다형성, 미세중복 영역, indel, 및 역위를 포함할 수 있고, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 돌연변이는 단백질 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이의 정상적인 결과인 "기능 상실" 돌연변이를 포함할 수 있다. 대부분의 기능 상실 돌연변이는 열성이며, 이는 이형접합체에서 제2 염색체 카피가 그의 존재가 돌연변이의 효과를 보상하는 완전 기능적 단백질을 코딩하는 유전자의 비돌연변이된 버전을 보유하기 때문이다. 돌연변이는 또한 정상 상태에서는 달리 존재하지 않는 단백질 또는 세포에 비정상적 활성을 부여하는 것인 "기능 획득" 돌연변이를 포괄한다. 많은 기능 획득 돌연변이는 코딩 영역보다는 조절 서열에 존재하고, 따라서 다수의 결과를 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 1개 이상의 유전자가 잘못된 조직에서 발현되게 할 수 있고, 이들 조직은 정상적으로는 결여되어 있는 기능을 얻는다. 그의 속성으로 인해, 기능 획득 돌연변이는 통상적으로 우성이다.
관련 기술분야에 공지된 부위-지정 돌연변이유발의 보다 오래된 방법은 단일 가닥 DNA 주형의 단리를 가능하게 하는 벡터, 예컨대 M13 박테리오파지 벡터 내로의 돌연변이시킬 서열의 서브-클로닝에 의존한다. 이들 방법에서, 돌연변이유발 프라이머 (즉, 돌연변이시킬 부위에 어닐링할 수 있지만 돌연변이시킬 부위에 1개 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 보유할 수 있는 프라이머)를 단일 가닥 주형에 어닐링시킨 후, 돌연변이유발 프라이머의 3' 단부로부터 출발하여 주형의 상보체를 중합시킨다. 이어서, 생성된 듀플렉스로 숙주 박테리아를 형질전환시키고, 목적하는 돌연변이에 대해 플라크를 스크리닝한다.
보다 최근에, 부위-지정 돌연변이유발은 단일 가닥 주형을 필요로 하지 않는 이점을 갖는 PCR 방법론을 이용하였다. 또한, 서브클로닝을 필요로 하지 않는 방법이 개발되었다. PCR-기반 부위-지정 돌연변이유발이 수행될 때 여러 이슈가 고려되어야 한다. 첫번째로, 이들 방법에서, 폴리머라제에 의해 도입된 바람직하지 않은 돌연변이의 확장을 방지하기 위해 PCR 사이클의 수를 감소시키는 것이 바람직하다. 두번째로, 반응에서 지속되는 비-돌연변이된 모 분자의 수를 감소시키기 위해 선택이 사용되어야 한다. 세번째로, 단일 PCR 프라이머 세트의 사용을 허용하기 위해 연장-길이 PCR 방법이 바람직하다. 그리고 네번째로, 일부 열안정성 폴리머라제의 비-주형-의존성 말단 연장 활성으로 인해, PCR-생성된 돌연변이체 생성물의 평활-말단 라이게이션 전에 말단-폴리싱 단계를 절차에 혼입시키는 것이 종종 필요하다.
1개 이상의 무작위로 위치한 돌연변이를 보유하는 돌연변이체 패널을 생성할 무작위 돌연변이유발 방법이 관련 기술분야에 존재한다. 이어서, 이러한 돌연변이체 패널을 대상으로 하여, 야생형 리버스 트랜스크립타제에 비해 목적하는 특성, 예를 들어 증가된 안정성을 나타내는 것에 관하여 스크리닝할 수 있다.
무작위 돌연변이유발 방법의 예는 소위 "오류-유발 PCR 방법"이다. 명칭이 암시하는 바와 같이, 방법은 DNA 폴리머라제가 고충실도 혼입을 지지하지 않는 조건 하에서 주어진 서열을 증폭시킨다. 상이한 DNA 폴리머라제에 대한 오류-유발 혼입을 촉진하는 조건은 다양하지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 주어진 효소에 대한 이러한 조건을 결정할 수 있다. 많은 DNA 폴리머라제에 대한 증폭의 충실도에서의 핵심 변수는, 예를 들어 완충제 중 2가 금속 이온의 유형 및 농도이다. 따라서, 망가니즈 이온의 사용 및/또는 마그네슘 또는 망가니즈 이온 농도의 변경은 폴리머라제의 오류율에 영향을 미치도록 적용될 수 있다.
다양한 측면에서, 프라임 편집제의 RT는 "오류-유발" 리버스 트랜스크립타제 변이체일 수 있다. 관련 기술분야에 공지되고/거나 이용가능한 오류-유발 리버스 트랜스크립타제가 사용될 수 있다. 리버스 트랜스크립타제는 자연적으로 어떠한 교정 기능도 갖지 않고; 따라서 리버스 트랜스크립타제의 오류율은 교정 활성을 포함하는 DNA 폴리머라제보다 일반적으로 더 높다는 것이 인지될 것이다. 임의의 특정한 리버스 트랜스크립타제의 오류율은 그의 RNA 주형에 대한 DNA의 주형-지정 중합의 정확도를 나타내는 효소의 "충실도"의 특성이다. 고충실도를 갖는 RT는 낮은 오류율을 갖는다. 반대로, 저충실도를 갖는 RT는 높은 오류율을 갖는다. M-MLV-기반 리버스 트랜스크립타제의 충실도는 합성된 15,000 내지 27,000개 뉴클레오티드에서 1개 오류 범위의 오류율을 갖는 것으로 보고되어 있다. 참조로 포함되는 문헌 [Boutabout et al., "DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1," Nucleic Acids Res, 2001, 29: 2217-2222]을 참조한다. 따라서, 본 출원의 목적상, "오류-유발"인 것으로 간주되거나 또는 "오류-유발 충실도"를 갖는 것으로 간주되는 리버스 트랜스크립타제는 합성된 15,000개 뉴클레오티드에서 1개 오류 미만의 오류율을 갖는 것이다.
오류-유발 리버스 트랜스크립타제는 또한 출발 RT 효소 (예를 들어, 야생형 M-MLV RT)의 돌연변이유발을 통해 생성될 수 있다. 돌연변이유발 방법은 제한되지 않고, 방향적 진화 과정, 예컨대 파지-보조 연속 진화 (PACE) 또는 파지-보조 비연속 진화 (PANCE)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "파지-보조 연속 진화 (PACE)"는 바이러스 벡터로서 파지를 사용하는 연속 진화를 지칭한다. PACE 기술의 일반적 개념은, 예를 들어 2010년 3월 11일에 WO 2010/028347로서 공개된, 2009년 9월 8일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2009/056194; 2012년 6월 28일에 WO 2012/088381로서 공개된, 2011년 12월 22일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2011/066747; 2015년 5월 5일에 허여된 미국 출원, 미국 특허 번호 9,023,594, 2015년 9월 11일에 WO 2015/134121로서 공개된, 2015년 1월 20일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2015/012022, 및 2016년 10월 20일에 WO 2016/168631로서 공개된, 2016년 4월 15일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2016/027795에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
오류-유발 리버스 트랜스크립타제는 또한 파지-보조 비-연속적 진화 (PANCE)에 의해 수득될 수 있고, 이는 본원에 사용된 바와 같이, 바이러스 벡터로서 파지를 사용하는 비-연속 진화를 지칭한다. PANCE는 새로운 이. 콜라이 숙주 세포를 가로질러 진화시킬 관심 유전자를 함유하는 진화 '선택 파지' (SP)의 연속 플라스크 전달을 사용하여 숙주 이. 콜라이 내부의 유전자는 일정하게 유지되게 하는 한편 SP 내에 함유된 유전자가 연속적으로 진화하게 하는, 신속한 생체내 방향적 진화를 위한 단순화된 기술이다. 연속 플라스크 전달은 오랫동안 미생물의 실험실 진화를 위한 폭넓게 접근가능한 접근법으로서의 역할을 하였고, 보다 최근에는 박테리오파지 진화를 위한 유사한 접근법이 개발되었다. PANCE 시스템은 PACE 시스템보다 더 낮은 엄격도를 특색으로 한다.
다른 오류-유발 리버스 트랜스크립타제가 문헌에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원의 방법 및 조성물에 사용하기 위해 고려된다. 예를 들어, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제는 문헌 [Bebenek et al., "Error-prone Polymerization by HIV-1 Reverse Transcriptase," J Biol Chem, 1993, Vol. 268: 10324-10334 및 Sebastian-Martin et al., "Transcriptional inaccuracy threshold attenuates differences in RNA-dependent DNA synthesis fidelity between retroviral reverse transcriptases," Scientific Reports, 2018, Vol. 8: 627]에 기재되어 있고, 이들 각각은 참조로 포함된다. 또한, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제를 비롯한 리버스 트랜스크립타제는 모두 뉴 잉글랜드 바이오랩스®로부터의 것인 프로토스크립트(ProtoScript)® (II) 리버스 트랜스크립타제, AMV 리버스 트랜스크립타제, 웜스타트(WarmStart)® 리버스 트랜스크립타제, 및 M-MuLV 리버스 트랜스크립타제, 또는 모두 다카라 바이오 유에스에이, 인크.(TAKARA BIO USA, INC.) (이전의 클론테크(CLONTECH))로부터의 것인 AMV 리버스 트랜스크립타제 XL, 스마트스크라이브(SMARTScribe) 리버스 트랜스크립타제, GPR 초순수 MMLV 리버스 트랜스크립타제를 포함하여 상업적 공급업체로부터 입수할 수 있다.
본원의 개시내용은 또한 RNaseH 도메인에서 돌연변이를 갖는 리버스 트랜스크립타제를 고려한다. 상기 언급된 바와 같이, 리버스 트랜스크립타제의 내재적 특성 중 하나는 RNA:cDNA 하이브리드의 RNA 주형을 중합과 동시에 절단하는 RNase H 활성이다. RNase H 활성은 RNA 주형이 전장 역전사의 완료 전에 분해될 수 있기 때문에 긴 cDNA의 합성에 바람직하지 않을 수 있다. RNase H 활성은 또한, 아마도 효소의 폴리머라제 활성과 그의 경쟁으로 인해, 역전사 효율을 저하시킬 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 변형된 RNaseH 활성을 포함하는 임의의 리버스 트랜스크립타제 변이체를 고려한다.
본원의 개시내용은 또한 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 도메인에서 돌연변이를 갖는 리버스 트랜스크립타제를 고려한다. 상기 언급된 바와 같이, 리버스 트랜스크립타제의 내재적 특성 중 하나는 RNA:cDNA 하이브리드의 주형 RNA 가닥에 의해 코딩된 바와 같이 신생 cDNA 가닥 내로 핵염기를 혼입시키는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성이다. RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성은 증가 또는 감소되어 (즉, 그의 혼입 속도의 관점에서) 효소의 프로세싱성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 비변형된 버전에 비해 효소의 프로세싱성이 증가 또는 감소되도록 변형된 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 임의의 리버스 트랜스크립타제 변이체를 고려한다.
또한, 변경된 열안정성 특징을 갖는 리버스 트랜스크립타제 변이체가 본원에서 고려된다. 리버스 트랜스크립타제가 고온을 견디는 능력은 cDNA 합성의 중요한 측면이다. 상승된 반응 온도는 강한 2차 구조 및/또는 높은 GC 함량을 갖는 RNA를 변성시키는 것을 도와, 리버스 트랜스크립타제가 서열을 따라 판독하도록 한다. 그 결과, 보다 높은 온도에서의 역전사는 전장 cDNA 합성 및 보다 높은 수율을 가능하게 하며, 이는 프라임 편집 과정의 결과로서 3' 플랩 ssDNA의 개선된 생성으로 이어질 수 있다. 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제는 전형적으로 37-48℃ 범위의 최적 온도를 갖지만; 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 및 그 초과를 포함한 48℃ 초과의 보다 높은 온도에서 역전사 활성을 허용하는 돌연변이가 도입될 수 있다.
오류-유발 RT, 열안정성 RT, 프로세싱성-증가 RT를 비롯한 본원에서 고려되는 변이체 리버스 트랜스크립타제는 돌연변이유발 또는 진화성 과정을 비롯한 다양한 상용 전략에 의해 조작될 수 있다. 일부 경우에, 변이체는 단일 돌연변이를 도입함으로써 생산될 수 있다. 다른 경우에, 변이체는 1개 초과의 돌연변이를 필요로 할 수 있다. 1개 초과의 돌연변이를 포함하는 그러한 돌연변이체에 대해, 주어진 돌연변이의 효과는 특정한 돌연변이체가 보유하는 다른 돌연변이와 별개로 부위-지정 돌연변이유발에 의한 야생형 유전자에의 확인된 돌연변이의 도입에 의해 평가될 수 있다. 이어서, 이와 같이 생산된 단일 돌연변이체의 스크리닝 검정은 그러한 돌연변이 단독의 효과의 결정을 가능하게 할 것이다.
본원에 사용된 변이체 RT 효소는 또한 임의의 야생형 RT, 또는 돌연변이체 RT, 또는 단편 RT, 또는 본원에서 개시되거나 고려되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 RT의 다른 변이체를 포함한 임의의 참조 RT 단백질과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 다른 "RT 변이체"를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, RT 변이체는 참조 RT와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 최대 100개, 또는 최대 200개, 또는 최대 300개, 또는 최대 400개, 또는 최대 500개 또는 그 초과의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, RT 변이체는 참조 RT의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 참조 RT의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 상응하는 야생형 RT (M-MLV 리버스 트랜스크립타제) (예를 들어, 서열식별번호: 89) 또는 서열식별번호: 90-100의 리버스 트랜스크립타제 중 임의의 것의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다.
일부 실시양태에서, 개시내용은 또한 그의 기능성을 보유하고 임의의 본원에 개시된 RT 단백질의 단편인 RT 단편을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, RT 단편은 적어도 100개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550개, 또는 최대 600개 또는 그 초과의 아미노산 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 또한 충분한 폴리머라제 기능을 여전히 보유하는 말단절단된 변이체를 생성하는, 특정 수의 아미노산만큼 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다에서 말단절단된 RT 변이체를 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, RT 말단절단된 변이체는 단백질의 N-말단 단부에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개의 아미노산의 말단절단을 갖는다. 다른 실시양태에서, RT 말단절단된 변이체는 단백질의 C-말단 단부에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개의 아미노산의 말단절단을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, RT 말단절단된 변이체는 N-말단 및 C-말단 단부에서 동일하거나 상이한 길이의 말단절단을 갖는다.
예를 들어, 본원에 개시된 프라임 편집제는 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 말단절단된 버전을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 4개의 돌연변이를 함유한다 (D200N, T306K, W313F, T330P; PE2에 존재하는 L603W 돌연변이는 말단절단으로 인해 더 이상 존재하지 않음에 주목). 이러한 말단절단된 편집제를 코딩하는 DNA 서열은 PE2보다 522 bp 더 작고, 따라서 DNA 서열의 전달이 그의 크기로 인해 도전과제인 적용 (즉, 아데노-연관 바이러스 및 렌티바이러스 전달)에서 잠재적으로 유용하게 한다. 이러한 실시양태는 MMLV-RT(trunc)로 지칭되고, 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00074
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제는 본원에 기재된 RT 변이체, 또는 임의의 참조 Cas9 변이체와 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 그의 RT 변이체 중 하나를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Effefson et al., "Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase," Science, June 24, 2016, Vol. 352: 1590-1593]에 기재된 바와 같은, 리버스 트랜스크립타제로 진화된 DNA 폴리머라제를 이용할 수 있다.
특정의 다른 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 napDNAbp를 또한 포함하는 융합 단백질의 성분으로서 제공된다. 다시 말해서, 일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 융합 단백질로서 napDNAbp에 융합된다.
다양한 실시양태에서, 변이체 리버스 트랜스크립타제는 서열식별번호: 89로 표시된 바와 같은 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제로부터 조작될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 하기 돌연변이: P51L, S67K, E69K, L139P, T197A, D200N, H204R, F209N, E302K, E302R, T306K, F309N, W313F, T330P, L345G, L435G, N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, E607K, 또는 D653N 중 1개 이상을 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다양한 실시양태에 따른 napDNAbp 단백질에 융합될 수 있거나 또는 개별 단백질로서 제공될 수 있는 일부 예시적인 리버스 트랜스크립타제가 하기 제공된다. 예시적인 리버스 트랜스크립타제는 하기 야생형 효소 또는 부분 효소와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다:
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 하기 돌연변이: P51X, S67X, E69X, L139X, T197X, D200X, H204X, F209X, E302X, T306X, F309X, W313X, T330X, L345X, L435X, N454X, D524X, E562X, D583X, H594X, L603X, E607X, 또는 D653X 중 1개 이상을 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 P51X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 L이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 S67X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E69X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 L139X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 P이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 T197X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 A이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 D200X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 N이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 H204X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 R이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 F209X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 N이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E302X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E302X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 R이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 T306X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 F309X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 N이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 W313X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 F이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 T330X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 P이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 L345X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 G이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 L435X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 G이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 N454X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 D524X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 G이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E562X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 Q이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 D583X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 N이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 H594X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 Q이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 L603X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 W이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E607X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 89의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 D653X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X는 N이다.
본 개시내용의 다양한 실시양태에 따른 napDNAbp 단백질에 융합될 수 있거나 또는 개별 단백질로서 제공될 수 있는 일부 예시적인 리버스 트랜스크립타제가 하기 제공된다. 예시적인 리버스 트랜스크립타제는 하기 야생형 효소 또는 부분 효소와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다:
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 하기 미국 특허 (이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨): 미국 특허 번호 10,202,658; 10,189,831; 10,150,955; 9,932,567; 9,783,791; 9,580,698; 9,534,201; 및 9,458,484 중 임의의 것에 기재되어 있거나 개시된 임의의 공중 이용가능한 리버스 트랜스크립타제, 및 돌연변이를 설치하는 것에 대한 공지된 방법 또는 단백질을 진화시키는 것에 대한 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 그의 임의의 변이체를 고려한다. 하기 참고문헌은 관련 기술분야의 리버스 트랜스크립타제를 기재한다. 각각의 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
리버스 트랜스크립타제에 관한 상기 언급된 참고문헌 중 임의의 것은, 이미 언급되지 않은 한, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
[4] PE 융합 단백질
본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 napDNAbp 및 폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제)를 포함하고, 임의로 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 고려한다. 본 출원은 단일 융합 단백질로 조합될 임의의 적합한 napDNAbp 및 폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제)를 고려한다. napDNAbp 및 폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제)의 예는 각각 본원에 규정된다. 폴리머라제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아미노산 서열은 용이하게 이용가능하기 때문에, 본 개시내용은 어떠한 방식으로도 본원에서 확인된 그러한 특정 폴리머라제로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 실시양태에서, 융합 단백질은 임의의 적합한 구조적 구성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 napDNAbp-융합-폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제)를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)-융합-napDNAbp를 포함할 수 있다. 융합된 도메인은 임의로 링커, 예를 들어 아미노산 서열에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 구조 NH2-[napDNAbp]-[폴리머라제]-COOH; 또는 NH2-[폴리머라제]-[napDNAbp]-COOH를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다. 폴리머라제가 리버스 트랜스크립타제인 실시양태에서, 융합 단백질은 구조 NH2-[napDNAbp]-[RT]-COOH; 또는 NH2-[RT]-[napDNAbp]-COOH를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다.
예시적인 융합 단백질이 도 14에 도시되어 있으며, 이는 링커 서열을 통해 닉카제 Cas9 ("Cas9(H840A)")에 융합된 MLV 리버스 트랜스크립타제 ("MLV-RT")를 포함하는 융합 단백질을 보여준다. 이러한 예는 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템에 이용될 수 있는 융합 단백질의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 융합 단백질은 H840A 돌연변이를 포함하는 Cas9 변이체 (즉, Cas9 닉카제) 및 M-MLV RT 야생형, 뿐만 아니라 Cas9 닉카제 도메인의 C-말단을 RT 도메인의 N-말단에 연결하는 N-말단 NLS 서열 (19개 아미노산) 및 아미노산 링커 (32개 아미노산)를 포함하는 하기 아미노산 서열 (본원에서 "PE1"로 지칭됨)을 가질 수 있다. PE1 융합 단백질은 하기 구조를 갖는다: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(wt)]. PE1 및 그의 개별 성분의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
또 다른 실시양태에서, 프라임 편집제 융합 단백질은 H840A 돌연변이를 포함하는 Cas9 변이체 (즉, Cas9 닉카제) 및 돌연변이 D200N, T330P, L603W, T306K, 및 W313F를 포함하는 M-MLV RT, 뿐만 아니라 Cas9 닉카제 도메인의 C-말단을 RT 도메인의 N-말단에 연결하는 N-말단 NLS 서열 (19개 아미노산) 및 아미노산 링커 (33개 아미노산)를 포함하는 하기 아미노산 서열 (본원에서 "PE2"로 지칭됨)을 가질 수 있다. PE2 융합 단백질은 하기 구조를 갖는다: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]. PE2의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
또 다른 실시양태에서, 프라임 편집제 융합 단백질은 하기 아미노산 서열을 가질 수 있다:
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
다른 실시양태에서, 프라임 편집제 융합 단백질은 변경된 PAM 특이성을 갖는 SaCas9 또는 SpCas9 닉카제, 예컨대 하기 예시적인 서열에 기초할 수 있다:
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
또 다른 실시양태에서, 본원에서 고려되는 프라임 편집제 융합 단백질은 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 말단절단된 버전에 융합된 Cas9 닉카제 (예를 들어, Cas9 (H840A))를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 또한 4개의 돌연변이를 함유한다 (D200N, T306K, W313F, T330P; PE2에 존재하는 L603W 돌연변이는 말단절단으로 인해 더 이상 존재하지 않음에 주목). 이러한 말단절단된 편집제를 코딩하는 DNA 서열은 PE2보다 522 bp 더 작고, 따라서 DNA 서열의 전달이 그의 크기로 인해 도전과제인 적용 (즉, 아데노-연관 바이러스 및 렌티바이러스 전달)에서 잠재적으로 유용하게 한다. 이러한 실시양태는 Cas9(H840A)-MMLV-RT(trunc) 또는 "PE2-짧은 형" 또는 "PE2-trunc"로서 지칭되고, 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00104
Figure pct00105
다양한 세포주에서의 상이한 표적 부위에 대한 PE2, PE2-trunc, PE3, 및 PE3-trunc의 효율 (즉, "명시된 편집 또는 indel을 갖는 총 서열분석 판독물의 %")을 비교한 막대 그래프를 제공하는 도 75를 참조한다. 데이터는 말단절단된 RT 변이체를 포함하는 프라임 편집제가 약 비-말단절단된 RT 단백질을 포함하는 프라임 편집제만큼 효율적이었음을 보여준다.
다양한 실시양태에서, 본원에서 고려되는 프라임 편집제 융합 단백질은 또한 PE1, PE2, 또는 상기 표시된 프라임 편집제 융합 서열 중 임의의 것과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 아미노산 서열을 갖는 상기 개시된 서열의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 링커는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 도메인 또는 모이어티 중 임의의 것을 연결하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제에 연결되거나 융합된 napDNAbp).
[5] 링커 및 다른 도메인
PE 융합 단백질은 napDNAbp (예를 들어, Cas9 도메인) 및 폴리머라제 도메인 (예를 들어, RT 도메인) 이외의 다양한 다른 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, napDNAbp가 Cas9이고 폴리머라제가 RT인 경우에, PE 융합 단백질은 Cas9 도메인을 RT 도메인과 연결하는 1개 이상의 링커를 포함할 수 있다. 링커는 또한 다른 기능적 도메인, 예컨대 핵 국재화 서열 (NLS) 또는 FEN1 (또는 다른 플랩 엔도뉴클레아제)을 PE 융합 단백질 또는 그의 도메인에 연결할 수 있다.
또한, 트랜스 프라임 편집을 수반하는 실시양태에서, 링커는 tPERT 동원 단백질을 프라임 편집제에, 예를 들어 tPERt 동원 단백질과 napDNAbp 사이를 연결하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 도메인 및 동원 단백질 도메인을 napDNAbp에 개별적으로 융합시키는 링커를 포함하는 트랜스 프라임 편집제 (tPE)의 예시적인 개략도에 대해 도 3g를 참조한다.
A. 링커
상기 정의된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어 뉴클레아제의 절단 도메인 및 결합 도메인을 연결하는 화학적 기 또는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 RNA-프로그램가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인과 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)의 촉매 도메인을 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 dCas9 및 리버스 트랜스크립타제를 연결한다. 전형적으로, 링커는 2개의 기, 분자, 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나 또는 그에 플랭킹하고, 공유 결합을 통해 서로 연결하여, 2개를 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 보다 길거나 보다 짧은 링커가 또한 고려된다.
링커는 공유 결합만큼 단순할 수 있거나, 또는 많은 원자 길이의 중합체 링커일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드이거나 또는 아미노산을 기초로 한다. 다른 실시양태에서, 링커는 펩티드-유사가 아니다. 특정 실시양태에서, 링커는 공유 결합 (예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디술피드 결합, 탄소-헤테로원자 결합 등)이다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미드 연결의 탄소-질소 결합이다. 특정 실시양태에서, 링커는 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 특정 실시양태에서, 링커는 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산 (예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산 (Ahx)의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 카르보시클릭 모이어티 (예를 들어, 시클로펜탄, 시클로헥산)를 기초로 한다. 다른 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (PEG)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 페닐 고리를 기초로 한다. 링커는 펩티드로부터 링커로의 친핵체 (예를 들어, 티올, 아미노)의 부착을 용이하게 하기 위해 관능화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체가 링커의 일부로서 사용될 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클 수용자, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)n (서열식별번호: 165), (G)n (서열식별번호: 166), (EAAAK)n (서열식별번호: 167), (GGS)n (서열식별번호: 168), (SGGS)n (서열식별번호: 169), (XP)n (서열식별번호: 170), 또는 그의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)n (서열식별번호: 176)을 포함하고, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 171)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 172)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSGGSGGS (서열식별번호: 173)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS (서열식별번호: 174)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGGSSGGS (서열식별번호: 175, 60AA)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 링커는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 도메인 또는 모이어티 중 임의의 것을 연결하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제에 연결되거나 융합된 napDNAbp).
상기 정의된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어 뉴클레아제의 절단 도메인 및 결합 도메인을 연결하는 화학적 기 또는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 RNA-프로그램가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인과 레콤비나제의 촉매 도메인을 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 dCas9 및 리버스 트랜스크립타제를 연결한다. 전형적으로, 링커는 2개의 기, 분자, 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나 또는 그에 플랭킹하고, 공유 결합을 통해 서로 연결하여, 2개를 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 보다 길거나 보다 짧은 링커가 또한 고려된다.
링커는 공유 결합만큼 단순할 수 있거나, 또는 많은 원자 길이의 중합체 링커일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드이거나 또는 아미노산을 기초로 한다. 다른 실시양태에서, 링커는 펩티드-유사가 아니다. 특정 실시양태에서, 링커는 공유 결합 (예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디술피드 결합, 탄소-헤테로원자 결합 등)이다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미드 연결의 탄소-질소 결합이다. 특정 실시양태에서, 링커는 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 특정 실시양태에서, 링커는 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산 (예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산 (Ahx)의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 카르보시클릭 모이어티 (예를 들어, 시클로펜탄, 시클로헥산)를 기초로 한다. 다른 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (PEG)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 페닐 고리를 기초로 한다. 링커는 펩티드로부터 링커로의 친핵체 (예를 들어, 티올, 아미노)의 부착을 용이하게 하기 위해 관능화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체가 링커의 일부로서 사용될 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클 수용자, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)n (서열식별번호: 165), (G)n (서열식별번호: 166), (EAAAK)n (서열식별번호: 167), (GGS)n (서열식별번호: 168), (SGGS)n (서열식별번호: 169), (XP)n (서열식별번호: 170), 또는 그의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)n (서열식별번호: 176)을 포함하고, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 171)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 172)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSGGSGGS (서열식별번호: 173)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS (서열식별번호: 174)를 포함한다.
특히, 프라임 편집제 도메인을 서로 연결하기 위해 다양한 실시양태에서 하기 링커가 사용될 수 있다:
GGS (서열식별번호: 767);
GGSGGS (서열식별번호: 768);
GGSGGSGGS (서열식별번호: 769);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (서열식별번호: 127);
SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 171);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGGSSGG S (서열식별번호: 175).
B. 핵 국재화 서열 (NLS)
다양한 실시양태에서, PE 융합 단백질은 단백질의 세포 핵으로의 전위를 촉진하는 것을 돕는 1개 이상의 핵 국재화 서열 (NLS)을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 하기 예를 포함할 수 있다:
Figure pct00106
상기 NLS 예는 비제한적이다. PE 융합 단백질은 문헌 [Cokol et al., "Finding nuclear localization signals," EMBO Rep., 2000, 1(5): 411-415 and Freitas et al., "Mechanisms and Signals for the Nuclear Import of Proteins," Current Genomics, 2009, 10(8): 550-7]에 기재된 것 중 임의의 것을 비롯한 임의의 공지된 NLS 서열을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 및 본원에 개시된 프라임 편집제를 코딩하는 구축물은 1개 이상, 바람직하게는 적어도 2개의 핵 국재화 신호를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 프라임 편집제는 적어도 2개의 NLS를 포함한다. 적어도 2개의 NLS를 갖는 실시양태에서, NLS는 동일한 NLS일 수 있거나 또는 상이한 NLS일 수 있다. 또한, NLS는 프라임 편집제의 나머지 부분과의 융합 단백질의 일부로서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, NLS 중 1개 이상은 2부분 NLS ("bpNLS")이다. 특정 실시양태에서, 개시된 융합 단백질은 2개의 2부분 NLS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 융합 단백질은 2개 초과의 2부분 NLS를 포함한다.
NLS 융합체의 위치는 프라임 편집제의 N-말단, C-말단, 또는 서열 내일 수 있다 (예를 들어, 코딩된 napDNAbp 성분 (예를 들어, Cas9)과 폴리머라제 도메인 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제 도메인) 사이에 삽입됨).
NLS는 관련 기술분야의 임의의 공지된 NLS 서열일 수 있다. NLS는 또한 핵 국재화를 위한 임의의 추후-발견될 NLS일 수 있다. NLS는 또한 임의의 자연 발생 NLS, 또는 임의의 비-자연 발생 NLS (예를 들어, 1개 이상의 목적하는 돌연변이를 갖는 NLS)일 수 있다.
용어 "핵 국재화 서열" 또는 "NLS"는, 예를 들어 핵 수송에 의해 세포 핵 내로의 단백질의 유입을 촉진하는 아미노산 서열을 지칭한다. 핵 국재화 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, NLS 서열은 2001년 5월 31일에 WO/2001/038547로서 공개된 2000년 11월 23일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/EP2000/011690 (Plank et al.)에 기재되어 있으며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, NLS는 아미노산 서열 PKKKRKV (서열식별번호: 16), MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (서열식별번호: 17), KRTADGSEFESPKKKRKV (서열식별번호: 3864), 또는 KRTADGSEFEPKKKRKV (서열식별번호: 13)를 포함한다. 다른 실시양태에서, NLS는 아미노산 서열 NLSKRPAAIKKAGQAKKKK (서열식별번호: 3865), PAAKRVKLD (서열식별번호: 192), RQRRNELKRSF (서열식별번호: 3866), NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (서열식별번호: 3867)를 포함한다.
개시내용의 한 측면에서, 프라임 편집제는 1개 이상의 핵 국재화 신호 (NLS), 바람직하게는 적어도 2개의 NLS로 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프라임 편집제는 2개 이상의 NLS로 변형된다. 개시내용은 개시내용의 시점에 관련 기술분야에 공지된 임의의 핵 국재화 신호, 또는 본 출원 시점 후에 최신 기술에서 확인되거나 또는 달리 이용가능하게 된 임의의 핵 국재화 신호의 사용을 고려한다. 대표적인 핵 국재화 신호는 서열이 발현될 세포의 핵으로 단백질을 지시하는 펩티드 서열이다. 핵 국재화 신호는 우세하게 염기성이고, 단백질의 아미노산 서열의 거의 어디에나 위치할 수 있고, 일반적으로 4개의 아미노산 (문헌 [Autieri & Agrawal, (1998) J. Biol. Chem. 273: 14731-37], 본원에 참조로 포함됨) 내지 8개의 아미노산의 짧은 서열을 포함하고, 전형적으로 리신 및 아르기닌 잔기가 풍부하다 (문헌 [Magin et al., (2000) Virology 274: 11-16], 본원에 참조로 포함됨). 핵 국재화 신호는 종종 프롤린 잔기를 포함한다. 다양한 핵 국재화 신호가 확인되었고, 생물학적 분자를 세포질로부터 세포의 핵으로 수송하는데 사용되었다. 예를 들어, 문헌 [Tinland et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:7442-46; Moede et al., (1999) FEBS Lett. 461:229-34]을 참조하고, 이는 참조로 포함된다. 전위는 현재 핵공 단백질을 수반하는 것으로 생각된다.
대부분의 NLS는 3개의 일반적 군으로 분류될 수 있다: (i) SV40 대형 T 항원 NLS에 의해 예시되는 1부분 NLS (PKKKRKV (서열식별번호: 16)); (ii) 가변적 수의 스페이서 아미노산에 의해 분리되고, 크세노푸스(Xenopus) 뉴클레오플라스민 NLS에 의해 예시되는 2개의 염기성 도메인으로 이루어진 2부분 모티프 (KRXXXXXXXXXXKKKL (서열식별번호: 3868)); 및 (iii) 비정규 서열, 예컨대 hnRNP Al 단백질의 M9, 인플루엔자 바이러스 핵단백질 NLS, 및 효모 Gal4 단백질 NLS (Dingwall and Laskey 1991).
핵 국재화 신호는 단백질의 아미노산 서열 내의 다양한 지점에서 나타난다. NLS는 단백질의 N-말단, C-말단 및 중심 영역에서 확인되었다. 따라서, 개시내용은 프라임 편집제의 C-말단, N-말단, 뿐만 아니라 내부 영역에서 1개 이상의 NLS로 변형될 수 있는 프라임 편집제를 제공한다. 성분 NLS 잔기로서 기능하지 않는 보다 긴 서열의 잔기는 핵 국재화 신호 자체를 예를 들어 장성에 의해 또는 입체적으로 방해하지 않도록 선택되어야 한다. 따라서, NLS-포함 서열의 조성에 대한 엄격한 제한은 없지만, 실제로, 이러한 서열은 길이 및 조성이 기능적으로 제한될 수 있다.
본 개시내용은 1개 이상의 NLS를 포함하도록 프라임 편집제를 변형시키는 임의의 적합한 수단을 고려한다. 한 측면에서, 프라임 편집제는 그의 N-말단 또는 그의 C-말단 (또는 둘 다)에서 1개 이상의 NLS에 번역상 융합된 프라임 편집제 단백질을 발현하도록, 즉 프라임 편집제-NLS 융합 구축물을 형성하도록 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, 프라임 편집제-코딩 뉴클레오티드 서열은 코딩된 프라임 편집제의 내부 영역에 1개 이상의 NLS를 코딩하는 리딩 프레임이 혼입되도록 유전자 변형될 수 있다. 또한, NLS는 프라임 편집제와 N-말단, C-말단, 또는 내부-부착된 NLS 아미노산 서열 사이에, 예를 들어 단백질의 중심 영역에, 코딩된 다양한 아미노산 링커 또는 스페이서 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 프라임 편집제 및 1개 이상의 NLS를 포함하는 융합 단백질을 발현시키기 위한 뉴클레오티드 구축물, 벡터, 및 숙주 세포를 제공한다.
본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 1개 이상의 링커, 예를 들어, 및 중합체, 아미노산, 핵산, 폴리사카라이드, 화학적, 또는 핵산 링커 요소를 통해 프라임 편집제에 연결된 핵 국재화 신호를 포함할 수 있다. 개시내용의 고려되는 범주 내의 링커는 어떠한 제한을 갖는 것으로 의도되지 않으며, 임의의 적합한 유형의 분자 (예를 들어, 중합체, 아미노산, 폴리사카라이드, 핵산, 지질, 또는 임의의 합성 화학적 링커 도메인)일 수 있고, 프라임 편집제와 1개 이상의 NLS 사이에 결합 (예를 들어, 공유 연결, 수소 결합) 형성을 유발하는 임의의 적합한 전략에 의해 프라임 편집제에 연결될 수 있다.
C. 플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)
다양한 실시양태에서, PE 융합 단백질은 5' 단일 가닥 DNA 플랩의 제거를 촉매하는 효소를 지칭하는 플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)를 1개 이상 포함할 수 있다. 이는 DNA 복제를 비롯한 세포 과정 동안 형성된 5' 플랩의 제거를 프로세싱하는 자연 발생 효소이다. 본원에 기재된 프라임 편집 방법은 프라임 편집 동안 표적 부위에 형성된 내인성 DNA의 5' 플랩을 제거하기 위해 내인성으로 공급된 플랩 엔도뉴클레아제 또는 트랜스로 제공된 것을 이용할 수 있다. 플랩 엔도뉴클레아제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Patel et al., "Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends," Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519 및 Tsutakawa et al., "Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily," Cell, 2011, 145(2): 198-211] (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 찾아볼 수 있다. 예시적인 플랩 엔도뉴클레아제는 하기 아미노산 서열로 표시될 수 있는 FEN1이다:
Figure pct00107
플랩 엔도뉴클레아제는 또한 임의의 FEN1 변이체, 돌연변이체, 또는 다른 플랩 엔도뉴클레아제 오르토로그, 상동체, 또는 변이체를 포함할 수 있다. 비제한적 FEN1 변이체 예는 하기와 같다:
Figure pct00108
Figure pct00109
다양한 실시양태에서, 본원에서 고려되는 프라임 편집제 융합 단백질은 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 아미노산 서열을 갖는 상기 개시된 서열의 임의의 플랩 엔도뉴클레아제 변이체를 포함할 수 있다.
5' 단부 단일 가닥 DNA 플랩의 제거를 용이하게 하기 위해 본 방법에 의해 이용될 수 있는 다른 엔도뉴클레아제는 (1) trex 2, (2) exo1 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Keijzers et al., Biosci Rep. 2015, 35(3): e00206)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
Trex 2
3' 3개의 프라임 복구 엑소뉴클레아제 2 (TREX2) - 인간
수탁 번호 NM_080701
Figure pct00110
3' 3개의 프라임 복구 엑소뉴클레아제 2 (TREX2) - 마우스
수탁 번호 NM_011907
Figure pct00111
3' 3개의 프라임 복구 엑소뉴클레아제 2 (TREX2) - 래트
수탁 번호 NM_001107580
Figure pct00112
ExoI
인간 엑소뉴클레아제 1 (EXO1)은 DNA 미스매치 복구 (MMR), 마이크로-매개 단부-연결, 상동 재조합 (HR), 및 복제를 포함한 많은 상이한 DNA 대사 과정에 연루되어 왔다. 인간 EXO1은 진핵 뉴클레아제 패밀리인 Rad2/XPG에 속하며, 이는 또한 FEN1 및 GEN1을 포함한다. Rad2/XPG 패밀리는 파지에서 인간까지의 종에 걸쳐 뉴클레아제 도메인에서 보존된다. EXO1 유전자 생성물은 5' 엑소뉴클레아제 및 5' 플랩 활성 둘 다를 나타낸다. 추가적으로, EXO1은 내재적 5' RNase H 활성을 함유한다. 인간 EXO1은 이중 가닥 DNA (dsDNA), 닉, 갭, 슈도 Y 구조를 프로세싱하는데 높은 친화도를 갖고, 그의 유전성 플랩 활성을 사용하여 홀리데이 접합부를 분해할 수 있다. 인간 EXO1은 MMR에 연루되며, MLH1 및 MSH2와 직접 상호작용하는 보존된 결합 도메인을 함유한다. EXO1 핵산분해 활성은 PCNA, MutSα (MSH2/MSH6 복합체), 14-3-3, MRN 및 9-1-1 복합체에 의해 양으로 자극된다.
엑소뉴클레아제 1 (EXO1) 수탁 번호 NM_003686 (호모 사피엔스(Homo sapiens) 엑소뉴클레아제 1 (EXO1), 전사체 변이체 3) - 이소형 A
Figure pct00113
엑소뉴클레아제 1 (EXO1) 수탁 번호 NM_006027 (호모 사피엔스 엑소뉴클레아제 1 (EXO1), 전사체 변이체 3) - 이소형 B
Figure pct00114
엑소뉴클레아제 1 (EXO1) 수탁 번호 NM_001319224 (호모 사피엔스 엑소뉴클레아제 1 (EXO1), 전사체 변이체 4) - 이소형 C
Figure pct00115
D. 인테인 및 분할-인테인
일부 실시양태 (예를 들어, AAV 입자를 사용한 생체내 프라임 편집제의 전달)에서, 폴리펩티드 (예를 들어, 데아미나제 또는 napDNAbp) 또는 융합 단백질 (예를 들어, 프라임 편집제)을 N-말단 절반 및 C-말단 절반으로 분할하고, 이를 개별적으로 전달한 다음, 그것을 공동국재화시켜 세포 내에서 완전한 단백질 (또는 경우에 따라 융합 단백질)을 재형성하도록 하는 것이 유리할 수 있음이 이해될 것이다. 단백질 또는 융합 단백질의 별개의 절반은 단백질 트랜스 스플라이싱의 메카니즘에 의한 완전한 단백질 또는 융합 단백질의 재형성을 용이하게 하기 위해 각각 분할-인테인 태그를 포함할 수 있다.
분할 인테인에 의해 촉매되는 단백질 트랜스-스플라이싱은 단백질 라이게이션을 위한 전적으로 효소적인 방법을 제공한다. 분할-인테인은 본질적으로 각각 N-인테인 및 C-인테인으로 명명되는 2개의 조각으로 분할된 인접 인테인 (예를 들어 미니-인테인)이다. 분할 인테인의 N-인테인 및 C-인테인은 비-공유적으로 회합되어 활성 인테인을 형성하고, 인접 인테인과 본질적으로 동일한 방식으로 스플라이싱 반응을 촉매할 수 있다. 분할 인테인은 자연에서 발견되었고, 또한 실험실에서 조작되었다. 본원에 사용된 용어 "분할 인테인"은 N-말단 및 C-말단 서열이 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 인테인으로 비-공유적으로 재회합 또는 재구성될 수 있는 별개의 분자가 되도록 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열 사이에 1개 이상의 펩티드 결합 파괴가 존재하는 임의의 인테인을 지칭한다. 임의의 촉매 활성 인테인 또는 그의 단편은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 분할 인테인을 유도하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서 분할 인테인은 진핵 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 박테리아 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 고세균 인테인으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 이와 같이 유래된 분할 인테인은 트랜스-스플라이싱 반응을 촉매하는데 필수적인 아미노산 서열만을 보유할 것이다.
본원에 사용된 "N-말단 분할 인테인 (In)"은 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 임의의 인테인 서열을 지칭한다. 따라서, In은 또한 트랜스-스플라이싱이 발생할 때 스플라이싱되는 서열을 포함한다. In은 자연 발생 인테인 서열의 N-말단 부분의 변형인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, In은, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함이 In을 트랜스-스플라이싱에서 비-기능적으로 만들지 않는 한, 이러한 추가의 아미노산 잔기 및/또는 돌연변이된 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함은 In의 트랜스-스플라이싱 활성을 개선 또는 증진시킨다.
본원에 사용된 "C-말단 분할 인테인 (Ic)"은 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 C-말단 아미노산 서열을 포함하는 임의의 인테인 서열을 지칭한다. 한 측면에서, Ic는 4 내지 7개의 인접 아미노산 잔기를 포함하고, 이 중 적어도 4개의 아미노산은 그가 유래된 인테인의 마지막 β-가닥으로부터의 것이다. 따라서, Ic는 또한 트랜스-스플라이싱이 발생할 때 스플라이싱되는 서열을 포함한다. Ic는 자연 발생 인테인 서열의 C-말단 부분의 변형인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, Ic는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함이 In을 트랜스-스플라이싱에서 비-기능적으로 만들지 않는 한, 이러한 추가의 아미노산 잔기 및/또는 돌연변이된 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함은 Ic의 트랜스-스플라이싱 활성을 개선 또는 증진시킨다.
본 발명의 일부 실시양태에서, Ic 또는 In에 연결된 펩티드는 특히 형광 기, 비오틴, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아미노산 유사체, 비천연 아미노산, 포스페이트 기, 글리코실 기, 방사성동위원소 표지, 및 제약 분자를 포함한 추가의 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, Ic에 연결된 펩티드는 특히 케톤, 알데히드, Cys 잔기 및 Lys 잔기를 포함하는 1개 이상의 화학적 반응성 기를 포함할 수 있다. 분할 인테인의 N-인테인 및 C-인테인은 비-공유적으로 회합되어 활성 인테인을 형성하고, "인테인-스플라이싱 폴리펩티드 (ISP)"가 존재하는 경우에 스플라이싱 반응을 촉매할 수 있다. 본원에 사용된 "인테인-스플라이싱 폴리펩티드 (ISP)"는 Ic, In, 또는 둘 다가 분할 인테인으로부터 제거될 때 남는 분할 인테인의 아미노산 서열의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, In은 ISP를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Ic는 ISP를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ISP는 In에도 Ic에도 공유 연결되지 않은 별개의 펩티드이다.
분할 인테인은 미니-인테인의 구조에서 발견되는 -12개의 보존된 베타-가닥 사이의 비구조화된 루프 또는 개재 아미노산 서열 내의 1개 이상의 분할 부위를 조작함으로써 인접 인테인으로부터 생성될 수 있다. 분할의 생성이 단백질 스플라이싱 활성이 상실되는데 충분한 정도로 인테인, 특히 구조화된 베타-가닥의 구조를 파괴하지 않을 것이라면, 베타-가닥 사이의 영역 내의 분할 부위의 위치에 일부 유연성이 존재할 수 있다.
단백질 트랜스-스플라이싱에서, 하나의 전구체 단백질은 N-엑스테인 부분에 이어 N-인테인으로 이루어지고, 또 다른 전구체 단백질은 C-인테인 부분에 이어 C-엑스테인으로 이루어지고, 트랜스-스플라이싱 반응 (N- 및 C-인테인에 의해 함께 촉매됨)은 2개의 인테인 서열을 절제하고, 2개의 엑스테인 서열을 펩티드 결합으로 연결한다. 효소 반응인 단백질 트랜스-스플라이싱은 매우 낮은 (예를 들어, 마이크로몰) 농도의 단백질로 작용할 수 있고, 생리학적 조건 하에 수행될 수 있다.
예시적인 서열은 하기와 같다:
Figure pct00116
Figure pct00117
인테인은 가장 빈번하게는 인접 도메인으로서 발견되지만, 일부는 자연 분할 형태로 존재한다. 이러한 경우에, 2개의 단편은 별개의 폴리펩티드로서 발현되고, 이는 스플라이싱, 소위 단백질 트랜스-스플라이싱이 일어나기 전에 회합되어야 한다.
예시적인 분할 인테인은 2개의 서브유닛, 즉 DnaE-N 및 DnaE-C를 포함하는 Ssp DnaE 인테인이다. 2개의 상이한 서브유닛은 별개의 유전자, 즉 각각 DnaE-N 및 DnaE-C 서브유닛을 코딩하는 dnaE-n 및 dnaE-c에 의해 코딩된다. DnaE는 시네코시스티스(Synechocystis) 종 PCC6803의 자연 발생 분할 인테인이고, 각각 DnaE-N 또는 DnaE-C와의 융합체를 포함한 2개의 별개의 단백질의 트랜스-스플라이싱을 지시할 수 있다.
추가의 자연 발생 또는 조작된 분할-인테인 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 또는 본원에 기재된 전체-인테인 서열 또는 관련 기술분야에서 입수가능한 것으로부터 제조될 수 있다. 분할-인테인 서열의 예는 문헌 [Stevens et al., "A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications," PNAS, 2017, Vol.114: 8538-8543; Iwai et al., "Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme, FEBS Lett, 580: 1853-1858]에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 추가의 분할 인테인 서열은, 예를 들어 WO 2013/045632, WO 2014/055782, WO 2016/069774, 및 EP2877490에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 생체내 및 시험관내 트랜스로의 단백질 스플라이싱이 기재되어 있으며 (Shingledecker, et al., Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBO J. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887-15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)), 이는 예를 들어 2개의 개별적으로-발현된 절반으로부터 완전한 PE 융합 단백질의 형성에 관하여 도 66 및 67에 제시된 바와 같이, 기능적 생성물을 형성하기 위해 후속적으로 라이게이션을 거치는 2개의 불활성 단편에 대해 단백질로서의 발현 기회를 제공한다.
E. RNA-단백질 상호작용 도메인
다양한 실시양태에서, 2개의 별개의 단백질 도메인 (예를 들어, Cas9 도메인 및 폴리머라제 도메인)은 "RNA-단백질 동원 시스템", 예컨대 "MS2 태그부착 기술"을 사용함으로써 서로 공동국재화되어 기능적 복합체 (2개의 별개의 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 기능과 유사함)를 형성할 수 있다. 이러한 시스템은 일반적으로 하나의 단백질 도메인은 "RNA-단백질 상호작용 도메인" (일명 "RNA-단백질 동원 도메인")으로, 다른 것은 RNA-단백질 상호작용 도메인, 예를 들어 특정 헤어핀 구조를 특이적으로 인식하고 그에 결합하는 "RNA-결합 단백질"로 태그부착한다. 이들 유형의 시스템은 프라임 편집제의 도메인을 공동국재화하기 위해서뿐만 아니라 프라임 편집제, 예컨대 UGI 도메인에 추가의 기능성을 동원하기 위해 활용될 수 있다. 한 예에서, MS2 태그부착 기술은 MS2 박테리오파지 코트 단백질 ("MCP" 또는 "MS2cp")과 파지의 게놈에 존재하는 스템-루프 또는 헤어핀 구조, 즉 "MS2 헤어핀"의 자연 상호작용에 기초한다. MS2 헤어핀의 경우에, 이는 MS2 박테리오파지 코트 단백질 (MCP)에 의해 인식되고 결합된다. 따라서, 하나의 예시적인 시나리오에서 데아미나제-MS2 융합체는 Cas9-MCP 융합체를 동원할 수 있다.
다른 모듈 RNA-단백질 상호작용 도메인의 검토는 관련 기술분야에, 예를 들어 문헌 [Johansson et al., "RNA recognition by the MS2 phage coat protein," Sem Virol., 1997, Vol. 8(3): 176-185; Delebecque et al., "Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies," Science, 2011, Vol. 333: 470-474; Mali et al., "Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering," Nat. Biotechnol., 2013, Vol.31: 833-838; 및 Zalatan et al., "Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds," Cell, 2015, Vol.160: 339-350]에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다른 시스템은 PCP 단백질을 특이적으로 동원하는 PP7 헤어핀, 및 Com 단백질을 특이적으로 동원하는 "com" 헤어핀을 포함한다. 문헌 [Zalatan et al.]을 참조한다.
MS2 헤어핀 (또는 동등하게 "MS2 압타머"로 지칭됨)의 뉴클레오티드 서열은 GCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCC (서열식별번호: 3871)이다.
MCP 또는 MS2cp의 아미노산 서열은: GSASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGEELPVAGWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY (서열식별번호: 3872)이다.
F. UGI 도메인
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 1개 이상의 우라실 글리코실라제 억제제 도메인을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)" 또는 "UGI 도메인"은 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 억제할 수 있는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, UGI 도메인은 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 3873에 제시된 바와 같은 UGI를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 UGI 단백질은 UGI의 단편 및 UGI 또는 UGI 단편에 상동인 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, UGI 도메인은 서열식별번호: 3873에 제시된 아미노산 서열의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI 단편은 서열식별번호: 3873에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI는 서열식별번호: 3873에 제시된 아미노산 서열과 상동인 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 3873에 제시된 아미노산 서열의 단편과 상동인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI 또는 UGI의 단편 또는 UGI 또는 UGI 단편의 상동체를 포함하는 단백질은 "UGI 변이체"로 지칭된다. UGI 변이체는 UGI 또는 그의 단편에 대해 상동성을 공유한다. 예를 들어, UGI 변이체는 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 3873에 제시된 바와 같은 UGI와 적어도 70% 동일하거나, 적어도 75% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 85% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, UGI 변이체는 단편이 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 3873에 제시된 바와 같은 UGI의 상응하는 단편과 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 99.9% 동일한 UGI의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
우라실-DNA 글리코실라제 억제제:
>sp|P14739|UNGI_BPPB2
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML (서열식별번호: 3873).
본원에 기재된 프라임 편집제는 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 링커에 의해 분리될 수 있는 1개 초과의 UGI 도메인을 포함할 수 있다.
G. 추가의 PE 요소
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 염기 복구 억제제를 포함할 수 있다. 용어 "염기 복구 억제제" 또는 "IBR"은 핵산 복구 효소, 예를 들어 염기 절제 복구 효소의 활성을 억제할 수 있는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, IBR은 OGG 염기 절제 복구 억제제이다. 일부 실시양태에서, IBR은 염기 절제 복구 억제제 ("iBER")이다. 예시적인 염기 절제 복구 억제제는 APE1, 엔도 III, 엔도 IV, 엔도 V, 엔도 VIII, Fpg, hOGG1, hNEIL1, T7 엔도I, T4PDG, UDG, hSMUG1, 및 hAAG의 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, IBR은 엔도 V 또는 hAAG의 억제제이다. 일부 실시양태에서, IBR은 촉매 불활성 글리코실라제 또는 촉매 불활성 디옥시게나제, 또는 옥시다제의 소분자 또는 펩티드 억제제, 또는 그의 변이체일 수 있는 iBER이다. 일부 실시양태에서, IBR은 TDG 억제제, MBD4 억제제 또는 AlkBH 효소의 억제제일 수 있는 iBER이다. 일부 실시양태에서, IBR은 촉매 불활성 TDG 또는 촉매 불활성 MBD4를 포함하는 iBER이다. 예시적인 촉매 불활성 TDG는 서열식별번호: 3872 (인간 TDG)의 N140A 돌연변이체이다.
일부 예시적인 글리코실라제가 하기 제공된다. 이들 글리코실라제 도메인 중 임의의 것의 촉매적으로 불활성화된 변이체는 본 개시내용에 제공된 프라임 편집제의 napDNAbp 또는 폴리머라제 도메인에 융합될 수 있는 iBER이다.
OGG (인간)
Figure pct00118
MPG (인간)
Figure pct00119
MBD4 (인간)
Figure pct00120
TDG (인간)
Figure pct00121
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 1개 이상의 이종 단백질 도메인 (예를 들어, 프라임 편집제 성분에 더하여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 도메인)을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열, 및 임의로 임의의 2개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 예시적인 특색은 국재화 서열, 예컨대 세포질 국재화 서열, 유출 서열, 예컨대 핵 유출 서열, 또는 다른 국재화 서열, 뿐만 아니라 융합 단백질의 가용화, 정제, 또는 검출에 유용한 서열 태그이다.
프라임 편집제 또는 그의 성분 (예를 들어, napDNAbp 도메인, 폴리머라제 도메인, 또는 NLS 도메인)에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 비제한적으로 에피토프 태그 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 에피토프 태그의 비제한적 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함한 자가형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 프라임 편집제는 말토스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합체, GAL4 DNA 결합 도메인 융합체, 및 단순 포진 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, DNA 분자에 결합하거나 또는 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. 프라임 편집제의 일부를 형성할 수 있는 추가의 도메인은 2011년 3월 10일에 공개된 미국 특허 공개 번호 2011/0059502에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
개시내용의 한 측면에서, 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함한 자가형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 리포터 유전자는 유전자 생성물의 발현의 변경 또는 변형을 측정하기 위한 마커로서 작용하는 유전자 생성물을 코딩하도록 세포 내로 도입될 수 있다. 개시내용의 특정 실시양태에서, 유전자 생성물은 루시페라제이다. 본 개시내용의 추가 실시양태에서, 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카르복실라제 담체 단백질 (BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌 (HA)-태그, 히스티딘 태그 또는 His-태그로도 지칭되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)-태그, 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프태그 (예를 들어, 소프태그 1, 소프태그 3), 스트렙-태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그, 및 SBP-태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 적합한 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 1개 이상의 His 태그를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 프라임 편집 시스템의 활성은 PE 시스템의 발현된 성분의 체류 시간, 양, 및/또는 활성을 조정함으로써 일시적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, PE는 PE의 세포내 반감기를 변형시킬 수 있는 단백질 도메인과 융합될 수 있다. 2개 이상의 벡터 (예를 들어, 본원에 기재된 성분이 2개 이상의 별개의 벡터 상에 코딩된 벡터 시스템)를 수반하는 특정 실시양태에서, PE 시스템의 활성은 벡터가 전달되는 시기를 제어함으로써 일시적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 시스템을 코딩하는 벡터는 주형을 코딩하는 벡터 전에 PE를 전달할 수 있다. 다른 실시양태에서, PEgRNA를 코딩하는 벡터는 PE 시스템을 코딩하는 벡터 전에 가이드를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, PE 시스템 및 PEgRNA를 코딩하는 벡터는 동시에 전달된다. 특정 실시양태에서, 동시에 전달된 벡터는 예를 들어 PE, PEgRNA, 및/또는 제2 가닥 가이드 RNA 성분을 일시적으로 전달한다. 추가 실시양태에서, 벡터 상의 코딩 서열로부터 전사된 RNA (예컨대, 예를 들어 뉴클레아제 전사체)는 RNA의 세포내 반감기를 변형시키고/거나 번역 제어를 조정할 수 있는 적어도 1개의 요소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA의 반감기는 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA의 반감기는 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 RNA의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 RNA의 3' UTR 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 폴리아데닐화 신호 (PA)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 캡, 예를 들어 상류 mRNA 또는 PEgRNA 단부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 전사 후 세포에서 보다 빠르게 분해되도록 PA를 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 적어도 1개의 AU-풍부 요소 (ARE)를 포함할 수 있다. ARE는 조직 유형, 세포 유형, 시기, 세포 국재화, 및 환경에 의존하는 방식으로 ARE 결합 단백질 (ARE-BP)에 의해 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈안정화 요소는 RNA 붕괴를 촉진하거나, RNA 안정성에 영향을 미치거나, 또는 번역을 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, ARE는 50 내지 150개 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ARE는 서열 AUUUA의 적어도 1개의 카피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 ARE가 RNA의 3' UTR에 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 우드척 간염 바이러스 (WHP)일 수 있다.
전사체로부터의 발현을 증진시키기 위한 3차 구조를 생성하는 전사후 조절 요소 (WPRE). 추가 실시양태에서, 요소는, 예를 들어 문헌 [Zufferey et al., J Virol, 73(4): 2886-92 (1999) and Flajolet et al., J Virol, 72(7): 6175-80 (1998)]에 기재된 바와 같이, 전사체로부터의 발현을 증진시킬 수 있는 변형된 및/또는 말단절단된 WPRE 서열이다. 일부 실시양태에서, WPRE 또는 등가물은 RNA의 3' UTR에 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 신속- 또는 저속-붕괴 전사체가 풍부한 다른 RNA 서열 모티프로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, PE 또는 PEgRNA를 코딩하는 벡터는 PE 시스템에 의한 벡터 상에 존재하는 표적 서열의 절단을 통해 자기-파괴될 수 있다. 절단은 벡터로부터 PE 또는 PEgRNA의 지속적인 전사를 막을 수 있다. 전사가 어느 정도의 시간 동안 선형화된 벡터 상에서 일어날 수 있지만, 세포내 분해에 적용되는 발현된 전사체 또는 단백질은 코딩 벡터의 발현으로부터의 지속적인 공급의 부재 하에 오프-타겟 효과를 생성하는 시간을 덜 가질 것이다.
[6] PEgRNA
본원에 기재된 프라임 편집 시스템은 임의의 적합한 PEgRNA의 사용을 고려한다. 본 발명자들은 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)의 메카니즘이 목적하는 뉴클레오티드 변화를 코딩하는 역전사 (RT) 주형 서열을 포함하는 특수하게 구성된 가이드 RNA의 사용을 통해 정밀하고 다재다능한 CRISPR/Cas-기반 게놈 편집을 수행하기 위해 활용되거나 적합화될 수 있음을 발견하였다. 본 출원은, RT 주형 서열이 표준 또는 전통적인 가이드 RNA 분자의 연장부로서 제공될 수 있기 때문에, 이러한 특수하게 구성된 가이드 RNA를 "연장된 가이드 RNA" 또는 "PEgRNA"로서 언급한다. 본 출원은 연장된 가이드 RNA에 대해 임의의 적합한 구성 또는 배열을 고려한다.
PEgRNA 아키텍처
도 3a는 본원에 개시된 프라임 편집 시스템에 사용가능한 연장된 가이드 RNA의 한 실시양태를 보여주며, 여기서 전통적인 가이드 RNA (녹색 부분)는 ~20개의 nt 프로토스페이서 서열 및 napDNAbp와 결합하는 gRNA 코어 영역을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 5' 단부에 연장된 RNA 절편, 즉 5' 연장부를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 5' 연장부는 역전사 주형 서열, 역전사 프라이머 결합 부위, 및 임의적인 5-20개의 뉴클레오티드 링커 서열을 포함한다. 도 1a-1b에 제시된 바와 같이, RT 프라이머 결합 부위는 R-루프의 비-표적 가닥에 닉이 형성된 후에 형성된 유리 3' 단부에 혼성화하여, 리버스 트랜스크립타제의 5'-3' 방향으로의 DNA 중합을 프라이밍한다.
도 3b는 본원에 개시된 프라임 편집 시스템에 사용가능한 연장된 가이드 RNA의 또 다른 실시양태를 보여주며, 여기서 전통적인 가이드 RNA (녹색 부분)는 ~20개의 nt 프로토스페이서 서열 및 napDNAbp와 결합하는 gRNA 코어를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 3' 단부에 연장된 RNA 절편, 즉 3' 연장부를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 3' 연장부는 역전사 주형 서열, 및 역전사 프라이머 결합 부위를 포함한다. 도 1c-1d에 제시된 바와 같이, RT 프라이머 결합 부위는 R-루프의 비-표적 가닥에 닉이 형성된 후에 형성된 유리 3' 단부에 혼성화하여, 리버스 트랜스크립타제의 5'-3' 방향으로의 DNA 중합을 프라이밍한다.
도 3c는 본원에 개시된 프라임 편집 시스템에 사용가능한 연장된 가이드 RNA의 또 다른 실시양태를 보여주며, 여기서 전통적인 가이드 RNA (녹색 부분)는 ~20개의 nt 프로토스페이서 서열 및 napDNAbp와 결합하는 gRNA 코어를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 gRNA 코어 내의 분자간 위치에서 연장된 RNA 절편, 즉 분자내 연장부를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 분자내 연장부는 역전사 주형 서열, 및 역전사 프라이머 결합 부위를 포함한다. RT 프라이머 결합 부위는 R-루프의 비-표적 가닥에 닉이 형성된 후에 형성된 유리 3' 단부에 혼성화하여, 리버스 트랜스크립타제의 5'-3' 방향으로의 DNA 중합을 프라이밍한다.
한 실시양태에서, 분자간 RNA 연장부의 위치는 가이드 RNA의 프로토스페이서 서열 내에 있지 않다. 또 다른 실시양태에서, 분자간 RNA 연장부의 위치는 gRNA 코어 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 분자간 RNA 연장부의 위치는 프로토스페이서 서열 내, 또는 프로토스페이서 서열을 파괴하는 위치를 제외하고는 가이드 RNA 분자의 임의의 위치이다.
한 실시양태에서, 분자간 RNA 연장부는 프로토스페이서 서열의 3' 단부로부터 하류에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 분자간 RNA 연장부는 프로토스페이서 서열의 3' 단부의 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드 하류에 삽입된다.
다른 실시양태에서, 분자간 RNA 연장부는 gRNA 내로 삽입되며, 이는 Cas9 단백질 또는 그의 등가물 (즉, 상이한 napDNAbp)과 결합 및/또는 상호작용하는, tracrRNA에 상응하거나 또는 그를 포함하는 가이드 RNA의 부분을 지칭한다. 바람직하게는, 분자간 RNA 연장부의 삽입은 tracrRNA 부분과 napDNAbp 사이의 상호작용을 방해하지 않거나 최소로 방해한다.
RNA 연장부의 길이는 임의의 유용한 길이일 수 있다. 다양한 실시양태에서, RNA 연장부는 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
RT 주형 서열은 또한 임의의 적합한 길이일 수 있다. 예를 들어, RT 주형 서열은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 역전사 프라이머 결합 부위 서열은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
다른 실시양태에서, 임의적인 링커 또는 스페이서 서열은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, RT 주형 서열은 비-표적 가닥에 상동성이지만 (따라서, 표적 가닥의 상응하는 부위에 상보성이지만), 1개 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 분자를 코딩한다. 적어도 1개의 뉴클레오티드 변화는 1개 이상의 단일-염기 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 결실, 및 1개 이상의 삽입을 포함할 수 있다.
도 1g에 도시된 바와 같이, RT 주형 서열의 합성된 단일 가닥 DNA 생성물은 비-표적 가닥과 상동성이고, 1개 이상의 뉴클레오티드 변화를 함유한다. RT 주형 서열의 단일 가닥 DNA 생성물은 상보적 표적 가닥 서열과 평형 상태로 혼성화하여, 상동 내인성 표적 가닥 서열을 대체한다. 대체된 내인성 가닥은 일부 실시양태에서 5' 내인성 DNA 플랩 종으로 지칭될 수 있다 (예를 들어, 도 1e 참조). 이러한 5' 내인성 DNA 플랩 종은 5' 플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)에 의해 제거될 수 있고, 이제 내인성 표적 가닥에 혼성화된 단일 가닥 DNA 생성물은 라이게이션되어 내인성 서열과 새로 합성된 가닥 사이에 미스매치를 생성할 수 있다. 미스매치는 세포의 선천성 DNA 복구 및/또는 복제 과정에 의해 분해될 수 있다.
다양한 실시양태에서, RT 주형 서열의 뉴클레오티드 서열은 5' 플랩 종으로서 대체되고 편집될 부위와 중첩되는 비-표적 가닥의 뉴클레오티드 서열에 상응한다.
연장된 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, 역전사 주형 서열은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩할 수 있으며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에서 내인성 단일 가닥 DNA를 대체할 수 있다. 닉 부위에서 대체된 내인성 단일 가닥 DNA는 5' 단부를 가질 수 있고, 내인성 플랩을 형성할 수 있으며, 이는 세포에 의해 절제될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 5' 단부 내인성 플랩의 제거는 상응하는 상보적 DNA 가닥에 대한 단일 가닥 3' DNA 플랩의 혼성화, 및 단일 가닥 3' DNA 플랩에 의해 운반되는 목적하는 뉴클레오티드 변화의 표적 DNA 내로의 혼입 또는 동화를 촉진하기 때문에 5' 단부 내인성 플랩의 절제는 생성물 형성을 구동하는 것을 도울 수 있다.
연장된 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구는 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 발생시켜, 목적하는 생성물을 형성한다.
또 다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 닉 부위의 약 -5 내지 약 +5 사이, 또는 닉 부위의 약 -10 내지 약 +10 사이, 또는 닉 부위의 약 -20 내지 약 +20 사이, 또는 닉 부위의 약 -30 내지 약 +30 사이, 또는 닉 부위의 약 -40 내지 약 +40 사이, 또는 닉 부위의 약 -50 내지 약 +50 사이, 또는 닉 부위의 약 -60 내지 약 +60 사이, 또는 닉 부위의 약 -70 내지 약 +70 사이, 또는 닉 부위의 약 -80 내지 약 +80 사이, 또는 닉 부위의 약 -90 내지 약 +90 사이, 또는 닉 부위의 약 -100 내지 약 +100 사이, 또는 닉 부위의 약 -200 내지 약 +200 사이인 편집 윈도우에서 설치된다.
다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 닉 부위로부터 약 +1 내지 +2, 또는 닉 부위로부터 약 +1 내지 +3, +1 내지 +4, +1 내지 +5, +1 내지 +6, +1 내지 +7, +1 내지 +8, +1 내지 +9, +1 내지 +10, +1 내지 +11, +1 내지 +12, +1 내지 +13, +1 내지 +14, +1 내지 +15, +1 내지 +16, +1 내지 +17, +1 내지 +18, +1 내지 +19, +1 내지 +20, +1 내지 +21, +1 내지 +22, +1 내지 +23, +1 내지 +24, +1 내지 +25, +1 내지 +26, +1 내지 +27, +1 내지 +28, +1 내지 +29, +1 내지 +30, +1 내지 +31, +1 내지 +32, +1 내지 +33, +1 내지 +34, +1 내지 +35, +1 내지 +36, +1 내지 +37, +1 내지 +38, +1 내지 +39, +1 내지 +40, +1 내지 +41, +1 내지 +42, +1 내지 +43, +1 내지 +44, +1 내지 +45, +1 내지 +46, +1 내지 +47, +1 내지 +48, +1 내지 +49, +1 내지 +50, +1 내지 +51, +1 내지 +52, +1 내지 +53, +1 내지 +54, +1 내지 +55, +1 내지 +56, +1 내지 +57, +1 내지 +58, +1 내지 +59, +1 내지 +60, +1 내지 +61, +1 내지 +62, +1 내지 +63, +1 내지 +64, +1 내지 +65, +1 내지 +66, +1 내지 +67, +1 내지 +68, +1 내지 +69, +1 내지 +70, +1 내지 +71, +1 내지 +72, +1 내지 +73, +1 내지 +74, +1 내지 +75, +1 내지 +76, +1 내지 +77, +1 내지 +78, +1 내지 +79, +1 내지 +80, +1 내지 +81, +1 내지 +82, +1 내지 +83, +1 내지 +84, +1 내지 +85, +1 내지 +86, +1 내지 +87, +1 내지 +88, +1 내지 +89, +1 내지 +90, +1 내지 +90, +1 내지 +91, +1 내지 +92, +1 내지 +93, +1 내지 +94, +1 내지 +95, +1 내지 +96, +1 내지 +97, +1 내지 +98, +1 내지 +99, +1 내지 +100, +1 내지 +101, +1 내지 +102, +1 내지 +103, +1 내지 +104, +1 내지 +105, +1 내지 +106, +1 내지 +107, +1 내지 +108, +1 내지 +109, +1 내지 +110, +1 내지 +111, +1 내지 +112, +1 내지 +113, +1 내지 +114, +1 내지 +115, +1 내지 +116, +1 내지 +117, +1 내지 +118, +1 내지 +119, +1 내지 +120, +1 내지 +121, +1 내지 +122, +1 내지 +123, +1 내지 +124, 또는 +1 내지 +125 사이인 편집 윈도우에서 설치된다.
또 다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 닉 부위로부터 약 +1 내지 +2, 또는 닉 부위로부터 약 +1 내지 +5, +1 내지 +10, +1 내지 +15, +1 내지 +20, +1 내지 +25, +1 내지 +30, +1 내지 +35, +1 내지 +40, +1 내지 +45, +1 내지 +50, +1 내지 +55, +1 내지 +100, +1 내지 +105, +1 내지 +110, +1 내지 +115, +1 내지 +120, +1 내지 +125, +1 내지 +130, +1 내지 +135, +1 내지 +140, +1 내지 +145, +1 내지 +150, +1 내지 +155, +1 내지 +160, +1 내지 +165, +1 내지 +170, +1 내지 +175, +1 내지 +180, +1 내지 +185, +1 내지 +190, +1 내지 +195, 또는 +1 내지 +200 사이인 편집 윈도우에서 설치된다.
다양한 측면에서, 연장된 가이드 RNA는 가이드 RNA의 변형된 버전이다. 가이드 RNA는 자연 발생이거나, 코딩 핵산으로부터 발현되거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 가이드 RNA를 수득하거나 또는 달리 합성하고, 관심 게놈 표적 부위의 표적 가닥과 상호작용하고 혼성화하는 프로토스페이서 서열을 포함한 가이드 RNA의 적절한 서열을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
다양한 실시양태에서, 가이드 RNA 서열의 특정한 설계 측면은 다른 인자, 예컨대 PAM 서열 위치, 표적 서열에서의 퍼센트 G/C 함량, 미세상동성 영역의 정도, 2차 구조 등 중에서, 관심 게놈 표적 부위 (즉, 편집될 목적하는 부위)의 뉴클레오티드 서열 및 본원에 기재된 프라임 편집 시스템에 존재하는 napDNAbp (예를 들어, Cas9 단백질)의 유형에 좌우될 것이다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 대한 napDNAbp (예를 들어, Cas9, Cas9 상동체, 또는 Cas9 변이체)의 서열-특이적 결합을 지시하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬한 경우에, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 그 초과이거나, 또는 약 그보다 더 높다. 최적 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용에 의해 결정될 수 있고, 그의 비제한적 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우스-휠러 변환(Burrows-Wheeler Transform) (예를 들어, 버로우스 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner)), 클러스탈W, 클러스탈 X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign) (노보크라프트 테크놀로지스(Novocraft Technologies)), ELAND (일루미나(Illumina), 캘리포니아주 샌디에고), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 이용가능함), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 이용가능함)에 기초한 알고리즘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이거나, 또는 약 그보다 더 길다.
일부 실시양태에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 미만, 또는 그보다 더 짧은 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열에 대한 프라임 편집제 (PE)의 서열-특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 포함한 프라임 편집제 (PE)의 성분은, 예컨대 본원에 개시된 프라임 편집제 (PE)의 성분을 코딩하는 벡터로의 형질감염에 이어서, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 서베이어 검정에 의한 표적 서열 내의 우선적 절단의 평가에 의해, 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 시험 튜브에서 표적 서열, 시험될 가이드 서열을 포함한 프라임 편집제 (PE)의 성분 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 제공하고, 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 사이에서 표적 서열에서의 결합 또는 절단율을 비교함으로써 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하고, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 발견할 수 있을 것이다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 고유한 것을 포함한다. 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9의 경우, 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG (서열식별번호: 204)의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있다 (여기서 NNNNNNNNNNNNXGG (서열식별번호: 205) (N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)). 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG (서열식별번호: 206)의 에스. 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있다 (여기서 NNNNNNNNNNNXGG (서열식별번호: 207) (N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)). 에스. 써모필루스 CRISPR1Cas9의 경우, 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW (서열식별번호: 208)의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있다 (여기서 NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (서열식별번호: 209) (N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있고; W는 A 또는 T임)). 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW (서열식별번호: 210)의 에스. 써모필루스 CRISPR 1 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있다 (여기서 NNNNNNNNNNNXXAGAAW (서열식별번호: 211) (N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있고; W는 A 또는 T임)). 에스. 피오게네스 Cas9의 경우, 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG (서열식별번호: 212)의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있다 (여기서 NNNNNNNNNNNNXGGXG (서열식별번호: 213) (N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)). 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG (서열식별번호: 214)의 에스. 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있다 (여기서 NNNNNNNNNNNXGGXG (서열식별번호: 215) (N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)). 이들 서열 각각에서, "M"은 A, G, T, 또는 C일 수 있고, 서열을 고유한 것으로 확인하는데 고려될 필요는 없다.
일부 실시양태에서, 가이드 서열은 가이드 서열 내의 2차 구조의 정도를 감소시키도록 선택된다. 2차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스 자유 에너지 계산에 기초한다. 이러한 한 알고리즘의 예는 문헌 [Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)]에 기재된 바와 같은 mFold이다. 폴딩 알고리즘의 또 다른 예는 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하는, 비엔나 대학교의 이론 화학 연구소에서 개발된 온라인 웹서버 RNAfold이다 (예를 들어, 문헌 [A. R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; 및 PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조). 추가의 알고리즘은 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 일련 번호 61/836,080; 광역 참조 BI-2013/004A)에서 찾아볼 수 있다.
일반적으로, tracr 메이트 서열은 (1) 상응하는 tracr 서열을 함유하는 세포에서 tracr 메이트 서열과 플랭킹된 가이드 서열의 절제; 및 (2) 표적 서열에서의 복합체의 형성 (여기서 복합체는 tracr 서열에 혼성화된 tracr 메이트 서열을 포함함) 중 1가지 이상을 촉진하기 위해 tracr 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 서열을 포함한다. 일반적으로, 상보성의 정도는 2개의 서열 중 더 짧은 것의 길이에 따른 tracr 메이트 서열 및 tracr 서열의 최적 정렬에 대한 것이다. 최적 정렬은 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있고, 2차 구조, 예컨대 tracr 서열 또는 tracr 메이트 서열 내의 자기-상보성을 추가로 고려할 수 있다. 일부 실시양태에서, 최적으로 정렬될 때 2개 중 더 짧은 것의 길이에 따른 tracr 서열과 tracr 메이트 서열 사이의 상보성의 정도는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 그 초과이거나, 또는 약 그보다 더 높다. 일부 실시양태에서, tracr 서열은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이거나, 또는 약 그보다 더 길다. 일부 실시양태에서, tracr 서열 및 tracr 메이트 서열은 단일 전사체 내에 함유되어, 둘 사이의 혼성화는 2차 구조, 예컨대 헤어핀을 갖는 전사체를 생성한다. 헤어핀 구조에 사용하기에 바람직한 루프 형성 서열은 4개의 뉴클레오티드 길이이고, 가장 바람직하게는 서열 GAAA를 갖는다. 그러나, 대안적 서열일 수 있는 바와 같이, 더 길거나 더 짧은 루프 서열이 사용될 수 있다. 서열은 바람직하게는 뉴클레오티드 트리플렛 (예를 들어, AAA), 및 추가의 뉴클레오티드 (예를 들어 C 또는 G)를 포함한다. 루프 형성 서열의 예는 CAAA 및 AAAG를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 전사체 또는 전사된 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 2개 이상의 헤어핀을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 전사체는 2, 3, 4 또는 5개의 헤어핀을 갖는다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 전사체는 최대 5개의 헤어핀을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단일 전사체는 전사 종결 서열을 추가로 포함하고; 바람직하게는 이는 폴리T 서열, 예를 들어 6개의 T 뉴클레오티드이다. 가이드 서열, tracr 메이트 서열, 및 tracr 서열을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드의 추가의 비제한적 예는 하기와 같고 (5'에서 3'으로 열거됨), 여기서 "N"은 가이드 서열의 염기를 나타내고, 제1 블록의 소문자는 tracr 메이트 서열을 나타내고, 제2 블록의 소문자는 tracr 서열을 나타내고, 최종 폴리-T 서열은 전사 종결인자를 나타낸다:
(1)NNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (서열식별번호: 216);
(2)NNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (서열식별번호: 217);
(3)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTT (서열식별번호: 218);
(4)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT (서열식별번호: 219);
(5)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT (서열식별번호: 220); 및
(6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT (서열식별번호: 221).
일부 실시양태에서, 서열 (1) 내지 (3)은 에스. 써모필루스 CRISPR1로부터의 Cas9와 조합되어 사용된다. 일부 실시양태에서, 서열 (4) 내지 (6)은 에스. 피오게네스로부터의 Cas9와 조합되어 사용된다. 일부 실시양태에서, tracr 서열은 tracr 메이트 서열을 포함하는 전사체와 별개의 전사체이다.
본원에 개시된 바와 같은 Cas9 도메인 및 단일 가닥 DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질 중 임의의 것을 표적 부위, 예를 들어 편집될 점 돌연변이를 포함하는 부위로 표적화하기 위해, 전형적으로 융합 단백질을 가이드 RNA, 예를 들어 sgRNA와 함께 공동-발현시키는 것이 필요하다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본원의 다른 곳에 보다 상세히 설명된 바와 같이, 가이드 RNA는 전형적으로 Cas9 결합을 가능하게 하는 tracrRNA 프레임워크, 및 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여하는 가이드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 구조
Figure pct00122
를 포함하며, 여기서 가이드 서열은 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 가이드 서열은 전형적으로 20개의 뉴클레오티드 길이이다. Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 게놈 표적 부위로 표적화하기에 적합한 가이드 RNA의 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집될 표적 뉴클레오티드의 50개 뉴클레오티드 상류 또는 하류 내의 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 제공된 융합 단백질 중 임의의 것을 특이적 표적 서열에 표적화하는데 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열이 본원에 제공된다. 추가의 가이드 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE)와 함께 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, PEgRNA는 도 3d에 도시된 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 도 3e에 도시된 것을 포함할 수 있다.
도 3d는 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3개의 주요 성분 요소, 즉 스페이서, gRNA 코어, 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B), 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 또한, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에서 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변경을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 다른 영역 중 임의의 것 내에 또는 그 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다.
도 3e는 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 또 다른 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3개의 주요 성분 요소, 즉 스페이서, gRNA 코어, 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B), 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 또한, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에서 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변경을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 다른 영역 중 임의의 것 내에 또는 그 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다.
PEgRNA 개선
PEgRNA는 또한 PEgRNA의 특성 및/또는 특징을 변형시켜 프라임 편집의 효능을 개선시킬 수 있는 추가의 설계 개선을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 이들 개선은 (1) 부담스러운 서열 요건 없이 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할, 비-폴리머라제 III (pol III) 프로모터로부터의 기능적 PEgRNA의 효율적인 발현을 가능하게 하는 설계; (2) 효능을 개선시킬 수 있는 코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드에 대한 개선; (3) RT 프로세싱성을 개선시켜 표적화된 게놈 유전자좌에서 보다 긴 서열의 삽입을 가능하게 하는, PEgRNA에 대한 변형; 및 (4) PEgRNA 안정성을 개선시키거나, RT 프로세싱성을 증진시키거나, PEgRNA의 미스폴딩을 방지하거나, 또는 게놈 편집에 중요한 추가의 인자를 동원하는, PEgRNA의 5' 또는 3' 말단에의 RNA 모티프의 부가를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 상이한 카테고리 중 1종 이상에 속할 수 있다.
한 실시양태에서, PEgRNA는 보다 큰 연장 아암을 갖는 보다 긴-길이의 PEgRNA의 발현을 개선시키기 위해 polIII 프로모터와 함께 설계될 수 있다. sgRNA는 전형적으로 U6 snRNA 프로모터로부터 발현된다. 이러한 프로모터는 pol III을 동원하여 회합된 RNA를 발현시키고, 이는 핵 내에 보유된 짧은 RNA의 발현에 유용하다. 그러나, pol III은 고도로 프로세싱성이 아니고, 수백개의 뉴클레오티드 길이보다 더 긴 RNA를 효율적인 게놈 편집에 요구되는 수준으로 발현시킬 수 없다. 추가적으로, pol III은 U 스트레치에서 멈추거나 종결될 수 있으며, 이는 잠재적으로 PEgRNA를 사용하여 삽입될 수 있는 서열 다양성을 제한한다. 폴리머라제 II (예컨대 pCMV) 또는 폴리머라제 I (예컨대 U1 snRNA 프로모터)을 동원하는 다른 프로모터를 보다 긴 sgRNA를 발현시키는 그의 능력에 대해 검사하였다. 그러나, 이들 프로모터는 전형적으로 부분적으로 전사되고, 이는 발현된 PEgRNA에서 스페이서의 5'의 여분의 서열을 생성할 것이며, 이는 부위-의존성 방식으로 현저하게 감소된 Cas9:sgRNA 활성을 생성하는 것으로 제시되었다. 추가적으로, pol III-전사된 PEgRNA는 단순히 연속 6-7개 U에서 종결될 수 있지만, pol II 또는 pol I로부터 전사된 PEgRNA는 상이한 종결 신호를 필요로 할 것이다. 종종 이러한 신호는 또한 폴리아데닐화를 발생시키며, 이는 핵으로부터 PEgRNA의 바람직하지 않은 수송을 발생시킬 것이다. 유사하게, pol II 프로모터, 예컨대 pCMV로부터 발현된 RNA는 전형적으로 5'-캡핑되며, 이는 또한 그의 핵 유출을 발생시킨다.
이전에, 린(Rinn) 및 동료들은 긴-비코딩 RNA- (lncRNA) 태그부착된 sgRNA의 생산을 위해 다양한 발현 플랫폼을 스크리닝하였다183. 이들 플랫폼은 pCMV로부터 발현되고 인간으로부터의 MALAT1 ncRNA로부터의 ENE 요소184, KSHV로부터의 PAN ENE 요소185, 또는 U1 snRNA로부터의 3' 박스186에서 종결하는 RNA를 포함한다. 특히, MALAT1 ncRNA 및 PAN ENE는 폴리A-테일을 보호하는 삼중 나선을 형성한다184, 187. 이들 구축물은 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있다. 이들 발현 시스템은 또한 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할 것으로 고려된다.
또한, 자기-절단 리보자임, 예컨대 해머헤드188, 피스톨189, 해체트189, 헤어핀190, VS191, 트위스터192, 또는 트위스터 시스터192 리보자임, 또는 전사된 가이드를 프로세싱하기 위한 다른 자기-절단 요소, 또는 Csy4193에 의해 인식되고 또한 가이드의 프로세싱으로 이어지는 헤어핀을 부가하는, PEgRNA의 일부로서 전사될 pol II 프로모터의 부분의 절단을 위한 일련의 방법이 설계되었다. 또한, 다중 ENE 모티프의 혼입은 KSHV PAN RNA 및 요소에 대해 이전에 입증된 바와 같이 개선된 PEgRNA 발현 및 안정성으로 이어질 수 있는 것으로 가설화된다185. 또한, PEgRNA를 원형 인트론 RNA (ciRNA)의 형태로 원형화하는 것은 또한 증진된 RNA 발현 및 안정성, 뿐만 아니라 핵 국재화로 이어질 수 있는 것으로 예상된다194.
다양한 실시양태에서, PEgRNA는 하기 서열에 의해 예시된 바와 같은 다양한 상기 요소를 포함할 수 있다.
비제한적 예 1 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 MALAT1 ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00123
비제한적 예 2 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 PAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00124
비제한적 예 3 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3xPAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00125
비제한적 예 4 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00126
비제한적 예 5 - pU1, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00127
다양한 다른 실시양태에서, PEgRNA는 스캐폴드 또는 코어 서열에 개선을 도입하는 것에 의해 개선될 수 있다. 이는 공지된 것을 도입함으로써 수행될 수 있다.
코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드는 PE 활성을 증진시키기 위해 개선될 가능성이 있다. 여러 이러한 접근법은 이미 입증되었다. 예를 들어, 스캐폴드의 제1 쌍형성 요소 (P1)는 GTTTT-AAAAC 쌍형성 요소를 함유한다. 이러한 연속 T는 pol III 일시정지 및 RNA 전사체의 조기 종결을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. P1의 이러한 부분에서 T-A 쌍 중 1개의 G-C 쌍으로의 합리적 돌연변이는 sgRNA 활성을 증진시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 이러한 접근법이 또한 PEgRNA에 대해 실행가능할 것임을 시사한다195. 추가적으로, P1의 길이를 증가시키는 것은 또한 sgRNA 폴딩을 증진시키고 개선된 활성으로 이어지는 것으로 밝혀졌고195, 이는 이것이 PEgRNA 활성의 개선을 위한 또 다른 방안임을 시사한다. 코어에 대한 예시적인 개선은 하기를 포함할 수 있다:
P1에 대해 6 nt 연장부를 함유하는 PEgRNA
Figure pct00128
P1 내에 T-A에서 G-C로의 돌연변이를 함유하는 PEgRNA
Figure pct00129
다양한 다른 실시양태에서, PEgRNA는 편집 주형 영역에 변형을 도입함으로써 개선될 수 있다. PEgRNA에 의해 주형화되는 삽입의 크기가 증가함에 따라, 엔도뉴클레아제에 의해 분해되거나, 자발적 가수분해를 겪거나, 또는 RT에 의해 역전사될 수 없거나 또는 PEgRNA 스캐폴드의 폴딩 및 후속 Cas9-RT 결합을 파괴하는 2차 구조로 폴딩될 가능성이 더 크다. 따라서, 전체 유전자의 삽입과 같은 대규모 삽입에 영향을 미치기 위해서는 PEgRNA의 주형에 대한 변형이 필요할 가능성이 있다. 이를 위한 일부 전략은 RNA를 분해 또는 가수분해에 대해 보다 저항성이게 하거나 또는 억제성 2차 구조를 채택할 가능성을 낮추는, 합성 또는 반합성 PEgRNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 혼입을 포함한다196. 이러한 변형은 G-풍부 서열에서 RNA 2차 구조를 감소시킬 8-아자-7-데아자구아노신; 분해를 감소시키고 특정 종류의 RNA 2차 구조를 증진시키는 잠금 핵산 (LNA); RNA 안정성을 증진시키는 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 또는 2'-O-메톡시에톡시 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 또한 안정성 및 활성을 증진시키기 위해 PEgRNA의 다른 곳에 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, PEgRNA의 주형은 목적하는 단백질 생성물을 코딩하고 또한 RT에 의해 언폴딩될 수 있는 간단한 2차 구조를 채택할 가능성이 더 크도록 설계될 수 있다. 이러한 단순한 구조는 열역학적 싱크로서 작용할 것이며, 이는 역전사를 막을 보다 복잡한 구조가 발생할 가능성을 줄인다. 마지막으로, 또한 주형을 2개의 별개의 PEgRNA로 분할할 수 있다. 이러한 설계에서, PE는 전사를 개시하고 또한 Cas9에 융합된 RNA-결합 단백질 또는 PEgRNA 자체 상의 RNA 인식 요소, 예컨대 MS2 압타머를 통해 표적화된 부위에 별개의 주형 RNA를 동원하는데 사용될 것이다. RT는 이러한 별개의 주형 RNA에 직접 결합할 수 있거나, 또는 제2 주형으로 스와핑하기 전에 원래의 PEgRNA 상에서 역전사를 개시할 수 있다. 이러한 접근법은 긴 주형의 부가 시 PEgRNA의 미스폴딩을 방지함으로써, 또한 아마도 PE-기반 긴 삽입을 억제할 수 있는, 긴 삽입이 이루어지는 게놈으로부터 Cas9의 해리를 필요로 하지 않음으로써 긴 삽입을 가능하게 할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 PEgRNA의 5' 및 3' 말단에, 또는 심지어 그 사이의 위치에 (예를 들어, gRNA 코어 영역, 또는 스페이서에) 추가의 RNA 모티프를 도입함으로써 개선될 수 있다. 여러 이러한 모티프 - 예컨대 KSHV로부터의 PAN ENE 및 MALAT1로부터의 ENE는 비-pol III 프로모터로부터 보다 긴 PEgRNA의 발현을 종결시키기 위한 가능한 수단으로서 상기 논의되었다. 이들 요소는 폴리A 테일을 에워싸는 RNA 삼중 나선을 형성하여, 이들이 핵 내에 보유되게 한다184, 187. 그러나, 말단 뉴클레오티드를 폐쇄하는 PEgRNA의 3' 말단에 복합체 구조를 형성함으로써, 이들 구조는 또한 아마도 PEgRNA의 엑소뉴클레아제-매개된 분해를 방지하는 것을 도울 것이다.
3' 말단에 삽입된 다른 구조적 요소도 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있지만, 비-pol III 프로모터로부터의 종결은 가능하게 하지 않는다. 이러한 모티프는 3' 말단을 폐쇄할 헤어핀 또는 RNA 쿼드로플렉스197, 또는 3' 말단에서 2'-3'-시클릭 포스페이트의 형성을 발생시키고 또한 잠재적으로 PEgRNA가 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 가능성을 낮출 자기-절단 리보자임, 예컨대 HDV198를 포함할 수 있다. PEgRNA를 불완전한 스플라이싱을 통해 고리화하도록 유도하여 - ciRNA를 형성하는 것은 - 또한 PEgRNA 안정성을 증가시키고 PEgRNA가 핵 내에 보유되도록 할 수 있다194.
추가의 RNA 모티프는 또한 RT 프로세싱성을 개선시키거나 또는 DNA-RNA 듀플렉스에 대한 RT 결합을 증진시킴으로써 PEgRNA 활성을 증진시킬 수 있다. 그의 동족 레트로바이러스 게놈에서 RT에 의해 결합된 천연 서열의 부가는 RT 활성을 증진시킬 수 있다199. 이는 레트로바이러스 게놈 이량체화 및 전사의 개시에 수반되는 천연 프라이머 결합 부위 (PBS), 폴리퓨린 트랙 (PPT), 또는 키싱 루프를 포함할 수 있다199.
PEgRNA의 5' 및 3' 말단에서의 이량체화 모티프 - 예컨대 키싱 루프 또는 GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체 쌍200 - 의 부가는 또한 PEgRNA의 효과적인 원형화를 발생시켜 안정성을 개선시킬 수 있다. 추가적으로, 이들 모티프의 부가가 PEgRNA 스페이서 및 프라이머의 물리적 분리를 가능하게 하여, PE 활성을 방해할 스페이서의 폐쇄를 방지할 수 있는 것으로 고려된다. 스페이서 영역에서 또는 프라이머 결합 부위를 따라 작은 토홀드 헤어핀을 형성하는 PEgRNA에 대한 짧은 5' 연장부 또는 3' 연장부는 또한 PEgRNA의 길이를 따라 상보성내 영역의 어닐링, 예를 들어 발생할 수 있는 스페이서와 프라이머 결합 부위 사이의 상호작용과 유리하게 경쟁할 수 있다. 마지막으로, 키싱 루프는 또한 다른 주형 RNA를 게놈 부위로 동원하고 RT 활성을 하나의 RNA로부터 다른 것으로 스와핑하는 것을 가능하게 하는데 사용될 수 있다. 다양한 2차 구조의 예시적인 실시양태로서, 도 3d 및 도 3e에 도시된 PEgRNA는 제시된 바와 같이 연장 아암의 말단 부분 (즉, e1 및 e2)을 비롯하여 PEgRNA의 임의의 영역 내로 조작될 수 있는 많은 2차 RNA 구조를 열거한다.
예시적인 개선은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
PEgRNA-HDV 융합체
Figure pct00130
PEgRNA-MMLV 키싱 루프
Figure pct00131
PEgRNA-VS 리보자임 키싱 루프
Figure pct00132
PEgRNA-GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체
Figure pct00133
PEgRNA 주형 스위칭 2차 RNA-HDV 융합체
Figure pct00134
PEgRNA 스캐폴드는 SpCas9 및 프라임 편집제 (PE)가 개선되는 방법과 유사한 방식으로 방향적 진화를 통해 추가로 개선될 수 있다. 방향적 진화는 Cas9 또는 진화된 Cas9 변이체에 의한 PEgRNA 인식을 증진시킬 수 있다. 추가적으로, 상이한 PEgRNA 스캐폴드 서열은 상이한 게놈 유전자좌에서 최적이어서, 해당 부위에서 PE 활성을 증진시키거나, 오프-타겟 활성을 감소시키거나, 또는 둘 다일 가능성이 있다. 마지막으로, 다른 RNA 모티프가 부가된 PEgRNA 스캐폴드의 진화는 비진화된 융합 RNA에 비해 융합된 PEgRNA의 활성을 거의 확실히 개선시킬 것이다. 예를 들어, c-디-GMP-I 압타머 및 해머헤드 리보자임으로 구성된 알로스테릭 리보자임의 진화는 현저하게 개선된 활성으로 이어졌고202, 이는 진화가 해머헤드-PEgRNA 융합체의 활성을 또한 개선시킬 것임을 시사한다. 또한, Cas9는 현재 일반적으로 sgRNA의 5' 연장을 용인하지 않지만, 방향적 진화는 아마도 이러한 불용인을 완화시켜 추가의 RNA 모티프가 이용되도록 하는 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다.
본 개시내용은 본원에 개시된 프라임 편집 시스템의 효능을 추가로 개선시키는 임의의 이러한 방식을 고려한다.
다양한 실시양태에서, 연속 T 시리즈는 전사될 PEgRNA의 능력을 제한할 수 있기 때문에 연장 아암으로부터 연속 T 서열의 출현을 제한하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 적어도 연속 3개의 T, 적어도 연속 4개의 T, 적어도 연속 5개의 T, 적어도 연속 6개의 T, 적어도 연속 7개의 T, 적어도 연속 8개의 T, 적어도 연속 9개의 T, 적어도 연속 10개의 T, 적어도 연속 11개의 T, 적어도 연속 12개의 T, 적어도 연속 13개의 T, 적어도 연속 14개의 T, 또는 적어도 연속 15개의 T의 스트링은 PEgRNA를 설계할 때 피해야 하거나, 또는 적어도 최종 설계된 서열로부터 제거되어야 한다. 한 실시양태에서, PEgRNA 연장 아암 내에 원치 않는 연속 T 스트링이 포함되는 것을 피할 수 있지만, 연속 A:T 핵염기 쌍이 풍부한 표적 부위를 피할 수 있다.
트랜스 프라임 편집을 위한 분할 PEgRNA 설계
본 개시내용은 또한 PEgRNA를 2개의 별개의 분자: 가이드 RNA 및 tPERT 분자로 분리함으로써 작업하는 프라임 편집의 변형된 버전을 지칭하는 트랜스 프라임 편집을 고려한다. tPERT 분자는 표적 DNA 부위에서 프라임 편집제 복합체와 공동-국재화되어, 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 프라임 편집제로 트랜스로 가져오도록 프로그램화된다. 예를 들어, (1) 동원 단백질 (RP)-PE:gRNA 복합체 및 (2) RNA-단백질 동원 도메인 (예를 들어, 스템 루프 또는 헤어핀)에 연결된 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 tPERT를 포함하는 2-성분 시스템을 보여주는 트랜스 프라임 편집제 (tPE)의 실시양태에 대해 도 3g를 참조하며, 여기서 RP-PE:gRNA 복합체의 동원 단백질 성분은 tPERT를 편집될 표적 부위로 동원함으로써 PBS 및 DNA 합성 주형을 프라임 편집제와 트랜스로 회합시킨다. 상기 또 다른 방식에서, tPERT는 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 PEgRNA의 연장 아암을 (모두 또는 일부) 함유하도록 조작된다. 이러한 접근법의 하나의 이점은 PEgRNA의 연장 아암을 가이드 RNA로부터 분리함으로써, 연장 아암의 PBS와 가이드 RNA의 스페이서 서열 사이에 발생하는 경향이 있는 어닐링 상호작용을 최소화한다는 것이다.
트랜스 프라임 편집의 주요 특색은 트랜스 프라임 편집제가 tPERT를 DNA 편집의 부위로 동원함으로써, 프라임 편집의 부위에 PEgRNA의 모든 기능을 효과적으로 공동-국재화하는 능력이다. 동원은 RNA-단백질 동원 도메인, 예컨대 MS2 압타머를 tPERT에 설치하고, RNA-단백질 동원 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 상응하는 동원 단백질을 프라임 편집제에 융합시켜 (예를 들어, napDNAbp에 대한 링커를 통해 또는 폴리머라제에 대한 링커를 통해), tPERT 분자를 프라임 편집제 복합체에 동원함으로써 달성될 수 있다. 도 3h에 기재된 과정에 도시된 바와 같이, RP-PE:gRNA 복합체는 표적 DNA 서열에 결합하여 닉킹한다. 이어서, 동원 단백질 (RP)은 tPERT를 동원하여 DNA 표적 부위에 결합된 프라임 편집제 복합체에 공동-국재화시킴으로써, tPERT 상에 위치한 프라이머 결합 부위가 닉킹된 가닥 상의 프라이머 서열에 결합하게 하고, 후속적으로 폴리머라제 (예를 들어, RT)가 tPERT 상에 위치한 DNA 합성 주형에 대해 tPERT의 5' 단부까지 단일 가닥의 DNA를 합성하게 한다.
도 3g 및 도 3h에는 tPERT가 RNA-단백질 동원 도메인의 5' 단부 상에 PBS 및 DNA 합성 주형을 포함하는 것으로서 제시되지만, RNA-단백질 동원 도메인의 3' 단부 상에 PBS 및 DNA 합성 주형이 위치하는 다른 구성의 tPERT가 설계될 수 있다. 그러나, DNA의 단일 가닥의 합성이 tPERT의 5' 단부에서 자연적으로 종결될 것이고, 따라서 프라임 편집의 DNA 합성 단계 동안 주형으로서 RNA-단백질 동원 도메인의 임의의 부분을 사용할 위험이 없다는 점에서 5' 연장부를 갖는 tPERT가 이점을 갖는다.
PEgRNA 설계 방법
본 개시내용은 또한 PEgRNA를 설계하는 방법에 관한 것이다.
설계의 한 측면에서, 설계 접근법은 프라임 편집이 사용되는 특정한 적용을 고려할 수 있다. 예를 들어, 본원에 예시되고 논의된 바와 같이, 프라임 편집은 제한 없이, (a) 뉴클레오티드 서열에 돌연변이-교정 변화를 설치하고, (b) 단백질 및 RNA 태그를 설치하고, (c) 관심 단백질 상에 이뮤노에피토프를 설치하고, (d) 단백질에 유도성 이량체화 도메인을 설치하고, (e) 생체분자의 활성을 변경하기 위해 서열을 설치하거나 제거하고, (f) 특이적 유전자 변화를 지시하기 위해 레콤비나제 표적 부위를 설치하고, (g) 오류-유발 RT를 사용함으로써 표적 서열을 돌연변이유발하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 관심 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 삽입, 변화, 또는 결실시키는 이들 방법에 더하여, 프라임 편집제는 또한 고도로 프로그램가능한 라이브러리를 구축하는데, 뿐만 아니라 세포 데이터 기록 및 계통 추적 연구를 수행하는데 사용될 수 있다. 이들 다양한 용도에서, 본원에 기재된 바와 같이 임의의 주어진 이들 적용에 특히 유용한 PEgRNA의 제조에 관한 특정한 설계 측면이 존재할 수 있다.
프라임 편집의 임의의 특정한 적용 또는 사용을 위해 PEgRNA를 설계하는 경우에, 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 고려사항이 고려될 수 있다:
(a) 표적 서열, 즉 1개 이상의 핵염기 변형을 프라임 편집제로 설치하고자 목적하는 뉴클레오티드 서열;
(b) 표적 서열 내의 절단 부위의 위치, 즉 프라임 편집제가 단일 가닥 닉을 유도하여 닉의 한 측면 상에 3' 단부 RT 프라이머 서열을 생성하고 닉의 다른 측면 상에 5' 단부 내인성 플랩을 생성할 (이는 궁극적으로 FEN1 또는 그의 등가물에 의해 제거되고 3' ssDNA 플랩에 의해 대체됨) 특이적 핵염기 위치. 절단 부위는 "편집 위치"와 유사한데, 이는 이것이 RNA-의존성 DNA 중합 동안 RT에 의해 연장되게 되는 3' 단부 RT 프라이머 서열을 생성하여 목적하는 편집을 함유하는 3' ssDNA 플랩을 생성하고, 이는 이어서 표적 서열에서 5' 내인성 DNA 플랩을 대체하기 때문이다.
(c) 이용가능한 PAM 서열 (정규 SpCas9 PAM 부위, 뿐만 아니라 확장된 또는 상이한 PAM 특이성을 갖는 Cas9 변이체 및 등가물에 의해 인식되는 비-정규 PAM 부위 포함);
(d) 이용가능한 PAM 서열과 표적 서열 내의 절단 부위의 위치 사이의 간격;
(e) 사용되는 프라임 편집제의 특정한 Cas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물;
(f) 프라이머 결합 부위의 서열 및 길이;
(g) 편집 주형의 서열 및 길이;
(h) 상동성 아암의 서열 및 길이;
(i) 스페이서 서열 및 길이; 및
(j) 코어 서열.
본 개시내용은 상기 이들 측면을 논의한다.
한 실시양태에서, 적합한 PEgRNA, 및 임의로 제2-부위 닉킹을 위한 닉킹-sgRNA 설계 가이드를 설계하기 위한 접근법이 본원에 제공된다. 이러한 실시양태는 상기 고려사항 중 1가지 이상을 고려한, 프라임 편집을 위한 PEgRNA 및 닉킹-sgRNA를 설계하기 위한 단계별 지침 세트를 제공한다. 단계는 도 70a-70i에 제시된 예를 참조한다.
1. 표적 서열 및 편집을 규정한다. 목적하는 편집 (점 돌연변이, 삽입, 결실, 또는 그의 조합)의 위치 주위에 집중된 표적 DNA 영역 (~200bp)의 서열을 검색한다. 도 70a를 참조한다.
2. 표적 PAM의 위치를 찾아낸다. 목적하는 편집 위치에 근접한 PAM을 확인한다. PAM은 목적하는 편집 위치에 근접한 DNA의 어느 하나의 가닥 상에서 확인될 수 있다. 편집 위치에 가까운 PAM이 바람직하지만 (즉, 여기서 닉 부위는 편집 위치로부터 30 nt 미만이거나, 또는 편집 위치로부터 닉 부위까지 29 nt, 28 nt, 27 nt, 26 nt, 25 nt, 24 nt, 23 nt, 22 nt, 21 nt, 20 nt, 19 nt, 18 nt, 17 nt, 16 nt, 15 nt, 14 nt, 13 nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt, 또는 2 nt 미만임), 닉을 편집 위치로부터 ≥ 30 nt에 배치하는 프로토스페이서 및 PAM을 사용하여 편집을 설치하는 것이 가능하다. 도 70b를 참조한다.
3. 닉 부위를 위치시킨다. 고려되는 각각의 PAM에 대해, 상응하는 닉 부위 및 어떤 가닥 상의 것인지 확인한다. Sp Cas9 H840A 닉카제의 경우, 절단은 PAM-함유 가닥에서 NGG PAM에 대해 5'의 세번째 및 네번째 염기 사이에서 일어난다. 모든 편집된 뉴클레오티드는 닉 부위의 3'에 존재해야 하고, 따라서 적절한 PAM은 PAM-함유 가닥 상의 표적 편집에 대해 5'에 닉을 배치해야 한다. 하기 제시된 예에서, 2종의 가능한 PAM이 존재한다. 단순성을 위해, 나머지 단계는 PAM 1만을 사용한 PEgRNA의 설계를 입증할 것이다. 도 70c를 참조한다.
4. 스페이서 서열을 설계한다. Sp Cas9의 프로토스페이서는 PAM-함유 가닥 상의 NGG PAM에 대해 5'의 20개 뉴클레오티드에 상응한다. 효율적인 Pol III 전사 개시는 G가 제1 전사된 뉴클레오티드일 것을 요구한다. 프로토스페이서의 제1 뉴클레오티드가 G인 경우에, PEgRNA에 대한 스페이서 서열은 단순히 프로토스페이서 서열이다. 프로토스페이서의 제1 뉴클레오티드가 G가 아닌 경우에, PEgRNA의 스페이서 서열은 G에 이어서 프로토스페이서 서열이 후속한다. 도 70d를 참조한다.
5. 프라이머 결합 부위 (PBS)를 설계한다. 출발 대립유전자 서열을 사용하여, PAM-함유 가닥 상의 DNA 프라이머를 확인한다. DNA 프라이머의 3' 단부는 닉 부위의 바로 상류에 있는 뉴클레오티드이다 (즉, Sp Cas9의 경우 NGG PAM에 대해 5'의 네번째 염기). PE2 및 PE3과 함께 사용하기 위한 일반적 설계 원리로서, DNA 프라이머에 대해 12 내지 13개 뉴클레오티드의 상보성을 함유하는 PEgRNA 프라이머 결합 부위 (PBS)가 ~40-60% GC 함량을 함유하는 서열에 대해 사용될 수 있다. 낮은 GC 함량을 갖는 서열의 경우에, 보다 긴 (14- 내지 15-nt) PBS가 시험되어야 한다. 보다 높은 GC 함량을 갖는 서열의 경우에, 보다 짧은 (8- 내지 11-nt) PBS가 시험되어야 한다. 최적의 PBS 서열은 GC 함량에 상관없이 실험적으로 결정되어야 한다. 길이-p PBS 서열을 설계하기 위해, 출발 대립유전자 서열을 사용하여 PAM-함유 가닥에서 닉 부위의 5'의 첫번째 p 뉴클레오티드의 역 상보체를 취한다. 도 70e를 참조한다.
6. RT 주형 (또는 DNA 합성 주형)을 설계한다. RT 주형 (또는 폴리머라제가 리버스 트랜스크립타제가 아닌 경우 DNA 합성 주형)은 설계된 편집 및 편집에 인접한 서열에 대한 상동성을 코딩한다. 한 실시양태에서, 이들 영역은 도 3d 및 도 3e의 DNA 합성 주형에 상응하며, 여기서 DNA 합성 주형은 "편집 주형" 및 "상동성 아암"을 포함한다. 최적의 RT 주형 길이는 표적 부위에 기초하여 달라진다. 짧은-범위 편집 (위치 +1 내지 +6)의 경우, 짧은 (9 내지 12 nt), 중간 (13 내지 16 nt), 및 긴 (17 내지 20 nt) RT 주형을 시험하는 것이 권장된다. 긴-범위 편집 (위치 +7 및 그 초과)의 경우, 충분한 3' DNA 플랩 상동성을 허용하기 위해 편집 위치를 지나 적어도 5개의 nt (바람직하게는 10개 이상의 nt) 연장된 RT 주형을 사용하는 것이 권장된다. 긴-범위 편집의 경우, 여러 RT 주형이 기능적 설계를 확인하기 위해 스크리닝되어야 한다. 보다 큰 삽입 및 결실 (≥5 nt)을 위해, RT 주형 내로의 보다 큰 3' 상동성 (~20 nt 이상)의 혼입이 권장된다. 편집 효율은 전형적으로 RT 주형이 역전사된 DNA 생성물에서 마지막 뉴클레오티드로서 G의 합성 (PEgRNA의 RT 주형에서의 C에 상응함)을 코딩하는 경우에 손상된다. 많은 RT 주형이 효율적인 프라임 편집을 지지하기 때문에, RT 주형을 설계할 때 최종 합성된 뉴클레오티드로서 G를 회피하는 것이 권장된다. 길이-r RT 주형 서열을 설계하기 위해, 목적하는 대립유전자 서열을 사용하고, 원래 PAM을 함유하는 가닥에서 닉 부위의 3'의 첫번째 r 뉴클레오티드의 역 상보체를 취한다. SNP 편집과 비교하여, 동일한 길이의 RT 주형을 사용한 삽입 또는 결실 편집은 동일한 상동성을 함유하지 않을 것임을 주목한다. 도 70f를 참조한다.
7. 전장 PEgRNA 서열을 조립한다. PEgRNA 성분을 하기 순서 (5'에서 3')로: 스페이서, 스캐폴드, RT 주형 및 PBS로 연결한다. 도 70g를 참조한다.
8. PE3에 대한 닉킹-sgRNA를 설계한다. 편집의 상류 및 하류의 비-편집된 가닥 상에서 PAM을 확인한다. 최적의 닉킹 위치는 고도로 유전자좌-의존적이고, 실험적으로 결정되어야 한다. 일반적으로, PEgRNA-유도된 닉에 걸친 위치에 대해 5'에 40 내지 90개의 뉴클레오티드가 배치된 닉은 보다 높은 편집 수율 및 보다 적은 indel로 이어진다. 닉킹 sgRNA는 출발 대립유전자에서 20-nt 프로토스페이서와 매칭되는 스페이서 서열을 가지며, 여기서 프로토스페이서가 G로 시작되지 않는 경우 5'-G가 부가된다. 도 70h를 참조한다.
9. PE3b 닉킹-sgRNA를 설계한다. PAM이 상보적 가닥에 존재하고 그의 상응하는 프로토스페이서가 편집을 위해 표적화된 서열과 중첩되는 경우에, 이러한 편집은 PE3b 시스템에 대한 후보일 수 있다. PE3b 시스템에서, 닉킹-sgRNA의 스페이서 서열은 출발 대립유전자가 아닌 목적하는 편집된 대립유전자의 서열과 매칭된다. PE3b 시스템은 편집된 뉴클레오티드(들)가 닉킹-sgRNA 프로토스페이서의 시드 영역 (PAM에 인접한 ~10개의 nt) 내에 속할 때 효율적으로 작동한다. 이는 편집된 가닥의 설치 후까지 상보적 가닥의 닉킹을 방지하여, 표적 DNA에의 결합에 대한 PEgRNA와 sgRNA 사이의 경쟁을 방지한다. PE3b는 또한 양쪽 가닥 상의 동시 닉의 생성을 피하고, 따라서 높은 편집 효율을 유지하면서 indel 형성을 유의하게 감소시킨다. PE3b sgRNA는 필요한 경우에 5' G를 부가하여 목적하는 대립유전자에서 20-nt 프로토스페이서와 매칭되는 스페이서 서열을 가져야 한다. 도 70i를 참조한다.
적합한 PEgRNA 및 제2-부위 닉킹 sgRNA를 설계하기 위한 상기 단계별 과정은 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 그로부터 유도될 수 있는 상기 기재된 단계별 과정의 변경을 고려한다.
[7] 프라임 편집을 이용하는 적용
이중 가닥 DNA 파괴 또는 공여자 DNA 주형을 필요로 하지 않으면서 인간 세포 내 표적화된 유전자좌에서 표적화된 삽입, 결실, 및 모든 12개의 가능한 염기-대-염기 전환을 매개하는 새로운 "검색-및-대체" 게놈 편집 기술로서 본원에 기재된 프라임 편집 시스템의 개발에 더하여, 본 발명자들은 또한 다양한 특정 적용에서 프라임 편집제의 사용을 고려하였다. 예를 들어, 본원에 예시되고 논의된 바와 같이, 프라임 편집은 (a) 뉴클레오티드 서열에 돌연변이-교정 변화를 설치하고, (b) 단백질 및 RNA 태그를 설치하고, (c) 관심 단백질 상에 이뮤노에피토프를 설치하고, (d) 단백질에 유도성 이량체화 도메인을 설치하고, (e) 생체분자의 활성을 변경하기 위해 서열을 설치하거나 제거하고, (f) 특이적 유전자 변화를 지시하기 위해 레콤비나제 표적 부위를 설치하고, (g) 오류-유발 RT를 사용함으로써 표적 서열을 돌연변이유발하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 관심 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 삽입, 변화, 또는 결실시키는 이들 방법에 더하여, 프라임 편집제는 또한 고도로 프로그램가능한 라이브러리를 구축하는데, 뿐만 아니라 세포 데이터 기록 및 계통 추적 연구를 수행하는데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 또한 프라임 편집의 효능을 개선시키는 것을 목표로 PEgRNA의 추가의 설계 특색을 고려하였다. 또한 추가로, 본 발명자들은 벡터 전달 시스템을 사용하고, 인테인 도메인을 사용하여 napDNAbp를 분할하는 것을 수반하는 프라임 편집제를 성공적으로 전달하는 방법을 구상하였다.
프라임 편집의 이들 구체적인 예시적인 용도는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 출원은, 일반적으로, 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 게놈 DNA 내 표적 부위에서 1개 이상의 핵염기의 설치, 제거, 및/또는 변형 중 일부 형태를 수반하는 프라임 편집을 위한 임의의 용도를 고려한다.
프라임 편집을 위한 예시된 용도 중 임의의 것을 위해, PE1, PE2, PE3, 및 PE3b, 또는 PE-짧은 형을 포함한 본원에 개시된 임의의 프라임 편집제를 사용할 수 있다.
A. 프라임 편집 메카니즘
다양한 실시양태에서, 프라임 편집 (또는 "프라임 편집")은 표적 DNA 분자 (뉴클레오티드 서열에서 변화가 도입되는 것이 목적됨)를 연장된 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)과 접촉시킴으로써 작동한다. 도 1g를 참조하면, 연장된 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에, 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함하고, 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입, 또는 결실)를 코딩한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/연장된 gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, 연장된 gRNA는 napDNAbp가 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의함), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 특정 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않은 가닥, 즉 "비-표적 가닥"에 상응하는 DNA의 가닥에서 생성된다. 그러나, 닉은 가닥 중 어느 하나에 도입될 수 있다. 즉, 닉은 R-루프 "표적 가닥" (즉, 연장된 gRNA의 프로토스페이서 서열에 혼성화된 가닥) 또는 "비-표적 가닥" (즉, R-루프의 단일 가닥 부분을 형성하고 표적 가닥에 상보적인 가닥) 내로 도입될 수 있다. 단계 (c)에서, DNA 가닥의 3' 단부 (닉에 의해 형성됨)는 역전사를 프라이밍하기 위해 (즉, "표적-프라이밍된 RT") 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 특정 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 RT 프라이밍 서열, 즉 "리버스 트랜스크립타제 프라이밍 서열"에 혼성화한다. 단계 (d)에서, 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 연장된 가이드 RNA의 5' 단부쪽으로 DNA의 단일 가닥을 합성하는 리버스 트랜스크립타제가 도입된다 (napDNAbp와의 융합 단백질로서 또는 트랜스로). 이는 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 염기 변화, 삽입, 또는 결실, 또는 그의 조합)를 포함하고, 그 외에는 닉 부위의 또는 그와 인접한 내인성 DNA와 상동성인 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 일단 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 내인성 DNA 서열에 침입하여 혼성화되면 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써 (예를 들어, 트랜스로, 프라임 편집제와의 융합체로서 제공되거나 또는 내인성으로 제공되는 FEN1 또는 유사한 효소에 의함) 목적하는 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, 세포 내인성 DNA 복구 및 복제 과정은 미스매칭된 DNA를 분해하여 뉴클레오티드 변화(들)를 혼입시켜 목적하는 변경된 생성물을 형성한다. 과정은 또한 도 1g에 예시된 바와 같은 "제2 가닥 닉킹", 또는 도 1i에 예시되고 본원에 논의된 바와 같은 "일시적 제2 가닥 닉킹"에 의해 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다.
프라임 편집의 과정은 하기 유전자 변화: 전환, 전이, 결실, 및 삽입 중 적어도 하나 이상을 도입할 수 있다. 또한, 프라임 편집은 특정한 적용을 위해 구현될 수 있다. 예를 들어, 본원에 예시되고 논의된 바와 같이, 프라임 편집은 (a) 뉴클레오티드 서열에 돌연변이-교정 변화를 설치하고, (b) 단백질 및 RNA 태그를 설치하고, (c) 관심 단백질 상에 이뮤노에피토프를 설치하고, (d) 단백질에 유도성 이량체화 도메인을 설치하고, (e) 생체분자의 활성을 변경하기 위해 서열을 설치하거나 제거하고, (f) 특이적 유전자 변화를 지시하기 위해 레콤비나제 표적 부위를 설치하고, (g) 오류-유발 RT를 사용함으로써 표적 서열을 돌연변이유발하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 관심 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 삽입, 변화, 또는 결실시키는 이들 방법에 더하여, 프라임 편집제는 또한 고도로 프로그램가능한 라이브러리를 구축하는데, 뿐만 아니라 세포 데이터 기록 및 계통 추적 연구를 수행하는데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 또한 프라임 편집의 효능을 개선시키는 것을 목표로 PEgRNA의 추가의 설계 특색을 고려하였다. 또한 추가로, 본 발명자들은 벡터 전달 시스템을 사용하고, 인테인 도메인을 사용하여 napDNAbp를 분할하는 것을 수반하는 프라임 편집제를 성공적으로 전달하는 방법을 구상하였다.
용어 "프라임 편집 시스템" 또는 "프라임 편집제 (PE)"는 napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제, 융합 단백질 (예를 들어, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함함), 연장된 가이드 RNA, 및 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성쪽으로 구동하는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 제2 가닥 닉킹 성분 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본원에 기재된 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)를 사용하는 게놈 편집 방법에 수반되는 조성물을 지칭한다.
또 다른 실시양태에서, 도 3f의 개략도는 전형적인 PEgRNA와 이중 가닥 DNA의 표적 부위의 상호작용 및 관심 유전자 변화를 함유하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩의 동반 생산을 도시한다. 이중 가닥 DNA는 상단 가닥이 3'에서 5' 배향으로, 하단 가닥이 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 상단 가닥은 "프로토스페이서" 및 PAM 서열을 포함하고, "표적 가닥"으로 지칭된다. 상보적 하단 가닥은 "비-표적 가닥"으로 지칭된다. 제시되지 않았지만, 도시된 PEgRNA는 Cas9 또는 등가물과 복합체화될 것이다. 개략도에 제시된 바와 같이, PEgRNA의 스페이서는 PAM 서열의 바로 하류에 위치하는 프로토스페이서로 지칭되는 표적 가닥 상의 상보적 영역에 어닐링되며, 이는 대략 20개 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 상호작용은 스페이서 RNA와 프로토스페이서 DNA 사이에 DNA/RNA 하이브리드로서 형성되고, 프로토스페이서 대향 영역에서 R 루프의 형성을 유도한다. 본원의 다른 곳에 교시된 바와 같이, Cas9 단백질 (제시되지 않음)은 이어서, 제시된 바와 같이 비-표적 가닥에서 닉을 유도한다. 이어서, 이는 3' ssDNA 플랩 영역의 형성으로 이어지며, 이는 *z*에 따르면 프라이머 결합 부위에서 PEgRNA의 3' 단부와 상호작용한다. ssDNA 플랩 (즉, 리버스 트랜스크립타제 프라이머 서열)의 3' 단부는 PEgRNA 상의 프라이머 결합 부위 (A)에 어닐링하여, 리버스 트랜스크립타제를 프라이밍한다. 이어서, 리버스 트랜스크립타제 (예를 들어, Cas9 구축물에 부착된, 융합 단백질로서 트랜스로 제공되거나 또는 시스로 제공됨)는 편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C)에 의해 코딩된 DNA의 단일 가닥을 중합한다. 중합은 연장 아암의 5' 단부쪽으로 계속된다. ssDNA의 중합된 가닥은, 다른 곳에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 도 1g에 제시된 바와 같이), 내인성 DNA를 침입하고, 상응하는 내인성 가닥 (이는 내인성 DNA의 5' DNA 플랩으로서 제거됨)을 대체하고, 자연 발생 DNA 복구/복제 라운드를 통해 목적하는 뉴클레오티드 편집 (단일 뉴클레오티드 염기 쌍 변화, 결실, 삽입 (전체 유전자 포함))을 설치하는 ssDNA 3' 단부 플랩을 형성한다.
프라임 편집의 이러한 적용은 실시예 1에 추가로 기재될 수 있다.
B. 오류-유발 RT와 함께 프라임 편집을 사용한 돌연변이유발
다양한 실시양태에서, 프라임 편집 시스템 (즉, 프라임 편집 시스템)은 표적화된 돌연변이유발을 수행하기 위해, 즉, 게놈 내의 DNA 또는 세포 내의 다른 DNA 요소의 잘-규정된 스트레치만을 돌연변이시키기 위해 오류-유발 리버스 트랜스크립타제의 사용을 포함할 수 있다. 도 22는 연장된 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 사용하여 표적 유전자좌 상에서 오류-유발 리버스 트랜스크립타제로 표적화된 돌연변이유발을 도입 및 수행하는 예시적인 과정의 개략도를 제공한다. 이 과정은 표적화된 돌연변이유발을 위한 프라임 편집의 실시양태로서 지칭될 수 있다. 연장된 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에, 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, gRNA는 napDNAbp가 돌연변이유발될 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의함), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 특정 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않은 가닥에 상응하는 DNA의 가닥에서 생성된다. 단계 (c)에서, 3' 단부 DNA 가닥은 역전사를 프라이밍하기 위해 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 특정 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 RT 프라이밍 서열에 혼성화한다. 단계 (d)에서, DNA의 돌연변이유발된 단일 가닥을 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 가이드 RNA의 3' 단부쪽으로 합성하는 오류-유발 리버스 트랜스크립타제가 도입된다. 예시적인 돌연변이는 별표 "*"로 표시된다. 이는 목적하는 돌연변이유발된 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 돌연변이유발된 영역이 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩 (돌연변이유발된 영역을 포함함)의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 다른 가닥 상의 상보적 서열에 침입하고 혼성화하면 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써 목적하는 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다. 과정은 또한 도 1f에 예시된 바와 같이 제2 가닥 닉킹에 의해 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다. 내인성 DNA 복구 및/또는 복제 과정 후에, 돌연변이유발된 영역은 DNA 유전자좌의 DNA의 양쪽 가닥 내로 혼입된다.
프라임 편집의 이러한 적용은 실시예 2에 추가로 기재될 수 있다.
오류-유발 또는 돌연변이유발 RT 효소는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 사용된 용어 "오류-유발" 리버스 트랜스크립타제는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 오류율보다 적은 오류율을 갖는 또 다른 리버스 트랜스크립타제 (예를 들어, 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제)로부터 유래된 리버스 트랜스크립타제 효소를 지칭한다. 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 오류율은 15,000 내지 27,000개 핵염기 혼입에서 1개의 오류 범위인 것으로 보고되어 있다. 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Boutabout et al., (2001) "DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1," Nucleic Acids Res 29(11):2217-2222]을 참조한다. 따라서, 본 출원의 목적상, 용어 "오류 유발"은 15,000개 핵염기 혼입에서 1개 초과의 오류 (6.7 x 10-5 이상), 예를 들어 14,000개 핵염기에서 1개의 오류 (7.14 x 10-5 이상), 13,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (7.7 x 10-5 이상), 12,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (7.7 x 10-5 이상), 11,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (9.1 x 10-5 이상), 10,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (1 x 10-4 또는 0.0001 이상), 9,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00011 이상), 8,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00013 이상), 7,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00014 이상), 6,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00016 이상), 5,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.0002 이상), 4,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00025 이상), 3,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00033 이상), 2,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00050 이상), 또는 1,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.001 이상), 또는 500개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.002 이상), 또는 250개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.004 이상)인 오류율을 갖는 RT를 지칭한다.
다양한 돌연변이유발 RT가 프라임 편집을 사용한 돌연변이유발된 서열의 생성을 위해 고려될 수 있다. 2가지의 이러한 예는 보르데텔라(Bordetella) 파지 (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Handa, S., et al., Nucl Acids Res 9711-25 (2018)] 참조) 및 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Arambula, D., et al., Proc Natl Acad Sci USA 8212-7 (2013)] 참조)로부터의 돌연변이유발 리버스 트랜스크립타제이다. 보르데텔라 파지로부터의 RT (brt)의 경우에, 표적 부위에 대한 돌연변이유발 RT의 결합을 개선시키기 위해 또한 보조 단백질이 (bavd) Cas9에, 뿐만 아니라 추가의 RNA 서열이 PEgRNA에 부가될 - 또는 트랜스로 전달될 - 필요가 있을 수 있을 수 있다 (문헌 [Handa, S., et al., Nucl Acids Res 9711-25 (2018)] 참조). 돌연변이유발 RT를 사용하는 경우에, PEgRNA의 주형 영역은 다양성을 증진시키기 위해 아데노신 또는 AAY 코돈이 풍부화될 수 있다.
보르데텔라 파지로부터의 돌연변이유발 RT의 아미노산 서열은 하기와 같이 제공된다. 본원에 개시된 다른 RT와 같이, Brt 단백질은 융합 단백질로서 napDNAbp에 융합되어 기능적 PE를 형성할 수 있다.
Figure pct00135
보르데텔라로부터의 Brt의 경우에, PE 융합체는 또한 추가의 보조 단백질 (Bavd)을 포함할 수 있다. 보조 단백질은 PE 융합 단백질에 융합되거나 또는 트랜스로 제공될 수 있다. Bavd 보조 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같이 제공된다:
Figure pct00136
보르데텔라로부터의 Brt의 경우에, PEgRNA는 PEgRNA에, 예를 들어 5' 또는 3' 단부에 부가된 추가의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 서열은 하기와 같으며, 이는 원래 보르데텔라 파지 게놈으로부터의 것이다:
Figure pct00137
이러한 PEgRNA 부가 서열은 다양한 방식으로 감소시켜 길이를 단축시킬 수 있다. 예를 들어, PEgRNA-부가 1 서열은 하기 예시적인 대안적 부가 서열로 감소될 수 있다:
Figure pct00138
다른 실시양태에서, PEgRNA 부가 서열은 또한 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, PEgRNA-부가 1 서열은 하기 예시적인 대안적 부가 서열로 돌연변이될 수 있다:
Figure pct00139
돌연변이를 도입하기 위한 PE의 사용에 관한 다양한 실시양태에서, 특별한 PEgRNA 고려사항이 적용될 수 있다. 예를 들어, 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 돌연변이유발 RT를 통한 효율적인 돌연변이유발을 가능하게 하기 위해 상기 기재된 추가의 PEgRNA 서열이 필요할 수 있다.
임의의 돌연변이유발 RT가 본원에 개시된 프라임 편집제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 참고문헌에 기재된 오류-유발 RT가 사용될 수 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다:
Figure pct00140
다양한 오류-유발 RT는 하기와 같이 메넨데즈-아리아스(Menendez-Arias) 등의 표 1 (그의 전체 내용은 참조로 포함됨)에 개시된 하기 효소를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00141
C. 트리플렛 확장 장애를 치료하기 위한 프라임 편집의 사용
본원에 기재된 프라임 편집 시스템 또는 프라임 편집 (PE) 시스템은 헌팅톤병 및 다른 트리뉴클레오티드 반복 장애와 같은 상태를 치료하기 위해 트리뉴클레오티드 반복 돌연변이 (또는 "트리플렛 확장 질환")를 축소시키는데 사용될 수 있다. 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 발달 신경생물학을 수반하고 종종 인지 뿐만 아니라 감각-운동 기능에 영향을 미치는 복잡한 진행성 장애이다. 장애는 유전학적 표현촉진을 나타낸다 (즉, 각 세대에 따라 중증도가 증가됨). DNA 확장 또는 축소는 통상적으로 감수분열적으로 (즉, 배우자발생 시간 동안, 또는 배아 발생 초기에) 일어나고, 종종 성별-편향을 가지며, 이는 일부 유전자가 여성을 통해 유전될 때에만 확장되고, 다른 것은 남성을 통해서만 확장된다는 것을 의미한다. 인간에서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 전사 또는 번역 수준에서 유전자 침묵을 유발할 수 있고, 이는 본질적으로 유전자 기능을 녹아웃시킨다. 대안적으로, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 종종 우성-음성 방식으로 (예를 들어 폴리-글루타민 질환) 단백질 기능을 제거하거나 변화시키는 대형의 반복 아미노산 서열로 생성된 변경된 단백질을 유발할 수 있다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 트리플렛 확장은 DNA 복제 동안 또는 DNA 복구 합성 동안 슬리피지에 의해 유발된다. 탠덤 반복부는 서로 동일한 서열을 갖기 때문에, 2개의 DNA 가닥 사이의 염기 쌍형성은 서열을 따라 다중 지점에서 일어날 수 있다. 이는 DNA 복제 또는 DNA 복구 합성 동안 "루프 아웃" 구조의 형성으로 이어질 수 있다. 이는 반복 서열의 반복 카피를 유도하여, 반복부의 수를 확장시킬 수 있다. 하이브리드 RNA:DNA 중간체를 수반하는 추가의 메카니즘이 제안되었다. 프라임 편집은 1개 이상의 또는 문제의 반복 코돈 트리플렛을 결실시킴으로써 이들 트리플렛 확장 영역을 감소 또는 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 용도의 한 실시양태에서, 도 23은 프라임 편집으로 트리뉴클레오티드 반복 서열을 축소 또는 감소시키기 위한 PEgRNA 설계의 개략도를 제공한다.
프라임 편집은 절단 부위에 적절하게 표적화된 PEgRNA를 포함하는 프라임 편집제로 트리플렛 반복 영역의 상류 영역을 닉킹함으로써 트리플렛 확장 영역을 축소시키도록 구현될 수 있다. 이어서, 프라임 편집제는 건강한 수의 트리플렛 반복부 (이는 특정한 유전자 및 질환에 의존함)를 코딩하는 주형 (즉, 그의 편집 주형)으로서 PEgRNA에 기초하여 새로운 DNA 가닥 (ssDNA 플랩)을 합성한다. 건강한 트리플렛 반복 서열을 포함하는 새로 합성된 ssDNA 가닥은 또한 반복부의 다른 단부 (적색 가닥)에 인접한 서열에 매칭되는 짧은 상동성 스트레치 (즉, 상동성 아암)를 포함하도록 합성된다. 새로 합성된 가닥의 침입, 및 내인성 DNA의 새로 합성된 ssDNA 플랩으로의 후속 대체는 축소된 반복 대립유전자로 이어진다.
특정한 트리뉴클레오티드 확장 장애에 따라, "트리뉴클레오티드 반복부 확장 단백질"에서 결함-유도 트리플렛 확장이 발생할 수 있다. 트리뉴클레오티드 반복부 확장 단백질은 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애의 발생에 대한 감수성, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애의 존재, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애의 중증도 또는 그의 임의의 조합과 연관된 단백질의 다양한 세트이다. 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 반복부의 유형에 의해 결정되는 2개의 카테고리로 나뉜다. 가장 흔한 반복부는 트리플렛 CAG이며, 이는 유전자의 코딩 영역에 존재하는 경우에 아미노산 글루타민 (Q)을 코딩한다. 따라서, 이들 장애는 폴리글루타민 (폴리Q) 장애로 지칭되고, 하기 질환을 포함한다: 헌팅톤병 (HD); 척수연수성 근육 위축 (SBMA); 척수소뇌성 운동실조 (SCA 유형 1, 2, 3, 6, 7, 및 17); 및 치상핵적핵-담창구시상하핵 위축 (DRPLA). 나머지 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 CAG 트리플렛을 수반하지 않거나 또는 CAG 트리플렛이 유전자의 코딩 영역에 있지 않고, 따라서 비-폴리글루타민 장애로 지칭된다. 비-폴리글루타민 장애는 유약 X 증후군 (FRAXA); 유약 XE 정신 지체 (FRAXE); 프리드라이히 운동실조 (FRDA); 근긴장성 이영양증 (DM); 및 척수소뇌 운동실조 (SCA 유형 8, 및 12)를 포함한다.
트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질은 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애에 대한 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질의 실험적 연관에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질의 생산율 또는 순환 농도는 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애를 갖는 집단에서 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애가 결여된 집단에 비해 상승 또는 저하될 수 있다. 단백질 수준의 차이는 웨스턴 블롯, 면역조직화학적 염색, 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA) 및 질량 분광측정법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단백질체학 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 대안적으로, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질은 DNA 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 및 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (Q-PCR)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 게놈 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 수득함으로써 확인될 수 있다.
프라임 편집에 의해 교정될 수 있는 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질의 비제한적 예는 AR (안드로겐 수용체), FMR1 (유약 X 정신 지체 1), HTT (헌팅틴), DMPK (근긴장성 이영양증-단백질 키나제), FXN (프라탁신), ATXN2 (아탁신 2), ATN1 (아트로핀 1), FEN1 (플랩 구조-특이적 엔도뉴클레아제 1), TNRC6A (트리뉴클레오티드 반복부 함유 6A), PABPN1 (폴리(A) 결합 단백질, 핵 1), JPH3 (준크토필린 3), MED15 (매개체 착물 서브유닛 15), ATXN1 (아탁신 1), ATXN3 (아탁신 3), TBP (TATA 박스 결합 단백질), CACNA1A (칼슘 채널, 전압-의존성, P/Q 유형, 알파 1A 서브유닛), ATXN80S (ATXN8 대향 가닥 (비-단백질 코딩)), PPP2R2B (단백질 포스파타제 2, 조절 서브유닛 B, 베타), ATXN7 (아탁신 7), TNRC6B (트리뉴클레오티드 반복부 함유 6B), TNRC6C (트리뉴클레오티드 반복부 함유 6C), CELF3 (CUGBP, Elav-유사 패밀리 구성원 3), MAB21L1 (mab-21-유사 1 (씨. 엘레간스(C. elegans))), MSH2 (mutS 상동체 2, 결장암, 비폴립증 유형 1 (이. 콜라이)), TMEM185A (막횡단 단백질 185A), SIX5 (6 호메오박스 5), CNPY3 (캐노피 3 상동체 (제브라피쉬)), FRAXE (유약 부위, 폴산 유형, 희귀, fra(X)(q28) E), GNB2 (구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질), 베타 폴리펩티드 2), RPL14 (리보솜 단백질 L14), ATXN8 (아탁신 8), INSR (인슐린 수용체), TTR (트랜스티레틴), EP400 (E1A 결합 단백질 p400), GIGYF2 (GRB10 상호작용 GYF 단백질 2), OGG1 (8-옥소구아닌 DNA 글리코실라제), STC1 (스탄니오칼신 1), CNDP1 (카르노신 디펩티다제 1 (메탈로펩티다제 M20 패밀리)), C10orf2 (염색체 10 오픈 리딩 프레임 2), MAML3 마스터마인드-유사 3 (드로소필라), DKC1 (선천성 이상각화증 1, 디스케린), PAXIP1 (PAX 상호작용 (전사-활성화 도메인과) 단백질 1), CASK (칼슘/칼모듈린-의존성 세린 단백질 키나제 (MAGUK 패밀리)), MAPT (미세관-연관 단백질 타우), SP1 (Sp1 전사 인자), POLG (폴리머라제 (DNA 지시됨), 감마), AFF2 (AF4/FMR2 패밀리, 구성원 2), THBS1 (트롬보스폰딘 1), TP53 (종양 단백질 p53), ESR1 (에스트로겐 수용체 1), CGGBP1 (CGG 트리플렛 반복부 결합 단백질 1), ABT1 (기저 전사 활성인자 1), KLK3 (칼리크레인-관련 펩티다제 3), PRNP (프리온 단백질), JUN (jun 종양유전자), KCNN3 (칼륨 중간/작은 전도도 칼슘-활성화된 채널, 서브패밀리 N, 구성원 3), BAX (BCL2-연관 X 단백질), FRAXA (유약 부위, 폴산 유형, 희귀, fra(X)(q27.3) A (대고환증, 정신 지체)), KBTBD10 (켈히 반복부 및 BTB (POZ) 도메인 함유 10), MBNL1 (머슬블라인드-유사 (드로소필라)), RAD51 (RAD51 상동체 (RecA 상동체, 이. 콜라이) (에스. 세레비지아에)), NCOA3 (핵 수용체 보조활성인자 3), ERDA1 (확장된 반복부 도메인, CAG/CTG 1), TSC1 (결절성 경화증 1), COMP (연골 올리고머 매트릭스 단백질), GCLC (글루타메이트-시스테인 리가제, 촉매 서브유닛), RRAD (Ras-관련 당뇨병 연관), MSH3 (mutS 상동체 3 (이. 콜라이)), DRD2 (도파민 수용체 D2), CD44 (CD44 분자 (인디안 혈액형)), CTCF (CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)), CCND1 (시클린 D1), CLSPN (클라스핀 상동체 (크세노푸스 라에비스)), MEF2A (근세포 인핸서 인자 2A), PTPRU (단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형, U), GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제), TRIM22 (3부 모티프-함유 22), WT1 (윌름스 종양 1), AHR (아릴 탄화수소 수용체), GPX1 (글루타티온 퍼옥시다제 1), TPMT (티오퓨린 S-메틸트랜스퍼라제), NDP (노리병 (가성신경교종)), ARX (아리스탈레스 관련 호메오박스), MUS81 (MUS81 엔도뉴클레아제 상동체 (에스. 세레비지아에)), TYR (티로시나제 (눈피부 백색증 IA)), EGR1 (조기 성장 반응 1), UNG (우라실-DNA 글리코실라제), NUMBL (numb 상동체 (드로소필라)-유사), FABP2 (지방산 결합 단백질 2, 장), EN2 (엔그라일드 호메오박스 2), CRYGC (크리스탈린, 감마 C), SRP14 (신호 인식 입자 14 kDa (상동 Alu RNA 결합 단백질)), CRYGB (크리스탈린, 감마 B), PDCD1 (프로그램화된 세포 사멸 1), HOXA1 (호메오박스 A1), ATXN2L (아탁신 2-유사), PMS2 (PMS2 감수분열 분리후 증가 2 (에스. 세레비지아에)), GLA (갈락토시다제, 알파), CBL (Cas-Br-M (뮤린) 동종향성 레트로바이러스 형질전환 서열), FTH1 (페리틴, 중쇄 폴리펩티드 1), IL12RB2 (인터류킨 12 수용체, 베타 2), OTX2 (오르토덴티클 호메오박스 2), HOXA5 (호메오박스 A5), POLG2 (폴리머라제 (DNA 지시됨), 감마 2, 보조 서브유닛), DLX2 (디스탈-레스 호메오박스 2), SIRPA (신호-조절 단백질 알파), OTX1 (오르토덴티클 호메오박스 1), AHRR (아릴-탄화수소 수용체 리프레서), MANF (중간뇌 성상세포-유도된 신경영양 인자), TMEM158 (막횡단 단백질 158 (유전자/위유전자)), 및 ENSG00000078687을 포함한다.
본원에 개시된 프라임 편집제는 하기 폴리글루타민 트리플렛 확장 질환 유전자를 포함한 (프라임 편집에 의해 완전히 또는 부분적으로 제거될 수 있는 병원성 반복부의 특정한 위치를 나타냄), 상기-나타낸 질환 단백질 중 임의의 것에서의 트리플렛 반복부 확장 영역을 축소시키는데 사용될 수 있다:
Figure pct00142
본원에 개시된 프라임 편집제는 또한 하기 비-폴리글루타민 트리플렛 확장 질환 유전자에서 전형적으로 발견되는 트리플렛 반복부 확장 영역을 축소시키는데 사용될 수 있다:
Figure pct00143
프라임 편집은 트리플렛 확장 영역의 적어도 1개의 코돈을 결실시키도록 설계된 편집 주형을 갖는 PEgRNA를 사용하여 트리플렛 확장 영역을 축소시키도록 구현될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이를 위해 프라임 편집에 사용하기 위한 PEgRNA는 건강한 (즉, 질환을 생성하는 것과 연관되지 않은) 수의 트리플렛 반복부에 도달하기 위해 트리플렛 확장 영역으로부터 적어도 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15, 또는 16, 또는 17, 또는 18, 또는 19, 또는 20, 또는 21, 또는 22, 또는 23, 또는 24, 또는 25, 또는 26, 또는 27, 또는 28, 또는 29, 또는 30, 또는 31, 또는 32, 또는 33, 또는 34, 또는 35, 또는 36, 또는 37, 또는 38, 또는 39, 또는 40, 또는 41, 또는 42, 또는 43, 또는 44, 또는 45, 또는 46, 또는 47, 또는 48, 또는 49, 또는 50, 또는 51, 또는 52, 또는 53, 또는 54, 또는 55, 또는 56, 또는 57, 또는 58, 또는 59, 또는 60, 또는 61, 또는 62, 또는 63, 또는 64, 또는 65, 또는 66, 또는 67, 또는 68, 또는 69, 또는 70, 또는 71, 또는 72, 또는 73, 또는 74, 또는 75, 또는 76, 또는 77, 또는 78, 또는 79, 또는 80, 또는 81, 또는 82, 또는 83, 또는 84, 또는 85, 또는 86, 또는 87, 또는 88, 또는 89, 또는 90, 또는 91, 또는 92, 또는 93, 또는 94, 또는 95, 또는 96, 또는 97, 또는 98, 또는 99, 또는 100개, 또는 그 초과의 코돈을 결실시키는데 사용되었다.
다른 실시양태에서, 이를 위해 프라임 편집에 사용하기 위한 PEgRNA는 건강한 (즉, 질환을 생성하는 것과 연관되지 않은) 수의 트리플렛 반복부에 도달하기 위해 트리플렛 확장 영역으로부터 적어도 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15, 또는 16, 또는 17, 또는 18, 또는 19, 또는 20개 또는 그 초과의 코돈을 결실시키는데 사용되었다.
다른 실시양태에서, 이를 위해 프라임 편집에 사용하기 위한 PEgRNA는 건강한 (즉, 질환을 생성하는 것과 연관되지 않은) 수의 트리플렛 반복부에 도달하기 위해 트리플렛 확장 영역으로부터 적어도 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15개, 또는 그 초과의 코돈을 결실시키는데 사용되었다.
다른 실시양태에서, 이를 위해 프라임 편집에 사용하기 위한 PEgRNA는 건강한 (즉, 질환을 생성하는 것과 연관되지 않은) 수의 트리플렛 반복부에 도달하기 위해 트리플렛 확장 영역으로부터 적어도 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개, 또는 그 초과의 코돈을 결실시키는데 사용되었다.
프라임 편집은 임의의 트리플렛 확장 영역, 예컨대 문헌 [Budworth et al., "A Brief History of Triplet Repeat Diseases," Methods Mol Biol, 2013, 1010: 3-17], US 20011/00165540 A1 (Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals), US 2016/0355796 A1 (Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders)에 기재된 것을 교정하도록 구성될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 개시내용은 (a) napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 융합체, (b) 트리뉴클레오티드 반복부 확장 영역을 표적화하는 스페이서 서열 및 트리뉴클레오티드 반복부 확장 영역의 제거를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 연장 아암을 포함하는 PEgRNA를 포함하는, 결함있는 유전자 내에 트리뉴클레오티드 반복부 확장 영역을 갖는 세포에 사용하기에 적합한 프라임 편집 구축물을 제공한다.
다양한 다른 실시양태에서, 개시내용은 napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 융합체, 및 트리뉴클레오티드 반복부 확장 영역을 표적화하는 스페이서 서열 및 트리뉴클레오티드 반복부 확장 영역의 제거를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 연장 아암을 포함하는 PEgRNA와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 프라임 편집을 사용하여 세포 내 결함있는 유전자에서 트리뉴클레오티드 반복부 확장 영역의 전부 또는 일부를 결실시키는 방법을 제공한다.
다양한 실시양태에서, 트리뉴클레오티드 반복부는 반복 CTG, CAG, CGG, CCG, GAA, 또는 TTC 트리뉴클레오티드를 포함한다.
다양한 다른 실시양태에서, 테트라뉴클레오티드 반복부, 펜타뉴클레오티드 반복부, 또는 헥사뉴클레오티드 반복부.
D. 펩티드 태그부착을 위한 프라임 편집의 사용
또 다른 측면에서, 개시내용은 프라임 편집을 사용하여 단백질 상에 1개 이상의 펩티드 태그를 유전자 그라프팅하기 위한, 본원에 기재된 프라임 편집제를 사용하는 방법을 제공한다. 보다 특히, 개시내용은 단백질을 코딩하는 표적 뉴클레오티드 서열을, 1개 이상의 펩티드 태그를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 그 안에 삽입하여 단백질 태그에 융합된 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 생성하도록 구성된 프라임 편집제와 접촉시키는 것을 포함하는, 단백질 상에 1개 이상의 펩티드 태그를 유전자 설치하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 개시내용은 단백질을 코딩하는 표적 뉴클레오티드 서열을, 1개 이상의 펩티드 태그를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 그 안에 삽입하여 단백질 태그에 융합된 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 생성하도록 구성된 프라임 편집제와 접촉시키는 것을 포함하는, 관심 펩티드 및 1개 이상의 펩티드 태그를 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
다양한 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA에서의 관심 특이적 유전자이다. 관심 유전자는 관심 단백질 (예를 들어, 수용체, 효소, 치료 단백질, 막 단백질, 수송 단백질, 신호 전달 단백질, 또는 면역학적 단백질 등)을 코딩할 수 있다. 관심 유전자는 또한 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 안티센스 RNA, 가이드 RNA, 마이크로RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 및 세포-유리 RNA (cfRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 RNA 분자를 코딩할 수 있다.
펩티드 태그는 분리, 정제, 가시화, 가용화, 또는 검출과 같은 목적을 위해 단백질에 1종 이상의 기능을 부여하는 임의의 펩티드 태그 또는 그의 변이체일 수 있다. 펩티드 태그는 "친화성 태그" (단백질 정제를 용이하게 하기 위함), "가용화 태그" (단백질의 적절한 폴딩을 보조하기 위함), "크로마토그래피 태그" (단백질의 크로마토그래피 특성을 변경하기 위함), "에피토프 태그" (고친화도 항체에 결합하기 위함), 및 "형광 태그" (세포 또는 시험관내에서 단백질의 가시화를 용이하게 하기 위함)를 포함할 수 있다. 펩티드 태그의 예는 하기 태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00144
펩티드 태그는 또한 하기 친화성 태그 (단백질의 분리 및/또는 정제를 위함)일 수 있다 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Kimple et al., "Overview of Affinity Tags for Protein Purification," Curr Protoc Protein Sci, 2013, 73:Unit-9.9]의 표 9.9.1에 기재된 바와 같음).
Figure pct00145
특정한 실시양태에서, 펩티드 태그는 His6 태그, FLAG-태그, V5-태그, GCN4-태그, HA-태그, Myc-태그, FIAsH/ReAsH-태그, 소르타제 기질, 파이-클램프를 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 펩티드 태그는 단백질 형광 표지, 면역침전, 이뮤노블롯팅, 면역조직화학, 단백질 동원, 유도성 단백질 데그론, 및 게놈-전반 스크리닝을 포함하는 적용에 사용될 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, 펩티드 태그는 단백질 자기-스플라이싱 기능을 설치하기 위해 인테인 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인테인"은 모든 생물 역으로부터의 유기체에서 발견되는 자가-프로세싱 폴리펩티드 도메인을 지칭한다. 인테인 (개재 단백질)은 단백질 스플라이싱으로 공지된 고유한 자가-프로세싱 사건을 수행하며, 여기서 이는 2개의 펩티드 결합의 절단을 통해 보다 큰 전구체 폴리펩티드로부터 그 자체를 절제하고, 그 과정에서 새로운 펩티드 결합의 형성을 통해 플랭킹 엑스테인 (외부 단백질) 서열을 라이게이션한다. 이러한 재배열은 인테인 유전자가 다른 단백질-코딩 유전자 내에 인 프레임으로 포매되어 발견되기 때문에 번역후에 (또는 가능하게는 공동-번역으로) 일어난다. 또한, 인테인-매개된 단백질 스플라이싱은 자발적이고; 이는 외부 인자 또는 에너지 공급원을 필요로 하지 않으며, 단지 인테인 도메인의 폴딩만을 필요로 한다. 이 과정은 또한 시스-단백질 스플라이싱으로도 공지되어 있으며, 이는 "분할 인테인"에 의한 트랜스-단백질 스플라이싱의 자연적 과정과 대조된다. 인테인은 엑스테인으로 공지된 플랭킹 단백질 서열의 동반 융합체에 의한 전구체 단백질로부터의 그 자체의 절제를 촉매하는 자기-스플라이싱 RNA 인트론의 단백질 등가물이다 (문헌 [Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127 (1994)] 참조) (문헌 [Perler et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1:292-299 (1997); Perler, F. B. Cell 92(1):1-4 (1998); Xu et al., EMBO J. 15(19):5146-5153 (1996)]에서 검토됨).
단백질 스플라이싱 과정의 메카니즘은 매우 상세하게 연구되었고 (Chong, et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 22159-22168; Xu, M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153), 보존된 아미노산은 인테인 및 엑스테인 스플라이싱 지점에서 발견되었다 (Xu, et al., EMBO Journal, 1994, 13 5517-522).
인테인은 또한 2개의 개별적으로 전사되고 번역되는 유전자에 의해 코딩된 2개의 단편으로서 존재할 수 있다. 이들 소위 분할 인테인은 자기-회합하고, 단백질-스플라이싱 활성을 트랜스로 촉매한다. 분할 인테인은 다양한 시아노박테리아 및 고세균에서 확인되었지만 (Caspi et al, Mol Microbiol. 50: 1569-1577 (2003); Choi J. et al, J Mol Biol. 556: 1093-1106 (2006.); Dassa B. et al, Biochemistry. 46:322-330 (2007.); Liu X. and Yang J., J Biol Chem. 275:26315-26318 (2003); Wu H. et al., Proc Natl Acad Sci USA. ￡5:9226-9231 (1998.); 및 Zettler J. et al, FEBS Letters. 553:909-914 (2009)), 지금까지 진핵생물에서는 발견되지 않았다. 최근에, 환경 메타게놈 데이터의 생물정보학적 분석은 신규 게놈 배열을 갖는 26개의 상이한 유전자좌를 밝혀내었다. 각각의 유전자좌에서, 보존된 효소 코딩 영역은 분할 인테인에 의해 개재되고, 인테인 서브도메인을 코딩하는 섹션 사이에 자립형 엔도뉴클레아제 유전자가 삽입된다. 이들 중에서, 5개의 유전자좌가 완전히 조립되었다: DNA 헬리카제 (gp41-l, gp41-8); 이노신-5'-모노포스페이트 데히드로게나제 (IMPDH-1); 및 리보뉴클레오티드 리덕타제 촉매 서브유닛 (NrdA-2 및 NrdJ-1). 이러한 파괴된 유전자 조직은 주로 파지에 존재하는 것으로 보인다 (Dassa et al., Nucleic Acids Research. 57:2560-2573 (2009)).
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 분할-인테인 태그를 2개의 상이한 단백질에 삽입하는데 사용될 수 있으며, 이는 공동-발현되어 융합 단백질 형성 시 그의 세포내 라이게이션을 유발한다. 단백질 트랜스-스플라이싱에서, 하나의 전구체 단백질은 N-엑스테인 부분에 이어 N-인테인으로 이루어지고, 또 다른 전구체 단백질은 C-인테인 부분에 이어 C-엑스테인으로 이루어지고, 트랜스-스플라이싱 반응 (N- 및 C-인테인에 의해 함께 촉매됨)은 2개의 인테인 서열을 절제하고, 2개의 엑스테인 서열을 펩티드 결합으로 연결한다. 효소 반응인 단백질 트랜스-스플라이싱은 매우 낮은 (예를 들어, 마이크로몰) 농도의 단백질로 작용할 수 있고, 생리학적 조건 하에 수행될 수 있다.
분할 인테인 Npu DnaE는 단백질 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 보고된 최고 속도를 갖는 것으로 특징화되었다. 또한, Npu DnaE 단백질 스플라이싱 반응은 상이한 엑스테인 서열, 6 내지 37℃의 온도, 및 최대 6M의 우레아의 존재와 관련하여 강건하고 고수율인 것으로 간주된다 (Zettler J. et al., FEBS Letters. 553:909-914 (2009); Iwai I. et al., FEBS Letters 550: 1853-1858 (2006)). 예상된 바와 같이, 이들 인테인의 N-도메인에서 Cysl Ala 돌연변이가 도입되었을 때, 초기 N에서 S- 아실 이동이 차단되었고, 따라서 단백질 스플라이싱이 차단되었다. 불행하게도, C-말단 절단 반응도 또한 거의 완전히 억제되었다. N-말단 절단가능한 펩티드 결합에서의 아실 이동에 대한 C-말단 스플라이스 접합부에서의 아스파라긴 고리화의 의존성은 자연 분할 DnaE 인테인 대립유전자에 공통적인 고유한 특성인 것으로 보인다 (Zettler J. et al., FEBS Letters. 555:909-914 (2009)).
분할 인테인에 의해 촉매되는 단백질 트랜스-스플라이싱은 단백질 라이게이션을 위한 전적으로 효소적인 방법을 제공한다. 분할-인테인은 본질적으로 각각 N-인테인 및 C-인테인으로 명명되는 2개의 조각으로 분할된 인접 인테인 (예를 들어 미니-인테인)이다. 분할 인테인의 N-인테인 및 C-인테인은 비-공유적으로 회합되어 활성 인테인을 형성하고, 인접 인테인과 본질적으로 동일한 방식으로 스플라이싱 반응을 촉매할 수 있다. 분할 인테인은 자연에서 발견되었고, 또한 실험실에서 조작되었다. 본원에 사용된 용어 "분할 인테인"은 N-말단 및 C-말단 서열이 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 인테인으로 비-공유적으로 재회합 또는 재구성될 수 있는 별개의 분자가 되도록 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열 사이에 1개 이상의 펩티드 결합 파괴가 존재하는 임의의 인테인을 지칭한다. 임의의 촉매 활성 인테인 또는 그의 단편은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 분할 인테인을 유도하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서 분할 인테인은 진핵 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 박테리아 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 고세균 인테인으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 이와 같이 유래된 분할 인테인은 트랜스-스플라이싱 반응을 촉매하는데 필수적인 아미노산 서열만을 보유할 것이다.
분할 인테인은 미니-인테인의 구조에서 발견되는 -12개의 보존된 베타-가닥 사이의 비구조화된 루프 또는 개재 아미노산 서열 내의 1개 이상의 분할 부위를 조작함으로써 인접 인테인으로부터 생성될 수 있다. 분할의 생성이 단백질 스플라이싱 활성이 상실되는데 충분한 정도로 인테인, 특히 구조화된 베타-가닥의 구조를 파괴하지 않을 것이라면, 베타-가닥 사이의 영역 내의 분할 부위의 위치에 일부 유연성이 존재할 수 있다.
본원에 기재된 프라임 편집제는 펩티드 태그 (인테인 포함)를 관심 단백질의 C-말단 단부 내로 혼입시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 펩티드 태그 (인테인 포함)는 관심 단백질의 N-말단 단부 내로 혼입될 수 있다. 펩티드 태그는 또한 관심 단백질의 내부에 혼입될 수 있다. 본원에 기재된 프라임 편집제에 의해 생성된 생성물 융합 단백질은 하기 구조를 가질 수 있다:
[관심 단백질] - [펩티드 태그];
[펩티드 태그] - [관심 단백질]; 또는
[관심 단백질 - N-말단 영역] - [펩티드 태그] - [관심 단백질 - C-말단 영역].
전반에 걸친 펩티드 태그부착에 사용하기 위한 가이드 RNA 설계의 원리는 펩티드 태그부착에 적용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 펩티드 태그부착을 위한 PEgRNA 구조는 하기 구조를 가질 수 있다: 5'-[스페이서 서열]-[gRNA 코어 또는 스캐폴드]-[연장 아암]-3', 여기서 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 상동성 아암, 편집 주형 (펩티드 태그를 코딩하는 서열을 포함함), 및 프라이머 결합 부위를 포함한다. 이러한 구성은 도 3d 및 도 24에 도시되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 펩티드 태그부착을 위한 PEgRNA 구조는 하기 구조를 가질 수 있다: 5'-[연장 아암]-[스페이서 서열]-[gRNA 코어 또는 스캐폴드]-3', 여기서 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 상동성 아암, 편집 주형 (펩티드 태그를 코딩하는 서열을 포함함), 및 프라이머 결합 부위를 포함한다. 이 구성은 도 3e에 도시되어 있다.
프라임 편집을 사용한 펩티드 태그부착의 실시양태는 도 25 및 26에 도시되고, 실시예 4에 기재된다.
E. 프리온 질환의 예방 또는 치료를 위한 프라임 편집의 사용
프라임 편집은 또한 프리온 질환 과정 동안 미스폴딩되는 프리온 단백질 (PRNP) 내로의 1개 이상의 보호 돌연변이의 설치를 통해 프리온 질환의 진행을 예방하거나 중지시키는데 사용될 수 있다. 프리온 질환 또는 전염성 해면상 뇌병증 (TSE)은 인간 및 동물 둘 다에 영향을 미치는 한 패밀리의 희귀 진행성 신경변성 장애이다. 이들은 긴 인큐베이션 기간, 뉴런 손실과 연관된 특징적인 해면상 변화, 및 염증 반응 유도 실패에 의해 구별된다.
인간에서, 프리온 질환은 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 치명적 가족성 불면증, 및 쿠루병을 포함한다. 동물에서, 프리온 질환은 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 "광우병"), 만성 소모성 질환 (CWD), 스크래피, 전염성 밍크 뇌병증, 고양이 해면상 뇌병증, 및 유제류 해면상 뇌병증을 포함한다. 프라임 편집은 이들 프리온 질환 중 어느 하나의 진행을 예방하거나 중지시키기 위해 프리온 단백질 내에 보호 점 돌연변이를 설치하는데 사용될 수 있다.
전형적 CJD는 인간 프리온 질환이다. 이는 특징적인 임상 및 진단 특색을 갖는 신경변성 장애이다. 이 질환은 급속 진행성이고, 항상 치명적이다. 이 질환에 의한 감염은 통상적으로 질병의 발병 1년 내에 사망으로 이어진다. CJD는 프리온 단백질로 공지되어 있는 세포 당단백질의 비정상적 이소형에 의해 유발되는 것으로 여겨지는 급속 진행성, 불변의 치명적 신경변성 장애이다. CJD는 전세계적으로 발생하며, 미국을 포함한 많은 국가에서 추정되는 연간 발생률은 인구 백만명당 약 1건의 사례인 것으로 보고되어 있다. 대다수의 CJD 환자는 통상적으로 질병의 발병 1년 내에 사망한다. CJD는 인간 및 동물에서 발생하는 다른 프리온 질환과 함께 전염성 해면상 뇌병증 (TSE)으로 분류된다. 환자의 약 85%에서, CJD는 인지가능한 전달 패턴 없이 산발성 질환으로서 발생한다. 프리온 단백질 유전자의 유전성 돌연변이로 인해, 보다 적은 비율의 환자 (5 내지 15%)에서 CJD가 발생한다. 이들 유전성 형태는 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군 및 치명적 가족성 불면증을 포함한다. CJD에 대한 치료는 현재 공지되어 있지 않다.
변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD)은 1996년에 영국에서 최초로 기재된 프리온 질환이다. 소에서 프리온 질환의 발생을 담당하는 작용제인 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 '광우'병)이 인간에서 vCJD의 발생을 담당하는 동일한 작용제라는 강력한 과학적 증거가 현재 존재한다. 변종 CJD (vCJD)는 전형적 CJD (종종 간단히 CJD로 불림)와 동일한 질환이 아니다. 이는 전형적 CJD와 상이한 임상적 및 병리학적 특징을 갖는다. 각각의 질환은 또한 프리온 단백질 유전자의 특정한 유전자 프로파일을 갖는다. 둘 다의 장애는 수년간 측정되는 비통상적으로 긴 인큐베이션 기간을 갖는 불변의 치명적인 뇌 질환이며, 프리온으로 불리는 비통상적인 전염성 작용제에 의해 유발된다. vCJD에 대한 치료는 현재 공지되어 있지 않다.
BSE (소 해면상 뇌병증 또는 "광우병")는 프리온으로 불리는 비통상적 전염성 작용제에 의한 감염으로부터 발생하는 소의 진행성 신경계 장애이다. 전염성 작용제의 성질은 잘 이해되어 있지 않다. 현재, 가장 허용되는 이론은 작용제가 프리온 단백질로 공지된 정상 단백질의 변형된 형태라는 것이다. 아직 이해되지 않는 이유로, 정상 프리온 단백질은 이후 소의 중추 신경계를 손상시키는 병원성 (유해) 형태로 변화된다. 상이한 BSE 계통: 영국에서의 발생의 원인이 된 정형의 또는 전형적 BSE 계통 및 2종의 비정형 계통 (H 및 L 계통)이 존재한다는 증거가 증가하고 있다. BSE에 대한 치료는 현재 공지되어 있지 않다.
만성 소모성 질환 (CWD)은 사슴, 엘크, 순록, 시카 사슴 및 무스에 영향을 미치는 프리온 질환이다. 이는 캐나다 및 미국을 비롯한 북미, 노르웨이 및 대한민국의 일부 지역에서 발견되었다. 감염된 동물에서 현저한 체중 감소 (소모), 비틀거림, 무기력 및 다른 신경계 증상을 포함할 수 있는 증상이 발생하기 전까지 1년 넘게 걸릴 수 있다. CWD는 모든 연령의 동물에 영향을 미칠 수 있고, 일부 감염된 동물에서는 질환이 전혀 발생하지 않고 사망할 수 있다. CWD는 동물에게 치명적이고, 치료 또는 백신은 없다.
TSE의 병원체는 프리온인 것으로 여겨진다. 용어 "프리온"은 전염성이고 뇌에서 가장 풍부하게 발견되는 프리온 단백질로 불리는 특정의 정상 세포성 단백질의 비정상적인 폴딩을 유도할 수 있는 비정상적, 병원체를 지칭한다. 이들 정상 프리온 단백질의 기능은 여전히 완전히 이해되지 않고 있다. 프리온 단백질의 비정상적인 폴딩은 뇌 손상 및 질환의 특징적인 징후 및 증상으로 이어진다. 프리온 질환은 통상적으로 급속 진행성이고, 항상 치명적이다.
본원에 사용된 용어 "프리온"은 인간 및 동물에서 질환 (해면상 뇌병증)을 유발하는 것으로 공지된 감염성 입자를 의미할 것이다. 용어 "프리온"은 단어 "단백질" 및 "감염"의 축약형이고, 입자는 주로, 독점적이지는 않지만, 입체형태를 변화시켜 PRNPSc가 되는 PRNPC를 발현하는 PRNP 유전자에 의해 코딩된 PRNPSc 분자로 구성된다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 바이로이드와 구별된다. 공지된 프리온은 동물을 감염시켜 양 및 염소의 신경계의 전염성 변성 질환인 스크래피 뿐만 아니라 소 해면상 뇌병증 (BSE) 또는 광우병 및 고양이의 고양이 해면상 뇌병증을 유발하는 것을 포함한다. 인간에게 영향을 미치는 것으로 공지된 상기 논의된 바와 같은 4종의 프리온 질환은 (1) 쿠루병, (2) 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), (3) 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커병 (GSS), 및 (4) 치명적 가족성 불면증 (FFI)이다. 본원에 사용된 바와 같은 프리온은 사용되는 임의의 동물--및 특히 인간 및 가축에서 이들 질환 또는 그 밖의 것을 모두 또는 그 중 임의의 것을 유발하는 프리온의 모든 형태를 포함한다.
일반적으로, 그리고 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 프리온 질환은 프리온 단백질의 미스폴딩에 의해 유발된다. 이러한 질환-종종 침착 질환으로 불림-프리온 단백질의 미스폴딩은 하기와 같이 설명될 수 있다. A가 단량체 또는 올리고머 상태에서 의도된 생리학적 역할을 수행하는 정상적으로 합성된 유전자 생성물이라면, A*는 현저한 입체형태적 변화를 겪기에 적격인 A의 입체형태적으로 활성화된 형태이고, B는 다량체 조립을 선호하는 입체형태적으로 변경된 상태 (즉, 침착을 형성하는 미스폴딩된 형태)이고, Bn은 병원성이고 비교적 재순환시키기 어려운 다량체 물질이다. 프리온 질환의 경우, PRNPC 및 PRNPSc는 상태 A 및 Bn에 상응하고, 여기서 A는 주로 나선형 및 단량체이고, Bn은 β-풍부 및 다량체이다.
프리온 단백질에서의 특정 돌연변이는 프리온 질환의 증가된 위험과 연관될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 반대로, 프리온 단백질에서의 특정 돌연변이는 사실상 보호성일 수 있다. 문헌 [Bagynszky et al., "Characterization of mutations in PRNP (prion) gene and their possible roles in neurodegenerative diseases," Neuropsychiatr Dis Treat., 2018; 14: 2067-2085]을 참조하며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
PRNP (NCBI RefSeq No. NP_000302.1 (서열식별번호: 291))-인간 프리온 단백질--은 염색체 20 (4686151-4701588)에 위치하는 16 kb 길이의 유전자에 의해 코딩된다. 이는 2개의 엑손을 함유하고, 엑손 2는 253개 아미노산 (AA) 길이의 PrP 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 보유한다. 엑손 1은 전사 개시 부위로서 작용할 수 있는 비코딩 엑손이다. 번역후 변형은 처음 22개의 AA N-말단 단편 (NTF) 및 마지막 23개의 AA C-말단 단편 (CTF)의 제거를 발생시킨다. NTF는 내형질 세망 (ER)으로의 PrP 수송 후에 절단되는 한편, CTF (글리코실포스파티딜이노시톨 [GPI] 신호 펩티드 [GPI-SP])는 GPI 앵커에 의해 절단된다. GPI 앵커는 PrP 단백질 수송에 수반될 수 있다. 이는 또한 프리온 단백질을 세포 막 외부 표면으로 부착시키는 역할을 할 수 있다. 정상 PrP는 긴 N-말단 루프 (옥타펩티드 반복 영역을 함유함), 2개의 짧은 β 시트, 3개의 α 나선, 및 C-말단 영역 (GPI 앵커를 함유함)으로 구성된다. PrP의 절단은 세포 막에 고정된 208 AA 길이의 당단백질을 생성한다.
PRNP (NP_000302.1)의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00146
PRNP (NP_000302.1)의 아미노산 서열은 하기와 같은, 하기 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref. Seq No. NM_000311.5, "호모 사피엔스 프리온 단백질 (PRNP), 전사체 변이체 1, mRNA)에 의해 코딩된다:
Figure pct00147
CJD 및 FFI와 연관된 PRNP (NP_000302.1)에 대한 돌연변이 부위는 하기와 같이 보고되어 있다. 이들 돌연변이는 본원에 개시된 프라임 편집제를 사용하여 제거 또는 설치될 수 있다.
Figure pct00148
Figure pct00149
GSS와 연관된 PRNP (NP_000302.1) (서열식별번호: 291)에 대한 돌연변이 부위는 하기와 같이 보고되어 있다:
Figure pct00150
Figure pct00151
프리온 질환에 대한 가능한 보호 성질과 연관된 PRNP (NP_000302.1) (서열식별번호: 291)에 대한 돌연변이 부위는 하기와 같다:
Figure pct00152
Figure pct00153
따라서, 다양한 실시양태에서, 프라임 편집은 PRNP에서 프리온 질환과 연관된 돌연변이를 제거하거나 또는 PRNP 내에 프리온 질환에 대해 보호성인 것으로 간주되는 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 프라임 편집은 PRNP 단백질 (NP_000302.1의 PRNP 대비) (서열식별번호: 291)에서 D178N, V180I, T188K, E196K, E196A, E200K, E200G, V203I, R208H, V210I, E211Q, I215V, 또는 M232R 돌연변이를 제거 또는 회복시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 프라임 편집은 PRNP 단백질 (NP_000302.1의 PRNP 대비) (서열식별번호: 291)에서 P102L, P105L, A117V, G131V, V176G, H187R, F198S, D202N, Q212P, Q217R, 또는 M232T 돌연변이를 제거 또는 회복시키기 위해 사용될 수 있다. 프라임 편집을 사용하여 PRNP에서 이러한 돌연변이의 존재를 제거 또는 교정함으로써, 프리온 질환의 위험을 감소 또는 제거할 수 있다.
다른 실시양태에서, 프라임 편집은 PRNP 내에 1종 이상의 프리온 질환에 대한 보호 효과와 연관된 보호 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 프라임 편집은 PRNP (NP_000302.1의 PRNP 대비) (서열식별번호: 291) 내에 G127S, G127V, M129V, D167G, D167N, N171S, E219K, 또는 P238S 보호 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 보호 돌연변이는 PRNP (NP_000302.1의 PRNP 대비) (서열식별번호: 291) 내의 G127, G127, M129, D167, D167, N171, E219, 또는 P238에 설치된 임의의 대안적 아미노산일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 프라임 편집은 도 27에 예시되고 실시예 5에 논의된 바와 같이, PRNP 내에 G127V 보호 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 프라임 편집은 PRNP 내에 E219K 보호 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다.
PRNP 단백질 및 보호 돌연변이 부위는 포유동물에서 보존되므로, 인간 질환을 치료하는 것에 더하여, 이는 또한 프리온 질환에 면역성인 소 및 양을 생성하는데 사용될 수 있거나, 또는 심지어 프리온 질환을 앓고 있는 동물의 야생 집단을 치유하는 것을 돕는데 사용될 수 있다. 프라임 편집은 인간 세포에서 자연 발생 보호 대립유전자의 ~25% 설치를 달성하는데 이미 사용되어 왔고, 이전 마우스 실험은 이러한 설치 수준이 대부분의 프리온 질환으로부터 면역을 유발하기에 충분하다는 것을 나타낸다. 이러한 방법은 대부분의 세포 유형에서 이러한 대립유전자를 이러한 높은 효율로 설치하기 위한 최초의, 잠재적으로 유일한 현재의 방식이다. 또 다른 가능한 치료 전략은 프라임 편집을 사용하여 유전자에 초기 정지 코돈을 설치함으로써 PRNP의 발현을 감소 또는 제거하는 것이다.
PEgRNA 설계를 위해 본원에 기재된 원리를 사용하여, 목적하는 보호 돌연변이를 설치하기 위해, 또는 PRNP로부터 프리온 질환-연관 돌연변이를 제거하기 위해 적절한 PEgRNA를 설계할 수 있다. 예를 들어, 하기 목록의 PEgRNA를 사용하여 인간 PRNP 내에 G127V 보호 대립유전자 및 E219K 보호 대립유전자, 뿐만 아니라 다양한 동물의 PRNP 내에 G127V 보호 대립유전자를 설치할 수 있다.
Figure pct00154
F. RNA 태그부착을 위한 프라임 편집의 사용
프라임 편집은 또한 RNA 태그부착을 통해 RNA 기능을 코딩하는 DNA의 서열을 조작, 변경, 및 달리 변형시키는데 사용될 수 있고, 이러한 방식으로 RNA의 구조 및 기능을 간접적으로 변형시키는 수단을 제공한다. 예를 들어, PE는 비-코딩 RNA 또는 mRNA를 태그부착하거나 또는 달리 조작하기 위해 RNA 수준에서 기능적인 모티프 (이하 RNA 모티프)를 삽입하는데 사용될 수 있다. 이들 모티프는 유전자 발현을 증가시키거나, 유전자 발현을 감소시키거나, 스플라이싱을 변경하거나, 전사후 변형을 변화시키거나, RNA의 세포하 위치에 영향을 미치거나, RNA의 단리 또는 세포내 또는 세포외 위치의 결정을 가능하게 하거나 (예를 들어, 형광 RNA 압타머, 예컨대 스피니치, 스피니치2, 베이비 스피니치, 또는 브로콜리(Broccoli)를 사용함), 내인성 또는 외인성 단백질 또는 RNA 결합제를 동원하거나, sgRNA를 도입하거나, 또는 자기-절단 또는 RNAse에 의한 RNA의 프로세싱을 유도하는 역할을 할 수 있다 (추가의 세부사항에 대해서는 도 28b 및 실시예 6 참조).
RNA 수송, 발현 수준, 스플라이싱, 및 검출을 포함한 RNA의 다양한 특성에 영향을 미치기 위해 적절한 PEgRNA (본원에 제공된 지침을 사용하여 설계됨)와 함께 프라임 편집을 사용하여 하기 RNA 태그 또는 모티프를 관심 유전자 내로 삽입할 수 있다.
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
* 각각의 PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 제시되고, 하기와 같이 글자체 유형에 의해 지정된 바와 같이 도 3f의 하기 구조적 요소를 갖는다: 5' - 스페이서 서열 (통상 글자체) - gRNA 코어 (밑줄표시된 서열) - 상동성 아암 (이탤릭체) - RT 주형 (볼드체) - 프라이머 결합 부위 (이탤릭체) - 3'.
상기 표의 PEgRNA는 상기 모티프의 예를 HEXA 유전자 (테이-삭스병에서 결함있음) (예를 들어, 진뱅크 번호 KR710351.1 (서열식별번호: 369)) 내로 부위-특이적으로 삽입하기 위해 설계되지만, 이는 단지 예시의 목적을 위한 것이다. RNA 태그부착에서의 프라임 편집의 사용은 HEXA 유전자에 제한되지 않고, 이는 실제로 임의의 것일 수 있다. HEXA mRNA는 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
Figure pct00167
Figure pct00168
상응하는 HEXA 단백질은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00169
특히, 생성된 RNA 모티프는 HEXA 유전자의 번역된 영역 내에 포함되어, 단백질 코딩 유전자의 기능을 파괴할 것이다. 삽입된 폴리아데닐화 모티프는 조기 전사체 종결을 초래할 것이다. 이 부위는 전사되어 RNA 생성물을 생성할 게놈 부위 내에 상기 표의 열거된 RNA 모티프의 삽입을 발생시킬 수 있는 잠재적 PEgRNA의 예시일 뿐이다.
RNA 태그부착을 위해 PE와 함께 사용하기 위한 PEgRNA는 U6 프로모터 (이 경우에 G로 시작하지 않는 프로토스페이서를 포함하는 가이드의 경우 PEgRNA의 5' 단부에 단일 구아노신이 부가될 것이고, 6-7 티민이 3' 단부에 부가될 것임) 또는 pol II 프로모터, 예컨대 pCMV (이 경우에 자기-절단 요소 또는 Csy4 모티프를 통해 RNA의 5' 단부로부터 이 프로모터의 내재적으로 전사된 서열을 제거하는 것이 필요할 수 있고, 핵으로부터 RNA의 유출을 발생시키지 않는 RNA의 3' 단부에 종결 모티프, 예컨대 상기 열거된 3' 박스 모티프가 부가될 필요가 있을 것임. 이 모티프는 어닐링 영역의 3'일 것이기 때문에 PE의 결과로서 게놈 내로 삽입되지 않을 것임에 주목함)로부터 발현될 수 있다. 코어 PEgRNA 스캐폴드는 밑줄표시되고, 상동성 및 어닐링 영역은 이탤릭체로 표시되고, 삽입된 서열은 볼드체로 표시된다. 삽입된 서열은 상기 예의 역 상보체이고 - 하기 기재된 바와 같이, 따라서 이들 PEgRNA는 코딩 가닥에 표적화될 필요가 있을 것임에 주목한다.
또한, HDV 외의 자기-절단 리보자임은 일부 실시양태에서 주어진 표적 부위에 맞춰질 필요가 있고; 즉, HDV는 코딩된 전사체를 그 자체에 대해 바로 5'에서 절단하는 반면, 모든 다른 자기-절단 리보자임에 대한 절단 부위는 리보자임 그 자체 내에 있음에 주목한다. 따라서, 제1 및 마지막 대략 5-10개 뉴클레오티드 (및 일부 경우에 잠재적으로 10개 초과)는 실제로 코딩된 서열의 일부일 것이다. 예로서, 서열 5'NNNNNTCATCCTGATAAACTGCAAA3' (서열식별번호: 371)을 5개의 N (여기서 N은 임의의 뉴클레오티드임) 다음에서 해머헤드 자기-절단 리보자임을 사용하여 절단하기 위해, 하기 서열이 삽입될 것이고, 여기서 밑줄표시된 서열은 불완전한 RNA 쌍형성 요소를 형성한다.
Figure pct00170
이러한 쌍형성 요소의 길이 및 성질 면에서는 유의한 유연성이 존재하고, 이는 원래의 제출에 열거된 비-HDV 자기-절단 리보자임 중 임의의 것에 대해 그러할 것이다. 상기 열거된 구축물과 동일한 프로토스페이서를 갖는 PEgRNA를 사용하여 hexA mRNA를 절단하기 위해 해머헤드 리보자임을 설치하기 위해, 하기 PEgRNA 서열을 사용할 수 있었다 (라벨은 상기와 동일함):
Figure pct00171
(여기서 코어 PEgRNA 스캐폴드는 밑줄표시되고, 상동성 및 어닐링 영역은 이탤릭체로 표시되고, 삽입된 서열은 볼드체로 표시됨) (서열식별번호: 373).
RNA 모티프의 삽입을 위한 다른 PEgRNA의 설계는 본원에 기재된 일반적 원리를 따를 수 있다. 그러나, 많은 RNA 모티프는 잠재적으로 고도로 구조화되어 있으며, 이는 이들이 역전사되고 게놈 내로 삽입되는 것을 어렵게 만들 수 있다는 것에 주목한다. 일부 RNA 서열, 예컨대 단순 헤어핀의 경우, RNA 서열 그 자체 및 그의 상보체 둘 다가 구조화되어 있다. 그러나, 이는 상기 언급된 서열에 대해서는 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 이들 모티프를 삽입할 경우, PEgRNA가 이들 서열의 역 상보체를 코딩하여 실제로 모티프를 코딩하는 DNA 서열을 게놈 내로 삽입하는 것이 가장 가능성이 높을 것이다. 유사하게, 자기-절단 리보자임을 PEgRNA 주형 영역에 포함시키는 것은 프로세싱 및 비효율적 활성이 발생시킬 것인 반면, 그의 역 상보체를 포함시키는 것은 그렇지 않을 것이다. 따라서, 이들 PEgRNA는 코딩 가닥을 표적화할 가능성이 있을 것인 반면에, 다른 유형의 삽입 (예컨대, 치료 교정)을 코딩하는 PEgRNA는 이론적으로 어느 하나의 가닥을 표적화할 수 있을 것이다.
또한, 많은 삽입된 모티프에 대해, 생성된 PEgRNA는 U6 프로모터로부터 전사될 수 없고, 다른 프로모터, 예컨대 pCMV의 사용을 필요로 할 수 있음에 주목한다. 유사하게, 보다 긴 PEgRNA는 또한 덜 안정할 수 있다. 보다 짧은 모티프, 예컨대 m6A 마커는 이러한 도전과제를 갖지 않을 것이다.
G. 정교한 유전자 라이브러리의 생성을 위한 프라임 편집의 사용
프라임 편집은 또한 규정된 또는 가변 삽입, 결실, 또는 규정된 아미노산/뉴클레오티드 전환을 갖는 단백질- 또는 RNA-코딩 유전자의 정교한 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있고, 고처리량 스크리닝 및 방향적 진화에서의 그의 사용은 본원에 기재되어 있다. 프라임 편집의 이러한 적용은 실시예 7에 추가로 기재될 수 있다.
가변 유전자 라이브러리의 생성은 돌연변이유발 PCR을 통해 가장 통상적으로 달성되었다 (문헌 [Cadwell RC and Joyce GF. PCR Methods Appl. 1992] 참조). 이 방법은 DNA 폴리머라제의 충실도를 감소시키는 반응 조건을 사용하는 것, 또는 보다 높은 돌연변이율을 갖는 변형된 DNA 폴리머라제를 사용하는 것에 의존한다. 따라서, 이들 폴리머라제에서의 편향은 라이브러리 생성물에 반영된다 (예를 들어, 전이 돌연변이 대 전환에 대한 선호도). 라이브러리 구축에 대한 이러한 접근법에 내재하는 제한은 다양화될 유전자의 크기에 영향을 미치는 상대적 무능이다. 대부분의 DNA 폴리머라제는 극도로 낮은 비율의 indel 돌연변이 (삽입 또는 결실)를 갖고, 이들 대부분은 단백질-코딩 영역에서 프레임시프트 돌연변이를 발생시켜, 라이브러리의 구성원이 임의의 하류 선택을 통과할 가능성이 없게 할 것이다 (문헌 [McInerney P, Adams P, and Hadi MZ. Mol Biol Int. 2014] 참조).
추가적으로, PCR 및 클로닝에서의 편향은 상이한 크기의 유전자로 이루어진 단일 라이브러리를 생성하는 것을 어렵게 만들 수 있다. 이들 제한은 기존의 단백질 기능을 증진시키거나 또는 신규 단백질 기능을 조작하기 위한 방향적 진화의 효능을 심각하게 제한할 수 있다. 자연 진화에서, 단백질 기능 또는 효능에서의 큰 변화는 돌연변이유발을 위한 정규 라이브러리 생성 동안 발생할 가능성이 없는 삽입 및 결실 돌연변이와 전형적으로 연관된다. 또한, 이들 돌연변이는 소수성 코어와 대조적으로 루프를 형성할 것으로 예측되는 해당 단백질의 영역에서 가장 통상적으로 발생한다. 따라서, 전통적인 비편향 접근법을 사용하여 생성된 대부분의 indel은 유해하거나 비효과적일 가능성이 있다.
이러한 돌연변이를 이들이 유익할 가능성이 가장 큰 단백질 내의 부위, 예를 들어 루프 영역으로 편향시킬 수 있는 라이브러리는, 모든 라이브러리가 단지 가능한 돌연변이 공간의 일부에만 접근한다는 것을 고려하면, 전통적인 라이브러리에 비해 유의한 이점을 가질 것이다. 마지막으로, NNK 프라이머를 사용한 다단계 PCR 및 클론 조립을 통해 또는 DNA 셔플링을 통해 부위-특이적 indel 돌연변이를 갖는 유전자 라이브러리를 생성하는 것이 가능하지만, 이들 라이브러리는 연속 진화에서 추가의 라운드의 'indel 유발'을 거칠 수 없다. 연속 진화는 최소 사용자 개입을 갖는 방향적 진화의 유형이다. 하나의 이러한 예는 PACE이다 (문헌 [Esvelt KM, Carlson JC, and Liu DR. Nature. 2011] 참조). 연속 진화는 최소 사용자 개입 하에 일어나기 때문에, 진화 동안 라이브러리 다양성에서의 임의의 증가는 천연 복제 기구를 사용하여 일어나야 한다. 따라서, 특이적 유전자좌로서 삽입 또는 제거된 코돈을 갖는 유전자의 라이브러리가 PACE에서 생성되고 스크리닝될 수 있지만, 추가의 라운드의 'indel 유발'은 가능하지 않다.
프라임 편집 (PE)의 프로그램가능성은 고처리량 스크리닝 및 방향적 진화에 사용하기 위한 고도로 정교한, 프로그램화된 유전자 라이브러리를 생성하는데 활용될 수 있는 것으로 고려된다 (도 29a 참조). PE는 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)에 코딩된 정보를 사용하여 명시된 유전자좌로부터 규정된 수의 뉴클레오티드를 삽입, 변화 또는 제거할 수 있다 (도 29b 참조). 이는 비기능적 프레임시프트 돌연변이의 배경 도입 없이, 돌연변이가 기능의 변화를 발생시킬 가능성이 가장 큰 루프 영역으로부터 1개 이상의 아미노산이 삽입 또는 제거된 표적화된 라이브러리의 생성을 가능하게 한다 (도 29c 참조). PE는 DNA 폴리머라제 또는 돌연변이되는 서열에 내재하는 편향에 관계없이 특정 세트의 돌연변이를 설치하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, CCC 코돈을 정지 코돈으로 전환시키는 것은, 이것이 2개의 전환을 포함한 3개의 연속 돌연변이를 필요로 할 것이기 때문에 정규 라이브러리 생성을 통해서는 발생할 가능성이 없을 것이지만, PE는 임의의 주어진 표적화된 코돈을 TGA 정지 코돈으로 1 단계로 전환시키는데 사용될 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어 임의의 다른 것은 코딩하지 않으면서 임의의 소수성 아미노산을 코딩하는 코돈을 주어진 부위에 혼입시킴으로써, 주어진 위치에 프로그램화된 다양성을 설치하는데 사용될 수 있다. 또한, PE의 프로그램가능성으로 인해, 다중 PEgRNA를 이용하여 다중 부위에서 다중의 상이한 편집을 동시에 생성할 수 있고, 이는 고도로 프로그램화된 라이브러리의 생성을 가능하게 한다 (도 29d 참조). 추가적으로, 달리 불변인 라이브러리 내에 돌연변이유발 영역을 생성하기 위해 보다 낮은 충실도를 갖는 리버스 트랜스크립타제 (예컨대 HIV-I 리버스 트랜스크립타제 또는 보르데텔라 파지 리버스 트랜스크립타제)를 사용하는 것이 가능하다 (문헌 [Naorem SS, Hin J, Wang S, Lee WR, Heng X, Miller JF, Guo H. Proc Natl Acad Sci 2017 및 Martinez MA, Vartanian JP, Wain-Hobson S. Proc Natl Acad Sci USA 1994] 참조).
동일한 부위 상에서의 반복 라운드의 PE의 가능성이 또한 고려되어, 예를 들어 루프 영역에서, 예를 들어 단일 부위에서의 코돈의 반복된 삽입을 가능하게 한다. 또한, 상기 기재된 접근법 모두가 연속 진화 내로 혼입되어, 신규한 계내 진화 라이브러리의 생성을 가능하게 할 수 있는 것으로 고려된다 (도 30 참조). 이들은 또한 달리 대형 라이브러리를 조립하는 것이 곤란할 다른 세포 유형 내에서, 예를 들어 포유동물 세포 내에서 이들 라이브러리를 구축하는데 사용될 수 있다. 방향적 진화를 위해 최적화된 PE-코딩 박테리아 균주의 생성은 개선된 또는 신규한 기능성을 갖는 단백질 및 RNA의 확인을 위한 유용한 추가의 도구일 것이다. PE의 모든 이들 용도는 PE의 신규한 성질로 인해 명백하지 않다. 결론적으로, PE를 통한 라이브러리 생성은 합성 생물학 및 방향적 진화에서, 뿐만 아니라 단백질 및 RNA 조합 돌연변이체의 고처리량 스크리닝을 위한 고도로 유용한 도구일 것이다.
경쟁 접근법
현재 다양한 라이브러리가 생성되는 주요 방법은 상기 기재된 돌연변이유발 PCR에 의하는 것이다 (문헌 [Cadwell RC and Joyce GF. PCR Methods Appl. 1992] 참조). 삽입 또는 결실은 PCR 동안 규정된 부위에서 축중성 NNK 프라이머를 통해 도입될 수 있지만, 다중 부위에서의 이러한 돌연변이의 도입은 다중 라운드의 반복 PCR 및 클로닝 후 돌연변이유발 PCR을 통해 보다 다양한 라이브러리를 구축하는 것을 필요로 하며, 이는 방법을 느리게 한다. 대안적인 상보적 방법은 DNA 셔플링으로, 여기서 DNase 처리를 통해 생성된 유전자의 라이브러리의 단편은 프라이머 없이 PCR 반응 내로 도입되어, 서로 상이한 단편의 어닐링 및 돌연변이유발 PCR 단독을 통하는 것보다 더 다양한 라이브러리의 신속한 생성을 유발한다 (문헌 [Meyer AJ, Ellefson JW, Ellington AD. Curr Protoc Mol Biol. 2014] 참조). 이러한 접근법은 이론적으로 indel 돌연변이를 생성할 수 있지만, 이는 보다 종종 유전자 기능을 파괴하는 프레임시프트 돌연변이를 발생시킨다. 또한, DNA 셔플링은 유전자 단편 사이의 고도의 상동성을 필요로 한다.
이들 방법 둘 다는 시험관내에서 수행되어야 하며, 생성된 라이브러리로 세포를 형질전환시키는 반면, PE에 의해 생성된 라이브러리는 계내에서 구축될 수 있으며, 이는 연속 진화에서의 그의 사용을 가능하게 한다. 라이브러리는 생체내 돌연변이유발을 통해 계내에서 구축될 수 있지만, 이들 라이브러리는 숙주 세포 기구에 의존하고, indel에 대해 편향을 나타낸다. 유사하게, 전통적인 클로닝 방법을 사용하여 부위-특이적 돌연변이 프로파일을 생성할 수 있지만, 이는 계내에서 사용될 수 없고, 일반적으로 세포를 형질전환시키기 전에 시험관내에서 한 번에 하나씩 조립된다. 원핵 및 진핵 세포 유형 둘 다에서의 PE의 효율 및 광범위한 기능성은, 모델 유기체 예컨대 이. 콜라이 내로 클로닝된 후 관심 세포 또는 유기체 내로 전달되는 것과 대조적으로, 이들 라이브러리가 관심 세포 유형에서 직접 구축될 수 있다는 것을 추가로 시사한다. 표적화된 다양화를 위한 또 다른 경쟁 접근법은 자동화 멀티플렉스 게놈 조작, 또는 MAGE로, 여기서 다중 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 복제 포크 내에 혼입되어 프로그램가능한 돌연변이를 생성할 수 있다7. 그러나, MAGE는 숙주 균주의 유의한 변형을 필요로 하고, 오프-타겟 또는 배경 돌연변이의 100배 증가로 이어질 수 있는 반면에 (문헌 [Nyerges A et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2016), PE는 보다 고도로 프로그램화되고, 보다 적은 오프-타겟 효과를 발생시킬 것으로 예상된다. 추가적으로, MAGE는 포유동물 세포를 비롯한 매우 다양한 세포 유형에서 입증되지 않았다.
대조적으로, 프라임 편집은 라이브러리 생성을 위한 신규하고 비-자명한 상보적 기술이다.
유전자 라이브러리를 구축하기 위한 PE의 사용
PE는 프로그램가능한 방식으로 유전자 라이브러리를 구축하는데 사용될 수 있다.
한 예에서, PE를 방향적 진화 실험에 사용하여 PACE를 사용한 연속 진화 실험 동안 단백질 변이체를 유전자 라이브러리 내로 도입할 수 있으며, 이는 전통적인 접근법을 통해서는 가능하지 않은 방식으로 점 돌연변이 및 indel 둘 다의 반복 축적을 허용한다.
PE가 이. 콜라이의 유전자 서열 내로 뉴클레오티드를 부위-특이적으로 및 프로그램가능하게 삽입할 수 있다는 것은 이미 밝혀졌다. 방향적 진화를 사용하여, 변형된 2-하이브리드 단백질:단백질 결합 PACE 선택을 통해 특이적 에피토프에 대한 결합이 개선된 모노바디를 확인할 수 있다. 이들 모노바디 내의 특이적이고 고도로 가변적인 루프는 친화도 및 특이성에 유의하게 기여한다. 개선된 모노바디 결합은 표적화된 방식으로 이들 루프의 길이 및 조성을 변화시킴으로써 PACE에서 신속하게 수득될 수 있다. 그러나, 다양한 서열 길이는 PACE의 확립된 기능이 아니다. 다양화된 루프 크기의 라이브러리가 PACE를 위한 출발점으로서 사용될 수 있지만, PACE 선택 전반에 걸쳐 길이에 대한 어떠한 후속 개선도 발생하지 않을 것이어서, 점 돌연변이 및 indel 돌연변이의 유익한 상승작용적 조합에 대한 접근이 차단된다.
다양한 실시양태에서, PE는 다양한 루프 길이를 갖는 모노바디의 계내 생성 및 진화를 가능하게 함으로써 PACE 선택을 개선시키는데 사용될 수 있다. 이를 위해, PE 효소 및 1개 이상의 PEgRNA를 코딩하는 추가의 PE 플라스미드에 PACE 이. 콜라이 균주를 도입할 수 있다. 이. 콜라이에서의 PE 효소 및 PEgRNA의 발현은 실험자에 의해 선택된 속도로 PACE 라군에게 전달되는 소분자의 제어 하에 있을 것이다.
다양한 실시양태에서, PEgRNA 성분은 PE를 선택 파지 상의 관심 부위로 지시하는 스페이서를 함유할 것이고, 새로운 PEgRNA 결합 부위가 도입되어 표적화된 부위에서 1개 이상의 코돈의 반복적인 삽입을 가능하게 하도록 다중의 3개의 뉴클레오티드가 표적 부위에 삽입될 수 있도록 설계될 것이다.
병행하여, 또 다른 숙주 이. 콜라이 균주는 1개 이상의 코돈의 제거를 주형화하여 진화 동안 루프 크기를 축소시킬 수 있는 PEgRNA를 포함할 수 있다. PACE 실험은 루프 서열의 느리고 제어된 부가 또는 제거를 허용하기 위해 둘 다의 균주의 혼합물을 이용하거나 또는 둘을 교대할 수 있다.
모노바디 라이브러리를 생성하기 위한 PE 및 PACE의 사용에 더하여, 이러한 기술은 또한 PE 및 PACE를 사용한 항체의 진화에 적용될 수 있다. 항체를 지배하는 결합 원리는 모노바디를 지배하는 것과 매우 유사하다: 항체 보체-결정 영역 루프의 길이는 그의 결합 기능에 중요하다. 추가로, 보다 긴 루프 길이는 HIV-1 및 다른 바이러스 감염에 대한 광범위한 보호 활성을 갖는 희귀 항체의 개발에 중요한 것으로 확인되었다 (문헌 [Mascola JR, Haynes BF. Immunol Rev. 2013] 참조). 항체 또는 항체-유래 분자에 대한 상기 기재된 바와 같은 PE의 적용은 다양한 루프 길이 및 다양화된 루프 서열을 갖는 항체의 생성을 허용할 것이다. PACE와 조합하여, 이러한 접근법은 표준 PACE에 접근가능하지 않은 루프 기하구조를 통해 증진된 결합을 허용할 것이고, 따라서 고도로 기능적인 항체의 진화를 허용할 것이다.
비제한적 예로서, 하기 PEgRNA를 사용하여 연속 진화 실험에 사용되는 박테리오파지의 게놈을 프로그램가능하게 변형시킬 수 있다:
Figure pct00172
다양한 실시양태에서, 유전자 라이브러리를 구축하기 위한 PE의 사용은 오류-유발 리버스 트랜스크립타제의 돌연변이유발 활성을 사용할 수 있다. 이러한 돌연변이유발 리버스 트랜스크립타제의 사용은 오류-유발 RT의 보다 낮은 충실도로 인해 돌연변이유발된 프로그램가능한 라이브러리의 생성을 용이하게 할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "오류-유발" 리버스 트랜스크립타제는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 오류율보다 적은 오류율을 갖는 또 다른 리버스 트랜스크립타제 (예를 들어, 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제)로부터 유래된 리버스 트랜스크립타제 효소를 지칭한다. 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 오류율은 15,000 내지 27,000개 핵염기 혼입에서 1개의 오류 범위인 것으로 보고되어 있다. 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Boutabout et al., (2001) "DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1," Nucleic Acids Res 29(11):2217-2222]을 참조한다.
따라서, 본 출원의 목적상, 용어 "오류 유발"은 15,000개 핵염기 혼입에서 1개 초과의 오류 (6.7 x 10-5 이상), 예를 들어 14,000개 핵염기에서 1개의 오류 (7.14 x 10-5 이상), 13,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (7.7 x 10-5 이상), 12,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (7.7 x 10-5 이상), 11,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (9.1 x 10-5 이상), 10,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (1 x 10-4 또는 0.0001 이상), 9,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00011 이상), 8,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00013 이상), 7,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00014 이상), 6,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00016 이상), 5,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.0002 이상), 4,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00025 이상), 3,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00033 이상), 2,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00050 이상), 또는 1,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.001 이상), 또는 500개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.002 이상), 또는 250개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.004 이상)인 오류율을 갖는 RT를 지칭한다.
다양한 돌연변이유발 RT가 고도로 돌연변이유발된 프로그램가능한 라이브러리의 생성을 위해 고려될 수 있다. 2가지의 이러한 예는 보르데텔라(Bordetella) 파지 (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Handa, S., et al., Nucl Acids Res 9711-25 (2018)] 참조) 및 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Arambula, D., et al., Proc Natl Acad Sci USA 8212-7 (2013)] 참조)로부터의 돌연변이유발 리버스 트랜스크립타제이다. 보르데텔라 파지로부터의 RT (brt)의 경우에, 표적 부위에 대한 돌연변이유발 RT의 결합을 개선시키기 위해 또한 보조 단백질이 (bavd) Cas9에, 뿐만 아니라 추가의 RNA 서열이 PEgRNA에 부가될 - 또는 트랜스로 전달될 - 필요가 있을 수 있을 수 있다 (문헌 [Handa, S., et al., Nucl Acids Res 9711-25 (2018)] 참조). 돌연변이유발 RT를 사용하는 경우에, PEgRNA의 주형 영역은 다양성을 증진시키기 위해 아데노신 또는 AAY 코돈이 풍부화될 수 있다.
보르데텔라 파지로부터의 돌연변이유발 RT의 아미노산 서열은 하기와 같이 제공된다. 본원에 개시된 다른 RT와 같이, Brt 단백질은 융합 단백질로서 napDNAbp에 융합되어 기능적 PE를 형성할 수 있다.
Figure pct00173
보르데텔라로부터의 Brt의 경우에, PE 융합체는 또한 추가의 보조 단백질 (Bavd)을 포함할 수 있다. 보조 단백질은 PE 융합 단백질에 융합되거나 또는 트랜스로 제공될 수 있다. Bavd 보조 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같이 제공된다:
Figure pct00174
보르데텔라로부터의 Brt의 경우에, PEgRNA는 PEgRNA에, 예를 들어 5' 또는 3' 단부에 부가된 추가의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 서열은 하기와 같으며, 이는 원래 보르데텔라 파지 게놈으로부터의 것이다:
Figure pct00175
이러한 PEgRNA 부가 서열은 다양한 방식으로 감소시켜 길이를 단축시킬 수 있다. 예를 들어, PEgRNA-부가 1 서열은 하기 예시적인 대안적 부가 서열로 감소될 수 있다:
Figure pct00176
다른 실시양태에서, PEgRNA 부가 서열은 또한 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, PEgRNA-부가 1 서열은 하기 예시적인 대안적 부가 서열로 돌연변이될 수 있다:
Figure pct00177
유전자 라이브러리를 설계하기 위한 PE의 사용에 관한 다양한 실시양태에서, 특별한 PEgRNA 고려사항이 적용될 수 있다. 예를 들어, 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 돌연변이유발 RT를 통한 효율적인 돌연변이유발을 가능하게 하기 위해 상기 기재된 추가의 PEgRNA 서열이 필요할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, PE를 사용한 반복적 코돈 삽입은 특이적 PEgRNA 설계를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, GGG (글리신) 코돈을 반복적으로 삽입하기 위해, PEgRNA의 전체 상동성 영역은 상기 제시된 바와 같이 G로 구성될 필요가 있을 수 있다. 이는 특정 부위만 반복적인 삽입이 가능할 수 있음을 의미할 것이다. 추가적으로, PAM 서열은 PE에 의해 파괴될 수 없을 것이다.
H. 이뮤노에피토프의 삽입을 위한 프라임 편집의 사용
프라임 편집제는 또한 공지된 면역원성 에피토프를 내인성 또는 외래 게놈 DNA에 삽입하여, 치료 또는 생명공학적 적용을 위한 상응하는 단백질의 변형을 발생시키는 수단으로서 사용될 수 있다 (도 31 및 32 참조). 프라임 편집의 발명 전에, 이러한 삽입은 단지 비효율적으로, DSB로부터의 높은 비율의 indel 형성으로 달성될 수 있다. 프라임 편집은 일반적으로 HDR보다 더 높은 효율을 제공하면서 삽입 편집으로부터의 높은 indel 형성의 문제를 해결한다. 이러한 보다 낮은 비율의 indel 형성은, 특히 면역원성 에피토프를 삽입하는 기재된 적용에서 표적화된 DNA 삽입을 위한 방법으로서 HDR에 비해 프라임 편집의 주요 이점을 제공한다. 에피토프의 길이는 수개의 염기 내지 수백개의 염기의 범위이다. 프라임 편집제는 포유동물 세포에서 이러한 표적화된 삽입을 달성하기 위한 효율적인 접근법이다.
본 발명의 주요 개념은 이전에 기재된 면역원성 에피토프를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 내인성 또는 외래 게놈 DNA 내에 그의 단백질 생성물 및/또는 발현 세포 유형의 하향조절 및/또는 파괴를 위해 삽입하기 위한 프라임 편집제의 사용이다. 면역원성 에피토프 삽입을 위한 뉴클레오티드 서열은 표적화된 유전자의 코딩된 단백질 및 삽입된 면역원성 에피토프의 상응하는 단백질 번역의 융합 단백질을 생산하는 방식으로 유전자에 표적화될 것이다. 환자의 면역계는 예를 들어 파상풍 또는 디프테리아 또는 홍역에 대한 상용 백신접종으로부터의 표준 사전 면역화의 결과로서 이들 에피토프를 인식하도록 이전에 훈련되었을 것이다. 융합된 에피토프의 면역원성 성질의 결과로서, 환자의 면역계는 프라임 편집된 단백질 (삽입된 에피토프만이 아님) 및 잠재적으로 그것이 발현되는 세포를 인식하고 이를 무력화할 것으로 예상될 것이다.
CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 정확한 게놈 표적화 기술은 최근, 조작된 DNA 서열의 표적화된 게놈 유전자좌 내로의 삽입을 포함한 광범위한 적용에서 연구되었다. 이전에는 상동성-지정 복구 (HDR)가 이러한 적용에 사용되어 왔으며, 이는 ssDNA 공여자 주형 및 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB)에 의한 복구 개시를 필요로 하였다. 이러한 전략은 세포에서 이루어지는 가장 넓은 범위의 가능한 변화를 제공하고, 대형 DNA 서열을 포유동물 세포 내로 삽입하는데 이용가능한 유일한 방법이다. 그러나, HDR은 그의 개시 DSB로부터 초래되는 바람직하지 않은 세포 부작용, 예컨대 높은 수준의 indel 형성, DNA 전위, 대형 결실, 및 P53 활성화에 의해 방해받는다. 이들 결점에 더하여, HDR은 많은 세포 유형에서의 낮은 효율에 의해 제한된다 (T 세포는 이러한 관찰에 대한 주목할 만한 예외임). 이들 단점을 극복하기 위한 최근의 노력은 인간 Rad51 돌연변이체를 Cas9 D10A 닉카제에 융합시켜 (RDN), 개선된 HDR 생성물:indel 비 및 보다 낮은 오프 타겟 편집을 특색으로 하는 DSB-부재 HDR 시스템을 생성하는 것을 포함하지만, 이는 여전히 세포-유형 의존성 및 단지 보통의 HDR 편집 효율에 의해 방해받는다.
PEgRNA와 커플링된 리버스 트랜스크립타제에 대한 Cas9의 최근에 개발된 융합체 ("프라임 편집제")는 부위-특이적 방식으로 임의의 단일 뉴클레오티드 치환을 설치하고 임의의 짧은 스트레치의 뉴클레오티드 (최대 적어도 수십개의 염기)를 삽입 또는 결실시키는 능력을 포함하여, 기존의 게놈 편집 방법에 비해 다수의 이점을 제공하는 신규한 게놈 편집 기술을 나타낸다. 특히, PE 편집은 일반적으로 낮은 비율의 비의도된 indel로 달성된다. 따라서, PE는 이전에 불가능하였거나 비실용적이었던 표적화된 삽입-기반 편집 적용을 가능하게 한다.
이러한 특정한 측면은 공지된 면역원성 에피토프를 내인성 또는 외래 게놈 DNA에 삽입하여, 치료 또는 생명공학적 적용을 위한 상응하는 단백질의 변형을 발생시키는 수단으로서 프라임 편집을 사용하는 방법을 기재한다 (도 31 및 32 참조). 프라임 편집의 발명 전에, 이러한 삽입은 단지 비효율적으로, DSB로부터의 높은 비율의 indel 형성으로 달성될 수 있다. 프라임 편집은 일반적으로 HDR보다 더 높은 효율을 제공하면서 삽입 편집으로부터의 높은 indel 형성의 문제를 해결한다. 이러한 보다 낮은 비율의 indel 형성은, 특히 면역원성 에피토프를 삽입하는 기재된 적용에서 표적화된 DNA 삽입을 위한 방법으로서 HDR에 비해 프라임 편집의 주요 이점을 제공한다. 에피토프의 길이는 수개의 염기 내지 수백개의 염기의 범위이다. 프라임 편집제는 포유동물 세포에서 이러한 표적화된 삽입을 달성하기 위한 가장 효율적이고 가장 흠없는 기술이다.
이러한 측면의 주요 개념은 이전에 기재된 면역원성 에피토프를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 내인성 또는 외래 게놈 DNA 내에 그의 단백질 생성물 및/또는 발현 세포 유형의 하향조절 및/또는 파괴를 위해 삽입하기 위한 프라임 편집제의 사용이다. 면역원성 에피토프 삽입을 위한 뉴클레오티드 서열은 표적화된 유전자의 코딩된 단백질 및 삽입된 면역원성 에피토프의 상응하는 단백질 번역의 융합 단백질을 생산하는 방식으로 유전자에 표적화될 것이다. 환자의 면역계는 예를 들어 파상풍 또는 디프테리아 또는 홍역에 대한 상용 백신접종으로부터의 표준 사전 면역화의 결과로서 이들 에피토프를 인식하도록 이전에 훈련되었을 것이다. 융합된 에피토프의 면역원성 성질의 결과로서, 환자의 면역계는 프라임 편집된 단백질 (삽입된 에피토프만이 아님) 및 잠재적으로 그것이 발현되는 세포를 인식하고 이를 무력화할 것으로 예상될 것이다.
표적화된 유전자에 대한 융합은 삽입된 에피토프 단백질 번역이 면역계 인식을 위해 노출되는 것을 보장하기 위해 필요에 따라 조작될 것이다. 이는 표적화된 유전자에 대한 면역원성 에피토프의 C-말단 융합체, 표적화된 유전자에 대한 면역원성 에피토프의 N-말단 융합체, 또는 면역원성 에피토프가 단백질 구조의 표면-노출 영역 내에 코딩되도록 하는 유전자 내로의 뉴클레오티드의 삽입을 생성하는 단백질 번역을 발생시키는 표적화된 뉴클레오티드 삽입을 포함할 수 있다.
표적 유전자 서열과 삽입된 면역원성 에피토프 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입된 뉴클레오티드로서 코딩된 단백질 링커는 표적화된 유전자의 면역계 인식, 세포 트래픽킹, 단백질 기능, 또는 단백질 폴딩을 용이하게 하기 위해 본 발명의 일부로서 조작될 필요가 있을 수 있다. 이들 삽입된 뉴클레오티드-코딩된 단백질 링커는 XTEN 링커의 가변 길이 및 서열 또는 글리신-세린 링커의 가변 길이 및 서열을 포함할 수 있다 (그러나 이에 제한되지는 않음). 이들 조작된 링커는 단백질 융합을 성공적으로 용이하게 하기 위해 이전에 사용되었다. 예시적인 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)n (서열식별번호: 165), (G)n (서열식별번호: 166), (EAAAK)n (서열식별번호: 167), (GGS)n (서열식별번호: 168), (SGGS)n (서열식별번호: 169), (XP)n (서열식별번호: 170), 또는 그의 임의의 조합을 포함한, 본원에 기재된 것 중 임의의 것을 포함할 수 있고, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)n (서열식별번호: 176)을 포함하고, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 171)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 172)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSGGSGGS (서열식별번호: 173)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS (서열식별번호: 174)를 포함한다.
이러한 측면의 구별되는 특색은 특정 아미노산 서열에 대해 이전에 획득된 면역 반응을 달리 비-면역원성 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 수단으로서 사용하는 능력을 포함한다. 또 다른 구별되는 특색은 부산물 편집으로서 원치 않는 indel을 높은 수준으로 유도하지 않고 그의 삽입에 있어서 효율적인 방식으로 이들 면역원성 에피토프의 뉴클레오티드 서열을 표적에 삽입하는 능력이다. 이러한 PE의 특정한 적용은 세포 유형-특이적 전달 방법 (예컨대 AAV 혈청형)을 조합하여 관심 세포 유형 내에 에피토프를 삽입하여 그에 대한 면역 반응을 촉발하는 능력을 갖는다.
면역원성 에피토프를 병원성 유전자 내로 삽입하는 수단으로서의 프라임 편집은 환자의 면역계가 매우 다양한 질환 (면역-종양학 전략에 의하는 것과 같이 암으로 제한되지는 않음)과 싸우도록 프로그램화하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술의 즉각적인 관련 사용은 관련 종양유전자 예컨대 HER2 또는 성장 인자 예컨대 EGFR에 대한 면역 반응을 유발함으로써 종양의 면역 회피 메카니즘을 손상시킬 수 있기 때문에, 암 치료제로서의 사용일 것이다. 이러한 접근법은 T-세포 조작과 유사한 것으로 보일 수 있지만, 이러한 접근법의 한가지 신규 진전은 이것이 조작된 T-세포를 생성하여 환자 내로 도입할 필요 없이 많은 세포 유형에서, 그리고 암 이외의 질환에 대해 사용될 수 있다는 것이다.
PE를 사용하여 대부분의 사람들이 이미 백신접종된 면역원성 에피토프 (파상풍, 백일해, 디프테리아, 홍역, 볼거리, 풍진 등)를 질환을 구동하는 외래 또는 내인성 유전자 내로 삽입하여, 환자의 면역계가 그러한 단백질을 무력화하도록 학습시킨다.
상기 언급된 전략으로부터 잠재적 치료 이익을 갖는 것으로 여겨지는 질환은, 예컨대 치명적 가족성 불면증에서 독성 단백질의 응집에 의해 유발되는 것을 포함한다. 유익할 수 있는 다른 질환은 달리 비독성인 내인성 단백질의 병원성 과다발현에 의해 유발되는 것, 및 외래 병원체에 의해 유발되는 것을 포함한다.
1차 치료 적응증은 상기 언급된 것, 예컨대 암, 프리온 및 다른 신경변성 질환, 감염성 질환을 위한 치료, 및 예방적 의학을 포함한다. 2차 치료 적응증은 후기-발병 유전 질환을 갖는 환자에 대한 예방적 관리를 포함할 수 있다. 현행 표준 관리 의학은 일부 질환, 예컨대 특히 공격성 암에 대해, 또는 의약이 질환 증상의 완화를 돕는 경우에 질환이 완전히 치유될 때까지 프라임 편집과 함께 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 하기는 본원에 개시된 프라임 편집제에 의해 유전자 내로 삽입될 수 있는 이뮤노에피토프의 예이다:
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관련 기술분야에 공지된 추가의 이뮤노에피토프가 또한 설치될 수 있다. 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 자원 (iedb.org/epitopedetails_v3.php) (그의 내용은 본원에 참조로 포함됨)으로부터 입수가능한 이뮤노에피토프 중 임의의 것은 본원에 개시된 프라임 편집제에 의해 설치될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제에 의해 설치될 수 있는 이뮤노에피토프는 하기 에피토프 중 임의의 것을 포함할 수 있다:
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I. 프라임 편집제의 전달
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 개별 벡터 상에서의 분할 인테인의 사용 및 뿐만 아니라 전기천공, 양이온성 지질-매개 제제의 사용, 및 리보뉴클레오단백질 복합체에 융합된 수용체 리간드를 사용한 유도된 세포내이입 방법과 같은 기술을 사용한 리보핵단백질 복합체 (즉, PEgRNA 및/또는 제2-부위 gRNA에 복합체화된 프라임 편집제)의 직접 전달 전략을 포함한 다양한 전략을 사용한, 프라임 편집제의 시험관내 및 생체내 전달을 제공한다. 임의의 이러한 방법이 본원에서 고려된다.
전달 옵션의 개관
일부 측면에서, 본 발명은 1개 이상의 프라임 편집제-코딩 폴리뉴클레오티드, 예컨대 또는 본원에 기재된 프라임 편집 시스템의 1개 이상의 성분을 코딩하는 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 벡터, 그의 1개 이상의 전사체, 및/또는 그로부터 전사된 1개 이상의 단백질을 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 또는 그로부터 생산된 유기체 (예컨대 동물, 식물, 또는 진균)를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열과 조합된 (및 임의로 그와 복합체화된) 본원에 기재된 바와 같은 프라임 편집제가 세포에 전달된다. 통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법이 핵산을 포유동물 세포 또는 표적 조직에 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 프라임 편집제의 성분을 코딩하는 핵산을 배양물 또는 숙주 유기체 내의 세포에 투여하는데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA (예를 들어, 본원에 기재된 벡터의 전사체), 네이키드 핵산, 및 전달 비히클, 예컨대 리포솜과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포로 전달된 후에 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는다. 유전자 요법 절차의 검토를 위해, 문헌 [Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bihm (eds) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참조한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증진된 흡수를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)™ 및 리포펙틴(Lipofectin)™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 파이너(Feigner), WO 91/17424; WO91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
표적화된 리포솜, 예컨대 면역지질 복합체를 포함한 지질:핵산 복합체의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참조).
핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체 내의 특이적 세포에 표적화하고 바이러스 페이로드를 핵으로 트래픽킹하기 위한 고도로 진화된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나 (생체내), 또는 시험관내에서 세포를 처리하는데 사용될 수 있고, 변형된 세포는 임의로 환자에게 투여될 수 있다 (생체외). 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 숙주 게놈에서의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법에 의해 가능하며, 이는 종종 삽입된 트랜스진의 장기간 발현을 발생시킨다. 추가적으로, 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다.
바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 혼입하여 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킴으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입 또는 감염시킬 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생산할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서, 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 좌우될 것이다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대한 패키징 능력을 갖는 시스-작용성 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스-작용성 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이는 이어서 치료 유전자를 표적 세포 내로 통합시켜 영구적 트랜스진 발현을 제공하는데 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스 (GaLV), 원숭이 면역 결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 및 그의 조합을 기반으로 하는 것을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)]; PCT/US94/05700 참조). 일시적 발현이 바람직한 적용에서는, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 가질 수 있고, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터에 의해, 높은 역가 및 발현 수준이 수득되었다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 아데노-연관 바이러스 ("AAV") 벡터는 또한, 예를 들어 핵산 및 펩티드의 시험관내 생산에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 요법 절차를 위해, 세포를 표적 핵산으로 형질도입하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [West et al., Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 번호 4,797,368; WO 93/24641; [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)] 참조). 재조합 AAV 벡터의 구축은 미국 특허 번호 5,173,414; 문헌 [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)]을 포함한 다수의 간행물에 기재되어 있다.
패키징 세포는 전형적으로 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 통상적으로, 핵산 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 세포주를 생산함으로써 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 내로의 후속 통합에 요구되는 최소 바이러스 서열을 함유하고, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오티드(들)에 대한 발현 카세트에 의해 대체된다. 누락된 바이러스 기능은 전형적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 숙주 게놈 내로의 패키징 및 통합에 요구되는 AAV 게놈으로부터의 ITR 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap를 코딩하지만 ITR 서열은 결여되어 있는 헬퍼 플라스미드를 함유하는 세포주 내에 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 벡터의 복제 및 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 유의한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 감수성인 열 처리에 의해 감소될 수 있다. 핵산을 세포에 전달하기 위한 추가의 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 US20030087817을 참조한다.
다양한 실시양태에서, PE 구축물 (분할-구축물 포함)은 1개 이상의 rAAV 벡터에서의 전달을 위해 조작될 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것과 관련된 rAAV는 임의의 유도체 또는 유사형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 2/1, 2/5, 2/8, 2/9, 3/1, 3/5, 3/8, 또는 3/9)을 포함한 임의의 혈청형의 것일 수 있다. rAAV는 세포에 전달될 유전자 로드 (즉, 관심 유전자, 예컨대 rAAV에 의해 세포 내로 운반되는 전체 또는 분할 PE 융합 단백질을 발현하는 재조합 핵산 벡터)를 포함할 수 있다. rAAV는 키메라일 수 있다.
본원에 사용된 rAAV의 혈청형은 재조합 바이러스의 캡시드 단백질의 혈청형을 지칭한다. 유도체 및 유사형의 비제한적 예는 rAAV2/1, rAAV2/5, rAAV2/8, rAAV2/9, AAV2-AAV3 하이브리드, AAVrh.10, AAVhu.14, AAV3a/3b, AAVrh32.33, AAV-HSC15, AAV-HSC17, AAVhu.37, AAVrh.8, CHt-P6, AAV2.5, AAV6.2, AAV2i8, AAV-HSC15/17, AAVM41, AAV9.45, AAV6(Y445F/Y731F), AAV2.5T, AAV-HAE1/2, AAV 클론 32/83, AAVShH10, AAV2 (Y->F), AAV8 (Y733F), AAV2.15, AAV2.4, AAVM41, 및 AAVr3.45를 포함한다. 키메라 VP1 단백질을 갖는 유도체 및 유사형의 비제한적 예는 rAAV2/5-1VP1u로, 이는 AAV2의 게놈, AAV5의 캡시드 백본 및 AAV1의 VP1u를 갖는다. 키메라 VP1 단백질을 갖는 유도체 및 유사형의 다른 비제한적 예는 rAAV2/5-8VP1u, rAAV2/9-1VP1u, 및 rAAV2/9-8VP1u이다.
AAV 유도체/유사형, 및 이러한 유도체/유사형을 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.] 참조). 유사형화 rAAV 벡터를 생산하고 사용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002; 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001] 참조).
rAAV 입자를 제조하거나 패키징 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 시약은 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 문헌 [Zolotukhin et al., Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167]; 및 미국 특허 공개 번호 US20070015238 및 US20120322861 참조, 이는 본원에 참조로 포함됨; 및 플라스미드 및 키트는 ATCC 및 셀 바이오랩스, 인크.(Cell Biolabs, Inc.)로부터 입수가능함). 예를 들어, 관심 유전자를 포함하는 플라스미드는, 예를 들어 rep 유전자 (예를 들어, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 코딩함) 및 cap 유전자 (VP1, VP2, 및 VP3을 코딩함, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 VP2 영역을 포함함)를 함유하는 1개 이상의 헬퍼 플라스미드와 조합될 수 있고, rAAV 입자가 패키징되고 후속적으로 정제될 수 있도록 재조합 세포 내로 형질감염될 수 있다.
재조합 AAV는 (a) 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 관심 RNA (예를 들어, siRNA 또는 마이크로RNA)를 포함하는 1개 이상의 이종 핵산 영역, 및 (b) 1개 이상의 핵산 영역 (예를 들어, 이종 핵산 영역)에 플랭킹된 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열 (예를 들어, 야생형 ITR 서열 또는 조작된 ITR 서열)을 포함하는 1개 이상의 영역을 최소한으로 포함할 수 있는 핵산 벡터를 포함할 수 있다. 본원에서, 관심 단백질을 코딩하는 서열 또는 관심 RNA를 포함하는 이종 핵산 영역은 관심 유전자로 지칭된다.
본원에 제공된 rAAV 입자 중 어느 하나는 VP1u 영역 외부에 상이한 혈청형의 아미노산을 갖는 캡시드 단백질을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, VP1 단백질의 백본의 혈청형은 ITR 및/또는 Rep 유전자의 혈청형과 상이하다. 일부 실시양태에서, 입자의 VP1 캡시드 단백질의 백본의 혈청형은 ITR의 혈청형과 동일하다. 일부 실시양태에서, 입자의 VP1 캡시드 단백질의 백본의 혈청형은 Rep 유전자의 혈청형과 동일하다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자의 캡시드 단백질은 개선된 형질도입 효율을 발생시키는 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 핵산 (예를 들어, 이종 핵산)의 발현을 용이하게 하는 서열, 예를 들어 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 1개 이상의 영역을 포함한다. 수많은 이러한 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 발현 제어 서열의 비제한적 예는 프로모터, 인슐레이터, 사일렌서, 반응 요소, 인트론, 인핸서, 개시 부위, 종결 신호, 및 폴리(A) 테일을 포함한다. 이러한 제어 서열의 임의의 조합이 본원에서 고려된다 (예를 들어, 프로모터 및 인핸서).
최종 AAV 구축물은 PEgRNA를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, AAV 구축물은 제2-부위 닉킹 가이드 RNA를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, AAV 구축물은 제2-부위 닉킹 가이드 RNA를 코딩하는 서열 및 PEgRNA를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, PEgRNA 및 제2-부위 닉킹 가이드 RNA는 적절한 프로모터, 예컨대 인간 U6 (hU6) 프로모터, 마우스 U6 (mU6) 프로모터, 또는 다른 적절한 프로모터로부터 발현될 수 있다. PEgRNA 및 제2-부위 닉킹 가이드 RNA는 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 구축물 또는 본원의 조성물은 대상체에게 경장으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 구축물 또는 본원의 조성물은 대상체에게 비경구로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자 또는 본원의 조성물은 대상체에게 피하로, 안구내로, 유리체내로, 망막하로, 정맥내로 (IV), 뇌실내로, 근육내로, 척수강내로 (IT), 수조내로, 복강내로, 흡입을 통해, 국소로, 또는 1개 이상의 세포, 조직, 또는 기관으로의 직접 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자 또는 본원의 조성물은 간 동맥 또는 문맥 내로의 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
분할 PE 벡터-기반 전략
이러한 측면에서, 프라임 편집제는 분할 부위에서 나뉘어질 수 있고, 전체/완전 프라임 편집제의 2개의 절반으로서 제공될 수 있다. 2개의 절반은 세포에 (예를 들어, 발현된 단백질로서 또는 개별 발현 벡터 상에서) 전달될 수 있고, 일단 세포 내부에서 접촉하면, 2개의 절반은 각각의 프라임 편집제 절반 상의 인테인의 자기-스플라이싱 작용을 통해 완전한 프라임 편집제를 형성한다. 분할 인테인 서열은 코딩된 프라임 편집제의 각각의 절반 내로 조작되어 세포 내부에서의 그의 트랜스스플라이싱 및 완전한, 기능성 PE의 동반 복구를 용이하게 할 수 있다.
이들 분할 인테인-기반 방법은 생체내 전달에 대한 여러 장벽을 극복한다. 예를 들어, 프라임 편집제를 코딩하는 DNA는 rAAV 패키징 제한보다 더 크고, 따라서 특별한 해결책을 필요로 한다. 하나의 이러한 해결책은 세포에 공동-전달되는 경우에 기능적 편집제 단백질을 재구성하는 2개의 개별 rAAV 입자 내로 패키징된 분할 인테인 쌍에 융합된 편집제를 제제화하는 것이다. 제2-부위 닉킹 표적의 최적화 및 렌티바이러스 및 rAAV를 포함한 바이러스 벡터 내로의 프라임 편집제의 적절한 패키징을 포함한, 프라임 편집의 고유한 특색을 설명하기 위한 여러 다른 특별한 고려사항이 기재된다.
이러한 측면에서, 프라임 편집제는 분할 부위에서 나뉘어질 수 있고, 전체/완전 프라임 편집제의 2개의 절반으로서 제공될 수 있다. 2개의 절반은 세포에 (예를 들어, 발현된 단백질로서 또는 개별 발현 벡터 상에서) 전달될 수 있고, 일단 세포 내부에서 접촉하면, 2개의 절반은 각각의 프라임 편집제 절반 상의 인테인의 자기-스플라이싱 작용을 통해 완전한 프라임 편집제를 형성한다. 분할 인테인 서열은 코딩된 프라임 편집제의 각각의 절반 내로 조작되어 세포 내부에서의 그의 트랜스스플라이싱 및 완전한, 기능성 PE의 동반 복구를 용이하게 할 수 있다.
도 66은 각각의 프라임 편집제 절반 단백질의 단부 또는 시작부에 위치한 분할-인테인 절반의 자기-스플라이싱 작용을 통해 전체 프라임 편집제로서 재생되는, 2개의 PE 절반 단백질로서 제공된 프라임 편집제의 한 실시양태를 도시한다. 본원에 사용된 용어 "PE N-말단 절반"은 완전 프라임 편집제의 N-말단 절반을 지칭하고, 이는 완전 프라임 편집제의 PE N-말단 절반 (즉, N-말단 엑스테인)의 C-말단 단부에 "N 인테인"을 포함한다. "N 인테인"은 완전한, 전체-형성된 분할-인테인 모이어티의 N-말단 절반을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "PE C-말단 절반"은 완전 프라임 편집제의 C-말단 절반을 지칭하고, 이는 완전 프라임 편집제의 C-말단 절반 (즉, C-말단 엑스테인)의 N-말단 단부에 "C 인테인"을 포함한다. 2개의 절반 단백질, 즉 PE N-말단 절반 및 PE C-말단 절반이, 예를 들어 세포 내에서 서로 접촉하게 되는 경우에, N 인테인 및 C 인테인은 자기-절제 및 PE N-말단 절반의 C-말단 단부와 PE C-말단 절반의 N-말단 단부 사이의 펩티드 결합의 형성의 동시 과정을 거쳐 완전한 napDNAbp 도메인 (예를 들어, Cas9 닉카제) 및 RT 도메인을 포함하는 완전한 프라임 편집제 단백질을 재형성한다. 도면에 제시되지는 않았지만, 프라임 편집제는 또한 N-말단 및/또는 C-말단의 NLS, 뿐만 아니라 각각의 도메인을 연결하는 아미노산 링커 서열을 포함한 추가의 서열을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 프라임 편집제는 전체 프라임 편집제를 "분할 부위"로서 "분할"함으로써 2개의 절반 단백질 (즉, PE N-말단 절반 및 PE C-말단 절반)로서 조작될 수 있다. "분할 부위"는 프라임 편집제에서 2개의 인접한 아미노산 잔기 사이의 분할 인테인 서열 (즉, N 인테인 및 C 인테인)의 삽입 위치를 지칭한다. 보다 구체적으로, "분할 부위"는 전체 프라임 편집제를 2개의 별개의 절반으로 나누는 위치를 지칭하며, 여기서 각각의 절반은 분할 부위에서 N 인테인 또는 C 인테인 모티프에 융합된다. 분할 부위는 프라임 편집제 융합 단백질의 임의의 적합한 위치에 있을 수 있지만, 바람직하게는 분할 부위는 (예를 들어, 발현 벡터에 의한) 전달을 위해 적절하게 사이징된 2개의 절반 단백질의 형성을 가능하게 하는 위치에 위치하고, 여기서 분할 부위 말단에서 각각의 절반 단백질에 융합된 인테인은 하나의 절반 단백질이 세포 내부에서 다른 절반 단백질과 접촉할 때 서로 충분히 상호작용하는데 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 분할 부위는 napDNAbp 도메인에 위치한다. 다른 실시양태에서, 분할 부위는 RT 도메인에 위치한다. 다른 실시양태에서, 분할 부위는 napDNAbp 도메인과 RT 도메인을 연결하는 링커에 위치한다.
다양한 실시양태에서, 분할 부위 설계는 2개의 절반 프라임 편집제 도메인을 2개의 상이한 AAV 게놈 내로 패키징할 목적으로, 둘 다 구조적으로 허용되는 N- 및 C-말단 인테인을 분할 및 삽입하기 위한 부위를 발견하는 것을 필요로 한다. 추가적으로, 트랜스 스플라이싱에 필요한 인테인 잔기는 C 말단 엑스테인의 N 말단에서 잔기를 돌연변이시키거나 또는 인테인 "자국"을 남길 잔기를 삽입함으로써 혼입될 수 있다.
SpCas9 닉카제 또는 SaCas9 닉카제를 포함하는 분할 프라임 편집제의 예시적인 분할 구성은 하기와 같다.
Figure pct00286
Figure pct00287
Figure pct00288
예로서 SpCas9 닉카제 (서열식별번호: 18, 1368개 아미노산)를 사용하는 다양한 실시양태에서, 분할은 1 내지 1368의 임의의 2개의 아미노산 사이에서 이루어질 수 있다. 그러나, 바람직한 분할은 단백질의 중심 영역 사이에, 예를 들어 서열식별번호: 18의 아미노산 50-1250, 또는 100-1200, 또는 150-1150, 또는 200-1100, 또는 250-1050, 또는 300-1000, 또는 350-950, 또는 400-900, 또는 450-850, 또는 500-800, 또는 550-750, 또는 600-700 사이에 위치할 것이다. 구체적인 예시적 실시양태에서, 분할 부위는 740/741, 또는 801/802, 또는 1010/1011, 또는 1041/1042 사이일 수 있다. 다른 실시양태에서, 분할 부위는 서열식별번호: 18의 SpCas9 대비 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 12/13, 14/15, 15/16, 17/18, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34, 34/35, 35/36, 36/37, 38/39, 39/40, 41/42, 42/43, 43/44, 44/45, 45/46, 46/47, 47/48, 48/49, 49/50, 51/52, 52/53, 53/54, 54/55, 55/56, 56/57, 57/58, 58/59, 59/60, 61/62, 62/63, 63/64, 64/65, 65/66, 66/67, 67/68, 68/69, 69/70, 71/72, 72/73, 73/74, 74/75, 75/76, 76/77, 77/78, 78/79, 79/80, 81/82, 82/83, 83/84, 84/85, 85/86, 86/87, 87/88, 88/89, 89/90 사이, 또는 90-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150, 1150-1200, 1200-1250, 1250-1300, 1300-1350, 및 1350-1368 사이의 인접 잔기의 임의의 2개의 쌍 사이, 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에서의 임의의 2개의 상응하는 잔기 사이, 또는 아미노산 서열 서열식별번호: 19-88 중 임의의 것, 또는 서열식별번호: 19-88 중 임의의 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 SpCas9의 변이체 또는 등가물에서의 임의의 2개의 상응하는 잔기 사이일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 분할 인테인 서열은 하기 인테인 서열로부터 조작될 수 있다.
Figure pct00289
Figure pct00290
다양한 다른 실시양태에서, 분할 인테인 서열은 하기와 같이 사용될 수 있다:
Figure pct00291
다양한 실시양태에서, 분할 인테인은 완전한 PE 융합 단백질의 개별 부분을 세포에 개별적으로 전달하는데 사용될 수 있으며, 이는 세포에서 발현 시 트랜스 스플라이싱을 통해 완전한 PE 융합 단백질로서 재구성된다.
일부 실시양태에서, 개시내용은
(a) 제1 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 발현 벡터를 구축하는 단계;
(b) 제2 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 C-말단 단편을 코딩하는 제2 발현 벡터를 구축하는 단계;
(c) 제1 및 제2 발현 벡터를 세포에 전달하는 단계
를 포함하는, PE 융합 단백질을 세포에 전달하는 방법을 제공하며,
여기서 N-말단 및 C-말단 단편은 제1 및 제2 분할 인테인 서열의 자기-절제를 유발하는 트랜스 스플라이싱 활성의 결과로서 세포에서 PE 융합 단백질로서 재구성된다.
일부 실시양태에서 분할 부위는 napDNAbp 도메인, 링커, 또는 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함한, 프라임 편집제 융합체 내의 임의의 곳일 수 있다.
다른 실시양태에서, 분할 부위는 napDNAbp 도메인 내에 있다.
또 다른 실시양태에서, 분할 부위는 리버스 트랜스크립타제 또는 폴리머라제 도메인 내에 있다.
또 다른 실시양태에서, 분할 부위는 링커 내에 있다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 napDNAbp (예를 들어, Cas9 도메인) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제를 제공하며, 여기서 napDNAbp 및/또는 리버스 트랜스크립타제 중 하나 또는 둘 다는 인테인, 예를 들어 리간드-의존성 인테인을 포함한다. 전형적으로, 인테인은 리간드 (예를 들어, 소분자, 예컨대 4-히드록시타목시펜, 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 아미노산, 및 뉴클레오티드)의 부재 하에 단백질 스플라이싱 활성을 나타내지 않거나 최소로 나타내는 리간드-의존성 인테인이다. 리간드-의존성 인테인은 공지되어 있고, 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는, U.S. 2014/0065711 A1로서 공개된 미국 특허 출원 U.S.S.N. 14/004,280에 기재된 것을 포함한다. 또한, 분할-Cas9 아키텍처의 사용에서, 일부 실시양태에서, 인테인은 서열식별번호: 8-15, 447, 452, 462, 및 472-479로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시양태에서, napDNAbp 도메인은 서열식별번호: 18의 정규 SpCas9 도메인과 비교하여 보다 작은 크기의 napDNAbp 도메인이다.
정규 SpCas9 단백질은 1368개 아미노산 길이이고, 158 킬로달톤의 예측 분자량을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "작은-크기의 Cas9 변이체"는 적어도 1300개 미만의 아미노산, 또는 적어도 1290개 미만의 아미노산, 또는 1280개 미만의 아미노산, 또는 1270개 미만의 아미노산, 또는 1260개 미만의 아미노산, 또는 1250개 미만의 아미노산, 또는 1240개 미만의 아미노산, 또는 1230개 미만의 아미노산, 또는 1220개 미만의 아미노산, 또는 1210개 미만의 아미노산, 또는 1200개 미만의 아미노산, 또는 1190개 미만의 아미노산, 또는 1180개 미만의 아미노산, 또는 1170개 미만의 아미노산, 또는 1160개 미만의 아미노산, 또는 1150개 미만의 아미노산, 또는 1140개 미만의 아미노산, 또는 1130개 미만의 아미노산, 또는 1120개 미만의 아미노산, 또는 1110개 미만의 아미노산, 또는 1100개 미만의 아미노산, 또는 1050개 미만의 아미노산, 또는 1000개 미만의 아미노산, 또는 950개 미만의 아미노산, 또는 900개 미만의 아미노산, 또는 850개 미만의 아미노산, 또는 800개 미만의 아미노산, 또는 750개 미만의 아미노산, 또는 700개 미만의 아미노산, 또는 650개 미만의 아미노산, 또는 600개 미만의 아미노산, 또는 550개 미만의 아미노산, 또는 500개 미만의 아미노산이지만, 적어도 약 400개 초과의 아미노산이고, Cas9 단백질의 요구되는 기능을 보유하는 임의의 Cas9 변이체-자연 발생, 조작, 또는 그 밖의 것-를 지칭한다.
한 실시양태에서, 실시예 20에 도시된 바와 같이, 본 명세서는 정규 SpCas9 (서열식별번호: 18)의 잔기 1024와 1025 (또는 Met-마이너스 서열식별번호: 18 대비 각각 잔기 1023 및 1024로 지칭될 수 있음) 사이에 분할된 하기 분할-인테인 PE 구축물을 포괄한다.
먼저, 1024 ("K") 및 1025 ("S") 잔기 사이의 분할 부위의 위치를 나타낸 서열식별번호: 18의 아미노산 서열은 하기와 같이 제시된다:
Figure pct00292
이러한 구성에서, N-말단 절반의 아미노산 서열 (아미노산 1-1024)은 하기와 같다:
Figure pct00293
이러한 구성에서, N-말단 절반의 아미노산 서열 (아미노산 1-1023) (여기서 단백질은 위치 1에서 Met-마이너스임)은 하기와 같다:
Figure pct00294
이러한 구성에서, C-말단 절반의 아미노산 서열 (아미노산 1024-1368 (또는 Met-마이너스 Cas9에서 아미노산 1023-1367로서 카운팅됨))은 하기와 같다:
Figure pct00295
실시예 20에 제시된 바와 같이, PE2 (서열식별번호: 18의 SpCas9를 기초로 함) 구축물을 하기와 같이 위치 1023/1024 (Met-마이너스 서열식별번호: 18 대비)에서 2개의 별개의 구축물로 분할하였다:
1023/1024 N 말단 절반에서의 SpPE2 분할
Figure pct00296
Figure pct00297
1023/1024 C 말단 절반에서의 SpPE2 분할
Figure pct00298
Figure pct00299
본 개시내용은 또한 분할-인테인 프라임 편집제를 세포에 전달하고/거나 세포를 분할-인테인 프라임 편집제로 처리하는 방법을 고려한다.
일부 실시양태에서, 개시내용은
(a) 제1 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 발현 벡터를 구축하는 단계;
(b) 제2 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 C-말단 단편을 코딩하는 제2 발현 벡터를 구축하는 단계;
(c) 제1 및 제2 발현 벡터를 세포에 전달하는 단계
를 포함하는, PE 융합 단백질을 세포에 전달하는 방법을 제공하며,
여기서 N-말단 및 C-말단 단편은 제1 및 제2 분할 인테인 서열의 자기-절제를 유발하는 트랜스 스플라이싱 활성의 결과로서 세포에서 PE 융합 단백질로서 재구성된다.
특정 실시양태에서, 제1 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 N-말단 단편은 서열식별번호: 3875, 또는 서열식별번호: 3875와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
다른 실시양태에서, 제1 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 C-말단 단편은 서열식별번호: 3876, 또는 서열식별번호: 3876과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
다른 실시양태에서, 개시내용은
(a) 제1 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 발현 벡터를 구축하는 단계;
(b) 제2 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 C-말단 단편을 코딩하는 제2 발현 벡터를 구축하는 단계;
(c) 제1 및 제2 발현 벡터를 세포에 전달하는 단계
를 포함하는, 세포 내의 표적 DNA 서열을 편집하는 방법을 제공하며,
여기서 N-말단 및 C-말단 단편은 제1 및 제2 분할 인테인 서열의 자기-절제를 유발하는 트랜스 스플라이싱 활성의 결과로서 세포에서 PE 융합 단백질로서 재구성된다.
특정 실시양태에서, 제1 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 N-말단 단편은 서열식별번호: 3875, 또는 서열식별번호: 3875와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
다른 실시양태에서, 제1 분할 인테인 서열에 융합된 PE 융합 단백질의 C-말단 단편은 서열식별번호: 3876, 또는 서열식별번호: 3876과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
PE 리보핵단백질 복합체의 전달
이러한 측면에서, 프라임 편집제는 전기천공 및 지질 나노입자를 포함한 다양한 방법에 의해 PEgRNA와 복합체화된 프라임 편집제 (즉, PE 리보핵단백질 복합체)의 전달을 수반하는 비-바이러스 전달 전략에 의해 전달될 수 있다. 핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증진된 흡수를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)™ 및 리포펙틴(Lipofectin)™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 파이너(Feigner), WO 91/17424; WO91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
표적화된 리포솜, 예컨대 면역지질 복합체를 포함한 지질:핵산 복합체의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참조).
리보핵단백질 복합체의 비-바이러스 전달을 위한 접근법을 논의하는 하기 참고문헌을 추가로 참조할 수 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00300
도 68c는 다양한 개시된 PE 리보핵단백질 복합체 (고농도의 PE2, 고농도의 PE3 및 저농도의 PE3)가 이러한 방식으로 전달될 수 있음을 보여주는 데이터를 제공한다.
mRNA에 의한 PE의 전달
프라임 편집-기반 게놈 편집이 바람직한 세포에 프라임 편집제 및/또는 PEgRNA를 전달하는데 활용될 수 있는 또 다른 방법은 메신저 RNA (mRNA) 전달 방법 및 기술의 사용을 활용하는 것에 의한다. 예를 들어, 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT/US2014/028330, US8822663B2, NZ700688A, ES2740248T3, EP2755693A4, EP2755986A4, WO2014152940A1, EP3450553B1, BR112016030852A2, 및 EP3362461A1을 포함한, 본 개시내용에서 이용될 수 있는 mRNA 전달 방법 및 조성물의 예. 본원에 참조로 포함되는 추가의 개시내용은 문헌 [Kowalski et al., "Delivering the Messenger: Advances in Technologies for Therapeutic mRNA Delivery," Mol Therap., 2019; 27(4): 710-728]에서 찾아볼 수 있다.
프라임 편집제를 코딩하는 DNA 벡터와 대조적으로, 프라임 편집제를 위한 전달 작용제로서의 RNA의 사용은 유전 물질이 그의 기능을 수행하기 위해 핵에 진입할 필요가 없다는 이점을 갖는다. 전달된 mRNA는 세포질에서 목적하는 단백질 (예를 들어, 프라임 편집제 융합 단백질) 및 핵산 생성물 (예를 들어, PEgRNA)로 직접 번역될 수 있다. 그러나, 보다 안정하기 위해 (예를 들어, 세포질에서 RNA-분해 효소에 저항하기 위해), 일부 실시양태에서 mRNA를 안정화시켜 전달 효율을 개선시키는 것이 필요하다. 특정 전달 담체, 예컨대 양이온성 지질 또는 중합체성 전달 담체도 또한, 목적하는 프라임 편집제 융합 단백질을 코딩하는 치료 mRNA를 달리 분해할 수 있는 내인성 RNase 효소로부터 형질감염된 mRNA를 보호하는 것을 도울 수 있다. 또한, 변형된 mRNA의 증가된 안정성에도 불구하고, mRNA, 특히 전장 단백질을 코딩하는 mRNA를 세포에 치료 수준의 단백질 생산을 가능하게 하는 방식으로 생체내 전달하는 것은 도전과제로 남아있다.
일부 예외로, mRNA의 세포내 전달은 일반적으로 작은 올리고뉴클레오티드의 세포내 전달보다 더 큰 도전과제이며, 부분적으로 다른 유형의 RNA (소형 간섭 RNA [siRNA], ~14 kDa; 안티센스 올리고뉴클레오티드 [ASO], 4-10 kDa)와 비교하여 mRNA 분자의 유의하게 더 큰 크기 (300-5,000 kDa, ~1-15 kb)로 인해 전달 나노입자 내로 캡슐화하는 것을 필요로 한다.
mRNA는 세포질에 도달하기 위해 세포막을 통과해야 한다. 세포막은 세포내 전달에 대한 동적이고 강력한 장벽이다. 이는 주로 쯔비터이온성 및 음으로 하전된 인지질의 지질 이중층으로 구성되며, 여기서 인지질의 극성 머리는 수성 환경을 향하고, 소수성 테일은 소수성 코어를 형성한다.
일부 실시양태에서, 개시내용의 mRNA 조성물은 mRNA (프라임 편집제 및/또는 PEgRNA를 코딩함), 수송 비히클, 및 임의로 표적 세포와의 접촉 및 후속 형질감염을 용이하게 하는 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, mRNA는 (예를 들어, mRNA의 야생형 또는 천연 버전과 비교하여) mRNA에 안정성을 부여하고 단백질의 연관된 비정상적 발현에 수반되는 1개 이상의 변형을 포함할 수 있다. 결함을 교정하는 야생형에 대한 1개 이상의 변형이 또한 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 5' 비번역 영역 또는 3' 비번역 영역 중 하나 또는 둘 다의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 1 (IE1) 유전자, 폴리 A 테일, Cap1 구조, 또는 인간 성장 호르몬 (hGH)의 부분 서열을 코딩하는 서열의 포함을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 mRNA 면역원성을 감소시키도록 변형된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 "프라임 편집제" mRNA는 표적 세포로의 전달을 용이하게 하기 위해 리포솜 전달 비히클 중에 제제화될 수 있다. 고려되는 전달 비히클은 1종 이상의 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및/또는 PEG-변형된 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클은 하기 양이온성 지질 중 적어도 1종을 포함할 수 있다: C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000, 또는 HGT5001. 실시양태에서, 전달 비히클은 콜레스테롤 (chol) 및/또는 PEG 변형된 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달 비히클은 DMG-PEG2K를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전달 비히클은 하기 지질 제제를 갖는다: C12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K, HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K 중 1종.
본 개시내용은 1개 이상의 PE-코딩 mRNA 분자로의 표적 세포의 형질감염을 용이하게 하는데 유용한 조성물 및 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 1개 이상의 표적 세포에 대한 조성물의 친화도를 증가시킬 수 있는 표적화 리간드의 사용을 고려한다. 한 실시양태에서, 표적화 리간드는 아포지단백질 B 또는 아포지단백질 E이고, 상응하는 표적 세포는 저밀도 지단백질 수용체를 발현하고, 따라서 표적화 리간드의 인식을 촉진한다. 매우 많은 표적 세포가 본 개시내용의 방법 및 조성물을 사용하여 우선적으로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 고려되는 표적 세포는 간세포, 상피 세포, 조혈 세포, 상피 세포, 내피 세포, 폐 세포, 골 세포, 줄기 세포, 중간엽 세포, 신경 세포, 심장 세포, 지방세포, 혈관 평활근 세포, 심근세포, 골격근 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 활막 내층 세포, 난소 세포, 고환 세포, 섬유모세포, B 세포, T 세포, 망상적혈구, 백혈구, 과립구, 및 종양 세포를 포함한다. 그러나, 이들에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, PE-코딩 mRNA는 임의로, 예를 들어 이러한 mRNA의 안정성 및/또는 반감기를 개선시키거나 또는 단백질 생산을 개선시키거나 또는 달리 용이하게 하는 화학적 또는 생물학적 변형을 가질 수 있다. 형질감염 시, 본 발명의 조성물 중 천연 mRNA는 30분 내지 수일의 반감기로 붕괴될 수 있다. 개시내용의 조성물 중 mRNA는 적어도 일부의 번역되는 능력을 보유함으로써 기능적 단백질 또는 효소를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 안정화된 mRNA를 포함하는 조성물 및 그의 투여 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, mRNA의 활성은 연장된 기간에 걸쳐 지속된다. 예를 들어, mRNA의 활성은 본 개시내용의 조성물이 대상체에게 주 2회 또는 격주 기준으로, 또는 보다 바람직하게는 매월, 격월, 분기마다 또는 연간 기준으로 투여되도록 지속될 수 있다. 본 발명의 mRNA의 연장된 또는 지속된 활성은 이러한 mRNA로부터 생산된 단백질 또는 효소의 양에 직접적으로 관련된다. 유사하게, 본 개시내용의 조성물의 활성은 mRNA의 번역을 개선 또는 증진시키기 위해 이루어진 변형에 의해 추가로 연장 또는 지속될 수 있다. 또한, 표적 세포에 의해 생산되는 기능적 단백질 또는 효소의 양은 표적 세포에 전달되는 mRNA의 양 및 이러한 mRNA의 안정성의 함수이다. 본 발명의 mRNA의 안정성이 개선되거나 증진될 수 있는 정도로, 생산된 단백질 또는 효소의 반감기, 활성 및 조성물의 투여 빈도가 추가로 연장될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 개시내용의 조성물 중의 mRNA는, 예를 들어 생체내 뉴클레아제 소화에 대한 개선된 저항성을 포함한, 핵산에 증가된 또는 증진된 안정성을 부여하는 적어도 1개의 변형을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "변형" 및 "변형된"은, 이러한 용어가 본원에 제공된 핵산에 관한 것일 때, 바람직하게는 안정성을 증진시키고 mRNA를 야생형 또는 자연 발생 버전의 mRNA보다 더 안정하게 (예를 들어, 뉴클레아제 소화에 대해 저항성이게) 하는 적어도 1개의 변경을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "안정한" 및 "안정성"은, 이러한 용어가 본 발명의 핵산에 관한 것일 때, 특히 mRNA와 관련한 것일 때, 예를 들어 이러한 mRNA를 정상적으로 분해할 수 있는 뉴클레아제 (즉, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제)에 의한 분해에 대한 증가된 또는 증진된 저항성을 지칭한다. 증가된 안정성은, 예를 들어, 가수분해 또는 표적 세포 또는 조직 내의 내인성 효소 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제) 또는 조건에 의한 다른 파괴에 대한 보다 낮은 감수성을 포함할 수 있으며, 그에 의해 표적 세포, 조직, 대상체 및/또는 세포질 내에서 이러한 mRNA의 체류가 증가 또는 증진된다. 본원에 제공된 안정화된 mRNA 분자는 그의 자연 발생, 비변형된 대응물 (예를 들어 mRNA의 야생형 버전)에 비해 더 긴 반감기를 입증한다. 또한, 용어 "변형" 및 "변형된"은, 이러한 용어가 본 발명의 mRNA에 관한 것일 때, 예를 들어 단백질 번역의 개시 시 기능하는 서열 (예를 들어, 코작(Kozak) 컨센서스 서열)의 포함을 포함한, mRNA 핵산의 번역을 개선 또는 증진시키는 변경이 고려된다. (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).
일부 실시양태에서, 개시내용의 조성물에 사용된 mRNA는 이를 보다 안정하게 하는 화학적 또는 생물학적 변형을 거쳤다. mRNA에 대한 예시적인 변형은 염기의 고갈 (예를 들어, 결실에 의하거나 또는 하나의 뉴클레오티드로 또 다른 뉴클레오티드를 치환하는 것에 의함) 또는 염기의 변형, 예를 들어 염기의 화학적 변형을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "화학적 변형"은 자연 발생 mRNA에서 관찰되는 것과 상이한 화학을 도입하는 변형, 예를 들어 공유 변형, 예컨대 변형된 뉴클레오티드의 도입 (예를 들어, 뉴클레오티드 유사체, 또는 이러한 mRNA 분자에서 자연적으로 발견되지 않는 펜던트 기의 포함)을 포함한다.
개시내용의 조성물에 사용되는 PE-코딩 mRNA 내로 혼입될 수 있는 다른 적합한 폴리뉴클레오티드 변형은 4'-티오-변형된 염기: 4'-티오-아데노신, 4'-티오-구아노신, 4'-티오-시티딘, 4'-티오-우리딘, 4'-티오-5-메틸-시티딘, 4'-티오-슈도우리딘, 및 4'-티오-2-티오우리딘, 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-히드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디히드로우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제뷸라린, 5-아자-제뷸라린, 5-메틸-제뷸라린, 5-아자-2-티오-제뷸라린, 2-티오-제뷸라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 변형은 또한, 예를 들어 비-뉴클레오티드 연결 또는 변형된 뉴클레오티드의 본 발명의 mRNA 서열 내로의 혼입 (예를 들어, 기능적 단백질 또는 효소를 코딩하는 mRNA 분자의 3' 및 5' 단부 중 하나 또는 둘 다에 대한 변형)을 포함한다. 이러한 변형은 mRNA 서열에 대한 염기의 부가 (예를 들어, 폴리 A 테일 또는 보다 긴 폴리 A 테일의 포함), 3' UTR 또는 5' UTR의 변경, mRNA와 작용제 (예를 들어, 단백질 또는 상보적 핵산 분자)의 복합체화, 및 mRNA 분자의 구조를 변화시키는 (예를 들어, 2차 구조를 형성하는) 요소의 포함을 포함한다.
일부 실시양태에서, PE-코딩 mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 하기와 같이 부가된다: 먼저, RNA 말단 포스파타제는 5' 뉴클레오티드로부터 말단 포스페이트 기 중 하나를 제거하여, 2개의 말단 포스페이트를 남기고; 구아노신 트리포스페이트 (GTP)가 이어서 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 말단 포스페이트에 부가되어, 5'5'5 트리포스페이트 연결을 생성하고; 구아닌의 7-질소는 이어서 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예는 m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 자연 발생 캡 구조는 제1 전사된 뉴클레오티드의 5'-단부에 트리포스페이트 가교를 통해 연결되어 m7G(5')ppp(5')N의 디뉴클레오티드 캡을 생성하는 7-메틸 구아노신을 포함하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오시드이다. 생체내에서, 캡은 효소적으로 부가된다. 캡은 핵에 부가되고, 효소 구아닐릴 트랜스퍼라제에 의해 촉매된다. RNA의 5' 말단 단부에 대한 캡의 부가는 전사 개시 직후에 일어난다. 말단 뉴클레오시드는 전형적으로 구아노신이고, 모든 다른 뉴클레오티드, 즉 G(5')ppp(5')GpNpNp에 대해 역 배향이다.
추가의 캡 유사체는 m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; 비메틸화 캡 유사체 (예를 들어, GpppG); 디메틸화 캡 유사체 (예를 들어, m2,7GpppG), 트리메틸화 캡 유사체 (예를 들어, m2,2,7GpppG), 디메틸화 대칭 캡 유사체 (예를 들어, m7Gpppm7G), 또는 항 역 캡 유사체 (예를 들어, ARCA; m7,2'OmeGpppG, m72'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG 및 그의 테트라포스페이트 유도체)로 이루어진 군으로부터 선택된 화학 구조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [Jemielity, J. et al., "Novel 'anti-reverse' cap analogs with superior translational properties", RNA, 9: 1108-1122 (2003)] 참조).
전형적으로, "테일"의 존재는 mRNA를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하는 역할을 한다. 폴리 A 또는 폴리 U 테일은 천연 메신저 및 합성 센스 RNA를 안정화시키는 것으로 생각된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 긴 폴리 A 또는 폴리 U 테일을 mRNA 분자에 부가하여 RNA를 보다 안정하게 할 수 있다. 폴리 A 또는 폴리 U 테일은 다양한 관련 기술분야-인식 기술을 사용하여 부가될 수 있다. 예를 들어, 긴 폴리 A 테일은 폴리 A 폴리머라제를 사용하여 합성 또는 시험관내 전사된 RNA에 부가될 수 있다 (Yokoe, et al., Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). 전사 벡터는 또한 긴 폴리 A 테일을 코딩할 수 있다. 또한, 폴리 A 테일은 PCR 생성물로부터 직접 전사에 의해 부가될 수 있다. 폴리 A는 또한 RNA 리가제에 의해 센스 RNA의 3' 단부에 라이게이션될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1991 edition)] 참조).
전형적으로, 폴리 A 또는 폴리 U 테일의 길이는 적어도 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 적어도 500개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA의 3' 말단 상의 폴리-A 테일은 전형적으로 약 10 내지 300개의 아데노신 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 10 내지 200개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 150개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 아데노신 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 60개의 아데노신 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 3' 폴리(C) 테일 구조를 포함한다. mRNA의 3' 말단 상의 적합한 폴리-C 테일은 전형적으로 약 10 내지 200개의 시토신 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 10 내지 150개의 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 60개의 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 40개의 시토신 뉴클레오티드)를 포함한다. 폴리-C 테일은 폴리-A 또는 폴리 U 테일에 부가될 수 있거나, 또는 폴리-A 또는 폴리 U 테일을 치환할 수 있다.
본 개시내용에 따른 PE-코딩 mRNA는 임의의 다양한 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA는 시험관내 전사 (IVT)를 통해 합성될 수 있다. 간략하게, IVT는 전형적으로 프로모터, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충제 시스템, 및 적절한 RNA 폴리머라제 (예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제), DNAse I, 피로포스파타제, 및/또는 RNAse 억제제를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형으로 수행된다. 정확한 조건은 특정한 적용에 따라 달라질 것이다.
mRNA 전달을 수반하는 실시양태에서, PE 융합 단백질을 코딩하는 mRNA 대 PEgRNA의 비는 효율적인 편집에 중요할 수 있다. 특정 실시양태에서, mRNA (PE 융합 단백질을 코딩함) 대 PEgRNA의 중량비는 1:1이다. 특정의 다른 실시양태에서, mRNA (PE 융합 단백질을 코딩함) 대 PEgRNA의 중량비는 2:1이다. 또 다른 실시양태에서, mRNA (PE 융합 단백질을 코딩함) 대 PEgRNA의 중량비는 1:2이다. 또 다른 실시양태에서, mRNA (PE 융합 단백질을 코딩함) 대 PEgRNA의 중량비는 약 1:1000, 1:900; 1:800; 1:700; 1:600; 1:500; 1:400; 1:300; 1:200; 1:100; 1:90; 1:80; 1:70; 1:60; 1:50; 1:40; 1:30; 1:20; 1:10; 및 1:1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, mRNA (PE 융합 단백질을 코딩함) 대 PEgRNA의 중량비는 약 1:1000, 1:900; 800:1; 700:1; 600:1; 500:1; 400:1; 300:1; 200:1; 100:1; 90:1; 80:1; 70:1; 60:1; 50:1; 40:1; 30:1; 20:1; 10:1; 및 1:1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
J. 비편향 방식으로 오프-타겟 편집을 확인하기 위한 프라임 편집의 사용
다른 게놈 편집제와 마찬가지로, PE가 그의 프로그램화된 유전자 변경을 게놈 주위의 비의도된 부위, 즉 "오프-타겟" 부위에 도입할 수 있는 일부 위험이 존재한다. 그러나, 현재 프라임 편집제를 사용하여 오프-타겟 편집을 검출하는 방법은 기재되어 있지 않다. 이러한 방법은 프라임 편집제를 사용하여 오프-타겟 편집의 잠재적 부위의 확인을 가능하게 할 것이다.
이러한 측면의 주요 개념은 napDNAbp 뉴클레아제 또는 프라임 편집제의 게놈 오프-타겟 변형 부위의 신속한 확인을 가능하게 하기 위해, 동일한 PEgRNA로부터 주형화된 온-타겟 및 오프-타겟 부위에 동일한 어댑터 서열 및/또는 프라이머 결합 부위를 삽입하기 위해 프라임 편집을 사용하는 아이디어이다. 이 방법은, 어댑터 및/또는 프라이머 결합 서열이 napDNAbp에 의한 DNA 결합 및 닉킹과 동일한 사건으로 삽입되어 하류 프로세싱을 단순화하기 때문에, 뉴클레아제 오프-타겟 부위를 확인하는 다른 기술과 구별된다.
도 33은 오프-타겟 확인의 기본 원리를 예시한다. 도면은 오프-타겟 편집을 결정하기 위해 프라임 편집을 사용하여 게놈 DNA 내로 프라이머 결합 서열 삽입 및 프라이머 결합 삽입을 위한 PEgRNA 설계를 보여주는 개략도이다. 이러한 실시양태에서, 프라임 편집은 살아있는 세포, 조직, 또는 동물 모델 내부에서 수행된다. 제1 단계로서, 적절한 PEgRNA를 설계한다. 상단 개략도는 이러한 측면에서 사용될 수 있는 예시적인 PEgRNA를 보여준다. PEgRNA 내의 스페이서 ("프로토스페이서"로 라벨링됨)는 게놈 표적의 가닥 중 하나에 상보적이다. PE:PEgRNA 복합체 (즉, PE 복합체)는 닉 부위에 코딩된 프라이머 결합 서열 및 절단 부위의 바로 하류의 영역 (적색)에 상보적인 상동성 영역 (PEgRNA의 상동성 아암에 의해 코딩됨)을 함유하는 단일 가닥 3' 단부 플랩을 설치한다. 플랩 침입 및 DNA 복구/복제 과정을 통해, 합성된 가닥은 DNA 내로 혼입되어 프라이머 결합 부위를 설치한다. 이러한 과정은 목적하는 게놈 표적에서 이루어질 수 있지만, 또한 PEgRNA와 오프-타겟 방식으로 상호작용할 수 있는 다른 게놈 부위에서도 일어날 수 있다 (즉, PEgRNA는 의도된 게놈 부위가 아닌 다른 게놈 부위에 대한 스페이서 영역의 상보성으로 인해 PE 복합체를 다른 오프-타겟 부위로 가이드한다). 따라서, 프라이머 결합 서열은 목적하는 게놈 표적 뿐만 아니라 게놈 내 다른 곳의 오프-타겟 게놈 부위에서도 설치될 수 있다. 의도된 게놈 표적 부위 및 오프-타겟 게놈 부위 둘 다에서 이들 프라이머 결합 부위의 삽입을 검출하기 위해, 게놈 DNA (PE-후)를 단리하고, 단편화하고, 어댑터 뉴클레오티드 (적색으로 제시됨)에 라이게이션할 수 있다. 이어서, PE에 의해 프라이머 결합 부위가 삽입된 온-타겟 및 오프-타겟 게놈 DNA 영역을 증폭시키기 위해 어댑터 및 삽입된 프라이머 결합 서열에 어닐링하는 PCR 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. 이어서, 고처리량 서열분석 뿐만 아니라 서열 정렬을 수행하여 온-타겟 부위 또는 오프-타겟 부위에서 PE-삽입된 프라이머 결합 서열의 삽입 지점을 확인할 수 있다.
따라서, 도 33은 조직 배양 또는 동물 모델의 살아있는 세포 내부에서의 편집 시 오프-타겟 편집 부위를 확인하는 것에 관한 한 측면을 예시한다. 이 방법을 수행하기 위해, 최종 목적 프라임 편집제와 동일한 스페이서 (및, 프라임 편집 오프-타겟을 조사하는 경우, 최종 목적 편집제와 동일한 프라이머-결합 부위 서열)를 갖지만, 프라임 편집에 의한 역전사 후에 어댑터 또는 프라이머 결합 부위를 설치하는데 필요한 서열을 포함하는 PEgRNA를 생성한다. 생체내 편집은 프라임 편집제 또는 RT-융합된 뉴클레아제를 사용하여 수행되고, 게놈 DNA를 단리한다. 게놈 DNA는 효소적 또는 기계적 수단에 의해 단편화되고, DNA 단편화 부위에 상이한 어댑터를 부가한다. PCR을 사용하여 하나의 어댑터로부터 PEgRNA를 통해 설치된 어댑터까지 증폭시킨다. 생성된 생성물을 심층-서열분석하여 모든 변형된 부위를 확인한다.
또 다른 측면에서, PE에 의한 오프-타겟 편집의 평가는 시험관내에서 수행될 수 있다. 이러한 측면에서, PE는 게놈 DNA의 시험관내 변형을 사용하는 오프-타겟 편집 부위의 게놈 DNA 확인의 시험관내 변형 동안 사용될 수 있다. 이러한 방법을 수행하기 위해, 표적 부위에 어댑터 또는 프라이머 결합 서열을 설치하도록 구성된 정제된 프라임 편집제 융합 단백질의 리보핵단백질 (RNP) 및 PEgRNA (즉, PE 복합체)가 조립되며, 이는 그 외에는 관심 PEgRNA와 동일하다. 이 RNP (즉, PE 복합체)는 DNA의 단편화 전 또는 후에 추출된 게놈 DNA와 함께 인큐베이션된다. 단편화 후에, 상이한 어댑터 서열이 단편 DNA의 단부에 라이게이션된다. PCR을 사용하여 삽입된 어댑터 서열 (즉, EP에 의해 삽입됨) 및 단편 단부에 라이게이션된 어댑터에 걸쳐있는 게놈 부위를 증폭시킨다. 어댑터 서열 사이의 고처리량 서열분석으로 온-타겟 및 오프-타겟인 게놈의 변형 부위를 확인할 수 있다. 세포 DNA 복구는 프라임 편집제에 의해 부가된 역전사된 DNA 어댑터를 제거하지 않을 것이기 때문에 이러한 시험관내 편집 방법은 검출 감도를 증진시켜야 한다.
이들 방법은 임의의 프라임 편집제, 또는 표적 절단 부위 (대부분의 Cas 뉴클레아제)를 인식하기 위해 가이드 RNA를 사용하는 임의의 게놈 편집제에 대한 오프-타겟 편집을 확인하는데 사용될 수 있다.
이들 방법은 게놈 편집제를 치료에 사용하는 것이 고려되는 모든 유전 질환에 적용될 수 있다.
PE에 의해 설치될 수 있는 예시적인 어댑터 및/또는 프라이머 결합 서열은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00301
이들 어댑터 및/또는 프라이머 결합 서열은 또한 상기 약술된 바와 같은 게놈 DNA 단편화 후 라이게이션 단계에서 사용될 수 있다.
오프-타겟 편집 및 그의 편집 표적 유전자좌를 평가하기 위한 본원에 기재된 방법의 사용을 예시하는 예시적인 PEgRNA 설계는 하기와 같다:
Figure pct00302
K. 유도성 이량체화 도메인의 삽입을 위한 프라임 편집의 사용
본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 이량체화 도메인을 1개 이상의 단백질 표적에 설치하는데 사용될 수 있다. 이량체화 도메인은 이중특이적 방식으로 결합하는 연결 모이어티 (예를 들어, 소분자, 펩티드, 또는 단백질)를 통해 1개 이상의 단백질 표적의 이량체화와 연관된 활성의 유도성 조절을 용이하게 할 수 있다. 다양한 측면에서, 이량체화 도메인은 상이한 단백질 (예를 들어, 동일한 유형 또는 상이한 단백질) 상에 설치될 경우, 각각 동일한 이중특이적 모이어티 (예를 들어, 이량체화 도메인에 개별적으로 결합하는 적어도 2개의 영역을 갖는 이중특이적 소분자, 펩티드, 또는 폴리펩티드)에 결합하여, 이중특이적 리간드에 대한 그의 공통 상호작용을 통해 단백질의 이량체화를 유발한다. 이러한 방식으로, 이중특이적 리간드는 2개의 단백질의 이량체화의 "유도제"로서 기능한다. 일부 경우에, 이중특이적 리간드 또는 화합물은 동일한 2개의 표적화 모이어티를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 이중특이적 리간드 또는 화합물은 각각 서로 상이한 표적화 모이어티를 가질 것이다. 동일한 2개의 표적화 모이어티를 갖는 이중특이적 리간드 또는 화합물은 상이한 단백질 표적 상에 설치된 동일한 이량체화 도메인을 표적화할 수 있을 것이다. 상이한 표적화 모이어티를 갖는 이중특이적 리간드 또는 화합물은 상이한 단백질 표적 상에 설치된 상이한 이량체화 도메인을 표적화할 수 있을 것이다.
본원에 사용된 용어 "이량체화 도메인"은 이중특이적 리간드의 결합 모이어티에 결합하는 리간드-결합 도메인을 지칭한다. "제1" 이량체화 도메인은 이중특이적 리간드의 제1 결합 모이어티에 결합하고, "제2" 이량체화 도메인은 동일한 이중특이적 리간드의 제2 결합 모이어티에 결합한다. 제1 이량체화 도메인이 (예를 들어, 본원에 논의된 바와 같은 PE를 통해) 제1 단백질에 융합되고, 제2 이량체화 도메인이 (예를 들어, 본원에 논의된 바와 같은 PE를 통해) 제2 단백질에 융합되는 경우에, 제1 및 제2 단백질은 이중특이적 리간드의 존재 하에 이량체화되고, 여기서 이중특이적 리간드는 제1 이량체화 도메인에 결합하는 적어도 1개의 모이어티 및 제2 이량체화 도메인에 결합하는 적어도 또 다른 모이어티를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "이중특이적 리간드" 또는 "이중특이적 모이어티"는 2개의 상이한 리간드-결합 도메인에 결합하는 리간드를 지칭한다. 다양한 실시양태에서, 이중특이적 모이어티 자체는 2개의 동일한 또는 2개의 상이한 화학적 모이어티의 이량체이고, 여기서 각각의 모이어티는 이량체화 도메인에 특이적으로 단단히 결합한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 소분자 화합물, 또는 펩티드, 또는 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, 리간드-결합 도메인은 펩티드 태그로서 단백질 상에 설치될 수 있는 "이량체화 도메인"이다. 다양한 실시양태에서, 각각 동일하거나 상이한 이량체화 도메인을 포함하는 2개의 단백질은 이중특이적 리간드에 대한 각각의 이량체화 도메인의 결합을 통해 이량체화되도록 유도될 수 있다. 이들 분자는 또한 "이량체화의 화학적 유도제" 또는 CID로 지칭될 수 있다. 또한, 이중특이적 리간드는 2개의 동일한 모이어티를 함께, 또는 2개의 상이한 모이어티를 함께 커플링시킴으로써 (예를 들어, 표준화 화학적 연결을 통함) 제조될 수 있으며, 여기서 각각의 모이어티는 이량체화 도메인에 단단히 특이적으로 결합한다.
다양한 측면에서, PE에 의해 설치된 이량체화 도메인은 동일하거나 상이할 수 있다.
예를 들어, 이량체화 도메인은 하기 아미노산 서열을 갖는 FKBP12일 수 있다:
Figure pct00303
또 다른 예에서, 이량체화 도메인은 합성 범핑된 FK506 모방체 (2, 도 3)에 결합하는 조작된 홀을 갖는 FKBP12의 돌연변이체인, FKBP12-F36V로 지칭되는 FKBP12의 돌연변이체일 수 있다107:
Figure pct00304
또 다른 예에서, 이량체화 도메인은 하기와 같은 시클로필린일 수 있다:
Figure pct00305
다양한 실시양태에서, 이들 이량체화 도메인의 아미노산 서열은 결합을 최적화하거나 또는 천연 표적에 대한 결합 직교성을 개선시키기 위해 변경될 수 있다. 소분자 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 PE 과정의 효율을 최적화하기 위해, 예컨대 PEgRNA 2차 구조를 감소시킴으로써 변경될 수 있다.
적합한 이량체화 도메인 및 그에 결합하는 동족 소분자 화합물의 다른 예가 하기와 같이 제공된다. 동족 소분자 화합물은 2개의 이량체화 도메인에 결합할 수 있는 이중특이적 리간드를 형성하기 위해 제2 소분자 화합물 (동일한 화합물 또는 상이한 화합물)에 (예를 들어, 화학적 링커를 통해) 커플링될 수 있음에 주목한다. 일부 경우, 예컨대 FK506 및 시클로스포린 A에서, 각각의 이량체화 (예를 들어, FK506-FK506 또는 시클로스포린 A-시클로스포린 A)는 단량체 화합물의 면역억제 활성을 감소시키거나 제거한다.
Figure pct00306
Figure pct00307
Figure pct00308
Figure pct00309
자연 발생 이중기능적 분자 및 그의 이중 표적 수용체의 다른 예는 하기와 같다. 프라임 편집은 이중 표적 수용체를 상이한 단백질에 설치하는데 사용될 수 있다. 일단 상이한 단백질이 이중기능적 분자 수용체를 함유하도록 PE에 의해 변형되면, 이중기능적 분자가 도입되어, 상이한 이량체화 도메인을 포함하도록 변형된 단백질의 이량체화가 유발될 수 있다. (1) 이중기능적 분자 및 (2) 그의 이중 표적 수용체의 쌍 형성의 예는 다음과 같다:
Figure pct00310
Figure pct00311
Figure pct00312
프라임 편집의 이러한 측면에서 사용될 수 있는 다른 이중기능적 분자의 예는 하기와 같다:
신스탑 A:
Figure pct00313
파클리탁셀:
Figure pct00314
디스코데르몰리드:
Figure pct00315
GNE-0011
Figure pct00316
ARV-825, 및
Figure pct00317
dBET1
Figure pct00318
신스탑 A, 파클리탁셀, 및 디스코데르몰리드는 미세관 안정화제이다. 따라서, 이들 화합물은 미세관 단백질을 포함하도록 PE에 의해 변형된 단백질을 이량체화하는데 사용될 수 있다. GNE-0011, ARV-825, 및 dBET1은 BRD4 결합 모티프 및 CRBN 결합 모티프를 포함한다. 따라서, 이들 화합물은 이들 표적화 도메인을 포함하도록 PE에 의해 변형된 단백질을 이량체화하는데 사용될 수 있다.
이량체화 도메인을 설치하기 위한 PEgRNA는 하기 구조를 포함할 수 있다 (도 3d 참조):
5'-[스페이서]-[gRNA 코어]-[연장 아암]-3', 여기서 연장 아암은 5'-[상동성 아암]-[편집 주형]-[프라이머 결합 부위]-3'를 포함함; 또는
5'-[연장 아암]-[스페이서]-[gRNA 코어]-3', 여기서 연장 아암은 5'-[상동성 아암]-[편집 주형]-[프라이머 결합 부위]-3'를 포함하고, 여기서 어느 하나의 구성을 갖는 "편집 주형"은 이량체화 도메인의 뉴클레오티드 서열을 포함함.
한 예에서, 인간 인슐린 수용체의 C-말단 단부에의 FKBP12 이량체화 도메인의 삽입을 위한 PEgRNA (스페이서는 밑줄표시되고, gRNA 코어는 특별한 표시가 없고, 플랩 상동성은 볼드체이고, FKBP12 삽입은 이탤릭체이고, 어닐링 영역은 볼드체 이탤릭체임):
Figure pct00319
또 다른 예에서, HEK3 유전자좌에의 FKBP12 이량체화 도메인의 삽입을 위한 PEgRNA (최적화를 위함):
Figure pct00320
이량체화 도메인을 설치하기 위한 표적 단백질은 특히 제한되지는 않지만; 이중특이적 리간드의 존재 하에서의 그의 이량체화가 (일단 PE에 의해 변형되면) 일부 유리한 생물학적 효과, 예를 들어 신호전달 경로, 감소된 면역반응성 등을 생성한다는 점에서 유리하다. 다양한 측면에서, 이량체화 도메인의 PE-의존성 설치를 통해 이량체화될 표적 단백질은 동일한 단백질 또는 상이한 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 단백질은 이량체화되는 경우 1종 이상의 하류 생물학적 캐스케이드, 예를 들어, 신호 전달 캐스케이드, 인산화 등을 촉발한다. PE가 이량체화 도메인을 설치하는데 사용될 수 있는 예시적인 표적 단백질은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00321
한 측면에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 살아있는 세포 또는 환자에서 관심 표적 단백질을 코딩하는 1개 이상의 유전자 내로 이량체화 도메인을 코딩하는 서열을 설치하는데 사용될 수 있다. 이는 "프라임 편집-CID 시스템"으로 지칭될 수 있으며, 여기서 CID는 각각 PE에 의해 설치된 이량체화 도메인에 융합된 표적 단백질의 이량체화를 유도하는 이중특이적 리간드이다. 이러한 편집 단독은 생리학적 효과를 갖지 않아야 한다. 전형적으로 각각이 표적 단백질의 카피에 융합된 2개의 이량체화 도메인에 동시에 결합할 수 있는 이량체 소분자인 이중특이적 리간드의 투여 시, 이중특이적 리간드는 표적화된 단백질의 이량체화를 유발한다. 이어서, 이러한 표적 단백질 이량체화 사건은 생물학적 신호전달 사건, 예컨대 적혈구생성 또는 인슐린 신호전달을 유도한다. 프라임 편집을 사용한 소분자 결합 단백질 (즉, 이량체화 도메인)을 코딩하는 유전자의 게놈 통합에 의해 편리한 소분자 약물 (즉, 이중특이적 리간드)의 제어 하에 이량체화-유도된 생물학적 과정, 예컨대 수용체 신호전달을 배치하는 신규 방법이 본원에 기재된다.
단백질 이량체화는 편재하는 생물학적 과정이다. 특히, 많은 막-결합 수용체의 동종이량체화는 종종 막대한 생물학적 결과를 갖는 신호전달 캐스케이드를 개시하는 것으로 공지되어 있다. 약물로서 사용하도록 승인된 다수의 소분자 천연 생성물은 그의 작용 메카니즘의 일부로서 단백질 이량체화의 화학적 유도제로서 작용한다.92 예를 들어, FK506은 FKBP12에 단단히 결합하고, 생성된 소분자-단백질 복합체는 이어서 포스파타제 칼시뉴린에 결합하여, T 세포 수용체 신호전달의 단계를 억제한다.93 마찬가지로, 시클로스포린 A는 시클로필린 및 칼시뉴린의 이량체화를 유도하고, 라파마이신은 FKBP 및 mTOR의 이량체화를 유도한다.93,94
한 실시양태에서, FK506:FKBP12 및 시클로스포린 A:시클로필린 소분자:단백질 결합 상호작용의 선택적 고친화도 결합을 사용하여, 이량체화의 합성 화학적 유도제를 또한 개발하였다. 한 예에서, FK1012로 명명된 FK506의 2개의 유닛으로 구성된 소분자는 신호전달 수용체의 세포질 도메인을 FKBP12로 태그부착한 경우 신호 전달에 영향을 미치는 것으로 제시되었다.95 이량체화의 화학적 유도제 (CID)는 이후에 다수의 신호전달 경로를 제어하는데 사용되어 왔다.96-103
생물학적 과정을 연구하기 위한 유용한 도구이지만, 치료 용도를 위한 합성 CID가 직면한 하나의 도전과제는 환자 내로 FKBP12- 또는 시클로필린-표적 단백질 키메라를 도입하는 것이 도전과제라는 것이다.
본 개시내용은 이전에 접근불가능한 치료 방법을 생성하기 위해 2가지의 개념을 합한다. 제1 개념은 살아있는 세포에서 표적화된 삽입을 포함한 정확한 게놈 편집을 가능하게 하는, 본원에 기재된 프라임 편집이다. 제2 개념은 세포 배양에서 신호전달 및 올리고머화 과정에 대한 소분자 제어를 가능하게 하는 강력한 도구인 화학적-유도된 이량체화이다.
단백질 이량체화에 대한 화학적 제어가 유익한 치료 효과를 가질 수 있는 특정 사례가 확인되었다.
인슐린 수용체는 세포질 키나제 도메인의 인산화에 의해 세포외 도메인에 대한 인슐린 결합에 반응하는 이종사량체 막횡단 단백질이다.104 막-국재화 성분, 인슐린 수용체의 C-말단 키나제 도메인, 및 FKBP12의 3개의 카피로 구성된 조작된 키메라 단백질은 FK1012에 반응하고, 세포 배양에서 인슐린 반응을 개시한다.99 유사하게, 환자 세포에서 천연 인슐린 수용체의 키나제 도메인의 C-말단 단부에 대한 FKBP12의 융합은 FK1012-의존성 인산화 및 인슐린 신호전달 캐스케이드의 개시를 가능하게 할 것으로 예상된다. 이 시스템은 인슐린을 만들 수 없거나 (예를 들어, 제1형 당뇨병), 또는 인슐린에 약하게 반응하는 (예를 들어, 제2형 당뇨병) 환자에서 인슐린 사용을 대체하거나 보완할 수 있다.
추가적으로, 에리트로포이에틴은 에리트로포이에틴 수용체 (EpoR)에 결합하여 Jak/STAT 신호전달 캐스케이드의 활성화를 발생시키는 이량체화 또는 사전형성된 수용체 이량체의 입체형태적 변화를 유도함으로써 적혈구 증식을 자극한다.105 FKBP12로 태그부착된 EpoR의 막-고정된 세포질 도메인의 FK1012-유도된 올리고머화는 신호전달 Jak/STAT 신호전달 캐스케이드를 개시하고 세포 증식을 촉진하기에 충분하다는 것이 입증되었다.106 환자 세포에서의 프라임 편집에 의해 FKBP12를 천연 EpoR에 융합시키는 것은 적혈구 증식 (적혈구생성)에 대한 FK1012-유도된 제어를 가능하게 할 것으로 예상된다. 이 시스템은 빈혈 환자에서 적혈구 성장을 촉발하는데 사용될 수 있다. FK1012-유도성 EpoR은 또한 생체외 조작을 거친 혈액 세포에 대한 생체내 선택 마커로서 사용될 수 있다.
원칙적으로, 임의의 수용체 티로신 키나제는 프라임 편집-CID 치료를 위한 실행가능한 표적일 수 있다. 하기 표는 인간 게놈 내의 모든 수용체 티로신 키나제의 목록을 포함한다.110
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프라임 편집-CID 시스템에는 수많은 이점이 존재한다. 하나의 이러한 이점은, 전형적으로 제조, 비용, 전달, 생산, 또는 저장에 있어서 문제를 야기하는 단백질인 내인성 리간드를, IV 또는 주사에 의해 투여되는 대신 경구로 투여될 수 있는 약물-유사 소분자로 대체할 수 있고, FDA-승인된 약물로부터 용이하게 제조되고 (또는 그 자체가 이미 약물이고), 전형적으로 단백질 약물과 연관된 특별한 생산 또는 저장 비용을 초래하지 않는다는 것이다. 또 다른 이점은 편집 단독이 생리학적 효과를 갖지 않는다는 것이다. 표적 단백질 이량체화의 양은 소분자 CID를 투여하는 것에 의해 제어될 수 있다. 또한, 표적 단백질 이량체화는 단량체 형태의 CID를 부가하는 것에 의해 용이하고 빠르게 가역적이다. 또 다른 이점은 단일 리간드가 다중 수용체를 표적화하는 경우에, 단지 1개의 수용체를 프라임-편집하는 것에 의해 선택성이 달성될 수 있다는 것이다. 마지막으로, 프라임 편집에 사용되는 전달 방법에 의존하여, 편집을 국한된 조직 또는 기관으로 제한하여, 특정 영역에서만 유도성 수용체 활성화를 가능하게 하는 것이 또한 가능할 수 있다.
2개의 개별 편집 사건이 높은 수준으로 발생할 수 있을 정도로 프라임 편집에 의한 편집 효율이 충분히 높은 경우에, 2개의 관심 단백질을 상이한 소분자 결합 도메인 (예컨대 FKBP 및 시클로필린)으로 태그부착하고, 소분자 이종이량체 (예컨대 FK506-시클로스포린 A 이량체)와의 이종이량체화를 유도하는 것이 또한 가능할 것이다.
천연 단백질에 대한 FKBP12 또는 다른 소분자 결합 단백질의 융합은 일반적으로 조직 배양에서 플라스미드로부터의 과다발현에 의해 달성되었다. 후속 화학적-유도된 이량체화는 융합 단백질을 생산하는 세포로의 표현형 변화를 유도하는 것으로 입증되었다.
하기 참고문헌은 상기 섹션 G에서 인용되며, 본원에 참조로 포함된다.
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Figure pct00324
L. 세포 데이터 기록을 위한 프라임 편집의 사용
프라임 편집제 및 생성된 게놈 변형은 또한 세포 과정 및 발생을 연구하고 기록하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 프라임 편집제는 세포에 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 갖는 융합 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 제공하고, 세포에 PEgRNA를 코딩하는 적어도 제2 핵산 서열을 제공함으로써 세포에 대한 자극의 존재 및 지속기간을 기록하는데 사용될 수 있다. 제1, 제2, 또는 둘 다의 핵산 서열은 세포 자극에 반응성인 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되어 융합 단백질 및/또는 PEgRNA의 발현을 유도함으로써 세포 내에서 표적 서열의 변형을 유발한다.
본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 세포 바코딩 및 계통 추적에 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각의 세포를 고유한 게놈 바코드로 바코딩함으로써, 프라임 편집제는 1개 이상의 표적 서열에 만들어진 변형에 기초하여 계통수의 구축을 가능하게 함으로써 세포 계통 지도를 밝히는 것을 도울 수 있다. 전구 세포로부터 출발하여, 프라임 편집제 시스템은 전체 유기체의 단일 세포에 대한 세포-운명 지도를 구축하는 것을 가능하게 할 수 있으며, 이는 1개 이상의 표적 서열에 만들어진 변형을 분석함으로써 해독될 수 있다. 세포의 계통을 추적하는 방법은 napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 갖는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하고, PEgRNA를 코딩하는 적어도 1개의 제2 핵산을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 융합 단백질 및 PEgRNA를 사용하여 1개 이상의 표적 서열에 1개 이상의 변형을 창출하여 고유한 세포 바코드를 생성함으로써, 고유한 세포 바코드를 사용하여 제1 세포로부터 발생한 임의의 세포의 계통의 추적을 가능하게 할 수 있다. 세포 데이터 기록 및 계통 추적 둘 다를 위한 프라임 편집제의 사용은 실시예 13에 추가로 기재된다.
프라임 편집제는 게놈 표적 서열 또는 통합된 미리 설계된 서열을 변형시킴으로써 계통 추적 및 세포 신호전달 기록 둘 다를 수행할 수 있다. 프라임 편집제는 Cas9 닉카제 단편 (SpCas9 H840A 변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 및 리버스 트랜스크립타제 도메인을 조작된 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)와 함께 포함하는 합성 융합 단백질을 사용한다. 함께, 이들 성분은 특정 게놈 서열 또는 통합된 미리 설계된 서열을 표적화하고, 미리 결정된 편집을 설치한다. PEgRNA는 표적 게놈 서열 및 편집된 결과 둘 다를 명시하기 때문에, 고도로 특이적이고 제어된 게놈 변형은 동일한 세포 내에서 다중 PEgRNA를 사용하여 동시에 달성될 수 있다. 접근가능한 게놈 변형은 모든 단일 뉴클레오티드 치환, 작은 크기 내지 중간 크기의 서열 삽입, 및 작은 크기 내지 중간 크기의 결실을 포함한다. 이러한 게놈 편집 기술의 다용성은 세포 내에서 일시적으로 커플링된 신호-특이적 기록을 가능하게 할 수 있다.
세포 데이터 기록을 위한 프라임 편집제의 사용은 세포 수명의 과정에 걸쳐 내인성 또는 외인성 자극의 강도 및/또는 지속기간을 기록하기 위한 조성물 (예를 들어, 핵산), 세포, 시스템, 키트, 및 방법을 포함할 수 있다. 세포 데이터 기록 시스템은 세포에서 자극 또는 변화에 반응하여 표적화되고 서열-명시된 게놈 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 생성함으로써 변화를 유도하도록 융합 단백질의 발현을 유도하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 napDNAbp (예를 들어, Cas9 도메인) 및 리버스 트랜스크립타제로 이루어진 융합 단백질을 포함할 수 있다. 2가지 별개의 상태 (즉, "온" 또는 "오프") 중 하나로 정보 (예를 들어, 자극의 존재 또는 부재)를 저장하는 디지털 메모리 장치와 대조적으로, 이들 세포 데이터 기록기는 1개 이상의 자극의 강도 (즉, 진폭) 및 지속기간 둘 다를 반영하는 방식으로 세포 DNA에 영구적인 마크를 유도할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 세포 데이터 기록 시스템은, 예를 들어 소분자, 단백질, 펩티드, 아미노산, 대사물, 무기 분자, 유기금속 분자, 유기 분자, 약물 또는 약물 후보, 당, 지질, 금속, 핵산, 내인성 또는 외인성 신호전달 캐스케이드의 활성화 동안 생산된 분자, 빛, 열, 소리, 압력, 기계적 응력, 전단 응력, 또는 바이러스 또는 다른 미생물에 대한 노출을 포함한 다중 세포 상태를 동시에 기록하는 능력을 갖는다. 이들 세포 데이터 기록기는 판독 (예를 들어, 세포 DNA에서의 변화)을 측정하기 위해 서열분석 기술 (예를 들어, 고처리량 서열분석)을 사용할 수 있고, 자극의 기록 또는 자극에 의해 유도된 세포 DNA에서의 변화(들)의 판독 둘 다를 위해 대형 세포 집단에 의존하지 않는다.
일반적으로, 세포에 사용하기 위한 본원에 제공된 세포 데이터 기록기 시스템은 napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제로 이루어진 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 플라스미드를 코딩하는 핵산 서열은 프로모터 (예를 들어, 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터)에 작동가능하게 연결된다. 자극이 존재하거나 또는 세포 상태에서 변화가 발생할 때, 자극은 융합 단백질의 발현을 유도한다. 또한, napDNAbp와 회합하고 napDNAbp 또는 융합 단백질을 표적 서열로 지시하는 적어도 1개의 PEgRNA를 코딩하는 1개 이상의 핵산이 세포 내에 존재한다 (즉, PEgRNA는 표적 서열에 상보적임). PEgRNA를 코딩하는 핵산은 프로모터 (예를 들어, 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터)에 또한 작동가능하게 연결될 수 있거나 또는 대안적으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 정확한 자극, 또는 정확한 자극의 세트 하에, 융합 단백질 및 PEgRNA 둘 다는 세포에서 발현되고, PEgRNA는 융합 단백질과 회합하여 이를 표적 서열로 지시한다. 이러한 표적 서열은 프라임 편집제의 활성을 기록함으로써, 자극 또는 자극의 세트의 존재, 또는 세포 상태에서의 변화를 기록한다. 1개 초과의 PEgRNA 서열이 또한 세포에 존재할 수 있고, 융합 단백질을 별개의 표적 서열로 지시할 수 있는 이들 추가의 PEgRNA 서열은 각각 상이한 자극의 존재를 감지하는 프로모터에 작동가능하게 연결되어, 복잡한 세포 데이터 기록 시스템이 자극 또는 자극의 세트의 존재 및 지속기간의 순서화된 기록을 위해 구축되도록 할 수 있다. 일부 경우에, 세포 데이터 기록 시스템의 성분 (예를 들어, 융합 단백질 및 PEgRNA) 중 1종 이상은 세포에서 구성적으로 발현될 수 있다. 조성물과 함께 사용하기 위한 세포 데이터 기록 시스템의 예시적인 성분이 본원에 기재된다. 본원에 제공된 성분의 추가의 적합한 조합은 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 따라서 본 개시내용의 범주에 포함된다.
표적화된 앰플리콘 서열분석 및/또는 RNA 서열분석에 의해 서열분석될 수 있는 (이는 단일 세포 기록 실험의 경우 특히 가치있음) DNA 표적의 반복된 변형은 신호전달 캐스케이드의 활성화, 대사 상태, 및 세포 분화 프로그램을 포함한 많은 중요한 생물학적 과정을 기록하는데 사용될 수 있다. 내부 및 외부 세포 신호를 게놈 내의 서열 변형과 연관시키는 것은 신호 반응성 프로모터가 존재하는 임의의 신호에 대해 가능하다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 원핵 시스템에 사용하기에 적합한 프로모터 (즉, 박테리아 프로모터)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 진핵 시스템에 사용하기에 적합한 프로모터 (즉, 진핵 프로모터)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 포유동물 (예를 들어, 인간) 시스템에 사용하기에 적합한 프로모터 (즉, 포유동물 프로모터)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 자극에 의해 유도된다 (즉, 유도성 프로모터). 일부 실시양태에서, 자극은 소분자, 단백질, 펩티드, 아미노산, 대사물, 무기 분자, 유기금속 분자, 유기 분자, 약물 또는 약물 후보, 당, 지질, 금속, 핵산, 내인성 또는 외인성 신호전달 캐스케이드의 활성화 동안 생산된 분자, 빛, 열, 소리, 압력, 기계적 응력, 전단 응력, 또는 바이러스 또는 다른 미생물, pH의 변화, 또는 산화/환원 상태의 변화이다. 일부 실시양태에서, 자극은 빛이다. 일부 실시양태에서, 자극은 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 자극은 소분자이다. 일부 실시양태에서, 자극은 항생제이다. 일부 실시양태에서, 자극은 안히드로테트라시클린 또는 독시시클린이다. 일부 실시양태에서, 자극은 당이다. 일부 실시양태에서, 자극은 아라비노스, 람노스, 또는 IPTG이다. 일부 실시양태에서, 자극은 활성화된 신호전달 캐스케이드 동안 생산된 신호전달 분자 (예를 들어, 활성화된 Wnt 신호전달 캐스케이드 동안 생산된 베타-카테닌)이다. 신호전달 분자를 검출하는 추가의 프로모터는, 예를 들어 면역 반응 (IL-2 프로모터), cAMP 반응성 요소 (CREB), NFκB 신호전달, 인터페론 반응, P53 (DNA 손상), Sox2, TGF-β 신호전달 (SMAD), Erk (예를 들어, 활성화된 Ras/Raf/Mek/Erk 캐스케이드로부터), PI3K/AKT (예를 들어, 활성화된 Ras/PI3K/Akt 캐스케이드로부터), 열 쇼크, Notch 신호전달, Oct4, 아릴 탄화수소 수용체, 또는 AP-1 전사 인자를 포함한 내인성 경로를 기록하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 유도하기 위해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 표 3에 열거된 프로모터이다. 원핵 및 진핵 시스템 둘 다에 사용하기 위한 추가의 적합한 프로모터는 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 본 개시내용의 범주 내에 있다.
프라임 편집제는 또한 세포 계통을 추적하는데 사용될 수 있다. 반복된 서열 변형을 사용하여 고유한 세포 바코드를 생성하여 개별 세포를 추적할 수 있다. 바코드의 어레이, 그의 순서, 및 크기는 모두 세포 계통을 추론하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상동성 서열 (즉, Cas9 닉 위치의 3' 서열), 및 특히 연관된 바코드를 갖는 상동성 서열의 삽입은 특히 유용한 계통 프라임 편집제 전략인 것으로 보인다. 이들 시스템은 연속 라운드의 편집이 동일한 세포에서 다른 PEgRNA 편집 사건에 의해 변형될 수 없는 PEgRNA 카세트로부터의 바코드의 삽입을 발생시키도록 설계될 수 있다. 바코딩 시스템은 주어진 자극과 연관될 수 있는 다중 바코드를 이용할 수 있다. 이 시스템은 표적 프로토스페이서의 대부분은 보존할 수 있지만, 시드 서열, PAM, 및 하류 인접 뉴클레오티드를 변경시킬 수 있다. 이는 사용될 PEgRNA의 유의한 재-설계 없이 다중 신호가 1개의 편집 유전자좌에 연결되는 것을 가능하게 한다. 전략은 단일 유전자좌에서 다수의 세포 자극 (내부 또는 외부)에 반응하여 멀티플렉스화 바코드 삽입을 가능하게 할 수 있다. 이는 고유 바코드가 존재하는 만큼 많은 신호의 강도, 지속기간, 및 순서의 기록을 가능하게 할 수 있다 (4^N개의 가능한 바코드를 생성하기 위해 다중 N개의 뉴클레오티드로 설계될 수 있음, 예를 들어 5-nt 바코드는 한 번에 4^5 또는 1024개의 고유 신호의 기록을 가능하게 할 것임). 이 시스템은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 사용될 수 있다.
M. 생체분자 활성을 조정하기 위한 프라임 편집의 사용
본원에 기재된 프라임 편집제의 사용은 또한 생체분자, 예컨대 DNA, RNA, 및 단백질의 세포하 국재화 및 변형 상태를 조절하는데 사용될 수 있다. 특정 생물학적 기능, 예컨대 전사 제어, 세포 대사, 및 신호 전달 캐스케이드는 세포 내의 특정한 위치에서 조심스럽게 조직된다. 단백질을 이들 및 다른 고유한 세포 구획으로 수송하는 능력은 다수의 생물학적 과정을 변경할 기회를 제공할 수 있다.
따라서, 프라임 편집은 유전자 코딩된 신호를 갖는 생체분자 (예를 들어 단백질, 지질, 당, 및 핵산)의 변경된 변형 상태 및 세포하 트래픽킹을 가능하게 할 유전자 코딩된 핸들을 설치하는데 사용될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 프라임 편집제-매개된 의약에 대한 표적 생체분자는 DNA이다. 예를 들어, DNA는 표적 유전자좌의 접근성을 변화시키는 다수의 DNA 서열을 설치함으로써 변형될 수 있으며, 이는 목적하는 서열의 증가 또는 감소된 전사로 이어질 수 있다. 다른 실시양태에서, 프라임 편집제-매개된 의약에 대한 표적 생체분자는 RNA이다. 예를 들어, RNA의 활성은 그의 세포 국재화, 상호작용 파트너, 구조적 역학, 또는 폴딩 열역학을 변화시킴으로써 변형될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프라임 편집제-매개된 의약에 대한 표적 생체분자는 단백질이다. 단백질은 번역후 변형에 영향을 미치기 위해 변형될 수 있거나, 단백질 모티프는 단백질의 세포하 국재화를 변화시키기 위해 설치될 수 있거나, 또는 단백질은 단백질-단백질 복합체화 사건 내에 존재하는 그의 능력을 생성하거나 파괴시키기 위해 변형될 수 있다.
프라임 편집의 이러한 적용은 실시예 14에 추가로 기재될 수 있다.
DNA 변형
PE-매개된 변형을 위한 하나의 표적 생체분자는 DNA이다. DNA에 대한 변형은 표적 유전자좌의 접근성을 변화시키는 다수의 DNA 서열을 설치하기 위해 이루어질 수 있다. 염색질 접근성은 유전자 전사 산출을 제어한다. 염색질 압축 효소를 동원하기 위한 마크의 설치는 이웃 유전자의 전사 산출을 감소시킬 것인 반면, 염색질 개방과 연관된 서열의 설치는 영역을 보다 접근가능하게 하여 이어서 전사를 증가시킬 것이다. 천연 조절 서열을 반영한 보다 복잡한 서열 모티프의 설치는 전형적으로 특정한 생물학적 전례를 갖지 않을 수 있는 많은 수의 단일 유형의 마크를 설치하는 상이한 후성 판독기, 기록기, 또는 지우기 효소-도구에 대한 현재 이용가능한 dCas9 융합체보다 더 미묘하고 생물학적으로 민감한 조절을 제공할 것이다. 2개의 유전자좌를 근접하게 만들거나 또는 유전자좌를 핵막과 접촉시킬 서열의 설치는 또한 급성장중인 3-D 게놈 아키텍처 분야에서 입증된 바와 같이 그러한 유전자좌의 전사 산출을 변경시킬 것이다.
RNA 변형
RNA에 대한 변형은 또한 그의 세포 국재화, 상호작용 파트너, 구조적 역학, 또는 폴딩 열역학을 변화시킴으로써 그의 활성을 변경시키기 위해 이루어질 수 있다. 번역 중지 또는 프레임시프팅을 유발할 모티프의 설치는 다양한 mRNA 프로세싱 메카니즘을 통해 mRNA 종의 존재비를 변화시킬 수 있다. 컨센서스 스플라이스 서열을 변형시키는 것은 또한 상이한 RNA 종의 존재비 및 우세도를 변경시킬 것이다. 상이한 스플라이스 이소형의 상대비를 변화시키는 것은 예측가능하게 단백질 번역 생성물의 비에서의 변화로 이어질 것이며, 이는 많은 생물학적 경로를 변경시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 대 핵 DNA 복구 단백질의 균형을 이동시키는 것은 화학요법 시약에 대한 상이한 암의 복원력을 변경시킬 것이다. 또한, RNA는 신규 단백질 표적에 대한 결합을 가능하게 하는 서열로 변형될 수 있다. 세포 단백질에 고친화도로 결합하는 다수의 RNA 압타머가 개발되었다. 이들 압타머 중 하나의 설치는 그의 번역, 생물학적 활성을 막을 단백질 표적에 대한 결합을 통해 상이한 RNA 종을 격리시키거나, 또는 RNA 종을 특정 세포하 구획으로 가져오는데 사용될 수 있다. 생체분자 분해는 또 다른 부류의 국재화 변형이다.
예를 들어, RNA 메틸화는 세포 내에서 RNA를 조절하는데 사용된다. 메틸화를 위한 컨센서스 모티프는 PE에 의해 표적 RNA 코딩 서열 내로 도입될 수 있다. RNA는 또한 넌센스 매개된 붕괴 기구 또는 다른 핵산 대사 경로를 지시하여 표적 RNA 종을 분해하는 서열을 포함하도록 변형될 수 있으며, 이는 세포에서 RNA의 풀을 변화시킬 것이다. 추가적으로, RNA 종은 그의 응집 상태를 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 서열은 관심 단일 RNA 또는 다중 RNA 상에 설치되어, 번역 또는 신호전달에 비효과적인 기질이 되게 할 RNA 엉킴을 생성할 수 있다.
단백질 변형
번역후 변형 (PTM)을 통한 단백질에 대한 변형은 또한 PE에 의해 수행될 수 있는 생체분자 조작의 중요한 부류를 나타낸다. RNA 종과 같이, 세포 내의 단백질의 존재비를 변화시키는 것은 PE의 중요한 능력이다. 편집은 오픈 리딩 프레임 내에 정지 코돈을 설치하기 위해 수행될 수 있고-이는 편집된 DNA 서열에 의해 전장 생성물이 생산되는 것을 제거할 것이다. 대안적으로, 표적 단백질에 대해 단백질 분해 속도가 변경되도록 하는 펩티드 모티프가 설치될 수 있다. 유전자 본체 내로의 분해 태그의 설치는 세포 내의 단백질의 존재비를 변경시키는데 사용될 수 있다. 또한, 소분자에 의해 유도되는 데그론의 도입은 단백질 분해에 대한 시간적 제어를 가능하게 할 수 있다. 이는 연구원이 주어진 표적의 소분자-매개된 치료 단백질 분해가 실행가능한 치료 전략이었는지 여부를 용이하게 평가할 수 있기 때문에 연구 및 치료 둘 다에 중요한 영향을 미칠 수 있다. 단백질 모티프는 또한 단백질의 세포하 국재화를 변화시키기 위해 설치될 수 있다. 아미노산 모티프는 핵, 미토콘드리아, 세포막, 퍼옥시솜, 리소솜, 프로테아솜, 엑소솜 등을 포함한 다수의 세포하 구획으로 단백질을 우선적으로 트래픽킹하도록 설치될 수 있다.
PTM 기구에 의해 변형된 모티프를 설치하거나 파괴하는 것은 단백질 번역후 변형을 변경시킬 수 있다. 인산화, 유비퀴틸화, 글리코실화, 지질화 (예를 들어 파르네실화, 미리스토일화, 팔미토일화, 프레닐화, GPI 앵커), 히드록실화, 메틸화, 아세틸화, 크로토닐화, SUMO화, 디술피드 결합 형성, 측쇄 결합 절단 사건, 폴리펩티드 백본 절단 사건 (단백질분해), 및 다수의 다른 단백질 PTM이 확인되었다. 이들 PTM은 종종 세포하 국재화를 변화시킴으로써 단백질 기능을 변화시킨다. 실제로, 키나제는 종종 인산화 사건을 통해 하류 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. 표적 포스포사이트의 제거는 신호 전달을 방지할 것이다. 전장 단백질 발현을 유지하면서 임의의 PTM 모티프를 부위-특이적으로 제거하거나 설치하는 능력은 기본 연구 및 치료 둘 다에 대한 중요한 진보일 것이다. PE의 서열 설치 범주 및 표적 윈도우는 이를 넓은 PTM 변형 공간에 매우 적합하게 만든다.
지질화 부위의 제거는 세포 막으로의 단백질의 트래픽킹을 방지할 것이다. 번역후 변형 과정을 표적화하는 현행 치료에 대한 주요 한계는 그의 특이성이다. 파르네실 트랜스퍼라제 억제제는 세포 막에서 KRAS 국재화를 제거하는 그의 능력에 대해 광범위하게 시험되었다. 불행하게도, 파르네실화의 전반적인 억제는 이들 소분자의 광범위한 사용을 막는 수많은 오프 타겟 효과를 가져온다. 유사하게, 소분자를 사용한 단백질 키나제의 특이적 억제는 인간 게놈의 큰 크기 및 다양한 키나제 사이의 유사성으로 인해 매우 도전과제일 수 있다. PE는 전반적인 효소 억제 대신 변형 부위의 제거에 의해 표적 단백질의 변형의 억제를 가능하게 하기 때문에, 이러한 특이성 문제에 대한 잠재적 해결책을 제공한다. 예를 들어, KRAS에서의 지질화된 펩티드 모티프의 제거는 파르네실 트랜스퍼라제 억제 대신에 사용될 수 있는 표적화된 접근법일 것이다. 이러한 접근법은 막 결합되도록 설계되지 않은 단백질 상에 지질-표적화 모티프를 설치함으로써 표적 단백질 활성을 억제하는 것의 기능적 반전이다.
PE는 또한 단백질-단백질 복합체화 사건을 촉발하는데 사용될 수 있다. 단백질은 종종 그의 생물학적 활성을 실행하기 위해 복합체 내에서 기능한다. PE는 이들 복합체 내에 존재하는 단백질의 능력을 생성하거나 파괴하는데 사용될 수 있다. 복합체 형성 사건을 제거하기 위해, 복합체화를 불리하게 하도록 단백질:단백질 계면을 따른 아미노산 치환 또는 삽입이 설치될 수 있다. SSX18은 중요한 히스톤-재형성 복합체인 BAF 복합체의 단백질 성분이다. SSX18에서의 돌연변이는 활막 육종을 구동한다. PE는 SSX18이 복합체에서 그의 단백질 파트너에 결합하는 것을 방지하는 측쇄를 설치하여 그의 종양원성 활성을 방지하는데 사용될 수 있다. PE는 또한 병원성 돌연변이를 제거하여 이 단백질의 WT 활성을 회복시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, PE는 단백질을 그의 천연 복합체 내에 유지시키거나, 또는 그의 활성을 억제하기 위해 그의 천연 활성과 비관련된 상호작용에 참여하도록 유도하는데 사용될 수 있다. 하나의 상호작용 상태를 또 다른 것에 비해 유지시키는 복합체를 형성하는 것은 중요한 치료 양식을 나타낼 수 있다. 단백질: 단백질 계면을 변경시켜 상호작용 Kd를 감소시키는 것은 이들 단백질을 서로 더 오래 점착 상태로 유지시킬 것이다. 단백질 복합체는 질환에서 신경모세포종 신호전달 캐스케이드를 구동하지만 달리 다른 세포에서는 건강한 전사 제어에 참여하는 n-myc와 같은 다중 신호전달 복합체를 가질 수 있다. PE는 건강한 상호작용 파트너와의 n-myc 회합을 구동하고 종양원성 상호작용 파트너에 대한 그의 친화도는 감소시키는 돌연변이를 설치하는데 사용될 수 있다.
섹션 I에 인용된 참고문헌
각각의 하기 참고문헌은 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00325
N. 프라임 편집을 위한 PEgRNA의 개선된 설계 측면
다른 실시양태에서, 프라임 편집 시스템은 프라임 편집 효율을 개선시킬 수 있는 PEgRNA 설계 및 전략의 사용을 포함할 수 있다. 이들 전략은 프라임 편집에 요구되는 다단계 공정으로 인해 존재하는 일부 문제를 극복하고자 한다. 예를 들어, PEgRNA 내에서 형성될 수 있는 불리한 RNA 구조는 PEgRNA로부터 게놈 유전자좌 내로 카피되는 DNA 편집의 억제를 발생시킬 수 있다. 이들 제한은 PEgRNA 성분의 재설계 및 조작을 통해 극복될 수 있다. 이들 재설계는 프라임 편집제 효율을 개선시킬 수 있고, 게놈 내로의 보다 긴 삽입 서열의 설치를 가능하게 할 수 있다.
따라서, 다양한 실시양태에서, PEgRNA 설계는 비-폴리머라제 III (pol III) 프로모터로부터 기능적 PEgRNA의 효율적인 발현을 가능하게 함으로써 보다 긴 PEgRNA를 생성할 수 있고, 이는 부담스러운 서열 요건에 대한 필요를 피할 것이다. 다른 실시양태에서, 코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드는 시스템의 효능을 개선시키기 위해 개선될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제 (RT) 프로세싱성을 개선시키기 위해 PEgRNA에 대해 변형이 이루어질 수 있고, 이는 표적화된 게놈 유전자좌에서 더 긴 서열의 삽입을 가능하게 할 것이다. 다른 실시양태에서, 안정성을 개선시키고/거나, RT 프로세싱성을 증진시키고/거나, PEgRNA의 미스폴딩을 방지하고/거나, 게놈 편집에 중요한 추가의 인자를 동원하기 위해 PEgRNA의 5' 및/또는 3' 말단에 RNA 모티프가 부가될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, PEgRNA 스캐폴드를 개선시키고 프라임 편집제 효율을 증진시킬 수 있는 주어진 서열 표적에 대한 PEgRNA의 진화를 위한 플랫폼이 제공된다. 이들 설계는 임의의 Cas9 또는 그의 진화된 변이체에 의해 인식되는 임의의 PEgRNA를 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
프라임 편집의 이러한 적용은 실시예 15에 추가로 기재될 수 있다.
PEgRNA는 PEgRNA의 특성 및/또는 특징을 변형시켜 프라임 편집의 효능을 개선시킬 수 있는 추가의 설계 개선을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 이들 개선은 (1) 부담스러운 서열 요건 없이 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할, 비-폴리머라제 III (pol III) 프로모터로부터의 기능적 PEgRNA의 효율적인 발현을 가능하게 하는 설계; (2) 효능을 개선시킬 수 있는 코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드에 대한 개선; (3) RT 프로세싱성을 개선시켜 표적화된 게놈 유전자좌에서 보다 긴 서열의 삽입을 가능하게 하는, PEgRNA에 대한 변형; 및 (4) PEgRNA 안정성을 개선시키거나, RT 프로세싱성을 증진시키거나, PEgRNA의 미스폴딩을 방지하거나, 또는 게놈 편집에 중요한 추가의 인자를 동원하는, PEgRNA의 5' 또는 3' 말단에 대한 RNA 모티프의 부가를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 상이한 카테고리 중 하나 이상에 속할 수 있다.
한 실시양태에서, PEgRNA는 보다 큰 연장 아암을 갖는 보다 긴-길이의 PEgRNA의 발현을 개선시키기 위해 polIII 프로모터와 함께 설계될 수 있다. sgRNA는 전형적으로 U6 snRNA 프로모터로부터 발현된다. 이러한 프로모터는 pol III을 동원하여 회합된 RNA를 발현시키고, 이는 핵 내에 보유된 짧은 RNA의 발현에 유용하다. 그러나, pol III은 고도로 프로세싱성이 아니고, 수백개의 뉴클레오티드 길이보다 더 긴 RNA를 효율적인 게놈 편집에 요구되는 수준으로 발현시킬 수 없다. 추가적으로, pol III은 U 스트레치에서 멈추거나 종결될 수 있으며, 이는 잠재적으로 PEgRNA를 사용하여 삽입될 수 있는 서열 다양성을 제한한다. 폴리머라제 II (예컨대 pCMV) 또는 폴리머라제 I (예컨대 U1 snRNA 프로모터)을 동원하는 다른 프로모터를 보다 긴 sgRNA를 발현시키는 그의 능력에 대해 검사하였다. 그러나, 이들 프로모터는 전형적으로 부분적으로 전사되고, 이는 발현된 PEgRNA에서 스페이서의 5'의 여분의 서열을 생성할 것이며, 이는 부위-의존성 방식으로 현저하게 감소된 Cas9:sgRNA 활성을 생성하는 것으로 제시되었다. 추가적으로, pol III-전사된 PEgRNA는 단순히 연속 6-7개 U에서 종결될 수 있지만, pol II 또는 pol I로부터 전사된 PEgRNA는 상이한 종결 신호를 필요로 할 것이다. 종종 이러한 신호는 또한 폴리아데닐화를 발생시키며, 이는 핵으로부터 PEgRNA의 바람직하지 않은 수송을 발생시킬 것이다. 유사하게, pol II 프로모터, 예컨대 pCMV로부터 발현된 RNA는 전형적으로 5'-캡핑되며, 이는 또한 그의 핵 유출을 발생시킨다.
이전에, 린 및 동료들은 긴-비코딩 RNA- (lncRNA) 태그부착된 sgRNA의 생산을 위해 다양한 발현 플랫폼을 스크리닝하였다183. 이들 플랫폼은 pCMV로부터 발현되고 인간으로부터의 MALAT1 ncRNA로부터의 ENE 요소184, KSHV로부터의 PAN ENE 요소185, 또는 U1 snRNA로부터의 3' 박스186에서 종결하는 RNA를 포함한다. 특히, MALAT1 ncRNA 및 PAN ENE는 폴리A-테일을 보호하는 삼중 나선을 형성한다184, 187. 이들 구축물은 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있다. 이들 발현 시스템은 또한 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할 것으로 고려된다.
또한, 자기-절단 리보자임, 예컨대 해머헤드188, 피스톨189, 해체트189, 헤어핀190, VS191, 트위스터192, 또는 트위스터 시스터192 리보자임, 또는 전사된 가이드를 프로세싱하기 위한 다른 자기-절단 요소, 또는 Csy4193에 의해 인식되고 또한 가이드의 프로세싱으로 이어지는 헤어핀을 부가하는, PEgRNA의 일부로서 전사될 pol II 프로모터의 부분의 절단을 위한 일련의 방법이 설계되었다. 또한, 다중 ENE 모티프의 혼입은 KSHV PAN RNA 및 요소에 대해 이전에 입증된 바와 같이 개선된 PEgRNA 발현 및 안정성으로 이어질 수 있는 것으로 가설화된다185. 또한, PEgRNA를 원형 인트론 RNA (ciRNA)의 형태로 원형화하는 것은 또한 증진된 RNA 발현 및 안정성, 뿐만 아니라 핵 국재화로 이어질 수 있는 것으로 예상된다194.
다양한 실시양태에서, PEgRNA는 하기 서열에 의해 예시된 바와 같은 다양한 상기 요소를 포함할 수 있다.
비제한적 예 1 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 MALAT1 ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00326
비제한적 예 2 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 PAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00327
비제한적 예 3 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3xPAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00328
비제한적 예 4 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00329
비제한적 예 5 - pU1, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00330
다양한 다른 실시양태에서, PEgRNA는 스캐폴드 또는 코어 서열에 개선을 도입하는 것에 의해 개선될 수 있다. 이는 공지된 것을 도입함으로써 수행될 수 있다.
코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드는 PE 활성을 증진시키기 위해 개선될 가능성이 있다. 여러 이러한 접근법은 이미 입증되었다. 예를 들어, 스캐폴드의 제1 쌍형성 요소 (P1)는 GTTTT-AAAAC 쌍형성 요소를 함유한다. 이러한 연속 T는 pol III 일시정지 및 RNA 전사체의 조기 종결을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. P1의 이러한 부분에서 T-A 쌍 중 1개의 G-C 쌍으로의 합리적 돌연변이는 sgRNA 활성을 증진시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 이러한 접근법이 또한 PEgRNA에 대해 실행가능할 것임을 시사한다195. 추가적으로, P1의 길이를 증가시키는 것은 또한 sgRNA 폴딩을 증진시키고 개선된 활성으로 이어지는 것으로 밝혀졌고195, 이는 이것이 PEgRNA 활성의 개선을 위한 또 다른 방안임을 시사한다. 코어에 대한 예시적인 개선은 하기를 포함할 수 있다:
P1에 대해 6 nt 연장부를 함유하는 PEgRNA
Figure pct00331
P1 내에 T-A에서 G-C로의 돌연변이를 함유하는 PEgRNA
Figure pct00332
다양한 다른 실시양태에서, PEgRNA는 편집 주형 영역에 변형을 도입함으로써 개선될 수 있다. PEgRNA에 의해 주형화되는 삽입의 크기가 증가함에 따라, 엔도뉴클레아제에 의해 분해되거나, 자발적 가수분해를 겪거나, 또는 RT에 의해 역전사될 수 없거나 또는 PEgRNA 스캐폴드의 폴딩 및 후속 Cas9-RT 결합을 파괴하는 2차 구조로 폴딩될 가능성이 더 크다. 따라서, 전체 유전자의 삽입과 같은 대규모 삽입에 영향을 미치기 위해서는 PEgRNA의 주형에 대한 변형이 필요할 가능성이 있다. 이를 위한 일부 전략은 RNA를 분해 또는 가수분해에 대해 보다 저항성이게 하거나 또는 억제성 2차 구조를 채택할 가능성을 낮추는, 합성 또는 반합성 PEgRNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 혼입을 포함한다196. 이러한 변형은 G-풍부 서열에서 RNA 2차 구조를 감소시킬 8-아자-7-데아자구아노신; 분해를 감소시키고 특정 종류의 RNA 2차 구조를 증진시키는 잠금 핵산 (LNA); RNA 안정성을 증진시키는 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 또는 2'-O-메톡시에톡시 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 또한 안정성 및 활성을 증진시키기 위해 PEgRNA의 다른 곳에 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, PEgRNA의 주형은 목적하는 단백질 생성물을 코딩하고 또한 RT에 의해 언폴딩될 수 있는 간단한 2차 구조를 채택할 가능성이 더 크도록 설계될 수 있다. 이러한 단순한 구조는 열역학적 싱크로서 작용할 것이며, 이는 역전사를 막을 보다 복잡한 구조가 발생할 가능성을 줄인다. 마지막으로, 또한 주형을 2개의 별개의 PEgRNA로 분할할 수 있다. 이러한 설계에서, PE는 전사를 개시하고 또한 Cas9에 융합된 RNA-결합 단백질 또는 PEgRNA 자체 상의 RNA 인식 요소, 예컨대 MS2 압타머를 통해 표적화된 부위에 별개의 주형 RNA를 동원하는데 사용될 것이다. RT는 이러한 별개의 주형 RNA에 직접 결합할 수 있거나, 또는 제2 주형으로 스와핑하기 전에 원래의 PEgRNA 상에서 역전사를 개시할 수 있다. 이러한 접근법은 긴 주형의 부가 시 PEgRNA의 미스폴딩을 방지함으로써, 또한 아마도 PE-기반 긴 삽입을 억제할 수 있는, 긴 삽입이 이루어지는 게놈으로부터 Cas9의 해리를 필요로 하지 않음으로써 긴 삽입을 가능하게 할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 PEgRNA의 5' 및 3' 말단에 추가의 RNA 모티프를 도입함으로써 개선될 수 있다. 여러 이러한 모티프 - 예컨대 KSHV로부터의 PAN ENE 및 MALAT1로부터의 ENE는 비-pol III 프로모터로부터 보다 긴 PEgRNA의 발현을 종결시키기 위한 가능한 수단으로서 상기 논의되었다. 이들 요소는 폴리A 테일을 에워싸는 RNA 삼중 나선을 형성하여, 이들이 핵 내에 보유되게 한다184,187. 그러나, 말단 뉴클레오티드를 폐쇄하는 PEgRNA의 3' 말단에 복합체 구조를 형성함으로써, 이들 구조는 또한 아마도 PEgRNA의 엑소뉴클레아제-매개된 분해를 방지하는 것을 도울 것이다.
3' 말단에 삽입된 다른 구조적 요소도 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있지만, 비-pol III 프로모터로부터의 종결은 가능하게 하지 않는다. 이러한 모티프는 3' 말단을 폐쇄할 헤어핀 또는 RNA 쿼드로플렉스197, 또는 3' 말단에서 2'-3'-시클릭 포스페이트의 형성을 발생시키고 또한 잠재적으로 PEgRNA가 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 가능성을 낮출 자기-절단 리보자임, 예컨대 HDV198를 포함할 수 있다. PEgRNA를 불완전한 스플라이싱을 통해 고리화하도록 유도하여 - ciRNA를 형성하는 것은 - 또한 PEgRNA 안정성을 증가시키고 PEgRNA가 핵 내에 보유되도록 할 수 있다194.
추가의 RNA 모티프는 또한 RT 프로세싱성을 개선시키거나 또는 DNA-RNA 듀플렉스에 대한 RT 결합을 증진시킴으로써 PEgRNA 활성을 증진시킬 수 있다. 그의 동족 레트로바이러스 게놈에서 RT에 의해 결합된 천연 서열의 부가는 RT 활성을 증진시킬 수 있다199. 이는 레트로바이러스 게놈 이량체화 및 전사의 개시에 수반되는 천연 프라이머 결합 부위 (PBS), 폴리퓨린 트랙 (PPT), 또는 키싱 루프를 포함할 수 있다199.
PEgRNA의 5' 및 3' 말단에서의 이량체화 모티프 - 예컨대 키싱 루프 또는 GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체 쌍200 - 의 부가는 또한 PEgRNA의 효과적인 원형화를 발생시켜 안정성을 개선시킬 수 있다. 추가적으로, 이들 모티프의 부가가 PEgRNA 스페이서 및 프라이머의 물리적 분리를 가능하게 하여, PE 활성을 방해할 스페이서의 폐쇄를 방지할 수 있는 것으로 고려된다. 스페이서 영역에서 작은 토홀드 헤어핀을 형성하는 PEgRNA에 대한 짧은 5' 또는 3' 연장부는 또한 스페이서에 결합하는 PEgRNA의 어닐링 영역과 유리하게 경쟁할 수 있다. 마지막으로, 키싱 루프는 또한 다른 주형 RNA를 게놈 부위로 동원하고 RT 활성을 하나의 RNA로부터 다른 것으로 스와핑하는 것을 가능하게 하는데 사용될 수 있다. 예시적인 개선은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
PEgRNA-HDV 융합체
Figure pct00333
PEgRNA-MMLV 키싱 루프
Figure pct00334
PEgRNA-VS 리보자임 키싱 루프
Figure pct00335
PEgRNA-GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체
Figure pct00336
PEgRNA 주형 스위칭 2차 RNA-HDV 융합체
Figure pct00337
PEgRNA 스캐폴드는 SpCas9 및 프라임 편집제 (PE)가 개선되는 방법과 유사한 방식으로 방향적 진화를 통해 추가로 개선될 수 있다. 방향적 진화는 Cas9 또는 진화된 Cas9 변이체에 의한 PEgRNA 인식을 증진시킬 수 있다. 추가적으로, 상이한 PEgRNA 스캐폴드 서열은 상이한 게놈 유전자좌에서 최적이어서, 해당 부위에서 PE 활성을 증진시키거나, 오프-타겟 활성을 감소시키거나, 또는 둘 다일 가능성이 있다. 마지막으로, 다른 RNA 모티프가 부가된 PEgRNA 스캐폴드의 진화는 비진화된 융합 RNA에 비해 융합된 PEgRNA의 활성을 거의 확실히 개선시킬 것이다. 예를 들어, c-디-GMP-I 압타머 및 해머헤드 리보자임으로 구성된 알로스테릭 리보자임의 진화는 현저하게 개선된 활성으로 이어졌고202, 이는 진화가 해머헤드-PEgRNA 융합체의 활성을 또한 개선시킬 것임을 시사한다. 또한, Cas9는 현재 일반적으로 sgRNA의 5' 연장을 용인하지 않지만, 방향적 진화는 아마도 이러한 불용인을 완화시켜 추가의 RNA 모티프가 이용되도록 하는 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다.
본 개시내용은 본원에 개시된 프라임 편집 시스템의 효능을 추가로 개선시키는 임의의 이러한 방식을 고려한다.
O. 확장된 표적화 범주로의 프라임 편집의 사용
스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9)를 사용한 프라임 편집 (PE)은 SpCas9가 효율적으로 결합할 수 있는 적합하게-배치된 NGG 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)가 존재하는 게놈 유전자좌에서 모든 단일 염기 치환, 삽입, 결실, 및 그의 조합을 효율적으로 설치할 수 있다. 그러나, 또 다른 측면에서 본원에 기재된 방법은 접근가능한 PAM을 확장시킴으로써 PE의 표적화 능력을 넓히고, 따라서 효율적인 PE에 접근가능한 표적화가능한 게놈 유전자좌를 넓힌다. SpCas9 이외의 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질을 사용하는 프라임 편집제는 상이한 PAM에 대한 접근을 허용함으로써 게놈 유전자좌의 확장된 표적화가능한 범주를 가능하게 한다. 또한, SpCas9보다 작은 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질의 사용은 또한 보다 효율적인 바이러스 전달을 가능하게 한다. SpCas9 이외의 Cas 단백질 또는 다른 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질을 갖는 PE는 SpCas9-기반 PE를 사용해서는 접근불가능하거나 비효율적인 고효율 치료 편집을 가능하게 할 것이다.
이는 SpCas9-기반 PE가 NGG PAM에 비해 편집의 비-이상적 간격으로 인해 비효율적이거나 또는 SpCas9-기반 구축물의 전체 크기가 세포 발현 및/또는 전달에 금지되는 상황에서 사용될 것으로 예상된다. 특정 질환-관련 유전자좌, 예컨대 표적 영역 근처의 SpCas9에 대한 NGG PAM이 거의 없고 불량하게 위치하는 헌팅틴 유전자는 PE 시스템 내의 상이한 Cas 단백질, 예컨대 NGA PAM을 인식하는 SpCas9-VRQR을 사용하여 용이하게 표적화될 수 있다. 보다 작은 Cas 단백질은 AAV 벡터 내로 보다 효율적으로 패키징될 수 있는 보다 작은 PE 구축물을 생성하는데 사용되어, 표적 조직으로의 보다 우수한 전달을 가능하게 할 것이다. 도 61은 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질로서 스타필로코쿠스 아우레우스 CRISPR-Cas를 사용하는 프라임 편집의 실시에 대한 감소를 보여준다. NT는 비처리 대조군이다.
도 62a-62b는 프라임 편집에 의한 정확한 위치에서의 목적하는 편집의 효율적인 설치를 위한 프로토스페이서의 입증된 중요성을 제공한다. 이는 이러한 기술의 신규 특색으로서의 대안적 PAM 및 프로토스페이서의 중요성을 강조한다. 도 62a에서의 "n.d."는 "검출되지 않음"이다.
도 63은 프라임 편집제 시스템에서 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질로서 SpCas9(H840A)-VRQR 및 SpCas9(H840A)-VRER을 사용하는 PE의 실시에 대한 감소를 보여준다. SpCas9(H840A)-VRQR napDNAbp는 본원에서 서열식별번호: 87로 개시된다. SpCas9(H840A)-VRER napDNAbp는 본원에서 서열식별번호: 88로 개시된다. SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RT 융합 단백질은 본원에서 서열식별번호: 516으로 개시되며, 여기서 MMLV RT는 야생형 MMLV RT 대비 D200N, L603W, T330P, T306K, 및 W313F 치환을 포함한다. SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT 융합 단백질은 본원에서 서열식별번호: 515로 개시되며, 여기서 MMLV RT는 야생형 MMLV RT 대비 D200N, L603W, T330P, T306K, 및 W313F 치환을 포함한다. 인간 게놈 내의 7개의 상이한 유전자좌가: 4개는 SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT 프라임 편집제 시스템에 의해, 3개는 SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RT 시스템에 의해 표적화된다. 시험된 구축물의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00338
Figure pct00339
Figure pct00340
도 63에 제시된 바와 같이, SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT는 "AGAG" 및 "GGAG"를 포함하는 PAM 부위에서 작동하였고, "GGAT" 및 "AGAT" PAM 서열에서 일부 편집 활성을 가졌다. SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RT는 "AGCG" 및 "GGCG"를 포함하는 PAM 부위에서 작동하였고, "TGCG"에서 일부 편집 활성을 가졌다.
데이터는 프라임 편집이 상이한 PAM 특이성을 보유하는 napDNAbp, 예컨대 본원에 기재된 Cas9 변이체를 사용하여 수행될 수 있음을 입증한다.
다양한 실시양태에서, 변경된 PAM 특이성을 갖는 napDNAbp (예를 들어, Cas9)는 그의 3'-단부에 5'-NAA-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 돌연변이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 1에 열거된 클론 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 1에 열거된 클론의 보존적 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 1에 열거된 Cas9 클론 중 어느 하나의 돌연변이의 조합을 포함한다.
표 1: NAA PAM 클론
Figure pct00341
Figure pct00342
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 1의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 1의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9와 비교하였을 때, 그의 3' 단부에 정규 PAM (5'-NGG-3')을 포함하지 않는 표적 서열에 대해 증가된 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 활성과 비교하였을 때, 적어도 5배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 3' 단부를 갖는 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 2에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 활성과 비교하였을 때, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1,000배, 적어도 5,000배, 적어도 10,000배, 적어도 50,000배, 적어도 100,000배, 적어도 500,000배, 또는 적어도 1,000,000배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 단부는 AAA, GAA, CAA, 또는 TAA 서열에 바로 인접한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAC-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 돌연변이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 2에 열거된 클론 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 2에 열거된 클론의 보존적 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 2에 열거된 Cas9 클론 중 어느 하나의 돌연변이의 조합을 포함한다.
표 2: NAC PAM 클론
Figure pct00343
Figure pct00344
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 2의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 2의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9와 비교하였을 때, 그의 3' 단부에 정규 PAM (5'-NGG-3')을 포함하지 않는 표적 서열에 대해 증가된 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 활성과 비교하였을 때, 적어도 5배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 3' 단부를 갖는 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 18에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 활성과 비교하였을 때, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1,000배, 적어도 5,000배, 적어도 10,000배, 적어도 50,000배, 적어도 100,000배, 적어도 500,000배, 또는 적어도 1,000,000배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 단부는 AAC, GAC, CAC, 또는 TAC 서열에 바로 인접한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAT-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 돌연변이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 3에 열거된 클론 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 3에 열거된 클론의 보존적 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 3에 열거된 Cas9 클론 중 어느 하나의 돌연변이의 조합을 포함한다.
표 3: NAT PAM 클론
Figure pct00345
정규 SpCas9와 비교하여 차등 PAM 특이성을 나타내는 상기 Cas9 변이체 중 임의의 것이 본원에 개시된 프라임 편집제에 사용될 수 있다.
P. 레콤비나제 표적 부위를 삽입하기 위한 프라임 편집의 사용
또 다른 측면에서, 프라임 편집은 레콤비나제 부위 (또는 "레콤비나제 인식 서열")를 목적하는 게놈 부위에 삽입하는데 사용될 수 있다. 레콤비나제 부위의 삽입은 게놈에서 부위-특이적 유전자 변화를 달성하기 위한 프로그램화된 위치를 제공한다. 이러한 유전자 변화는 다른 유전자 변화 중에서도, 예를 들어 플라스미드의 게놈 통합, 게놈 결실 또는 삽입, 염색체 전위, 및 카세트 교환을 포함할 수 있다. 이들 예시적인 유형의 유전자 변화가 도 64(b)-(f)에 예시된다. 이어서, 설치된 레콤비나제 인식 서열을 사용하여 그 부위에서 부위-특이적 재조합을 수행하여 다양한 재조합 결과, 예컨대 DNA 단편의 절제, 통합, 역위, 또는 교환을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 도 65는 GFP 발현 마커를 포함하는 DNA 공여자 주형을 통합하는데 사용될 수 있는 레콤비나제 부위의 설치를 예시한다. 레콤비나제 부위 내로 통합된 GFP 발현 시스템을 함유하는 세포는 형광을 낼 것이다.
레콤비나제 부위를 게놈 내로 설치하는 메카니즘은 다른 서열, 예컨대 펩티드/단백질 및 RNA 태그를 게놈 내로 설치하는 것과 유사하다. 레콤비나제 표적 서열의 설치를 예시하는 개략도가 도 64(a)에 제시된다. 과정은 레콤비나제 표적 서열을 도입할 목적하는 표적 유전자좌를 선택하는 것으로 시작된다. 다음으로, 프라임 편집제 융합체가 제공된다 ("RT-Cas9:gRNA"). 여기서, "gRNA"는 본원에 기재된 원리를 사용하여 설계될 수 있는 PEgRNA를 지칭한다. 다양한 실시양태에서 PEgRNA는 도 3d에 상응하는 아키텍처를 포함할 것이다 (5'-[~20-nt 스페이서]-[gRNA 코어]-[연장 아암]-3', 여기서 연장 아암은 3'에서 5' 방향으로 프라이머 결합 부위 ("A"), 편집 주형 ("B"), 및 상동성 아암 ("C")을 포함함). 편집 주형 ("B")은 레콤비나제 부위에 상응하는 서열, 즉 레콤비나제 부위의 센스 또는 안티센스 가닥이고 프라임 편집 과정을 통해 게놈 DNA 표적 유전자좌 내로 혼입되는 상보적 단일 가닥 DNA를 코딩하는 PEgRNA의 단일 가닥 RNA를 포함할 것이다.
다양한 측면에서, 본 개시내용은 부위-특이적 레콤비나제(들)에 대한 노출 후에 정확하고 효율적인 게놈 변형을 지시할, 인간 또는 다른 게놈 내의 고가치 유전자좌에 레콤비나제 인식 서열을 도입하기 위한 PE의 사용을 제공한다 (도 64). 도 64에 제시된 다양한 실시양태에서, PE는 (b) DNA 공여자 주형의 게놈 통합을 위한 부위로서 사용하기 위한 단일 SSR 표적을 삽입하는데 사용될 수 있다. (c)는 게놈의 일부를 결실시키기 위해 SSR 표적 부위의 탠덤 삽입이 어떻게 사용될 수 있는지 보여준다. (d)는 게놈의 일부를 역전시키기 위해 SSR 표적 부위의 탠덤 삽입이 어떻게 사용될 수 있는지 보여준다. (e)는 2개의 원위 염색체 영역에서의 2개의 SSR 표적 부위의 삽입이 염색체 전위를 어떻게 발생시킬 수 있는지 보여준다. (f)는 게놈 내의 2개의 상이한 SSR 표적 부위의 삽입이 DNA 공여자 주형으로부터 카세트를 교환하는데 어떻게 사용될 수 있는지 보여준다. SSR 표적을 삽입하기 위해 PE를 사용하는 것에 의한 각각의 유형의 게놈 변형이 고려되지만, 이 목록은 또한 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
레콤비나제 인식 서열의 PE-매개된 도입은 대규모 게놈 결함, 예컨대 유전자 상실, 역위, 또는 중복, 또는 염색체 전위에 의해 유발되는 유전 질환의 치료에 특히 유용할 수 있다1-7 (표 6). 예를 들어, 윌리암스-보이렌 증후군은 염색체 721에서의 24의 결실에 의해 유발되는 발달 장애이다. 살아있는 세포에의 다중 전체 유전자의 효율적이고 표적화된 삽입을 위한 기술은 현재 존재하지 않지만 (이러한 전장 유전자 삽입을 행하는 PE의 잠재력이 현재 연구되고 있지만, 아직 확립되지 않았음); PE에 의해 삽입된 표적에서의 레콤비나제-매개된 통합은 이러한 질환 및 다른 질환에 대한 영구적인 치유를 위한 하나의 접근법을 제공한다. 또한, 레콤비나제 인식 서열의 표적화된 도입은 트랜스제닉 식물, 동물 연구 모델, 생물생산 세포주, 또는 다른 통상의 진핵 세포주의 생성을 포함한 적용을 고도로 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 식물에서 PE-특이적 표적에서의 레콤비나제-매개된 게놈 재배열은 개선된 특성을 갖는 농업 작물을 생성하기 위한 병목 중 하나를 극복할 수 있다8,9.
표 6. 레콤비나제 인식 서열의 PE-기반 설치를 통해 복구될 수 있는 대규모 게놈 변형과 연관된 유전 질환의 예.
Figure pct00346
천연 및 조작된 티로신 레콤비나제 (표 7), 대형 세린 인테그라제 (표 8), 세린 레솔바제 (표 9), 및 티로신 인테그라제 (표 10)를 포함한 다수의 SSR 패밀리 구성원이 특징화되었고, 그의 레콤비나제 인식 서열이 기재되었다. 증진된 비율의 게놈 통합을 입증한 변형된 표적 서열이 또한 여러 SSR에 대해 기재되었다22-30. 천연 레콤비나제에 더하여, 별개의 특이성을 갖는 프로그램가능한 레콤비나제가 개발되었다31-40. PE를 사용하여, 이들 인식 서열 중 1개 이상을 목적하는 적용에 따라 게놈 내 명시된 위치, 예컨대 세이프 하버 유전자좌에 도입할 수 있다41-43.
예를 들어, 프라임 편집에 의한 게놈 내 단일 레콤비나제 인식 서열의 도입은 DNA 공여자 주형과의 통합 재조합을 발생시킬 것이다 (도 64b). 인간 세포에서 강건하게 작동하는 세린 인테그라제는 유전자 통합에 특히 매우 적합할 수 있다44,45.
추가적으로, 2개의 레콤비나제 인식 서열의 도입은 표적의 정체 및 배향에 따라 개재 서열의 결실, 개재 서열의 역위, 염색체 전위, 또는 카세트 교환을 발생시킬 수 있다 (도 64c-f). 레콤비나제 표적과 충분히 밀접하게 유사한 내인성 서열을 선택하는 것에 의해, 완전한 레콤비나제 표적을 도입하는데 필요한 편집의 범주가 감소될 것이다.
마지막으로, 여러 레콤비나제는 천연 발생 유사부위에서 인간 또는 진핵 게놈 내로 통합되는 것으로 입증되었다46-64. PE 편집은 이들 유전자좌를 변형시켜 이들 천연 유사부위에서의 통합 속도를 증진시키거나, 또는 대안적으로 원치 않는 오프-타겟 서열로서 작용할 수 있는 유사부위를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 PE를 사용하여 진핵 게놈에 레콤비나제 표적 서열을 도입하기 위한 일반적 방법론을 기재하며, 그의 적용은 거의 무한하다. 게놈 편집 반응은 맞춤형 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 이용하는 CRISPR/Cas9 단백질 및 리버스 트랜스크립타제 도메인의 키메라 융합체인 "프라임 편집제"와 함께 사용하기 위해 의도된다. 더 나아가, 여러 기술을 사용하여 indel의 비율을 낮춤으로써 DNA 주형을 통해 레콤비나제 인식 서열을 도입하기 위해 Cas9 도구 및 상동성-지정 복구 (HDR) 경로가 또한 이용될 수 있다65-67. 인간 세포 배양물에서의 개념 증명 실험이 도 65에 제시된다.
하기 여러 표가 레콤비나제 인식 서열의 PE-지정 설치에 관한 상기 설명에서 인용되고, 사용될 수 있는 예시적인 레콤비나제, 및 PE에 의해 설치될 수 있는 그의 동족 레콤비나제 인식 서열의 목록을 제공한다.
표 7. 티로신 레콤비나제 및 SSR 표적 서열.
Figure pct00347
표 8. 대형 세린 인테그라제 및 SSR 표적 서열.
Figure pct00348
Figure pct00349
Figure pct00350
표 9. 세린 레솔바제 및 SSR 표적 서열.
Figure pct00351
표 10. 티로신 인테그라제 및 표적 서열.
Figure pct00352
다양한 다른 측면에서, 본 개시내용은 1개 이상의 레콤비나제 인식 서열을 설치하기 위해 PE를 사용하는 방법 및 부위-특이적 재조합에서의 그의 용도에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 부위-특이적 재조합은 다양한 재조합 결과, 예컨대 DNA 단편의 절제, 통합, 역위, 또는 교환을 발생시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 2개 이상의 핵산 (예를 들어, DNA) 분자의 2개 이상의 영역의 또는 이들 사이의 재조합을 유도하는데 유용하다. 다른 실시양태에서, 방법은 단일 핵산 분자 (예를 들어, DNA) 내의 2개 이상의 영역의 또는 이들 사이의 재조합을 유도하는데 유용하다.
일부 실시양태에서, 개시내용은 (a) 프라임 편집에 의해 게놈 유전자좌에 레콤비나제 인식 서열을 설치하는 단계; (b) 게놈 유전자좌를 레콤비나제의 존재 하에 레콤비나제 인식 서열을 또한 포함하는 DNA 공여자 주형과 접촉시키는 단계를 포함하는, 부위-특이적 재조합에 의해 공여자 DNA 주형을 통합시키는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 개시내용은 (a) 프라임 편집에 의해 게놈 유전자좌에 한 쌍의 레콤비나제 인식 서열을 설치하는 단계; (b) 게놈 유전자좌를 레콤비나제와 접촉시킴으로써, 한 쌍의 레콤비나제 인식 서열 사이의 게놈 영역의 결실을 촉매하는 단계를 포함하는, 부위-특이적 재조합에 의해 게놈 영역을 결실시키는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 (a) 프라임 편집에 의해 게놈 유전자좌에 한 쌍의 레콤비나제 인식 서열을 설치하는 단계; (b) 게놈 유전자좌를 레콤비나제와 접촉시킴으로써, 한 쌍의 레콤비나제 인식 서열 사이의 게놈 영역의 역위를 촉매하는 단계를 포함하는, 부위-특이적 재조합에 의해 게놈 영역을 역전시키는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 (a) 프라임 편집에 의해 제1 게놈 유전자좌에 제1 레콤비나제 인식 서열을 설치하는 단계; (b) 프라임 편집에 의해 제2 게놈 유전자좌에 제2 레콤비나제 인식 서열을 설치하는 단계; (c) 제1 및 제2 게놈 유전자좌를 레콤비나제와 접촉시킴으로써, 제1 및 제2 게놈 유전자좌의 염색체 전위를 촉매하는 단계를 포함하는, 제1 게놈 부위와 제2 게놈 부위 사이의 염색체 전위를 유도하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 개시내용은 (a) 프라임 편집에 의해 제1 게놈 유전자좌에 제1 레콤비나제 인식 서열을 설치하는 단계; (b) 프라임 편집에 의해 제2 게놈 유전자좌에 제2 레콤비나제 인식 서열을 설치하는 단계; (c) 제1 및 제2 게놈 유전자좌를 제1 및 제2 레콤비나제 인식 서열 및 레콤비나제와 플랭킹된 카세트를 포함하는 공여자 DNA와 접촉시켜, 플랭킹된 게놈 유전자좌 및 DNA 공여자 내 카세트의 교환을 촉매하는 단계를 포함하는, 게놈 유전자좌와 카세트를 포함하는 공여자 DNA 사이의 카세트 교환을 유도하는 방법을 제공한다.
게놈 내에 1개 초과의 레콤비나제 인식 서열의 삽입을 수반하는 다양한 실시양태에서, 레콤비나제 인식 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 레콤비나제 인식 서열은 동일하다. 다른 실시양태에서, 레콤비나제 인식 서열은 상이하다.
다양한 실시양태에서, 레콤비나제는 티로신 레콤비나제, 예컨대 표 7에 제시된 바와 같은 Cre, Dre, Vcre, Scre, Flp, B2, B3, Kw, R, TD1-40, Vika, Nigri, Panto, Kd, Fre, Cre(ALSHG), Tre, Brec1, 또는 Cre-R3M3일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 레콤비나제 인식 서열은 사용 중인 레콤비나제에 상응하는 표 7의 RRS일 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, 레콤비나제는 대형 세린 레콤비나제, 예컨대 표 8에 제시된 바와 같은 Bxb1, PhiC31, R4, phiBT1, MJ1, MR11, TP901-1, A118, V153, phiRV1, phi370.1, TG1, WB, BL3, SprA, phiJoe, phiK38, Int2, Int3, Int4, Int7, Int8, Int9, Int10, Int11, Int12, Int13, L1, peaches, Bxz2, 또는 SV1일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 레콤비나제 인식 서열은 사용 중인 레콤비나제에 상응하는 표 8의 RRS일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 레콤비나제는 세린 레콤비나제, 예컨대 표 8에 제시된 바와 같은 Bxb1, PhiC31, R4, phiBT1, MJ1, MR11, TP901-1, A118, V153, phiRV1, phi370.1, TG1, WB, BL3, SprA, phiJoe, phiK38, Int2, Int3, Int4, Int7, Int8, Int9, Int10, Int11, Int12, Int13, L1, peaches, Bxz2, 또는 SV1일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 레콤비나제 인식 서열은 사용 중인 레콤비나제에 상응하는 표 8의 RRS일 수 있다.
다른 실시양태에서, 레콤비나제는 세린 레솔바제, 예컨대 표 9에 제시된 바와 같은 Gin, Cin, Hin, Min, 또는 Sin일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 레콤비나제 인식 서열은 사용 중인 레콤비나제에 상응하는 표 9의 RRS일 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, 레콤비나제는 티로신 인테그라제, 예컨대 표 10에 제시된 바와 같은 HK022, P22, 또는 L5일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 레콤비나제 인식 서열은 사용 중인 레콤비나제에 상응하는 표 10의 RRS일 수 있다.
일부 실시양태에서, PE에 의한 부위-특이적 재조합을 위한 방법 중 임의의 것이 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부위-특이적 재조합을 위한 방법 중 임의의 것은 세포에서 수행된다 (예를 들어, 세포에서 게놈 DNA를 재조합함). 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 세포, 예컨대 진핵 세포는 본원에 기재된 바와 같은 개체, 예컨대 대상체 (예를 들어, 인간 대상체) 내의 것일 수 있다. 본원에 기재된 방법은 시험관내 및 생체내에서, 예를 들어 트랜스제닉 세포, 세포주, 또는 동물의 생성과 관련하여 세포의 유전자 변형, 또는 대상체의 세포에서 게놈 서열의 변경, 예를 들어 유전적 결함의 교정에 유용하다.
섹션 L에 인용된 참고문헌
각각의 하기 참고문헌이 실시예 17에 인용되며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00353
[8] 치료 방법
본 개시내용은 프리온 질환 (예를 들어, 본원의 실시예 5), 트리뉴클레오티드 반복부 확장 질환 (예를 들어, 본원의 실시예 3), 또는 CDKL5 결핍 장애 (CDD) (예를 들어, 본원의 실시예 23)에 예시된 바와 같으나 이에 제한되지는 않는, 본원에 제공된 프라임 편집 시스템에 의해 교정될 수 있는 점 돌연변이 또는 다른 돌연변이 (예를 들어, 결실, 삽입, 역위, 중복 등)와 연관되거나 그에 의해 유발된 질환으로 진단된 대상체의 치료 방법을 제공한다.
실질적으로 임의의 질환-유발 유전적 결함은 프라임 편집을 사용함으로써 복구될 수 있으며, 이는 적절한 프라임 편집제 융합 단백질 (napDNAbp 및 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 포함함)을 선택하는 것, 및 (a) 편집 부위를 함유하는 적절한 표적 DNA를 표적화하고, (b) 닉 부위의 바로 하류의 내인성 가닥을 치환 및 대체하는 목적하는 편집을 포함하는, 닉 부위의 3' 단부로부터의 DNA의 단일 가닥의 합성을 위한 주형을 제공하도록 설계된 적절한 PEgRNA를 설계하는 것을 포함한다. 프라임 편집은 제한 없이, (a) 뉴클레오티드 서열에 돌연변이-교정 변화를 설치하고, (b) 단백질 및 RNA 태그를 설치하고, (c) 관심 단백질 상에 이뮤노에피토프를 설치하고, (d) 단백질에 유도성 이량체화 도메인을 설치하고, (e) 생체분자의 활성을 변경하기 위해 서열을 설치하거나 제거하고, (f) 특이적 유전자 변화를 지시하기 위해 레콤비나제 표적 부위를 설치하고, (g) 오류-유발 RT를 사용함으로써 표적 서열을 돌연변이유발하는데 사용될 수 있다.
장애를 치료하는 방법은 초기 단계로서 본원에 기재된 방법에 따른 적절한 PEgRNA 및 프라임 편집제 융합 단백질의 설계를 수반할 수 있으며, 이는 고려될 수 있는 다수의 고려사항, 예컨대 하기를 포함한다:
(a) 표적 서열, 즉 1개 이상의 핵염기 변형을 프라임 편집제로 설치하고자 목적하는 뉴클레오티드 서열;
(b) 표적 서열 내의 절단 부위의 위치, 즉 프라임 편집제가 단일 가닥 닉을 유도하여 닉의 한 측면 상에 3' 단부 RT 프라이머 서열을 생성하고 닉의 다른 측면 상에 5' 단부 내인성 플랩을 생성할 (이는 궁극적으로 FEN1 또는 그의 등가물에 의해 제거되고 3' ssDNA 플랩에 의해 대체됨) 특이적 핵염기 위치. 절단 부위는 RNA-의존성 DNA 중합 동안 PE 융합 단백질의 폴리머라제 (예를 들어, RT 효소)에 의해 연장되게 되는 3' 단부 프라이머 서열을 생성하여 목적하는 편집을 함유하는 3' ssDNA 플랩을 생성하고, 이는 이어서 표적 서열에서 5' 내인성 DNA 플랩을 대체한다.
(c) 이용가능한 PAM 서열 (정규 SpCas9 PAM 부위, 뿐만 아니라 확장된 또는 상이한 PAM 특이성을 갖는 Cas9 변이체 및 등가물에 의해 인식되는 비-정규 PAM 부위 포함);
(d) 이용가능한 PAM 서열과 PAM 가닥 내의 절단 부위의 위치 사이의 간격;
(e) 사용되는데 이용가능한 프라임 편집제의 특정한 Cas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물 (이는 부분적으로 이용가능한 PAM에 의해 좌우됨);
(f) 프라이머 결합 부위의 서열 및 길이;
(g) 편집 주형의 서열 및 길이;
(h) 상동성 아암의 서열 및 길이;
(i) 스페이서 서열 및 길이; 및
(j) gRNA 코어 서열.
적합한 PEgRNA, 및 임의로 제2 부위 닉킹을 위한 닉킹-sgRNA 설계 가이드가 상기 고려사항 중 1가지 이상을 고려한 하기 예시적인 단계별 지침 세트에 의해 설계될 수 있다. 단계는 도 70a-70i에 제시된 예를 참조한다.
1. 표적 서열 및 편집을 규정한다. 목적하는 편집 (점 돌연변이, 삽입, 결실, 또는 그의 조합)의 위치 주위에 집중된 표적 DNA 영역 (~200bp)의 서열을 검색한다. 도 70a를 참조한다.
2. 표적 PAM의 위치를 찾아낸다. 목적하는 편집 위치에 근접한 PAM을 확인한다. PAM은 목적하는 편집 위치에 근접한 DNA의 어느 하나의 가닥 상에서 확인될 수 있다. 편집 위치에 가까운 PAM이 바람직하지만 (즉, 여기서 닉 부위는 편집 위치로부터 30 nt 미만이거나, 또는 편집 위치로부터 닉 부위까지 29 nt, 28 nt, 27 nt, 26 nt, 25 nt, 24 nt, 23 nt, 22 nt, 21 nt, 20 nt, 19 nt, 18 nt, 17 nt, 16 nt, 15 nt, 14 nt, 13 nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt, 또는 2 nt 미만임), 닉을 편집 위치로부터 ≥ 30 nt에 배치하는 프로토스페이서 및 PAM을 사용하여 편집을 설치하는 것이 가능하다. 도 70b를 참조한다.
3. 닉 부위를 위치시킨다. 고려되는 각각의 PAM에 대해, 상응하는 닉 부위 및 어떤 가닥 상의 것인지 확인한다. Sp Cas9 H840A 닉카제의 경우, 절단은 PAM-함유 가닥에서 NGG PAM에 대해 5'의 세번째 및 네번째 염기 사이에서 일어난다. 모든 편집된 뉴클레오티드는 닉 부위의 3'에 존재해야 하고, 따라서 적절한 PAM은 PAM-함유 가닥 상의 표적 편집에 대해 5'에 닉을 배치해야 한다. 하기 제시된 예에서, 2종의 가능한 PAM이 존재한다. 단순성을 위해, 나머지 단계는 PAM 1만을 사용한 PEgRNA의 설계를 입증할 것이다. 도 70c를 참조한다.
4. 스페이서 서열을 설계한다. SpCas9의 프로토스페이서는 PAM-함유 가닥 상의 NGG PAM에 대해 5'의 20개 뉴클레오티드에 상응한다. 효율적인 Pol III 전사 개시는 G가 제1 전사된 뉴클레오티드일 것을 요구한다. 프로토스페이서의 제1 뉴클레오티드가 G인 경우에, PEgRNA에 대한 스페이서 서열은 단순히 프로토스페이서 서열이다. 프로토스페이서의 제1 뉴클레오티드가 G가 아닌 경우에, PEgRNA의 스페이서 서열은 G에 이어서 프로토스페이서 서열이 후속한다. 도 70d를 참조한다.
5. 프라이머 결합 부위 (PBS)를 설계한다. 출발 대립유전자 서열을 사용하여, PAM-함유 가닥 상의 DNA 프라이머를 확인한다. DNA 프라이머의 3' 단부는 닉 부위의 바로 상류에 있는 뉴클레오티드이다 (즉, Sp Cas9의 경우 NGG PAM에 대해 5'의 네번째 염기). PE2 및 PE3과 함께 사용하기 위한 일반적 설계 원리로서, DNA 프라이머에 대해 12 내지 13개 뉴클레오티드의 상보성을 함유하는 PEgRNA 프라이머 결합 부위 (PBS)가 ~40-60% GC 함량을 함유하는 서열에 대해 사용될 수 있다. 낮은 GC 함량을 갖는 서열의 경우에, 보다 긴 (14- 내지 15-nt) PBS가 시험되어야 한다. 보다 높은 GC 함량을 갖는 서열의 경우에, 보다 짧은 (8- 내지 11-nt) PBS가 시험되어야 한다. 최적의 PBS 서열은 GC 함량에 상관없이 실험적으로 결정되어야 한다. 길이-p PBS 서열을 설계하기 위해, 출발 대립유전자 서열을 사용하여 PAM-함유 가닥에서 닉 부위의 5'의 첫번째 p 뉴클레오티드의 역 상보체를 취한다. 도 70e를 참조한다.
6. RT 주형 (또는 DNA 합성 주형)을 설계한다. RT 주형 (또는 폴리머라제가 리버스 트랜스크립타제가 아닌 경우 DNA 합성 주형)은 설계된 편집 및 편집에 인접한 서열에 대한 상동성을 코딩한다. 한 실시양태에서, 이들 영역은 도 3d 및 도 3e의 DNA 합성 주형에 상응하며, 여기서 DNA 합성 주형은 "편집 주형" 및 "상동성 아암"을 포함한다. 최적의 RT 주형 길이는 표적 부위에 기초하여 달라진다. 짧은-범위 편집 (위치 +1 내지 +6)의 경우, 짧은 (9 내지 12 nt), 중간 (13 내지 16 nt), 및 긴 (17 내지 20 nt) RT 주형을 시험하는 것이 권장된다. 긴-범위 편집 (위치 +7 및 그 초과)의 경우, 충분한 3' DNA 플랩 상동성을 허용하기 위해 편집 위치를 지나 적어도 5개의 nt (바람직하게는 10개 이상의 nt) 연장된 RT 주형을 사용하는 것이 권장된다. 긴-범위 편집의 경우, 여러 RT 주형이 기능적 설계를 확인하기 위해 스크리닝되어야 한다. 보다 큰 삽입 및 결실 (≥5 nt)을 위해, RT 주형 내로의 보다 큰 3' 상동성 (~20 nt 이상)의 혼입이 권장된다. 편집 효율은 전형적으로 RT 주형이 역전사된 DNA 생성물에서 마지막 뉴클레오티드로서 G의 합성 (PEgRNA의 RT 주형에서의 C에 상응함)을 코딩하는 경우에 손상된다. 많은 RT 주형이 효율적인 프라임 편집을 지지하기 때문에, RT 주형을 설계할 때 최종 합성된 뉴클레오티드로서 G를 회피하는 것이 권장된다. 길이-r RT 주형 서열을 설계하기 위해, 목적하는 대립유전자 서열을 사용하고, 원래 PAM을 함유하는 가닥에서 닉 부위의 3'의 첫번째 r 뉴클레오티드의 역 상보체를 취한다. SNP 편집과 비교하여, 동일한 길이의 RT 주형을 사용한 삽입 또는 결실 편집은 동일한 상동성을 함유하지 않을 것임을 주목한다. 도 70f를 참조한다.
7. 전장 PEgRNA 서열을 조립한다. PEgRNA 성분을 하기 순서 (5'에서 3')로: 스페이서, 스캐폴드, RT 주형 및 PBS로 연결한다. 도 70g를 참조한다.
8. PE3에 대한 닉킹-sgRNA를 설계한다. 편집의 상류 및 하류의 비-편집된 가닥 상에서 PAM을 확인한다. 최적의 닉킹 위치는 고도로 유전자좌-의존적이고, 실험적으로 결정되어야 한다. 일반적으로, PEgRNA-유도된 닉에 걸친 위치에 대해 5'에 40 내지 90개의 뉴클레오티드가 배치된 닉은 보다 높은 편집 수율 및 보다 적은 indel로 이어진다. 닉킹 sgRNA는 출발 대립유전자에서 20-nt 프로토스페이서와 매칭되는 스페이서 서열을 가지며, 여기서 프로토스페이서가 G로 시작되지 않는 경우 5'-G가 부가된다. 도 70h를 참조한다.
9. PE3b 닉킹-sgRNA를 설계한다. PAM이 상보적 가닥에 존재하고 그의 상응하는 프로토스페이서가 편집을 위해 표적화된 서열과 중첩되는 경우에, 이러한 편집은 PE3b 시스템에 대한 후보일 수 있다. PE3b 시스템에서, 닉킹-sgRNA의 스페이서 서열은 출발 대립유전자가 아닌 목적하는 편집된 대립유전자의 서열과 매칭된다. PE3b 시스템은 편집된 뉴클레오티드(들)가 닉킹-sgRNA 프로토스페이서의 시드 영역 (PAM에 인접한 ~10개의 nt) 내에 속할 때 효율적으로 작동한다. 이는 편집된 가닥의 설치 후까지 상보적 가닥의 닉킹을 방지하여, 표적 DNA에의 결합에 대한 PEgRNA와 sgRNA 사이의 경쟁을 방지한다. PE3b는 또한 양쪽 가닥 상의 동시 닉의 생성을 피하고, 따라서 높은 편집 효율을 유지하면서 indel 형성을 유의하게 감소시킨다. PE3b sgRNA는 필요한 경우에 5' G를 부가하여 목적하는 대립유전자에서 20-nt 프로토스페이서와 매칭되는 스페이서 서열을 가져야 한다. 도 70i를 참조한다.
적합한 PEgRNA 및 제2-부위 닉킹 sgRNA를 설계하기 위한 상기 단계별 과정은 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 그로부터 유도될 수 있는 상기 기재된 단계별 과정의 변경을 고려한다.
적합한 PEgRNA 및 PE 융합 단백질이 선택/설계되면, 이는 적합한 방법론에 의해, 예컨대 벡터-기반 형질감염 (PEgRNA 및 PE 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하고 벡터로의 형질감염 시 세포 내에서 발현되는 1개 이상의 벡터), 전달 포맷 (예를 들어, 지질 입자, 나노입자)의 PEgRNA와 복합체화된 PE 융합 단백질의 직접 전달 (예를 들어, RNP 전달), 또는 mRNA-기반 전달 시스템에 의해 투여될 수 있다. 이러한 방법은 본 개시내용에서 본원에 기재되고, 임의의 공지된 방법이 이용될 수 있다.
PEgRNA 및 PE 융합 단백질 (또는 함께, PE 복합체로 지칭됨)은 관심 표적 DNA와 접촉 시 목적하는 편집이 그 안에 설치되도록 하는 치료 유효량으로 세포에 전달될 수 있다.
적절한 세포로의 전달이 실현가능한 한 이러한 방법에 의해 임의의 질환이 치료가능한 것으로 생각된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 의도된 목적 및 의도된 표적 세포에 적합하도록 PE 전달 방법론을 선별 및/또는 선택할 수 있을 것이다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 이러한 질환, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 점 돌연변이와 연관된 암을 갖는 대상체에게, 목적하는 유전자 변화를 포함하는 공여자 DNA 분자의 존재 하에 상동성-지정 복구에 의해 매개되는 바와 같은, 점 돌연변이를 교정하거나 또는 탈활성화 돌연변이를 질환-연관 유전자 내로 도입하는 본원에 기재된 프라임 편집 시스템의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 질환, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 점 돌연변이와 연관된 암을 갖는 대상체에게, 점 돌연변이를 교정하거나 또는 탈활성화 돌연변이를 질환-연관 유전자 내로 도입하는 본원에 기재된 프라임 편집 시스템의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환은 증식성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 유전 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 신생물성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 대사 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 리소솜 축적 질환이다. 점 돌연변이를 교정하거나 또는 탈활성화 돌연변이를 질환-연관 유전자 내로 도입함으로써 치료될 수 있는 다른 질환은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, 개시내용은 이와 관련하여 제한되지 않는다.
본 개시내용은 추가의 질환 또는 장애, 예를 들어 TPRT-매개된 유전자 편집에 의해 교정될 수 있는 점 돌연변이와 연관되거나 그에 의해 유발되는 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다. 일부 이러한 질환은 본원에 기재되어 있고, 본원에 제공된 전략 및 융합 단백질에 의해 치료될 수 있는 추가의 적합한 질환은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예시적인 적합한 질환 및 장애가 하기 열거된다. 각각의 서열 내의 특정 위치 또는 잔기의 넘버링은 사용되는 특정한 단백질 및 넘버링 스킴에 좌우됨을 이해할 것이다. 넘버링은, 예를 들어 성숙 단백질의 전구체 및 성숙 단백질 자체에서 상이할 수 있고, 종마다의 서열의 차이는 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어 서열 정렬 및 상동 잔기의 결정에 의해 임의의 상동 단백질 및 각각의 코딩 핵산에서 각각의 잔기를 확인할 수 있을 것이다. 예시적인 적합한 질환 및 장애는 제한 없이 다음을 포함한다: 2-메틸-3-히드록시부티르산뇨; 3 베타-히드록시스테로이드 데히드로게나제 결핍; 3-메틸클루타콘산뇨; 3-옥소-5 알파-스테로이드 델타 4-데히드로게나제 결핍; 46,XY 성별 반전, 유형 1, 3, 및 5; 5-옥소프롤리나제 결핍; 6-피루보일-테트라히드로프테린 신타제 결핍; 아르스코그 증후군; 아즈 증후군; 연골무발생증 유형 2; 완전색맹 2 및 7; 후천성 긴 QT 증후군; 뇌량무형성 증후군, 쉰젤 유형; 아크로카피토페모랄 이형성증; 선단이골증 2, 호르몬 저항성 동반 또는 비동반; 말단홍색각피증; 말단왜소 이형성증; ACTH-비의존성 거대결정성 부신 증식증 2; 활성화된 PI3K-델타 증후군; 급성 간헐성 포르피린증; 아실-CoA 데히드로게나제 패밀리, 구성원 9의 결핍; 아담스-올리버 증후군 5 및 6; 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 결핍; 아데닐레이트 키나제 결핍; 아데닐로숙시네이트 리아제 결핍으로 인한 용혈성 빈혈; 청소년 신결석증; 신장-간-췌장 이형성증; 멕켈 증후군 유형 7; 부신백질이영양증; 성인 접합부 수포성 표피박리증; 수포성 표피박리증, 접합부, 국소 변이형; 성인 신경 세로이드 리포푸신증; 성인 신경 세로이드 리포푸신증; 안구운동 실행증을 동반한 성인 발병 운동실조; 성인 증후군; 무섬유소혈증 및 선천성 무섬유소혈증; 상염색체 열성 무감마글로불린혈증 2; 연령-관련 황반 변성 3, 6, 11, 및 12; 에카르디 구티에레스 증후군 1, 4, 및 5; 동창 루푸스 1; 알라질 증후군 1 및 2; 알렉산더병; 알캅톤뇨증; 알란-헌던-두들리 증후군; 범발성 탈모증 선천성; 알퍼스 뇌병증; 알파-1-항트립신 결핍; 상염색체 우성, 상염색체 열성, 및 X-연관 열성 알포트 증후군; 알츠하이머병, 가족성, 3, 경직성 하반신부전마비 및 실행증 동반; 알츠하이머병, 유형, 1, 3, 및 4; 저석회화 유형 및 저성숙 유형, IIA1 불완전 사기질형성증; 아미노아실라제 1 결핍; 아미시 영아 간질 증후군; 아밀로이드생성 트랜스티레틴 아밀로이드증; 아밀로이드 심근병증, 트랜스티레틴-관련; 심근병증; 근위축성 측삭 경화증 유형 1, 6, 15 (전두측두엽 치매 동반 또는 비동반), 22 (전두측두엽 치매 동반 또는 비동반), 및 10; TDP43 함유물을 동반한 전두측두엽 치매, TARDBP-관련; 앤더만 증후군; 안데르센 타윌 증후군; 선천성 긴 QT 증후군; 빈혈, 비구상 용혈성, G6PD 결핍으로 인함; 안젤만 증후근; 소두증을 동반한 중증 신생아-발병 뇌병증; 자폐증에 감수성, X-연관 3; 혈관병증, 유전성, 신병증, 동맥류 및 근육 경련 동반; 안지오텐신 i-전환 효소, 양성 혈청 증가; 무홍채증, 소뇌 운동실조, 및 정신 지체; 손발톱결여증; 항트롬빈 III 결핍; 생식기 기형 및 장애성 스테로이드생성을 동반한 앤틀리-빅슬러 증후군; 대동맥류, 가족성 흉부 4, 6, 및 9; 흉부 대동맥류 및 대동맥 박리; 전신성 평활근 기능장애 증후군; 모야모야병 5; 재생불량성 빈혈; 겉보기 미네랄로코르티코이드 과잉; 아르기나제 결핍; 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍; 아로마타제 결핍; 부정맥유발성 우심실 심근병증 유형 5, 8, 및 10; 원발성 가족성 비대성 심근병증; 선천성 다발성 관절만곡증, 원위, X-연관; 관절만곡증 신장 기능장애 담즙정체 증후군; 관절만곡증, 신장 기능장애, 및 담즙정체 2; 아스파라긴 신테타제 결핍; 뉴런 이동의 이상; 비타민 E 결핍을 동반한 운동실조; 운동실조, 감각, 상염색체 우성; 운동실조-모세혈관확장증 증후군; 유전성 암-소인 증후군; 무트랜스페린혈증; 심방 세동, 가족성, 11, 12, 13, 및 16; 심방 중격 결손 2, 4, 및 7 (방실 전도 결함 동반 또는 비동반); 심방 정지 2; 방실 중격 결손 4; 유전성 안구 위축증; ATR-X 증후군; 귓바퀴관절융기 증후군 2; 자가면역 질환, 다기관, 영아-발병; 자가면역 림프증식성 증후군, 유형 1a; 상염색체 우성 발한저하성 외배엽 이형성증; 미토콘드리아 DNA 결실을 동반한 상염색체 우성 진행성 외안근마비 1 및 3; 상염색체 우성 염전 이상긴장증 4; 상염색체 열성 중심핵성 근병증; 상염색체 열성 선천성 어린선 1, 2, 3, 4A, 및 4B; 상염색체 열성 이완성 피부증 유형 IA 및 1B; 상염색체 열성 발한저하성 외배엽 이형성증 증후군; 외배엽 이형성증 11b; 발한저하성/모발/치아 유형, 상염색체 열성; 상염색체 열성 저인산혈증 골 질환; 악센펠트-리거 증후군 유형 3; 베인브리지-로퍼스 증후군; 바나얀-릴리-루발카바 증후군; PTEN 과오종 종양 증후군; 바레이처-윈터 증후군 1 및 2; 바라카트 증후군; 바르데-비들 증후군 1, 11, 16, 및 19; 무표지 림프구 증후군 유형 2, 상보군 E; 바터 증후군 산전 유형 2; 바터 증후군 유형 3, 저칼슘뇨 동반 3, 및 4; 기저 신경절 석회화, 특발성, 4; 염주털; 양성 가족성 혈뇨; 양성 가족성 신생아 발작 1 및 2; 발작, 양성 가족성 신생아, 1 및/또는 근파동; 발작, 조기 영아 간질성 뇌병증 7; 양성 가족성 신생아-영아 발작; 양성 유전성 무도병; 심근병증을 동반한 양성 견갑비골 근육 이영양증; 버나드-술리에 증후군, 유형 A1 및 A2 (상염색체 우성); 베스트로핀병증, 상염색체 열성; 베타 지중해빈혈; 베스렘 근병증 및 베스렘 근병증 2; 비에티 결정질 각막망막 이영양증; 담즙산 합성 결함, 선천성, 2; 비오티니다제 결핍; 버크 바렐 정신 지체 이형 증후군; 실눈증, 안검하수증, 및 역내안각주름; 블룸 증후군; 보제슨-포스만-레만 증후군; 보우셔 노이하우저 증후군; 단지증 유형 A1 및 A2; 고혈압을 동반한 단지증; 출혈을 동반한 뇌 소혈관 질환; 분지형-쇄 케토산 데히드로게나제 키나제 결핍; 아가미귀 증후군 2 및 3; 유방암, 조기 발병; 유방-난소암, 가족성 1, 2, 및 4; 취약 각막 증후군 2; 브로디 근병증; 땀 염화물 상승 동반 또는 비동반 기관지확장증 3; 브라운-비알레토-반 라에레 증후군 및 브라운-비알레토-반 라에레 증후군 2; 브루가다 증후군; 브루가다 증후군 1; 심실 세동; 발작성 가족성 심실 세동; 브루가다 증후군 및 브루가다 증후군 4; 긴 QT 증후군; 심장 돌연사; 과녁 황반 이영양증; 스타르가르트병 4; 추체-간체 이영양증 12; 수포성 어린선형 홍피증; 번-맥코운 증후군; 칸디다증, 가족성, 2, 5, 6, 및 8; 탄수화물-결핍 당단백질 증후군 유형 I 및 II; 탄산 안히드라제 VA 결핍, 이에 기인한 고암모니아혈증; 결장의 암종; 심장 부정맥; 긴 QT 증후군, LQT1 하위유형; 심뇌근병증, 치명성 영아, 시토크롬 c 옥시다제 결핍으로 인함; 심장얼굴피부 증후군; 심근병증; 다논병; 비대성 심근병증; 좌심실 비치밀 심근병증; 카네발 증후군; 카니 복합증, 유형 1; 카르니틴 아실카르니틴 트랜스로카제 결핍; 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제 I, II, II (후기 발병), 및 II (영아) 결핍; 백내장 1, 4, 상염색체 우성, 상염색체 우성, 다중 유형, 소각막 동반, 코폭-유사, 소아, 소각막 및 글루코스뇨 동반, 및 핵 미만성 비진행성; 카테콜아민성 다형성 심실성 빈맥; 미측 퇴행 증후군; Cd8 결핍, 가족성; 중심핵병; 염색체 1,9 및 16의 동원체 불안정성 및 면역결핍; 진행성 외안근마비를 동반한 영아 소뇌 운동실조 및 소뇌 운동실조, 정신 지체, 및 평형이상 증후군 2; 뇌 아밀로이드 혈관병증, APP-관련; 피질하 경색 및 백질뇌병증 동반 뇌 상염색체 우성 및 열성 동맥병증; 뇌 해면 기형 2; 뇌안구안면골격 증후군 2; 뇌-안구-안면-골격 증후군; 석회화 및 낭을 동반한 대뇌망막 미세혈관병증; 세로이드 리포푸신증 뉴런 2, 6, 7, 및 10; 체디악-히가시 증후군, 체디악-히가시 증후군, 성인 유형; 샤르코-마리-투스병 유형 1B, 2B2, 2C, 2F, 2I, 2U (축삭), 1C (탈수초성), 우성 중간체 C, 열성 중간체 A, 2A2, 4C, 4D, 4H, IF, IVF, 및 X; 견갑비골 척수성 근육 위축; 원위 척수성 근육 위축, 선천성 비진행성; 척수성 근육 위축, 원위, 상염색체 열성, 5; CHARGE 연합증; 소아기 저포스파타제증; 성인 저포스파타제증; 담낭염; 진행성 가족성 간내 담즙정체 3; 담즙정체, 간내, 임신중 3; 콜레스타놀 축적 질환; 콜레스테롤 모노옥시게나제 (측쇄 절단) 결핍; 연골이형성증 블롬스트랜드 유형; 점상 연골이형성증 1, X-연관 열성 및 2 X-연관 우성; CHOPS 증후군; 만성 육아종성 질환, 상염색체 열성 시토크롬 b-양성, 유형 1 및 2; 추들리-맥쿨로우 증후군; 섬모 이상운동증, 원발성, 7, 11, 15, 20 및 22; 시트룰린혈증 유형 I; 시트룰린혈증 유형 I 및 II; 쇄골두개 이골증; C-유사 증후군; 코케인 증후군 유형 A; 조효소 Q10 결핍, 원발성 1, 4, 및 7; 코핀 시리스/지적 장애; 코핀-로우리 증후군; 코헨 증후군; 감기-유발 발한 증후군 1; 콜-카펜터 증후군 2; 육아종을 동반한 복합 세포성 및 체액성 면역 결함; 복합 d-2- 및 l-2-히드록시글루타르산뇨; 복합 말론산 및 메틸말론산뇨; 복합 산화성 인산화 결핍 1, 3, 4, 12, 15, 및 25; 복합 부분 및 완전 17-알파-히드록실라제/17,20-리아제 결핍; 공통 가변성 면역결핍 9; 보체 성분 4, 이의 부분 결핍, 기능장애성 c1 억제제로 인함; 보체 인자 B 결핍; 추체 단색형색각; 추체-간체 이영양증 2 및 6; 추체-간체 이영양증 불완전 사기질형성증; 선천성 부신 증식증 및 선천성 부신 저형성증, X-연관; 선천성 무거핵구성 혈소판감소증; 선천성 무홍채증; 선천성 중앙 저환기; 히르쉬스프룽 질환 3; 선천성 구축성 거미가락증; 선천성 사지 및 안면 구축, 저긴장증, 및 발달 지체; 선천성 글리코실화 장애 유형 1B, 1D, 1G, 1H, 1J, 1K, 1N, 1P, 2C, 2J, 2K, IIm; 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 유형 I 및 II; 선천성 안면 외배엽 이형성증; 선천성 적혈구생성 포르피린증; 선천성 전신 지방이영양증 유형 2; 선천적 심장 질환, 다중 유형, 2; 선천적 심장 질환; 단속 대동맥궁; 선천성 지방종성 과도성장, 혈관 기형, 및 표피 모반; 비소세포 폐암; 난소의 신생물; 심장 전도 결손, 비특이적; 선천성 미세융모 위축; 선천성 근육 이영양증; 부분 LAMA2 결핍으로 인한 선천성 근육 이영양증; 뇌 및 안구 기형을 동반한 선천성 근육 이영양증-디스트로글리칸병증, 유형 A2, A7, A8, A11, 및 A14; 정신 지체를 동반한 선천성 근육 이영양증-디스트로글리칸병증, 유형 B2, B3, B5, 및 B15; 정신 지체를 비동반한 선천성 근육 이영양증-디스트로글리칸병증, 유형 B5; 선천성 근육 비대-뇌 증후군; 선천성 근무력 증후군, 아세타졸아미드-반응성; 섬유 유형 불균등을 동반한 선천성 근병증; 선천성 안구 결손증; 선천성 비진행성 야맹증, 유형 1A, 1B, 1C, 1E, 1F, 및 2A; 코프로포르피린증; 납작각막 2; 각막 이영양증, 푸크스 내피, 4; 각막 내피 이영양증 유형 2; 각막 취약성 구형각막, 청색 공막 및 관절 과운동성; 코넬리아 드 랑쥐 증후군 1 및 5; 관상 동맥 질환, 상염색체 우성 2; 관상동맥 심장 질환; 고알파지단백혈증 2; 피질 이형성증, 복합체, 다른 뇌 기형 동반 5 및 6; 피질 기형, 후두; 코르티코스테로이드-결합 글로불린 결핍; 코르티코스테론 메틸옥시다제 유형 2 결핍; 코스텔로 증후군; 코우덴 증후군 1; 편평고; 두개골간 이형성증, 상염색체 우성; 두개골유합증 1 및 4; 두개골유합증 및 치아 기형; 크레아틴 결핍, X-연관; 크루존 증후군; 잠복안구 증후군; 잠복고환, 일측 또는 양측; 쿠싱 지절유합증; 피부 악성 흑색종 1; 골이영양증 및 중증 폐, 위장, 및 뇨 이상을 동반한 이완성 피부증; 청색증, 일과성 신생아 및 비정형 신병증성; 낭성 섬유증; 시스틴뇨; 시토크롬 c 옥시다제 i 결핍; 시토크롬-c 옥시다제 결핍; D-2-히드록시글루타르산뇨 2; 다리에병, 분절성; 미로 무형성 소이증 및 소치증 (LAMM)을 동반한 난청; 난청, 상염색체 우성 3a, 4, 12, 13, 15, 상염색체 우성 비증후군성 감각신경성 17, 20, 및 65; 난청, 상염색체 열성 1A, 2, 3, 6, 8, 9, 12, 15, 16, 18b, 22, 28, 31, 44, 49, 63, 77, 86, 및 89; 난청, 와우, 근시 및 지적 손상 동반, 전정 침범 비동반, 상염색체 우성, X-연관 2; 2-메틸부티릴-CoA 데히드로게나제의 결핍; 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제의 결핍; 알파-만노시다제의 결핍; 방향족-L-아미노산 데카르복실라제의 결핍; 비스포스포글리세레이트 뮤타제의 결핍; 부티릴-CoA 데히드로게나제의 결핍; 페록시다제의 결핍; 갈락토키나제의 결핍; 구아니디노아세테이트 메틸트랜스퍼라제의 결핍; 히알루로노글루코사미니다제의 결핍; 리보스-5-포스페이트 이소머라제의 결핍; 스테로이드 11-베타-모노옥시게나제의 결핍; UDP글루코스-헥소스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 결핍; 크산틴 옥시다제의 결핍; 데제린-소타스병; 샤르코-마리-투스병, 유형 ID 및 IVF; 데제린-소타스 증후군, 상염색체 우성; 수지상 세포, 단핵구, B 림프구, 및 자연 킬러 림프구 결핍; 드뷔쿠아 이형성증 2; 드뷔쿠아 증후군; DFNA 2 비증후군성 청각 상실; 시신경 위축 및 난청을 동반한 당뇨병 및 요붕증; 당뇨병, 유형 2, 및 인슐린-의존성, 20; 다이아몬드-블랙판 빈혈 1, 5, 8, 및 10; 설사 3 (분비 나트륨, 선천성, 증후군성) 및 5 (터프팅 장병증 동반, 선천성); 디카르복실산 아미노산뇨증; 미만성 수장족저 각피증, 보트니안 유형; 수족지신장뇌 증후군; 디히드로프테리딘 리덕타제 결핍; 확장성 심근병증 1A, 1AA, 1C, 1G, 1BB, 1DD, 1FF, 1HH, 1I, 1KK, 1N, 1S, 1Y, 및 3B; 좌심실 비치밀 3; 시토크롬 p450 옥시도리덕타제 결핍으로 인한 장애성 스테로이드생성; 원위 관절만곡증 유형 2B; 원위 유전성 모터 뉴런병증 유형 2B; 원위 근병증 마르케스베리-그릭스 유형; 원위 척수성 근육 위축, X-연관 3; 첩모중생증-림프부종 증후군; 피부의 부재를 동반한 우성 이영양성 수포성 표피박리증; 우성 유전성 시신경 위축; 돈나이 바로우 증후군; 도파민 베타 히드록실라제 결핍; 도파민 수용체 d2, 감소된 뇌 밀도; 다울링-데고스병 4; 도인 벌집형 망막 이영양증; 말라티아 레벤티네스; 듀안 증후군 유형 2; 두빈-존슨 증후군; 뒤시엔느 근육 이영양증; 베커 근육 이영양증; 이상피브리노겐혈증; 선천성 이상각화증 상염색체 우성 및 상염색체 우성, 3; 선천성 이상각화증, 상염색체 열성, 1, 3, 4, 및 5; 선천성 이상각화증 X-연관; 이상운동증, 가족성, 안면 근파동 동반; 이상플라스미노겐혈증; 이상긴장증 2 (염전, 상염색체 열성), 3 (염전, X-연관), 5 (도파-반응성 유형), 10, 12, 16, 25, 26 (근간대성); 발작, 양성 가족성 영아, 2; 조기 영아 간질성 뇌병증 2, 4, 7, 9, 10, 11, 13, 및 14; 비정형 레트 증후군; 초기 T 세포 전구세포 급성 림프모구성 백혈병; 외배엽 이형성증 피부 취약성 증후군; 외배엽 이형성증-합지증 증후군 1; 수정체 편위, 고립성 상염색체 열성 및 우성; 가락결손증, 외배엽 이형성증, 및 구순열/구개 증후군 3; 엘러스-단로스 증후군 유형 7 (상염색체 열성), 전형적 유형, 유형 2 (조로), 히드록시리신-결핍, 유형 4, 유형 4 변이형, 및 테나신-X 결핍으로 인함; 아이흐스펠트 유형 선천성 근육 이영양증; 내분비-뇌골이형성증; 증진된 s-추체 증후군; 비대 전정 수도관 증후군; 엔테로키나제 결핍; 사마귀양 표피이형성증; 단순 수포성 표피박리증 및 지대 근육 이영양증, 얼룩덜룩한 색소침착을 동반한 단순 수포성 표피박리증, 유문 폐쇄증을 동반한 단순 수포성 표피박리증, 상염색체 열성 및 유문 폐쇄증을 동반한 단순 수포성 표피박리증; 표피박리성 수장족저 각피증; 가족성 열성 발작 8; 간질, 소아기 부재 2, 12 (특발성 전신, 이에 감수성) 5 (야간 전두엽), 야간 전두엽 유형 1, 부분, 가변성 초점 동반, 진행성 근간대성 3, 및 X-연관, 가변성 학습 불능 및 행동 장애 동반; 간질성 뇌병증, 소아기-발병, 초기 영아, 1, 19, 23, 25, 30, 및 32; 골단 이형성증, 다중, 근시 및 전도성 난청 동반; 간헐성 운동실조 유형 2; 간헐성 통증 증후군, 가족성, 3; 엡스타인 증후군; 펙트너 증후군; 적혈구생성 프로토포르피린증; 에스트로겐 저항성; 삼출성 유리체망막병증 6; 파브리병 및 심장 변이형 파브리병; 인자 H, VII, X, v 및 인자 VIII, 2의 복합 결핍, xiii, 서브유닛, 결핍; 가족성 선종성 폴립증 1 및 3; 두드러기 및 난청을 동반한 가족성 아밀로이드 신병증; 가족성 한랭 두드러기; 충부의 가족성 무형성증; 가족성 양성 천포창; 가족성 유방암; 유방암, 이에 감수성; 골육종; 췌장암 3; 가족성 심근병증; 가족성 한랭 자가염증성 증후군 2; 가족성 결장직장암; 가족성 삼출성 유리체망막병증, X-연관; 가족성 편마비성 편두통 유형 1 및 2; 가족성 고콜레스테롤혈증; 가족성 비후성 심근병증 1, 2, 3, 4, 7, 10, 23 및 24; 가족성 저칼륨혈증-저마그네슘혈증; 가족성 형성부전성, 사구체낭성 신장; 가족성 영아 근무력증; 가족성 소아 통풍; 가족성 지중해열 및 가족성 지중해열, 상염색체 우성; 가족성 공뇌증; 가족성 만발성 피부 포르피린증; 가족성 폐 모세혈관종증; 가족성 신장 글루코스뇨; 가족성 신장 저요산혈증; 가족성 제한성 심근병증 1; 가족성 유형 1 및 3 고지단백혈증; 판코니 빈혈, 상보군 E, I, N, 및 O; 판코니-빅켈 증후군; 잠두중독증, 이에 감수성; 열성 발작, 가족성, 11; 페인골드 증후군 1; 태아성 헤모글로빈 정량적 형질 유전자좌 1; FG 증후군 및 FG 증후군 4; 외안근의 섬유증, 선천성, 1, 2, 3a (안외 침범 동반 또는 비동반), 3b; 피쉬-아이 질환; 반점 각막 이영양증; 플로팅-하버 증후군; 정신 지체 동반 또는 비동반 언어 장애를 동반한 초점성 간질; 초점성 분절성 사구체경화증 5; 전뇌 결함; 프랭크 테르 하르 증후군; 보론 디 로코 크로바토 증후군; 프레이저 증후군; 윌름스 종양 1; 프리만-쉘돈 증후군; 전두골간단 이형성증 1 및 3; 전두측두엽 치매; 전두측두엽 치매 및/또는 근위축성 측삭 경화증 3 및 4; 전두측두엽 치매 염색체 3-연관 및 전두측두엽 치매 유비퀴틴-양성; 프룩토스-비포스파타제 결핍; 푸르만 증후군; 감마-아미노부티르산 트랜스아미나제 결핍; 감스토르프-볼파르트 증후군; 고셔병 유형 1 및 아급성 뉴런병증성; 주시 마비, 가족성 수평, 진행성 척추측만증 동반; 전신 우성 이영양성 수포성 표피박리증; 열성 발작을 동반한 전신 간질 플러스 3, 유형 1, 유형 2; 간질성 뇌병증 레녹스-가스토 유형; 거대 축삭 신경병증; 글라즈만 혈소판무력증; 녹내장 1, 개방각, e, F, 및 G; 녹내장 3, 원발성 선천성, d; 녹내장, 선천성 및 녹내장, 선천성, 결손증; 녹내장, 원발성 개방각, 소아-발병; 신경교종 감수성 1; 글루코스 수송체 유형 1 결핍 증후군; 글루코스-6-포스페이트 수송 결함; GLUT1 결핍 증후군 2; 간질, 특발성 전신, 이에 감수성, 12; 글루타메이트 포름이미노트랜스퍼라제 결핍; 글루타르산혈증 IIA 및 IIB; 글루타르산뇨, 유형 1; 글루타티온 신테타제 결핍; 글리코겐 축적 질환 0 (근육), II (성인 형태), IXa2, IXc, 유형 1A; 유형 II, 유형 IV, IV (복합 간 및 근병증성), 유형 V, 및 유형 VI; 골드만-파브르 증후군; 고돈 증후군; 골린 증후군; 완전전뇌증 서열; 완전전뇌증 7; 육아종성 질환, 만성, X-연관, 변이형; 난소의 과립막 세포 종양; 회색 혈소판 증후군; 그리셀리 증후군 유형 3; 그뢰노우브 각막 이영양증 유형 I; 성장 및 정신 지체, 하악안면 이골증, 소두증, 및 구개열; 뇌하수체 기형을 동반한 성장 호르몬 결핍; 면역결핍을 동반한 성장 호르몬 무감응; GTP 시클로히드롤라제 I 결핍; 하쥬-체니 증후군; 수족 자궁 증후군; 청각 장애; 혈관종, 모세관 영아; 혈액 신생물; 혈색소증 유형 1, 2B, 및 3; 당뇨병의 미세혈관 합병증 7; 트랜스페린 혈청 수준 정량적 형질 유전자좌 2; 헤모글로빈 H 질환, 비결실; 용혈성 빈혈, 비구상, 글루코스 포스페이트 이소머라제 결핍으로 인함; 혈구포식성 림프조직구증식증, 가족성, 2; 혈구포식성 림프조직구증식증, 가족성, 3; 헤파린 보조인자 II 결핍; 유전성 장병성 말단피부염; 유전성 유방 및 난소암 증후군; 운동실조-모세혈관확장증-유사 장애; 유전성 미만성 위암; 타원체를 동반한 유전성 미만성 백질뇌병증; 유전성 인자 II, IX, VIII 결핍 질환; 유전성 출혈성 모세혈관확장증 유형 2; 무한증을 동반한 유전성 무통각증; 유전성 림프부종 유형 I; 시신경 위축을 동반한 유전성 운동 및 감각 신경병증; 초기 호흡 부전을 동반한 유전성 근병증; 유전성 신경통 근위축; 유전성 비폴립증 결장직장 신생물; 린치 증후군 I 및 II; 유전성 췌장염; 췌장염, 만성, 이에 감수성; 유전성 감각 및 자율 신경병증 유형 IIB 및 IIA; 유전성 철적혈모구성 빈혈; 헤르만스키-푸들라크 증후군 1, 3, 4, 및 6; 착위, 내장, 2, 4, 및 6, 상염색체; 착위, 내장, X-연관; 이소증; 조직구성 수질성 망상증; 조직구증-림프절병증 플러스 증후군; 홀로카르복실라제 신테타제 결핍; 완전전뇌증 2, 3,7, 및 9; 홀트-오람 증후군; MTHFR 결핍으로 인한 호모시스테인혈증, CBS 결핍으로 인한 호모시스틴뇨증, 및 호모시스틴뇨증, 피리독신-반응성; 코발라민 대사에서의 결함으로 인한 호모시스틴뇨증-거대적모구성 빈혈, cblE 보완 유형; 호웰-에반스 증후군; 후를러 증후군; 허친슨-길포드 증후군; 수두증; 고암모니아혈증, 유형 III; 고콜레스테롤혈증 및 고콜레스테롤혈증, 상염색체 열성; 과도놀람증 2 및 과도놀람증 유전성; 고페리틴혈증 백내장 증후군; 고글리신뇨증; 주기열을 동반한 고이뮤노글로불린 D; 메발론산뇨증; 고이뮤노글로불린 E 증후군; 고인슐린혈증성 저혈당증 가족성 3, 4, 및 5; 고인슐린증-고암모니아혈증 증후군; 고리신혈증; 이상긴장증, 다혈구혈증 및 간경변증을 동반한 고망가니즈혈증; 고오르니틴혈증-고암모니아혈증-호모시트룰린뇨증 증후군; 부갑상선기능항진증 1 및 2; 부갑상선기능항진증, 신생아 중증; 고페닐알라닌혈증, bh4-결핍, a, 부분 pts 결핍으로 인함, BH4-결핍, D, 및 비-pku; 정신 지체 증후군을 동반한 고포스파타제증 2, 3, 및 4; 털감소증성 골연골이형성증; 저베타지단백혈증, 가족성, apob32 연관; 저칼슘혈증, 상염색체 우성 1; 저칼슘뇨 고칼슘혈증, 가족성, 유형 1 및 3; 저연골형성; 철 과부하를 동반한 저색소성 소구성 빈혈; 간 내 글리코겐 신테타제의 결핍을 동반한 저혈당증; 후각결여 동반 또는 비동반 저생식선자극 생식선기능저하증 11; 면역 결핍을 동반한 발한저하성 외배엽 이형성증; 발한저하성 X-연관 외배엽 이형성증; 저칼륨혈성 주기성 마비 1 및 2; 저마그네슘혈증 1, 장; 저마그네슘혈증, 발작, 및 정신 지체; 저수초형성 백질이영양증 7; 형성부전성 좌심 증후군; 방실 중격 결손 및 공통 방실 접합부; 요도하열 1 및 2, X-연관; 갑상선기능저하증, 선천성, 비갑상선종성, 1; 털감소증 8 및 12; 털감소증-림프부종-모세혈관확장증 증후군; I 혈액형 시스템; 지멘스 수포성 어린선; 박탈성 어린선; 어린선 조숙 증후군; 특발성 기저 신경절 석회화 5; 특발성 섬유화 폐포염, 만성 형태; 선천성 이상각화증, 상염색체 우성, 2 및 5; 영아기의 특발성 고칼슘혈증; 칼슘 유입 결함으로 인한 T-세포 불활성화를 동반한 면역 기능장애 2; 면역결핍 15, 16, 19, 30, 31C, 38, 40, 8, cd3-제타에서의 결함으로 인함, 과다 IgM 동반 유형 1 및 2, 및 X-연관, 마그네슘 결함, 엡스타인-바르 바이러스 감염 및 신생물 동반; 면역결핍-동원체 불안정성-안면 기형 증후군 2; 봉입체 근병증 2 및 3; 노나카 근병증; 영아 경련 및 발작성 무도무정위운동증, 가족성; 영아 피질 과골증; 영아 GM1 강글리오시드증; 영아 저포스파타제증; 영아 신결석증; 영아 안진, X-연관; 영아 파킨슨증-이상긴장증; 다중-꼬리 정자 및 과도한 DNA와 연관된 불임; 인슐린 저항성; 인슐린-저항성 당뇨병 및 흑색 극세포증; 인슐린-의존성 당뇨병 분비성 설사 증후군; 간질성 신염, 거대세포핵; 자궁내 성장 지연, 골간단 이형성증, 선천성 부신 저형성증, 및 생식기 기형; 아이오도티로실 커플링 결함; IRAK4 결핍; 이리도전방각이발생증 우성 유형 및 유형 1; 뇌 내 철 축적; 좌골슬개골 이형성증; 도세포 증식증; 고립성 17,20-리아제 결핍; 고립성 루트로핀 결핍; 이소발레릴-CoA 데히드로게나제 결핍; 잔코빅 리베라 증후군; 제벨 랑쥐-닐슨 증후군 2; 주버트 증후군 1, 6, 7, 9/15 (이유전자), 14, 16, 및 17, 및 구안지 증후군 xiv; 헬리츠 중증 접합부 수포성 표피박리증; 소아 GM>1< 강글리오시드증; 소아 폴립증 증후군; 소아 폴립증/유전성 출혈성 모세혈관확장증 증후군; 소아 망막층간분리; 가부키 메이크업 증후군; 칼만 증후군 1, 2, 및 6; 지연된 사춘기; 칸자키병; 카라크 증후군; 카르타게너 증후군; 케니-카페이 증후군 유형 2; 케펜-루빈스키 증후군; 원추각막 1; 모낭 각화증; 선상 수장족저 각화증 1; 킨틀러 증후군; L-2-히드록시글루타르산뇨; 라슨 증후군, 우성 유형; 격자 각막 이영양증 유형 III; 레베르 흑암시; 젤베거 증후군; 퍼옥시솜 생물발생 장애; 젤베거 증후군 스펙트럼; 레베르 선천성 흑암시 11, 12, 13, 16, 4, 7, 및 9; 레베르 시신경 위축; 아미노글리코시드-유발 난청; 난청, 비증후군성 감각신경성, 미토콘드리아; 좌심실 비치밀 5; 좌우축 기형; 리병; 미토콘드리아 단쇄 에노일-CoA 히드라타제 1 결핍; 미토콘드리아 복합체 I 결핍으로 인한 리 증후군; 라이너병; 레리 웨일 이상연골골형성증; 치사 선천성 구축 증후군 6; 백혈구 부착 결핍 유형 I 및 III; 백질이영양증, 저수초형성, 11 및 6; 백질뇌병증, 운동실조 동반, 뇌간 및 척수 침범 및 락테이트 상승 동반, 소멸 백질 동반, 및 진행성, 난소 부전 동반; 전체 백색손발톱; 루이 소체 치매; 리히텐스타인-노르 증후군; 리-프라우메니 증후군 1; Lig4 증후군; 지대 근육 이영양증, 유형 1B, 2A, 2B, 2D, C1, C5, C9, C14; 뇌 및 안구 기형을 동반한 선천성 근육 이영양증-디스트로글리칸병증, 유형 A14 및 B14; 리파제 결핍 복합; 지질 단백증; 지방이영양증, 가족성 부분, 유형 2 및 3; 활택뇌증 1, 2 (X-연관), 3, 6 (소두증 동반), X-연관; 피질하 층형 이소증, X-연관; 간부전 급성 영아; 로이스-디에츠 증후군 1, 2, 3; 긴 QT 증후군 1, 2, 2/9, 2/5, (이유전자), 3, 5 및 5, 후천성, 이에 감수성; 폐암; 림프부종, 유전성, id; 림프부종, 원발성, 골수이형성증 동반; 림프증식성 증후군 1, 1 (X-연관), 및 2; 리소솜 산 리파제 결핍; 대두증, 거구증, 안면 이형 증후군; 황반 이영양증, 난황상, 성인-발병; 악성 고온요법 감수성 유형 1; 악성 림프종, 비-호지킨; 악성 흑색종; 전립선의 악성 종양; 하악말단 이골증; 유형 A 또는 B 지방이영양증을 동반한 하악말단 이형성증, 비정형; 하악안면 이골증, 트리처 콜린스 유형, 상염색체 열성; 만노스-결합 단백질 결핍; 메이플 시럽뇨 질환 유형 1A 및 유형 3; 마르덴 워커 유사 증후군; 마르팡 증후군; 마린스코-쇼그렌 증후군; 마트솔프 증후군; 청소년의 성숙기-발병 당뇨병, 유형 1, 유형 2, 유형 11, 유형 3, 및 유형 9; 메이-헤글린 기형; MYH9 관련 장애; 세바스티안 증후군; 맥쿤-올브라이트 증후군; 소마토트로프 선종; 성별 코드-기질 종양; 쿠싱 증후군; 맥쿠식 카우프만 증후군; 맥레오드 신경유극적혈구증가증 증후군; 멕켈-그루버 증후군; 중간쇄 아실-조효소 A 데히드로게나제 결핍; 수모세포종; 피질하 낭을 동반한 거대뇌성 백질뇌병증 1 및 2a; 거대뇌증 선천성 모세혈관확장 대리석 피부증; PIK3CA 관련 과도성장 스펙트럼; 거대뇌증-다소뇌회증-다지증-수두증 증후군 2; 거대적모구성 빈혈, 티아민-반응성, 당뇨병 및 감각신경성 난청 동반; 마이어-골린 증후군 1 및 4; 멜닉-니들스 증후군; 수막종; 정신 지체, X-연관, 3, 21, 30, 및 72; 정신 지체 및 뇌교 및 소뇌 저형성증을 동반한 소두증; 정신 지체 X-연관 증후군 5; 정신 지체, 전방 상악 돌출, 및 사시; 정신 지체, 상염색체 우성 12, 13, 15, 24, 3, 30, 4, 5, 6,및 9; 정신 지체, 상염색체 열성 15, 44, 46, 및 5; 정신 지체, 상동증적 운동, 간질 및/또는 뇌 기형; 정신 지체, 증후군성, 클라에스-젠슨 유형, X-연관; 정신 지체, X-연관, 비특이적, 증후군성, 헤데라 유형, 및 증후군성, wu 유형; 메로신 결핍 선천성 근육 이영양증; 이염성 백질이영양증 소아, 후기 영아, 및 성인 유형; 이염성 백질이영양증; 영양위축성 이형성증; 메트헤모글로빈혈증 유형 I 및 2; 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 결핍, 상염색체 우성; 호모시스틴뇨증을 동반한 메틸말론산혈증; 메틸말론산뇨 cblB 유형; 메틸말로닐-CoA 뮤타제 결핍으로 인한 메틸말론산뇨; 메틸말론산뇨, mut(0) 유형; 소두 골이형성 원발 왜소증 유형 2; 맥락망막병증, 림프부종 또는 정신 지체 동반 또는 비동반 소두증; 소두증, 열공 헤르니아 및 신증후군; 소두증; 뇌량의 저형성증; 경직성 하반신마비 50, 상염색체 열성; 전반적 발달 지연; CNS 저수포형성증; 뇌 위축; 소두증, 정상 지능 및 면역결핍; 소두증-모세관 기형 증후군; 소구성 빈혈; 소안구증 증후군성 5, 7, 및 9; 소안구증, 고립성 3, 5, 6, 8, 및 결손증 동반 6; 구형소수정체증; 편두통, 가족성 뇌기저; 밀러 증후군; 외안근마비를 동반한 미니코어 근병증; 근병증, 코어 동반 선천성; 미첼-릴리 증후군; 미토콘드리아 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 신타제 결핍; 미토콘드리아 복합체 I, II, III, III (핵 유형 2, 4, 또는 8) 결핍; 미토콘드리아 DNA 고갈 증후군 11, 12 (심근병증 유형), 2, 4B (MNGIE 유형), 8B (MNGIE 유형); 미토콘드리아 DNA-고갈 증후군 3 및 7, 간뇌 유형, 및 13 (뇌근병증 유형); 미토콘드리아 포스페이트 담체 및 피루베이트 담체 결핍; 미토콘드리아 삼중기능성 단백질 결핍; 긴-쇄 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 결핍; 미요시 근육 이영양증 1; 근병증, 원위, 전경골 발병 동반; 모어-트라네뱌예르크 증후군; 몰리브데넘 보조인자 결핍, 상보군 A; 모와트-윌슨 증후군; 점액지질증 III 감마; 뮤코폴리사카라이드증 유형 VI, 유형 VI (중증), 및 유형 VII; 뮤코폴리사카라이드증, MPS-I-H/S, MPS-II, MPS-III-A, MPS-III-B, MPS-III-C, MPS-IV-A, MPS-IV-B; 색소성 망막염 73; 강글리오시드증 GM1 유형1 (심장 침범 동반) 3; 다중심성 골용해 신병증; 다중심성 골용해, 소결절증 및 관절병증; 다발성 선천성 기형; 심방 중격 결손 2; 다발성 선천성 기형-저긴장증-발작 증후군 3; 다중 피부 및 점막 정맥 기형; 다발성 내분비 신생물, 유형 1 및 4; 다중 골단 이형성증 5 또는 우성; 다중 위장 폐쇄증; 다중 익상편 증후군 에스코바르 유형; 다중 술파타제 결핍; 다중 익상편 증후군 3; 근육 AMP 구아닌 옥시다제 결핍; 근육 안구 뇌 질환; 근육 이영양증, 선천성, 메가코니알 유형; 근무력증, 가족성 영아, 1; 근무력 증후군, 선천성, 11, 아세틸콜린 수용체 결핍 연관; 근무력 증후군, 선천성, 17, 2A (느린-채널), 4B (빠른-채널), 및 관상 응집체 부재; 미엘로퍼옥시다제 결핍; MYH-연관 폴립증; 자궁내막 암종; 심근경색 1; 근간대성 이상긴장증; 근간대성-무긴장성 간질; 불균일 적색 근섬유를 동반한 간질을 동반한 근간대성경련; 근원섬유성 근병증 1 및 ZASP-관련; 미오글로빈뇨, 급성 재발성, 상염색체 열성; 근신경 위장 뇌병증 증후군; 진행성 외안근마비를 동반한 영아 소뇌 운동실조; 미토콘드리아 DNA 고갈 증후군 4B, MNGIE 유형; 근병증, 중심핵성, 1, 선천성, 과량의 근육 스핀들 동반, 원위, 1, 락트산 산증, 및 철적혈모구성 빈혈 1, 미토콘드리아 진행성, 선천성 백내장, 청각 상실 및 발달 지체 동반, 및 관상 응집체, 2; 근시 6; 근경화증, 상염색체 열성; 선천성 근긴장증; 선천성 근긴장증, 상염색체 우성 및 열성 형태; 손발톱-슬개골 증후군; 난스-호란 증후군; 소안구증 2; 나바호 신경간병증; 네말린 근병증 3 및 9; 신생아 저긴장증; 지적 장애; 발작; 지연된 말 및 언어 발달; 정신 지체, 상염색체 우성 31; 시트린 결핍에 의해 유발된 신생아 간내 담즙정체; 신원성 요붕증, 신원성 요붕증, X-연관; 신석증/골다공증, 저인산혈증, 2; 신결석증 13, 15 및 4; 불임; 뇌-안구-신장 증후군 (신결석증, 안구운동 실행증 및 소뇌 이상); 신증후군, 유형 3, 유형 5, 안구 이상 동반 또는 비동반, 유형 7, 및 유형 9; 네스토르-기예르모 조로증 증후군; 노이-락소바 증후군 1; 뇌 철 축적을 동반한 신경변성 4 및 6; 신경계페리틴병증; 신경섬유종증, 유형 1 및 유형 2; 신경섬유육종; 신경뇌하수체 요붕증; 신경병증, 유전성 감각, 유형 IC; 중성 1 아미노산 수송 결함; 근병증을 동반한 중성 지질 축적 질환; 호중구 면역결핍 증후군; 니콜라이데스-바라이처 증후군; 니만-픽병 유형 C1, C2, 유형 A, 및 유형 C1, 성인 형태; 비-케톤성 고글리신혈증; 누난 증후군 1 및 4, 레오파드 증후군 1; 소아 골수단핵구성 백혈병 동반 또는 비동반 누난 증후군-유사 장애; 정상칼륨혈성 주기성 마비, 칼륨-감수성; 노룸병; 간질, 청각 상실, 및 정신 지체 증후군; 정신 지체, X-연관 102 및 증후군성 13; 비만; 안구 백색증, 유형 I; 눈피부 백색증 유형 1B, 유형 3, 및 유형 4; 눈코치아골격 이형성증; 치아저포스파타제증; 오돈토트리코멜릭 증후군; 오구치병; 치아부족증-결장직장암 증후군; 오피츠 G/BBB 증후군; 시신경 위축 9; 구강-안면-수족지 증후군; 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍; 구강안면열 11 및 7, 구순열/구개-외배엽 이형성증 증후군; 오르스타빅 린데만 솔베르크 증후군; 경도 연골이형성증을 동반한 골관절염; 박리성 골연골염; 골형성 부전증 유형 12, 유형 5, 유형 7, 유형 8, 유형 I, 유형 III, 정상 공막 동반, 우성 형태, 열성 주산기 치사; 두개 경화증을 동반한 선상 골병증; 골화석증 상염색체 우성 유형 1 및 2, 열성 4, 열성 1, 열성 6; 가성신경교종을 동반한 골다공증; 귀-구개-수족지 증후군, 유형 I 및 II; 난소 이발생증 1; 난소백질이영양증; 선천성 손발톱비대증 4 및 유형 2; 골의 파제트병, 가족성; 팔리스터-홀 증후군; 수장족저 각피증, 비표피박리성, 초점성 또는 미만성; 췌장 무발생증 및 선천성 심장 질환; 파피용-르페브르 증후군; 부신경절종 3; 폰 오일렌부르크의 선천성 이상근긴장증; 부갑상선 암종; 파킨슨병 14, 15, 19 (소아-발병), 2, 20 (조기 발병), 6, (상염색체 열성 조기 발병, 및 9; 부분 백색증; 부분 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 결핍; 망막 색소 상피의 패턴화된 이영양증; PC-K6a; 펠리제우스-메르츠바허병; 펜드레드 증후군; 말초 탈수초성 신경병증, 중앙 이상수초화; 히르쉬스프룽 질환; 영속성 신생아 당뇨병; 당뇨병, 영속성 신생아, 신경계 양상 동반; 신생아 인슐린-의존성 당뇨병; 청소년의 성숙기-발병 당뇨병, 유형 2; 퍼옥시솜 생물발생 장애 14B, 2A, 4A, 5B, 6A, 7A, 및 7B; 페라울트 증후군 4; 페리 증후군; 영아기의 지속성 고인슐린혈증성 저혈당증; 가족성 고인슐린증; 표현형; 페닐케톤뇨; 크롬친화세포종; 유전성 부신경절종-크롬친화세포종 증후군; 부신경절종 1; 장의 카르시노이드 종양; 코우덴 증후군 3; 포스포글리세레이트 데히드로게나제 결핍; 포스포글리세레이트 키나제 1 결핍; 감광성 모발유황이영양증; 피탄산 축적 질환; 픽병; 피어슨 증후군; 색소성 망막 이영양증; 색소침착 결절성 부신피질 질환, 원발성, 1; 모기질세포종; 피트-홉킨스 증후군; 뇌하수체 의존성 고코르티솔증; 뇌하수체 호르몬 결핍, 복합 1, 2, 3, 및 4; 플라스미노겐 활성인자 억제제 유형 1 결핍; 플라스미노겐 결핍, 유형 I; 혈소판-유형 출혈 장애 15 및 8; 다형피부증, 유전성 섬유화성, 건 구축, 근병증 및 폐 섬유증 동반; 다낭성 신장 질환 2, 성인 유형, 및 영아 유형; 경화성 백질뇌병증을 동반한 다낭성 지질막성 골이형성증; 면역결핍 동반 또는 비동반 폴리글루코산체 근병증 1; 다소뇌회증, 비대칭, 양측 전두두정; 다발신경병증, 청각 상실, 운동실조, 색소성 망막염, 및 백내장; 교뇌소뇌 저형성증 유형 4; 슬와 익상편 증후군; 공뇌증 2; 한공각화증 8, 파종성 표재성 광선 유형; 포르포빌리노겐 신타제 결핍; 만발성 피부 포르피린증; 색소성 망막염을 동반한 척수후 기둥 운동실조; 후방 극성 백내장 유형 2; 프라더-윌리-유사 증후군; 조기 난소 부전 4, 5, 7, 및 9; 원발성 상염색체 열성 소두증 10, 2, 3, 및 5; 원발성 섬모 이상운동증 24; 원발성 확장성 심근병증; 좌심실 비치밀 6; 4, 좌심실 비치밀 10; 발작성 심방 세동; 원발성 고옥살산뇨, 유형 I, 유형, 및 유형 III; 원발성 비대성 골관절병증, 상염색체 열성 2; 원발성 저마그네슘혈증; 원발성 개방각 녹내장 소아 발병 1; 원발성 폐고혈압; 프림로즈 증후군; 진행성 가족성 심장 차단 유형 1B; 진행성 가족성 간내 담즙정체 2 및 3; 진행성 간내 담즙정체; 운동실조를 동반한 진행성 근간대성경련 간질; 진행성 가성류마티스 이형성증; 진행성 경화성 회백질위축증; 프롤리다제 결핍; 프롤린 데히드로게나제 결핍; 정신분열증 4; 프로페르딘 결핍, X-연관; 프로피온산혈증; 전구단백질 컨버타제 1/3 결핍; 전립선암, 유전성, 2; 적색각이상 결함; 단백뇨; 핀란드 선천성 신증후군; 프로테우스 증후군; 유방 선암종; 가연골무형성 척추골단 이형성증 증후군; 제1형 가성저알도스테론증 상염색체 우성 및 열성 및 유형 2; 가성부갑상선기능저하증 유형 1A, 가가성부갑상선기능저하증; 가성신생아 부신백질이영양증; 가성원발성 고알도스테론증; 탄성섬유 가성황색종; 영아기의 전신 동맥 석회화 2; 다중 응고 인자 결핍을 동반한 탄성섬유 가성황색종-유사 장애; 건선 감수성 2; PTEN 과오종 종양 증후군; 유전성 출혈성 모세혈관확장증 관련 폐동맥 고혈압; 폐 섬유증 및/또는 골수 부전, 텔로미어-관련, 1 및 3; 폐고혈압, 원발성, 1, 유전성 출혈성 모세혈관확장증 동반; 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라제 결핍; 피루베이트 카르복실라제 결핍; 피루베이트 데히드로게나제 E1-알파 결핍; 적혈구의 피루베이트 키나제 결핍; 레인 증후군; RAS병증; 열성 이영양성 수포성 표피박리증; 손발톱 장애, 비증후군성 선천성, 8; 라이펜스타인 증후군; 신장 이형성증; 신장 카르니틴 수송 결함; 신장 결손증 증후군; 신장 이형성증; 신장 이형성증, 망막 색소성 이영양증, 소뇌 운동실조 및 골격 이형성증; 신세관성 산증, 원위, 상염색체 열성, 후기-발병 감각신경성 청각 상실 동반, 또는 용혈성 빈혈 동반; 신세관성 산증, 근위, 안구 이상 및 정신 지체 동반; 망막 원추 이영양증 3B; 색소성 망막염; 색소성 망막염 10, 11, 12, 14, 15, 17, 및 19; 색소성 망막염 2, 20, 25, 35, 36, 38, 39, 4, 40, 43, 45, 48, 66, 7, 70, 72; 망막모세포종; 레트 장애; 횡문근양 종양 소인 증후군 2; 열공성 망막 박리, 상염색체 우성; 근형부 점상 연골이형성증 유형 2 및 유형 3; 로버츠-SC 해표지증 증후군; 로비노 소라우프 증후군; 로비노 증후군, 상염색체 열성, 상염색체 열성, 단지-신-다지증 동반; 로트문드-톰슨 증후군; 라파딜리노 증후군; RRM2B-관련 미토콘드리아 질환; 루빈스타인-테이비 증후군; 살라병; 샌드호프병, 성인 및 영아 유형; 사르코이드증, 조기 발병; 블라우 증후군; 쉰들러병, 유형 1; 분열뇌증; 정신분열증 15; 슈네켄베켄 이형성증; 슈반세포종증 2; 슈바르츠 얌펠 증후군 유형 1; 공막화각막, 상염색체 열성; 경화협착; 속발성 갑상선기능저하증; 세가와 증후군, 상염색체 열성; 시니어-로켄 증후군 4 및 5; 감각 실조 신경병증, 구음장애, 및 안근부전마비; 세피아프테린 리덕타제 결핍; 참깨 증후군; ADA 결핍으로 인한 중증 복합 면역결핍, 소두증, 성장 지연 및 이온화 방사선에 대한 감수성 동반, 비정형, 상염색체 열성, T 세포-음성, B 세포-양성, NK 세포-음성 또는 NK-양성; 중증 선천성 호중구감소증; 중증 선천성 호중구감소증 3, 상염색체 열성 또는 우성; 중증 선천성 호중구감소증 및 6, 상염색체 열성; 영아기에서의 중증 근간대성 간질; 열성 발작을 동반한 전신 간질 플러스, 유형 1 및 2; 중증 X-연관 근세관성 근병증; 짧은 QT 증후군 3; 비특이적 골격 이상을 동반한 저신장; 저신장, 이도 폐쇄증, 하악 저형성증, 골격 이상; 저신장, 손발톱이형성증, 안면 이형, 및 털감소증; 원발 왜소증; 다지증 동반 또는 비동반 짧은-늑골 흉부 이형성증 11 또는 3; 시알산증 유형 I 및 II; 은 경직성 하반신마비 증후군; 느려진 신경 전도 속도, 상염색체 우성; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 스나이더 로빈슨 증후군; 소마토트로프 선종; 프로락틴선종; 가족성, 뇌하수체 선종 소인; 소토스 증후군 1 또는 2; 경직성 운동실조 5, 상염색체 열성, 샤를부아-사기네이 유형, 1, 10, 또는 11, 상염색체 열성; 근위축성 측삭 경화증 유형 5; 경직성 하반신마비 15, 2, 3, 35, 39, 4, 상염색체 우성, 55, 상염색체 열성, 및 5A; 담즙산 합성 결함, 선천성, 3; 정자발생 실패 11, 3, 및 8; 구상적혈구증 유형 4 및 5; 타원체 근병증; 척수성 근육 위축, 하지 우세형 2, 상염색체 우성; 척수성 근육 위축, 유형 II; 척수소뇌성 운동실조 14, 21, 35, 40, 및 6; 척수소뇌성 운동실조 상염색체 열성 1 및 16; 비장 저형성증; 척추손목발목 유합증 증후군; 스폰딜로케이로디스플라시아, 엘러스-단로스 증후군-유사, 면역 조절이상 동반, 아그레칸 유형, 선천성 관절 탈구 동반, 짧은 사지-손 유형, 세다가티안 유형, 추체-간체 이영양증 동반, 및 코즐로우스키 유형; 파라스트렘마틱 왜소증; 스타르가르트병 1; 추체-간체 이영양증 3; 스티클러 증후군 유형 1; 니스트 이형성증; 스티클러 증후군, 유형 1 (비증후군성 안구) 및 4; 자상-연관 혈관병증, 영아-발병; 스토르모르켄 증후군; 스터지-웨버 증후군, 모세관 기형, 선천성, 1; 숙시닐-CoA 아세토아세테이트 트랜스퍼라제 결핍; 수크라제-이소말타제 결핍; 영아 돌연사 증후군; 술파이트 옥시다제 결핍, 고립성; 판막위 대동맥 협착; 계면활성제 대사 기능장애, 폐, 2 및 3; 지절유합증, 근위, 1b; 합지증 세나니 렌즈 유형; 합지증 유형 3; 증후군성 X-연관 정신 지체 16; 내반첨족; 탄지에르병; TARP 증후군; 테이-삭스병, B1 변이형, Gm2-강글리오시드증 (성인), Gm2-강글리오시드증 (성인-발병); 템타미 증후군; 테노리오 증후군; 말단 골 이형성증; 테스토스테론 17-베타-데히드로게나제 결핍; 사지절단증, 상염색체 열성; 팔로 사징증; 형성부전성 좌심 증후군 2; 동맥간증; 심장 및 대혈관의 기형; 심실 중격 결손 1; 티엘-벤케 각막 이영양증; 흉부 대동맥류 및 대동맥 박리; 마르파노이드 체형; 3 M 증후군 2; 혈소판감소증, 혈소판 기능장애, 용혈, 및 불균형 글로빈 합성; 혈소판감소증, X-연관; 혈전성향증, 유전성, 단백질 C 결핍으로 인함, 상염색체 우성 및 열성; 갑상선 무발생증; 갑상선암, 여포성; 갑상선 호르몬 대사, 비정상적; 갑상선 호르몬 저항성, 전신, 상염색체 우성; 갑상선중독성 주기성 마비 및 갑상선중독성 주기성 마비 2; 티로트로핀-방출 호르몬 저항성, 전신; 티모시 증후군; TNF 수용체-연관 주기성 발열 증후군 (TRAPS); 치아 무발생증, 선택적, 3 및 4; 토르사드 드 포인트; 타운즈-브룩스-아가미귀신장-유사 증후군; 신생아의 일과성 수포성 피부박리증; 트리처 콜린스 증후군 1; 정신 지체, 왜소증 및 색소성 망막 변성을 동반한 긴속눈썹증; 모발비지절 이형성증 유형 I; 모발비지절 증후군 유형 3; 트리메틸아민뇨; 결절성 경화증 증후군; 림프관근종증; 결절성 경화증 1 및 2; 티로시나제-음성 눈피부 백색증; 티로시나제-양성 눈피부 백색증; 티로신혈증 유형 I; UDP글루코스-4-에피머라제 결핍; 울리히 선천성 근육 이영양증; 중증 사지 결핍을 동반한 척골 및 비골 부재; 업쇼-슐만 증후군; 우로카네이트 히드라타제 결핍; 어셔 증후군, 유형 1, 1B, 1D, 1G, 2A, 2C, 및 2D; 색소성 망막염 39; UV-감수성 증후군; 반더우드 증후군; 반 말데르겜 증후군 2; 헤네캄 림프관확장증-림프부종 증후군 2; 혼합 포르피린증; 낭성 신장 질환을 동반한 뇌실확장증; 베르헤이즈 증후군; 초장쇄 아실-CoA 데히드로게나제 결핍; 방광요관 역류 8; 내장 착위 5, 상염색체; 내장 근병증; 비타민 D-의존성 구루병, 유형 1 및 2; 난황상 이영양증; 폰 빌레브란트 질환 유형 2M 및 유형 3; 바르덴부르크 증후군 유형 1, 4C, 및 2E (신경계 침범 동반); 클라인-바르덴베르크 증후군; 바커-바르부르크 선천성 근육 이영양증; 바르부르크 마이크로 증후군 2 및 4; 사마귀, 저감마글로불린혈증, 감염, 및 골수배출장애; 위버 증후군; 바일-마르케사니 증후군 1 및 3; 바일-마르케사니-유사 증후군; 바이센바허-즈베이뮬러 증후군; 베르드니히-호프만병; 샤르코-마리-투스병; 베르너 증후군; WFS1-관련 장애; 비데만-스타이너 증후군; 윌슨병; 볼프람-유사 증후군, 상염색체 우성; 워스병; 반 부헴병 유형 2; 색소성 건피증, 상보군 b, D군, E군, 및 G군; X-연관 무감마글로불린혈증; X-연관 유전성 운동 및 감각 신경병증; 스테릴-술파타제 결핍을 동반한 X-연관 어린선; X-연관 뇌실주위 이소증; 귀-구개-수족지 증후군, 유형 I; X-연관 중증 복합 면역결핍; 짐메르만-라반트 증후군 및 짐메르만-라반트 증후군 2; 및 층판 분말상 백내장 3.
표적 뉴클레오티드 서열은 질환, 장애, 또는 상태와 연관된 표적 서열 (예를 들어, 점 돌연변이)을 포함할 수 있다. 표적 서열은 질환, 장애, 또는 상태와 연관된 T에서 C로의 (또는 A에서 G로의) 점 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 C 염기의 탈아미노화는 질환, 장애, 또는 상태와 연관되지 않은 서열에 대한 미스매치 복구-매개된 교정을 발생시킨다. 표적 서열은 질환, 장애, 또는 상태와 연관된 G에서 A로의 (또는 C에서 T로의) 점 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 A 염기의 탈아미노화는 질환, 장애, 또는 상태와 연관되지 않은 서열에 대한 미스매치 복구-매개된 교정을 발생시킨다. 표적 서열은 단백질을 코딩할 수 있고, 여기서 점 돌연변이는 코돈 내에 있고, 야생형 코돈과 비교하여 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산에서 변화를 발생시킨다. 표적 서열은 또한 스플라이스 부위에 있을 수 있고, 점 돌연변이는 야생형 전사체와 비교하여 mRNA 전사체의 스플라이싱에서 변화를 발생시킨다. 또한, 표적은 유전자의 비-코딩 서열, 예컨대 프로모터에 있을 수 있고, 점 돌연변이는 유전자의 증가된 또는 감소된 발현을 발생시킨다.
따라서, 일부 측면에서, 돌연변이체 C의 탈아미노화는 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 변화를 발생시키며, 이는 일부 경우에 야생형 아미노산의 발현을 발생시킬 수 있다. 다른 측면에서, 돌연변이체 A의 탈아미노화는 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 변화를 발생시키며, 이는 일부 경우에 야생형 아미노산의 발현을 발생시킬 수 있다.
세포를 조성물 또는 rAAV 입자와 접촉시키는 것을 수반하는 본원에 기재된 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 접촉 단계는 대상체에서 이루어진다. 특정 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 상태로 진단되었다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 포유동물 세포를 조성물 또는 rAAV 입자와 접촉시키는 것을 수반한다. 특정한 실시양태에서, 방법은 망막 세포, 피질 세포 또는 소뇌 세포를 접촉시키는 것을 수반한다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 전달된 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제는 바람직하게는 원래의 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제 (즉, 세포에 전달되거나 또는 전체로서 세포에서 발현된 비분할 단백질)와 비교하여 대등한 활성을 갖는다. 예를 들어, 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제는 원래의 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 활성의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)를 보유한다. 일부 실시양태에서, 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제는 원래의 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 것보다 더 활성이다 (예를 들어, 2배, 5배, 10배, 100배, 1000배, 또는 그 초과).
본원에 기재된 조성물은 대상체가 앓고 있는 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 치료 유효량으로 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. CRISPR/Cas9-기반 게놈-편집 기술을 사용하여 치료 및/또는 예방될 수 있는 임의의 질환 또는 장애는 본원에 기재된 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제에 의해 치료될 수 있다. 분할 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 gRNA를 추가로 코딩하지 않는 경우에, gRNA를 코딩하는 개별 핵산 벡터가 본원에 기재된 조성물과 함께 투여될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
예시적인 적합한 질환, 장애 또는 상태는, 제한 없이, 낭성 섬유증, 페닐케톤뇨, 표피박리성 과다각화증 (EHK), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 샤르코-마리-투스병 유형 4J, 신경모세포종 (NB), 폰 빌레브란트병 (vWD), 선천성 근긴장증, 유전성 신장 아밀로이드증, 확장성 심근병증, 유전성 림프부종, 가족성 알츠하이머병, 프리온 질환, 만성 영아 신경계 피부 관절 증후군 (CINCA), 선천성 난청, 니만-픽병 유형 C (NPC) 질환, 및 데스민-관련 근병증 (DRM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 장애를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 질환 또는 상태는 니만-픽병 유형 C (NPC) 질환이다.
일부 실시양태에서, 질환, 장애 또는 상태는 NPC 유전자, DNMT1 유전자, PCSK9 유전자, 또는 TMC1 유전자에서의 점 돌연변이와 연관된다. 특정 실시양태에서, 점 돌연변이는 NPC에서의 T3182C 돌연변이이며, 이는 I1061T 아미노산 치환을 발생시킨다.
특정 실시양태에서, 점 돌연변이는 TMC1에서의 A545G 돌연변이이며, 이는 Y182C 아미노산 치환을 발생시킨다. TMC1은 내이의 감각 유모 세포에서 기계감수성 이온 채널을 형성하고 정상적인 청각 기능에 요구되는 단백질을 코딩한다. Y182C 아미노산 치환은 선천성 난청과 연관된다.
일부 실시양태에서, 질환, 장애 또는 상태는 유전자의 코딩 영역 내에 정지 코돈, 예를 들어 조기 정지 코돈을 생성하는 점 돌연변이와 연관된다.
추가의 예시적인 질환, 장애 및 상태는 낭성 섬유증 (예를 들어, 문헌 [Schwank et al., Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 2013; 13: 653-658; 및 Wu et al., Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell stem cell. 2013; 13: 659-662] 참조, 이들 중 어느 것도 유전적 결함을 교정하기 위해 데아미나제 융합 단백질을 사용하지 않음); 페닐케톤뇨 - 예를 들어, 페닐알라닌 히드록실라제 유전자에서의 위치 835 (마우스) 또는 240 (인간) 또는 상동 잔기에서 페닐알라닌에서 세린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [McDonald et al., Genomics. 1997; 39:402-405] 참조; 버나드-술리에 증후군 (BSS) - 예를 들어, 혈소판 막 당단백질 IX에서의 위치 55 또는 상동 잔기에서 페닐알라닌에서 세린으로의 돌연변이, 또는 잔기 24 또는 상동 잔기에서 시스테인에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Noris et al., British Journal of Haematology. 1997; 97: 312-320, 및 Ali et al., Hematol. 2014; 93: 381-384] 참조; 표피박리성 과다각화증 (EHK) - 예를 들어, 케라틴 1에서의 위치 160 또는 161 (개시인자 메티오닌을 카운팅하는 경우) 또는 상동 잔기에서 류신에서 프롤린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Chipev et al., Cell. 1992; 70: 821-828] 참조, 또한 www[dot]uniprot[dot]org에서 유니프롯 데이터베이스에서 수탁 번호 P04264 참조; 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) - 예를 들어, α1-항트립신의 프로세싱된 형태에서의 위치 54 또는 55 (개시인자 메티오닌을 카운팅하는 경우) 또는 상동 잔기에서, 또는 비프로세싱된 형태에서의 잔기 78 또는 상동 잔기에서 류신에서 프롤린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Poller et al., Genomics. 1993; 17: 740-743] 참조, 또한 유니프롯 데이터베이스에서 수탁 번호 P01011 참조; 샤르코-마리-투스병 유형 4J - 예를 들어, FIG4에서의 위치 41 또는 상동 잔기에서 이소류신에서 트레오닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Lenk et al., PLoS Genetics. 2011; 7: e1002104] 참조; 신경모세포종 (NB) - 예를 들어, 카스파제-9에서의 위치 197 또는 상동 잔기에서 류신에서 프롤린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Kundu et al., 3 Biotech. 2013, 3:225-234] 참조; 폰 빌레브란트병 (vWD) - 예를 들어, 폰 빌레브란트 인자의 프로세싱된 형태에서의 위치 509 또는 상동 잔기에서, 또는 폰 빌레브란트 인자의 비프로세싱된 형태에서의 위치 1272 또는 상동 잔기에서 시스테인에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Lavergne et al., Br. J. Haematol. 1992] 참조, 또한 유니프롯 데이터베이스에서 수탁 번호 P04275 참조; 82: 66-72; 선천성 근긴장증 - 예를 들어, 근육 클로라이드 채널 유전자 CLCN1에서의 위치 277 또는 상동 잔기에서 시스테인에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Weinberger et al., The J. of Physiology. 2012; 590: 3449-3464] 참조; 유전성 신장 아밀로이드증 - 예를 들어, 아포지단백질 AII의 프로세싱된 형태에서의 위치 78 또는 상동 잔기에서, 또는 비프로세싱된 형태에서의 위치 101 또는 상동 잔기에서 정지 코돈에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Yazaki et al., Kidney Int. 2003; 64: 11-16] 참조; 확장성 심근병증 (DCM) - 예를 들어, FOXD4 유전자에서의 위치 148 또는 상동 잔기에서 트립토판에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이), 예를 들어, 문헌 [Minoretti et al., Int. J. of Mol. Med. 2007; 19: 369-372] 참조; 유전성 림프부종 - 예를 들어, VEGFR3 티로신 키나제에서의 위치 1035 또는 상동 잔기에서 히스티딘에서 아르기닌으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이), 예를 들어, 문헌 [Irrthum et al., Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 295-301] 참조; 가족성 알츠하이머병 - 예를 들어, 프레세닐린1에서의 위치 143 또는 상동 잔기에서 이소류신에서 발린으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이), 예를 들어, 문헌 [Gallo et al., J. Alzheimer's disease. 2011; 25: 425-431] 참조; 프리온 질환 - 예를 들어, 프리온 단백질에서의 위치 129 또는 상동 잔기에서 메티오닌에서 발린으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Lewis et al., J. of General Virology. 2006; 87: 2443-2449] 참조; 만성 영아 신경학적 피부 관절 증후군 (CINCA) - 예를 들어, 크리오피린에서의 위치 570 또는 상동 잔기에서 티로신에서 시스테인으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Fujisawa et al., Blood. 2007; 109: 2903-2911] 참조; 및 데스민-관련 근병증 (DRM) - 예를 들어, αβ 크리스탈린에서의 위치 120 또는 상동 잔기에서 아르기닌에서 글리신으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Kumar et al., J. Biol. Chem. 1999; 274: 24137-24141] 참조를 포함한다. 모든 참고문헌 및 데이터베이스 엔트리의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
트리뉴클레오티드 반복부 확장 질환
트리뉴클레오티드 반복부 확장은 헌팅톤병, 유약 X 증후군, 및 프리드라이히 운동실조를 포함한 다수의 인간 질환과 연관된다. 가장 흔한 트리뉴클레오티드 반복부는 CAG 트리플렛을 함유하지만, GAA 트리플렛 (프리드라이히 운동실조) 및 CGG 트리플렛 (유약 X 증후군)이 또한 발생한다. 확장에 대한 소인을 유전하거나, 또는 이미 확장된 모 대립유전자를 획득하는 것은 질환을 획득할 가능성을 증가시킨다. 트리뉴클레오티드 반복부의 병원성 확장은 가설상 프라임 편집을 사용하여 교정될 수 있다.
반복 영역의 상류 영역은 RNA-가이드된 뉴클레아제에 의해 닉킹될 수 있고, 이는 이어서 도 1g 또는 도 22에 요약된 일반적 메카니즘에 따라 건강한 수의 반복부 (이는 특정한 유전자 및 질환에 의존함)를 함유하는 새로운 DNA 가닥의 합성을 프라이밍하는데 사용될 수 있다. 반복 서열 후에, 반복부의 다른 단부 (적색 가닥)에 인접한 서열의 정체와 매칭되는 짧은 상동성 스트레치가 부가된다. TPRT 시스템에 의한 새로 합성된 가닥의 침입, 및 내인성 DNA의 새로 합성된 플랩으로의 후속 대체는 축소된 반복 대립유전자로 이어진다. 용어 "축소된"은 뉴클레오티드 반복 영역의 길이를 단축시켜 트리뉴클레오티드 반복 영역을 복구하는 것을 지칭한다.
본원에 기재된 프라임 편집 시스템 또는 프라임 편집 (PE) 시스템은 헌팅톤병 및 다른 트리뉴클레오티드 반복 장애와 같은 상태를 치료하기 위해 트리뉴클레오티드 반복 돌연변이 (또는 "트리플렛 확장 질환")를 축소시키는데 사용될 수 있다. 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 발달 신경생물학을 수반하고 종종 인지 뿐만 아니라 감각-운동 기능에 영향을 미치는 복잡한 진행성 장애이다. 장애는 유전학적 표현촉진을 나타낸다 (즉, 각 세대에 따라 중증도가 증가됨). DNA 확장 또는 축소는 통상적으로 감수분열적으로 (즉, 배우자발생 시간 동안, 또는 배아 발생 초기에) 일어나고, 종종 성별-편향을 가지며, 이는 일부 유전자가 여성을 통해 유전될 때에만 확장되고, 다른 것은 남성을 통해서만 확장된다는 것을 의미한다. 인간에서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 전사 또는 번역 수준에서 유전자 침묵을 유발할 수 있고, 이는 본질적으로 유전자 기능을 녹아웃시킨다. 대안적으로, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 종종 우성-음성 방식으로 (예를 들어 폴리-글루타민 질환) 단백질 기능을 제거하거나 변화시키는 대형의 반복 아미노산 서열로 생성된 변경된 단백질을 유발할 수 있다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 트리플렛 확장은 DNA 복제 동안 또는 DNA 복구 합성 동안 슬리피지에 의해 유발된다. 탠덤 반복부는 서로 동일한 서열을 갖기 때문에, 2개의 DNA 가닥 사이의 염기 쌍형성은 서열을 따라 다중 지점에서 일어날 수 있다. 이는 DNA 복제 또는 DNA 복구 합성 동안 "루프 아웃" 구조의 형성으로 이어질 수 있다. 이는 반복 서열의 반복 카피를 유도하여, 반복부의 수를 확장시킬 수 있다. 하이브리드 RNA:DNA 중간체를 수반하는 추가의 메카니즘이 제안되었다. 프라임 편집은 1개 이상의 또는 문제의 반복 코돈 트리플렛을 결실시킴으로써 이들 트리플렛 확장 영역을 감소 또는 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 용도의 한 실시양태에서, 도 23은 프라임 편집으로 트리뉴클레오티드 반복 서열을 축소 또는 감소시키기 위한 PEgRNA 설계의 개략도를 제공한다.
프라임 편집은 절단 부위에 적절하게 표적화된 PEgRNA를 포함하는 프라임 편집제로 트리플렛 반복 영역의 상류 영역을 닉킹함으로써 트리플렛 확장 영역을 축소시키도록 구현될 수 있다. 이어서, 프라임 편집제는 건강한 수의 트리플렛 반복부 (이는 특정한 유전자 및 질환에 의존함)를 코딩하는 주형 (즉, 그의 편집 주형)으로서 PEgRNA에 기초하여 새로운 DNA 가닥 (ssDNA 플랩)을 합성한다. 건강한 트리플렛 반복 서열을 포함하는 새로 합성된 ssDNA 가닥은 또한 반복부의 다른 단부 (적색 가닥)에 인접한 서열에 매칭되는 짧은 상동성 스트레치 (즉, 상동성 아암)를 포함하도록 합성된다. 새로 합성된 가닥의 침입, 및 내인성 DNA의 새로 합성된 ssDNA 플랩으로의 후속 대체는 축소된 반복 대립유전자로 이어진다.
특정한 트리뉴클레오티드 확장 장애에 따라, "트리뉴클레오티드 반복부 확장 단백질"에서 결함-유도 트리플렛 확장이 발생할 수 있다. 트리뉴클레오티드 반복부 확장 단백질은 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애의 발생에 대한 감수성, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애의 존재, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애의 중증도 또는 그의 임의의 조합과 연관된 단백질의 다양한 세트이다. 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 반복부의 유형에 의해 결정되는 2개의 카테고리로 나뉜다. 가장 흔한 반복부는 트리플렛 CAG이며, 이는 유전자의 코딩 영역에 존재하는 경우에 아미노산 글루타민 (Q)을 코딩한다. 따라서, 이들 장애는 폴리글루타민 (폴리Q) 장애로 지칭되고, 하기 질환을 포함한다: 헌팅톤병 (HD); 척수연수성 근육 위축 (SBMA); 척수소뇌성 운동실조 (SCA 유형 1, 2, 3, 6, 7, 및 17); 및 치상핵적핵-담창구시상하핵 위축 (DRPLA). 나머지 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애는 CAG 트리플렛을 수반하지 않거나 또는 CAG 트리플렛이 유전자의 코딩 영역에 있지 않고, 따라서 비-폴리글루타민 장애로 지칭된다. 비-폴리글루타민 장애는 유약 X 증후군 (FRAXA); 유약 XE 정신 지체 (FRAXE); 프리드라이히 운동실조 (FRDA); 근긴장성 이영양증 (DM); 및 척수소뇌 운동실조 (SCA 유형 8, 및 12)를 포함한다.
트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질은 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애에 대한 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질의 실험적 연관에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질의 생산율 또는 순환 농도는 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애를 갖는 집단에서 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애가 결여된 집단에 비해 상승 또는 저하될 수 있다. 단백질 수준의 차이는 웨스턴 블롯, 면역조직화학적 염색, 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA) 및 질량 분광측정법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단백질체학 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 대안적으로, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질은 DNA 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 및 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (Q-PCR)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 게놈 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 수득함으로써 확인될 수 있다.
프라임 편집에 의해 교정될 수 있는 트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질의 비제한적 예는 AR (안드로겐 수용체), FMR1 (유약 X 정신 지체 1), HTT (헌팅틴), DMPK (근긴장성 이영양증-단백질 키나제), FXN (프라탁신), ATXN2 (아탁신 2), ATN1 (아트로핀 1), FEN1 (플랩 구조-특이적 엔도뉴클레아제 1), TNRC6A (트리뉴클레오티드 반복부 함유 6A), PABPN1 (폴리(A) 결합 단백질, 핵 1), JPH3 (준크토필린 3), MED15 (매개체 착물 서브유닛 15), ATXN1 (아탁신 1), ATXN3 (아탁신 3), TBP (TATA 박스 결합 단백질), CACNA1A (칼슘 채널, 전압-의존성, P/Q 유형, 알파 1A 서브유닛), ATXN80S (ATXN8 대향 가닥 (비-단백질 코딩)), PPP2R2B (단백질 포스파타제 2, 조절 서브유닛 B, 베타), ATXN7 (아탁신 7), TNRC6B (트리뉴클레오티드 반복부 함유 6B), TNRC6C (트리뉴클레오티드 반복부 함유 6C), CELF3 (CUGBP, Elav-유사 패밀리 구성원 3), MAB21L1 (mab-21-유사 1 (씨. 엘레간스(C. elegans))), MSH2 (mutS 상동체 2, 결장암, 비폴립증 유형 1 (이. 콜라이)), TMEM185A (막횡단 단백질 185A), SIX5 (6 호메오박스 5), CNPY3 (캐노피 3 상동체 (제브라피쉬)), FRAXE (유약 부위, 폴산 유형, 희귀, fra(X)(q28) E), GNB2 (구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질), 베타 폴리펩티드 2), RPL14 (리보솜 단백질 L14), ATXN8 (아탁신 8), INSR (인슐린 수용체), TTR (트랜스티레틴), EP400 (E1A 결합 단백질 p400), GIGYF2 (GRB10 상호작용 GYF 단백질 2), OGG1 (8-옥소구아닌 DNA 글리코실라제), STC1 (스탄니오칼신 1), CNDP1 (카르노신 디펩티다제 1 (메탈로펩티다제 M20 패밀리)), C10orf2 (염색체 10 오픈 리딩 프레임 2), MAML3 마스터마인드-유사 3 (드로소필라), DKC1 (선천성 이상각화증 1, 디스케린), PAXIP1 (PAX 상호작용 (전사-활성화 도메인과) 단백질 1), CASK (칼슘/칼모듈린-의존성 세린 단백질 키나제 (MAGUK 패밀리)), MAPT (미세관-연관 단백질 타우), SP1 (Sp1 전사 인자), POLG (폴리머라제 (DNA 지시됨), 감마), AFF2 (AF4/FMR2 패밀리, 구성원 2), THBS1 (트롬보스폰딘 1), TP53 (종양 단백질 p53), ESR1 (에스트로겐 수용체 1), CGGBP1 (CGG 트리플렛 반복부 결합 단백질 1), ABT1 (기저 전사 활성인자 1), KLK3 (칼리크레인-관련 펩티다제 3), PRNP (프리온 단백질), JUN (jun 종양유전자), KCNN3 (칼륨 중간/작은 전도도 칼슘-활성화된 채널, 서브패밀리 N, 구성원 3), BAX (BCL2-연관 X 단백질), FRAXA (유약 부위, 폴산 유형, 희귀, fra(X)(q27.3) A (대고환증, 정신 지체)), KBTBD10 (켈히 반복부 및 BTB (POZ) 도메인 함유 10), MBNL1 (머슬블라인드-유사 (드로소필라)), RAD51 (RAD51 상동체 (RecA 상동체, 이. 콜라이) (에스. 세레비지아에)), NCOA3 (핵 수용체 보조활성인자 3), ERDA1 (확장된 반복부 도메인, CAG/CTG 1), TSC1 (결절성 경화증 1), COMP (연골 올리고머 매트릭스 단백질), GCLC (글루타메이트-시스테인 리가제, 촉매 서브유닛), RRAD (Ras-관련 당뇨병 연관), MSH3 (mutS 상동체 3 (이. 콜라이)), DRD2 (도파민 수용체 D2), CD44 (CD44 분자 (인디안 혈액형)), CTCF (CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)), CCND1 (시클린 D1), CLSPN (클라스핀 상동체 (크세노푸스 라에비스)), MEF2A (근세포 인핸서 인자 2A), PTPRU (단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형, U), GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제), TRIM22 (3부 모티프-함유 22), WT1 (윌름스 종양 1), AHR (아릴 탄화수소 수용체), GPX1 (글루타티온 퍼옥시다제 1), TPMT (티오퓨린 S-메틸트랜스퍼라제), NDP (노리병 (가성신경교종)), ARX (아리스탈레스 관련 호메오박스), MUS81 (MUS81 엔도뉴클레아제 상동체 (에스. 세레비지아에)), TYR (티로시나제 (눈피부 백색증 IA)), EGR1 (조기 성장 반응 1), UNG (우라실-DNA 글리코실라제), NUMBL (numb 상동체 (드로소필라)-유사), FABP2 (지방산 결합 단백질 2, 장), EN2 (엔그라일드 호메오박스 2), CRYGC (크리스탈린, 감마 C), SRP14 (신호 인식 입자 14 kDa (상동 Alu RNA 결합 단백질)), CRYGB (크리스탈린, 감마 B), PDCD1 (프로그램화된 세포 사멸 1), HOXA1 (호메오박스 A1), ATXN2L (아탁신 2-유사), PMS2 (PMS2 감수분열 분리후 증가 2 (에스. 세레비지아에)), GLA (갈락토시다제, 알파), CBL (Cas-Br-M (뮤린) 동종향성 레트로바이러스 형질전환 서열), FTH1 (페리틴, 중쇄 폴리펩티드 1), IL12RB2 (인터류킨 12 수용체, 베타 2), OTX2 (오르토덴티클 호메오박스 2), HOXA5 (호메오박스 A5), POLG2 (폴리머라제 (DNA 지시됨), 감마 2, 보조 서브유닛), DLX2 (디스탈-레스 호메오박스 2), SIRPA (신호-조절 단백질 알파), OTX1 (오르토덴티클 호메오박스 1), AHRR (아릴-탄화수소 수용체 리프레서), MANF (중간뇌 성상세포-유도된 신경영양 인자), TMEM158 (막횡단 단백질 158 (유전자/위유전자)), 및 ENSG00000078687을 포함한다.
특정한 측면에서, 본 개시내용은 확장 반복부 장애 (또한 반복부 확장 장애 또는 트리뉴클레오티드 반복 장애로도 공지됨)로 진단된 대상체의 치료를 위한 TPRT-기반 방법을 제공한다. 확장 반복부 장애는 미소위성체 반복부가 한계 길이를 넘어 확장되는 경우에 발생한다. 현재, 적어도 30종의 유전 질환이 반복부 확장에 의해 유발되는 것으로 여겨진다. 이러한 다양한 장애 군의 과학적 이해는 1990년대 초반에 트리뉴클레오티드 반복부가 유약 X, 척수성 및 연수성 근육 위축, 근긴장성 이영양증, 및 헌팅톤병 (문헌 [Nelson et al., "The unstable repeats - three evolving faces of neurological disease," Neuron, March 6, 2013, Vol.77; 825-843], 이는 본원에 참조로 포함됨), 뿐만 아니라 하우 리버 증후군, 야콥센 증후군, 치상핵적핵-담창구시상하핵 위축 (DRPLA), 마차도-요셉병, 합다지증 (SPD II), 수족 생식기 증후군 (HFGS), 쇄골두개 이형성증 (CCD), 완전전뇌증 장애 (HPE), 선천성 중추성 과다호흡 증후군 (CCHS), ARX-비증후군성 X-연관 정신 지체 (XLMR), 및 안인두 근육 이영양증 (OPMD)을 포함한 여러 주요 유전성 상태의 기저를 이룬다는 발견으로 인해 이루어졌다 (참조). 미소위성체 반복부 불안정성은 이들 상태의 특징인 것으로 밝혀졌으며, 이는 예상된 바와 같이 - 반복부 확장은 각각의 연속 세대에서 발생할 수 있는 현상이며, 이는 자손에서 보다 중증의 표현형 및 보다 이른 발병 연령으로 이어진다. 반복부 확장은 여러 상이한 메카니즘을 통해 질환을 유발하는 것으로 여겨진다. 즉, 확장은 유전자, mRNA 전사체, 및/또는 코딩된 단백질의 수준에서 세포 기능을 방해할 수 있다. 일부 조건에서, 돌연변이는 반복부-함유 유전자를 침묵시킴으로써 기능 상실 메카니즘을 통해 작용한다. 다른 실시양태에서, 질환은 기능 획득 메카니즘으로 인해 발생하며, 그에 의해 mRNA 전사체 또는 단백질은 새로운 이상 기능을 갖는다.
한 실시양태에서, 트리뉴클레오티드 반복부 장애를 치료하는 방법이 도 23에 도시된다. 일반적으로, 접근법은 프라임 편집 과정의 메카니즘을 통해 내인성 이환 트리뉴클레오티드 반복부 서열을 대체하도록 의도된 목적하는 건강한 대체 트리뉴클레오티드 반복부 서열을 코딩하는 영역을 포함하는 연장된 gRNA와 조합하여 TPRT 게놈 편집 (즉, 프라임 편집)을 사용하는 것을 수반한다. TPRT 게놈 편집 (즉, 프라임 편집)에 의한 트리뉴클레오티드 반복 서열 및 트리뉴클레오티드 반복부 축소를 위한 예시적인 gRNA 설계의 개략도가 도 23에 제시된다.
프리온 질환
프라임 편집은 또한 프리온 질환 과정 동안 미스폴딩되는 프리온 단백질 (PRNP) 내로의 1개 이상의 보호 돌연변이의 설치를 통해 프리온 질환의 진행을 예방하거나 중지시키는데 사용될 수 있다. 프리온 질환 또는 전염성 해면상 뇌병증 (TSE)은 인간 및 동물 둘 다에 영향을 미치는 한 패밀리의 희귀 진행성 신경변성 장애이다. 이들은 긴 인큐베이션 기간, 뉴런 손실과 연관된 특징적인 해면상 변화, 및 염증 반응 유도 실패에 의해 구별된다.
인간에서, 프리온 질환은 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 치명적 가족성 불면증, 및 쿠루병을 포함한다. 동물에서, 프리온 질환은 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 "광우병"), 만성 소모성 질환 (CWD), 스크래피, 전염성 밍크 뇌병증, 고양이 해면상 뇌병증, 및 유제류 해면상 뇌병증을 포함한다. 프라임 편집은 이들 프리온 질환 중 어느 하나의 진행을 예방하거나 중지시키기 위해 프리온 단백질 내에 보호 점 돌연변이를 설치하는데 사용될 수 있다.
전형적 CJD는 인간 프리온 질환이다. 이는 특징적인 임상 및 진단 특색을 갖는 신경변성 장애이다. 이 질환은 급속 진행성이고, 항상 치명적이다. 이 질환에 의한 감염은 통상적으로 질병의 발병 1년 내에 사망으로 이어진다. CJD는 프리온 단백질로 공지되어 있는 세포 당단백질의 비정상적 이소형에 의해 유발되는 것으로 여겨지는 급속 진행성, 불변의 치명적 신경변성 장애이다. CJD는 전세계적으로 발생하며, 미국을 포함한 많은 국가에서 추정되는 연간 발생률은 인구 백만명당 약 1건의 사례인 것으로 보고되어 있다. 대다수의 CJD 환자는 통상적으로 질병의 발병 1년 내에 사망한다. CJD는 인간 및 동물에서 발생하는 다른 프리온 질환과 함께 전염성 해면상 뇌병증 (TSE)으로 분류된다. 환자의 약 85%에서, CJD는 인지가능한 전달 패턴 없이 산발성 질환으로서 발생한다. 프리온 단백질 유전자의 유전성 돌연변이로 인해, 보다 적은 비율의 환자 (5 내지 15%)에서 CJD가 발생한다. 이들 유전성 형태는 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군 및 치명적 가족성 불면증을 포함한다. CJD에 대한 치료는 현재 공지되어 있지 않다.
변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD)은 1996년에 영국에서 최초로 기재된 프리온 질환이다. 소에서 프리온 질환의 발생을 담당하는 작용제인 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 '광우'병)이 인간에서 vCJD의 발생을 담당하는 동일한 작용제라는 강력한 과학적 증거가 현재 존재한다. 변종 CJD (vCJD)는 전형적 CJD (종종 간단히 CJD로 불림)와 동일한 질환이 아니다. 이는 전형적 CJD와 상이한 임상적 및 병리학적 특징을 갖는다. 각각의 질환은 또한 프리온 단백질 유전자의 특정한 유전자 프로파일을 갖는다. 둘 다의 장애는 수년간 측정되는 비통상적으로 긴 인큐베이션 기간을 갖는 불변의 치명적인 뇌 질환이며, 프리온으로 불리는 비통상적인 전염성 작용제에 의해 유발된다. vCJD에 대한 치료는 현재 공지되어 있지 않다.
BSE (소 해면상 뇌병증 또는 "광우병")는 프리온으로 불리는 비통상적 전염성 작용제에 의한 감염으로부터 발생하는 소의 진행성 신경계 장애이다. 전염성 작용제의 성질은 잘 이해되어 있지 않다. 현재, 가장 허용되는 이론은 작용제가 프리온 단백질로 공지된 정상 단백질의 변형된 형태라는 것이다. 아직 이해되지 않는 이유로, 정상 프리온 단백질은 이후 소의 중추 신경계를 손상시키는 병원성 (유해) 형태로 변화된다. 상이한 BSE 계통: 영국에서의 발생의 원인이 된 정형의 또는 전형적 BSE 계통 및 2종의 비정형 계통 (H 및 L 계통)이 존재한다는 증거가 증가하고 있다. BSE에 대한 치료는 현재 공지되어 있지 않다.
만성 소모성 질환 (CWD)은 사슴, 엘크, 순록, 시카 사슴 및 무스에 영향을 미치는 프리온 질환이다. 이는 캐나다 및 미국을 비롯한 북미, 노르웨이 및 대한민국의 일부 지역에서 발견되었다. 감염된 동물에서 현저한 체중 감소 (소모), 비틀거림, 무기력 및 다른 신경계 증상을 포함할 수 있는 증상이 발생하기 전까지 1년 넘게 걸릴 수 있다. CWD는 모든 연령의 동물에 영향을 미칠 수 있고, 일부 감염된 동물에서는 질환이 전혀 발생하지 않고 사망할 수 있다. CWD는 동물에게 치명적이고, 치료 또는 백신은 없다.
TSE의 병원체는 프리온인 것으로 여겨진다. 용어 "프리온"은 전염성이고 뇌에서 가장 풍부하게 발견되는 프리온 단백질로 불리는 특정의 정상 세포성 단백질의 비정상적인 폴딩을 유도할 수 있는 비정상적, 병원체를 지칭한다. 이들 정상 프리온 단백질의 기능은 여전히 완전히 이해되지 않고 있다. 프리온 단백질의 비정상적인 폴딩은 뇌 손상 및 질환의 특징적인 징후 및 증상으로 이어진다. 프리온 질환은 통상적으로 급속 진행성이고, 항상 치명적이다.
본원에 사용된 용어 "프리온"은 인간 및 동물에서 질환 (해면상 뇌병증)을 유발하는 것으로 공지된 감염성 입자를 의미할 것이다. 용어 "프리온"은 단어 "단백질" 및 "감염"의 축약형이고, 입자는 주로, 독점적이지는 않지만, 입체형태를 변화시켜 PRNPSc가 되는 PRNPC를 발현하는 PRNP 유전자에 의해 코딩된 PRNPSc 분자로 구성된다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 바이로이드와 구별된다. 공지된 프리온은 동물을 감염시켜 양 및 염소의 신경계의 전염성 변성 질환인 스크래피 뿐만 아니라 소 해면상 뇌병증 (BSE) 또는 광우병 및 고양이의 고양이 해면상 뇌병증을 유발하는 것을 포함한다. 인간에게 영향을 미치는 것으로 공지된 상기 논의된 바와 같은 4종의 프리온 질환은 (1) 쿠루병, (2) 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), (3) 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커병 (GSS), 및 (4) 치명적 가족성 불면증 (FFI)이다. 본원에 사용된 바와 같은 프리온은 사용되는 임의의 동물--및 특히 인간 및 가축에서 이들 질환 또는 그 밖의 것을 모두 또는 그 중 임의의 것을 유발하는 프리온의 모든 형태를 포함한다.
일반적으로, 그리고 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 프리온 질환은 프리온 단백질의 미스폴딩에 의해 유발된다. 이러한 질환-종종 침착 질환으로 불림-프리온 단백질의 미스폴딩은 하기와 같이 설명될 수 있다. A가 단량체 또는 올리고머 상태에서 의도된 생리학적 역할을 수행하는 정상적으로 합성된 유전자 생성물이라면, A*는 현저한 입체형태적 변화를 겪기에 적격인 A의 입체형태적으로 활성화된 형태이고, B는 다량체 조립을 선호하는 입체형태적으로 변경된 상태 (즉, 침착을 형성하는 미스폴딩된 형태)이고, Bn은 병원성이고 비교적 재순환시키기 어려운 다량체 물질이다. 프리온 질환의 경우, PRNPC 및 PRNPSc는 상태 A 및 Bn에 상응하고, 여기서 A는 주로 나선형 및 단량체이고, Bn은 β-풍부 및 다량체이다.
프리온 단백질에서의 특정 돌연변이는 프리온 질환의 증가된 위험과 연관될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 반대로, 프리온 단백질에서의 특정 돌연변이는 사실상 보호성일 수 있다. 문헌 [Bagynszky et al., "Characterization of mutations in PRNP (prion) gene and their possible roles in neurodegenerative diseases," Neuropsychiatr Dis Treat., 2018; 14: 2067-2085]을 참조하며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
PRNP (NCBI RefSeq No. NP_000302.1 (서열식별번호: 291))-인간 프리온 단백질--은 염색체 20 (4686151-4701588)에 위치하는 16 kb 길이의 유전자에 의해 코딩된다. 이는 2개의 엑손을 함유하고, 엑손 2는 253개 아미노산 (AA) 길이의 PrP 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 보유한다. 엑손 1은 전사 개시 부위로서 작용할 수 있는 비코딩 엑손이다. 번역후 변형은 처음 22개의 AA N-말단 단편 (NTF) 및 마지막 23개의 AA C-말단 단편 (CTF)의 제거를 발생시킨다. NTF는 내형질 세망 (ER)으로의 PrP 수송 후에 절단되는 한편, CTF (글리코실포스파티딜이노시톨 [GPI] 신호 펩티드 [GPI-SP])는 GPI 앵커에 의해 절단된다. GPI 앵커는 PrP 단백질 수송에 수반될 수 있다. 이는 또한 프리온 단백질을 세포 막 외부 표면으로 부착시키는 역할을 할 수 있다. 정상 PrP는 긴 N-말단 루프 (옥타펩티드 반복 영역을 함유함), 2개의 짧은 β 시트, 3개의 α 나선, 및 C-말단 영역 (GPI 앵커를 함유함)으로 구성된다. PrP의 절단은 세포 막에 고정된 208 AA 길이의 당단백질을 생성한다.
PRNP (NP_000302.1)의 253개 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00354
PRNP (NP_000302.1)의 253개 아미노산 서열은 하기 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref. Seq No. NM_000311.5, "호모 사피엔스 프리온 단백질 (PRNP), 전사체 변이체 1, mRNA)에 의해 코딩되며, 하기와 같다:
Figure pct00355
CJD 및 FFI와 연관된 PRNP (NP_000302.1)에 대한 돌연변이 부위는 하기와 같이 보고되어 있다. 이들 돌연변이는 본원에 개시된 프라임 편집제를 사용하여 제거 또는 설치될 수 있다.
Figure pct00356
Figure pct00357
GSS와 연관된 PRNP (NP_000302.1) (서열식별번호: 291)에 대한 돌연변이 부위는 하기와 같이 보고되어 있다:
Figure pct00358
Figure pct00359
프리온 질환에 대한 가능한 보호 성질과 연관된 PRNP (NP_000302.1) (서열식별번호: 291)에 대한 돌연변이 부위는 하기와 같다:
Figure pct00360
Figure pct00361
따라서, 다양한 실시양태에서, 프라임 편집은 PRNP에서 프리온 질환과 연관된 돌연변이를 제거하거나 또는 PRNP 내에 프리온 질환에 대해 보호성인 것으로 간주되는 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 프라임 편집은 PRNP 단백질 (NP_000302.1의 PRNP 대비) (서열식별번호: 291)에서 D178N, V180I, T188K, E196K, E196A, E200K, E200G, V203I, R208H, V210I, E211Q, I215V, 또는 M232R 돌연변이를 제거 또는 회복시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 프라임 편집은 PRNP 단백질 (NP_000302.1의 PRNP 대비) (서열식별번호: 291)에서 P102L, P105L, A117V, G131V, V176G, H187R, F198S, D202N, Q212P, Q217R, 또는 M232T 돌연변이를 제거 또는 회복시키기 위해 사용될 수 있다. 프라임 편집을 사용하여 PRNP에서 이러한 돌연변이의 존재를 제거 또는 교정함으로써, 프리온 질환의 위험을 감소 또는 제거할 수 있다.
다른 실시양태에서, 프라임 편집은 PRNP 내에 1종 이상의 프리온 질환에 대한 보호 효과와 연관된 보호 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 프라임 편집은 PRNP (NP_000302.1의 PRNP 대비) (서열식별번호: 291) 내에 G127S, G127V, M129V, D167G, D167N, N171S, E219K, 또는 P238S 보호 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 보호 돌연변이는 PRNP (NP_000302.1의 PRNP 대비) (서열식별번호: 291) 내의 G127, G127, M129, D167, D167, N171, E219, 또는 P238에 설치된 임의의 대안적 아미노산일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 프라임 편집은 도 27에 예시되고 실시예 5에 논의된 바와 같이, PRNP 내에 G127V 보호 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 프라임 편집은 PRNP 내에 E219K 보호 돌연변이를 설치하기 위해 사용될 수 있다.
PRNP 단백질 및 보호 돌연변이 부위는 포유동물에서 보존되므로, 인간 질환을 치료하는 것에 더하여, 이는 또한 프리온 질환에 면역성인 소 및 양을 생성하는데 사용될 수 있거나, 또는 심지어 프리온 질환을 앓고 있는 동물의 야생 집단을 치유하는 것을 돕는데 사용될 수 있다. 프라임 편집은 인간 세포에서 자연 발생 보호 대립유전자의 ~25% 설치를 달성하는데 이미 사용되어 왔고, 이전 마우스 실험은 이러한 설치 수준이 대부분의 프리온 질환으로부터 면역을 유발하기에 충분하다는 것을 나타낸다. 이러한 방법은 대부분의 세포 유형에서 이러한 대립유전자를 이러한 높은 효율로 설치하기 위한 최초의, 잠재적으로 유일한 현재의 방식이다. 또 다른 가능한 치료 전략은 프라임 편집을 사용하여 유전자에 초기 정지 코돈을 설치함으로써 PRNP의 발현을 감소 또는 제거하는 것이다.
PEgRNA 설계를 위해 본원에 기재된 원리를 사용하여, 목적하는 보호 돌연변이를 설치하기 위해, 또는 PRNP로부터 프리온 질환-연관 돌연변이를 제거하기 위해 적절한 PEgRNA를 설계할 수 있다. 예를 들어, 하기 목록의 PEgRNA를 사용하여 인간 PRNP 내에 G127V 보호 대립유전자 및 E219K 보호 대립유전자, 뿐만 아니라 다양한 동물의 PRNP 내에 G127V 보호 대립유전자를 설치할 수 있다.
[9] 제약 조성물
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 프라임 편집 시스템의 다양한 성분 중 임의의 것 (예를 들어, napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제, 융합 단백질 (예를 들어, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함함), 연장된 가이드 RNA, 및 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성쪽으로 구동하는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 제2 가닥 닉킹 성분 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "제약 조성물"은 제약 용도를 위해 제제화된 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 추가의 작용제 (예를 들어, 특이적 전달, 반감기 증가, 또는 다른 치료 화합물을 위함)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 신체의 한 부위 (예를 들어, 전달 부위)로부터 또 다른 부위 (예를 들어, 신체의 기관, 조직 또는 부분)로 화합물을 운반 또는 수송하는데 수반되는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제 (예를 들어, 윤활제, 활석, 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘 또는 스테아르산아연, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 제약상 허용되는 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 대상체의 조직에 유해하지 않다는 의미에서 "허용되는" 것이다 (예를 들어, 생리학상 상용성, 멸균, 생리학적 pH 등). 제약상 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-무함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 벌킹제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산 (23) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알콜, 예컨대 에탄올; 및 (23) 제약 제제에 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질. 습윤제, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제, 퍼퓸제, 보존제 및 항산화제가 또한 제제에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "제약상 허용되는 담체" 등과 같은 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체에게 전달하기 위해, 예를 들어 유전자 편집을 위해 제제화된다. 본원에 기재된 제약 조성물의 적합한 투여 경로는 제한 없이 국소, 피하, 경피, 피내, 병변내, 관절내, 복강내, 방광내, 경점막, 치은, 치아내, 와우내, 경고실, 기관내, 경막외, 척수강내, 근육내, 정맥내, 혈관내, 골내, 안구주위, 종양내, 뇌내, 및 뇌실내 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 이환 부위 (예를 들어, 종양 부위)에 국부로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 이식물에 의해 대상체에게 투여되며, 이식물은 막, 예컨대 시알라스틱 막, 또는 섬유를 포함한 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질이다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달된다. 한 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 또 다른 실시양태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61] 참조. 또한 문헌 [Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조). 다른 제어 방출 시스템은, 예를 들어 상기 문헌 [Langer]에 논의되어 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체, 예를 들어 인간에게 정맥내 또는 피하 투여하기에 적합화된 조성물로서 상용 절차에 따라 제제화된다. 일부 실시양태에서, 주사에 의한 투여를 위한 제약 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우에, 제약은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 국부 마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 단위 투여 형태로, 예를 들어 활성제의 양을 나타내는 기밀 용기, 예컨대 앰플 또는 사쉐 내의 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 제약이 주입에 의해 투여되는 경우에, 이는 멸균 제약 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 제약 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
전신 투여를 위한 제약 조성물은 액체, 예를 들어 멸균 염수, 락테이트화 링거 또는 행크 용액일 수 있다. 또한, 제약 조성물은 고체 형태일 수 있고, 사용 직전에 재용해 또는 현탁될 수 있다. 동결건조 형태가 또한 고려된다.
제약 조성물은 지질 입자 또는 소포, 예컨대 리포솜 또는 미세결정 내에 함유될 수 있으며, 이는 또한 비경구 투여에 적합하다. 입자는 조성물이 그 안에 함유되는 한, 임의의 적합한 구조, 예컨대 단층 또는 다층일 수 있다. 화합물은 융합생성 지질 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 낮은 수준 (5-10 mol%)의 양이온성 지질을 함유하는 "안정화된 플라스미드-지질 입자" (SPLP)에 포획될 수 있고, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 코팅에 의해 안정화될 수 있다 (Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47). 양으로 하전된 지질, 예컨대 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸술페이트, 또는 "DOTAP"가 이러한 입자 및 소포에 특히 바람직하다. 이러한 지질 입자의 제조는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,880,635; 4,906,477; 4,911,928; 4,917,951; 4,920,016; 및 4,921,757을 참조하고; 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 제약 조성물은, 예를 들어 단위 용량으로서 투여 또는 패키징될 수 있다. 용어 "단위 용량"은 본 개시내용의 제약 조성물과 관련하여 사용되는 경우에 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 요구되는 희석제; 즉, 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 함유한다.
추가로, 제약 조성물은 (a) 동결건조 형태의 본 발명의 화합물을 함유하는 용기 및 (b) 주사용 제약상 허용되는 희석제 (예를 들어, 멸균수)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 제약 키트로서 제공될 수 있다. 제약상 허용되는 희석제는 본 발명의 동결건조 화합물의 재구성 또는 희석에 사용될 수 있다. 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 정부 기관에 의한 승인을 반영하는, 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지서가 이러한 용기(들)와 임의로 회합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 포함된다. 일부 실시양태에서, 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지 및 시험 튜브를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 본원에 기재된 질환을 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다. 조성물 중 활성제는 본 발명의 화합물이다. 일부 실시양태에서, 용기 상의 또는 용기와 회합된 라벨은 조성물이 선택된 질환을 치료하는데 사용된다는 것을 표시한다. 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용에 대한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
[10] 키트, 세포, 벡터, 및 전달
키트
본 개시내용의 조성물은 키트로 조립될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 프라임 편집제의 발현을 위한 핵산 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트는 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제를 목적하는 표적 서열에 표적화하기 위해, 적절한 가이드 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, PEgRNA 및 제2-부위 gRNA) 또는 이러한 가이드 뉴클레오티드 서열의 발현을 위한 핵산 벡터를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 키트는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 성분을 수용하는 1개 이상의 용기 및 임의로 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 키트 중 임의의 것은 검정 방법을 수행하는데 필요한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 키트의 각각의 성분은, 적용가능한 경우에, 액체 형태 (예를 들어, 용액) 또는 고체 형태 (예를 들어, 건조 분말)로 제공될 수 있다. 특정 경우에, 성분 중 일부는, 예를 들어 키트와 함께 제공될 수 있거나 또는 제공되지 않을 수 있는 적합한 용매 또는 다른 종 (예를 들어, 물)의 첨가에 의해 (예를 들어, 활성 형태로) 재구성가능하거나 또는 달리 가공가능할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 제공된 성분의 사용에 대한 지침서 및/또는 홍보물을 임의로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "지침서"는 지침서 및/또는 홍보물의 성분을 규정할 수 있고, 전형적으로 개시내용의 패키징 상의 또는 그와 회합된 서면 지침서를 수반할 수 있다. 지침서는 또한 사용자가 지침서를 키트와 연관된 것으로 명확하게 인식하게 할 임의의 방식, 예를 들어 시청각 (예를 들어, 비디오테이프, DVD 등), 인터넷 및/또는 웹-기반 통신 등으로 제공되는 임의의 구두 또는 전자 지침서를 포함할 수 있다. 서면 지침서는 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태일 수 있으며, 이는 또한 동물 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 기관의 승인을 반영할 수 있다. 본원에 사용된 "홍보된"은 개시내용와 연관된, 교육, 병원 및 다른 임상 지침, 과학적 탐구, 약물 발견 또는 개발, 학술 연구, 제약 판매를 포함한 제약 산업 활동, 및 임의의 형태의 서면, 구두 및 전자 커뮤니케이션을 포함한 임의의 광고 또는 다른 홍보 활동의 방법을 포함한 영업을 수행하는 모든 방법을 포함한다. 추가적으로, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 구체적 적용에 따라 다른 성분을 포함할 수 있다.
키트는 1개 이상의 용기에 본원에 기재된 성분 중 임의의 1종 이상을 함유할 수 있다. 성분은 멸균 제조되고, 시린지 내에 패키징되고, 냉장 운송될 수 있다. 대안적으로, 이는 저장을 위해 바이알 또는 다른 용기에 수용될 수 있다. 제2 용기는 멸균 제조된 다른 성분을 가질 수 있다. 대안적으로, 키트는 바이알, 튜브 또는 다른 용기 내에서 예비혼합되고 운송된 활성제를 포함할 수 있다.
키트는 다양한 형태, 예컨대 블리스터 파우치, 수축 랩핑된 파우치, 진공 밀봉가능한 파우치, 밀봉가능한 열성형된 트레이, 또는 파우치 내에 느슨하게 패킹된 부속품을 갖는 유사한 파우치 또는 트레이 형태, 1개 이상의 튜브, 용기, 박스 또는 백을 가질 수 있다. 키트는 부속품이 첨가된 후에 멸균될 수 있고, 이에 의해 용기 내의 개별 부속품을 달리 꺼내는 것이 가능하다. 키트는 임의의 적절한 멸균 기술, 예컨대 방사선 멸균, 가열 멸균, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 멸균 방법을 사용하여 멸균될 수 있다. 키트는 또한 특정한 적용에 따라 다른 성분, 예를 들어, 용기, 세포 배지, 염, 완충제, 시약, 시린지, 바늘, 소독제를 적용 또는 제거하기 위한 직물, 예컨대 거즈, 일회용 장갑, 투여 전의 작용제를 위한 지지체 등을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 프라임 편집 시스템의 다양한 성분 (예를 들어, napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제, 폴리머라제, 융합 단백질 (예를 들어, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제 (또는 보다 넓게는, 폴리머라제)를 포함함), 연장된 가이드 RNA, 및 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성쪽으로 구동하는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 제2 가닥 닉킹 성분 (예를 들어, 제2 가닥 닉킹 gRNA) 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열(들)은 프라임 편집 시스템 성분의 발현을 구동하는 이종 프로모터 (또는 단일 초과의 프로모터)를 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 프라임 편집 시스템의 다양한 성분을 코딩하는 1개 이상의 핵산 구축물을 포함하는, 예를 들어 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 프라임 편집 시스템의 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프라임 편집 시스템 성분의 발현을 구동하는 이종 프로모터를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 (a) 리버스 트랜스크립타제에 융합된 napDNAbp (예를 들어, Cas9 도메인)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 (b) (a)의 서열의 발현을 구동하는 이종 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다.
세포
본원에 기재된 조성물 중 임의의 것을 함유할 수 있는 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 본원에 기재된 방법은 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제를 진핵 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포) 내로 전달하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내의 것 (예를 들어, 배양된 세포)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체내 (예를 들어, 대상체, 예컨대 인간 대상체 내)의 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체외의 것 (예를 들어, 대상체로부터 단리되고, 동일한 또는 상이한 대상체에게 다시 투여될 수 있는 것)이다.
본 개시내용의 포유동물 세포는 인간 세포, 영장류 세포 (예를 들어, 베로 세포), 래트 세포 (예를 들어, GH3 세포, OC23 세포) 또는 마우스 세포 (예를 들어, MC3T3 세포)를 포함한다. 제한 없이, 인간 배아 신장 (HEK) 세포, HeLa 세포, 국립 암 연구소의 60 암 세포주 (NCI60)로부터의 암 세포, DU145 (전립선암) 세포, Lncap (전립선암) 세포, MCF-7 (유방암) 세포, MDA-MB-438 (유방암) 세포, PC3 (전립선암) 세포, T47D (유방암) 세포, THP-1 (급성 골수성 백혈병) 세포, U87 (교모세포종) 세포, SHSY5Y 인간 신경모세포종 세포 (골수종으로부터 클로닝됨) 및 Saos-2 (골암) 세포를 포함한 다양한 인간 세포주가 존재한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (예를 들어, HEK 293 또는 HEK 293T 세포) 내로 전달된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 줄기 세포 (예를 들어, 인간 줄기 세포), 예컨대, 예를 들어, 만능 줄기 세포 (예를 들어, 인간 유도된 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 포함한 인간 만능 줄기 세포) 내로 전달된다. 줄기 세포는 배양 시 무한 기간 동안 분열하고 특화 세포를 생성하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 만능 줄기 세포는 유기체의 모든 조직으로 분화할 수 있지만, 단독으로는 완전한 유기체 발생을 지속할 수 없는 줄기 세포의 유형을 지칭한다. 인간 유도된 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포의 정의 특성을 유지하는데 중요한 유전자 및 인자를 발현하도록 강제됨으로써 배아 줄기 세포-유사 상태로 재프로그램화된 체세포 (예를 들어, 성숙 또는 성체)를 지칭한다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Takahashi and Yamanaka, Cell 126 (4): 663-76, 2006] 참조). 인간 유도된 만능 줄기 세포 세포는 줄기 세포 마커를 발현하고, 모든 3가지 배엽층 (외배엽, 내배엽, 중배엽)의 세포 특징을 생성할 수 있다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 세포주의 추가의 비제한적 예는 293-T, 293-T, 3T3, 4T1, 721, 9L, A-549, A172, A20, A253, A2780, A2780ADR, A2780cis, A431, ALC, B16, B35, BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C2C12, C3H-10T1/2, C6, C6/36, Cal-27, CGR8, CHO, CML T1, CMT, COR-L23, COR-L23/5010, COR-L23/CPR, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, E14Tg2a, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, Hepa1c1c7, 하이 파이브 세포, HL-60, HMEC, HT-29, HUVEC, J558L 세포, Jurkat, JY 세포, K562 세포, KCL22, KG1, Ku812, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1, 2, 3....48, MC-38, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, MDCK II, MG63, MONO-MAC 6, MOR/0.2R, MRC5, MTD-1A, MyEnd, NALM-1, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NW-145, OPCN/OPCT Peer, PNT-1A/PNT 2, PTK2, Raji, RBL 세포, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, S2, Saos-2 세포, Sf21, Sf9, SiHa, SKBR3, SKOV-3, T-47D, T2, T84, THP1, U373, U87, U937, VCaP, WM39, WT-49, X63, YAC-1 및 YAR 세포를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 구축물 중 임의의 것을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 1개 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에서 자연 발생하는 바와 같이 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 세포는 대상체로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 채취한 세포, 예컨대 세포주로부터 유래된다. 조직 배양을 위한 매우 다양한 세포주가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 세포주의 예는 C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 원숭이 신장 상피, BALB/3T3 마우스 배아 섬유모세포, 3T3 스위스, 3T3-L1, 132-d5 인간 태아 섬유모세포; 10.1 마우스 섬유모세포, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A 172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1 세포, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293. BxPC3. C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY 세포, K562 세포, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK 11, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN/OPCT 세포주, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2 세포, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1 세포주, U373, U87, U937, VCaP, 베로 세포, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, 및 그의 트랜스제닉 변종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
세포주는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 공급원으로부터 입수가능하다 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (버지니아주 마나사스) 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 1개 이상의 벡터로 형질감염된 세포는 1개 이상의 벡터-유래 서열을 포함하는 새로운 세포주를 확립하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템의 성분으로 일시적으로 형질감염되고 (예컨대 1개 이상의 벡터의 일시적 형질감염, 또는 RNA로의 형질감염에 의함), CRISPR 복합체의 활성을 통해 변형된 세포는 변형을 함유하지만 임의의 다른 외인성 서열은 결여된 세포를 포함하는 새로운 세포주를 확립하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 1개 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된 세포, 또는 이러한 세포로부터 유래된 세포주는 1개 이상의 시험 화합물을 평가하는데 사용된다.
벡터
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 프라임 편집제 또는 그의 성분, 예를 들어 분할 Cas9 단백질 또는 분할 핵염기 프라임 편집제를 세포 내로 전달하기 위해 재조합 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터)를 사용하는 것에 관한 것이다. 분할-PE 접근법의 경우, PE 융합 단백질의 N-말단 부분 및 PE 융합체의 C-말단 부분은 별개의 재조합 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터)에 의해 동일한 세포 내로 전달되는데, 이는 전장 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제가 다양한 바이러스 벡터, 예를 들어 rAAV의 패키징 한계 (~4.9 kb)를 초과하기 때문이다.
따라서, 한 실시양태에서, 개시내용은 분할 프라임 편집제 융합 단백질 또는 그의 분할 성분을 전달할 수 있는 벡터를 고려한다. 일부 실시양태에서, 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제를 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 인간 세포) 내로 전달하기 위한 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 (i) Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 C-말단에서 인테인-N에 융합된 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 N-말단 부분을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자; 및 (ii) Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 C-말단 부분의 N-말단에 융합된 인테인-C를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자를 포함한다. 본 개시내용의 rAAV 입자는 바이러스 캡시드 단백질 내에 캡시드화된 rAAV 벡터 (즉, rAAV의 재조합 게놈)를 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 (1) 본원에 기재된 바와 같은 임의의 형태의 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제의 N-말단 부분 또는 C-말단 부분을 코딩하는 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산 영역, (2) 이종 핵산 영역의 발현을 용이하게 하는 서열 (예를 들어, 프로모터)을 포함하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 (3) 세포의 게놈 내로의 이종 핵산 영역의 통합을 용이하게 하는 서열을 포함하는 1개 이상의 핵산 영역을 (임의로 발현을 용이하게 하는 서열을 포함하는 1개 이상의 핵산 영역과 함께) 포함한다. 일부 실시양태에서, 통합을 용이하게 하는 바이러스 서열은 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제의 N-말단 부분 또는 C-말단 부분을 코딩하는 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열은 ITR 서열이 각 측면에 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 ITR이 플랭킹된 영역 내에 또는 영역 외부에 함유된, 본원에 기재된 바와 같은 AAV Rep 단백질을 코딩하는 영역을 추가로 포함한다. ITR 서열은 임의의 AAV 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)으로부터 유래될 수 있거나 또는 1종 초과의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, ITR 서열은 AAV2 또는 AAV6으로부터 유래된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 rAAV 입자는 적어도 1개의 rAAV2 입자, rAAV6 입자, rAAV8 입자, rPHP.B 입자, rPHP.eB 입자, 또는 rAAV9 입자, 또는 그의 변이체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 개시된 rAAV 입자는 rPHP.B 입자, rPHP.eB 입자, rAAV9 입자이다.
ITR 서열 및 ITR 서열을 함유하는 플라스미드는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 펜실베니아주 필라델피아 소재의 벡터 바이오랩스(Vector Biolabs); 캘리포니아주 샌디에고 소재의 셀바이오랩스(Cellbiolabs); 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 및 매사추세츠주 캠브리지 소재의 애드진(Addgene)으로부터 입수가능한 제품 및 서비스; 및 문헌 [Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Nov 26;93(24):14082-7; and Curtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine™. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201 ⓒ Humana Press Inc. 2003. Chapter 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski]; 미국 특허 번호 5,139,941 및 5,962,313 참조, 이들은 모두 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 이종 핵산 영역의 발현을 제어하기 위한 1개 이상의 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 전사 종결인자, 및/또는 다른 조절 요소)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열은 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과)의 전사 종결인자에 작동가능하게 연결된다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 전사 종결인자의 비제한적 예는 소 성장 호르몬 유전자 (bGH), 인간 성장 호르몬 유전자 (hGH), SV40, CW3, φ, 또는 그의 조합의 전사 종결인자를 포함한다. 여러 전사 종결인자의 효율은 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제의 발현 수준에서의 그의 각각의 효과를 결정하기 위해 시험되었다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 사용된 전사 종결인자는 bGH 전사 종결인자이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, WPRE는 말단절단된 WPRE 서열, 예컨대 "W3"이다. 일부 실시양태에서, WPRE는 전사 종결인자의 5'에 삽입된다. 이러한 서열은 전사되는 경우에, 특히 바이러스 벡터로부터의 발현을 증진시키는 3차 구조를 생성한다.
일부 실시양태에서, 본원에 사용된 벡터는 PE 융합 단백질, 또는 그의 성분 중 임의의 것 (예를 들어, napDNAbp, 링커, 또는 폴리머라제)을 코딩할 수 있다. 또한, 본원에 사용된 벡터는 PEgRNA, 및/또는 제2 가닥 닉킹을 위한 보조 gRNA를 코딩할 수 있다. 벡터는 세포에서 1개 이상의 코딩 서열의 발현을 구동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포, 예컨대, 예를 들어, 박테리아 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 예컨대, 예를 들어 효모, 식물, 곤충, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 설치류 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 인간 세포일 수 있다. 상이한 유형의 세포에서 발현을 구동하기에 적합한 프로모터는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 야생형일 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 보다 효율적이거나 효과적인 발현을 위해 변형될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 말단절단되어도 그의 기능을 보유할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 벡터를 바이러스 내로 적절히 패키징하는데 적합한 정상 크기 또는 감소된 크기를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라임 편집제 벡터에 사용될 수 있는 프로모터는 구성적, 유도성, 또는 조직-특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적인 구성적 프로모터는 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터 (CMV), 원숭이 바이러스 (SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 (MLP) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 신장 인자-알파 (EFla) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 이뮤노글로불린 프로모터, 그의 기능적 단편, 또는 상기 중 임의의 것의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 말단절단된 CMV 프로모터일 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 EFla 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열 쇼크, 광, 화학물질, 펩티드, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알콜에 의해 유도가능한 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 낮은 기저 (비-유도된) 발현 수준을 갖는 것, 예컨대, 예를 들어, 테트-온(Tet-On)® 프로모터 (클론테크)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터는 간 조직에서 독점적으로 또는 우세하게 발현된다. 비제한적인 예시적인 조직-특이적 프로모터는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, Nphsl 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 및 WASP 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프라임 편집제 벡터 (예를 들어, 프라임 편집제 융합 단백질 및/또는 PEgRNA, 및/또는 보조 제2 가닥 닉킹 gRNA를 코딩하는 임의의 벡터를 포함함)는 표적 세포에 전달된 후에만 발현을 시작하는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열 쇼크, 광, 화학물질, 펩티드, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알콜에 의해 유도가능한 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 낮은 기저 (비-유도된) 발현 수준을 갖는 것, 예컨대, 예를 들어, 테트-온® 프로모터 (클론테크)일 수 있다.
추가의 실시양태에서, 프라임 편집제 벡터 (예를 들어, 프라임 편집제 융합 단백질 및/또는 PEgRNA, 및/또는 보조 제2 가닥 닉킹 gRNA를 코딩하는 임의의 벡터를 포함함)는 특정 조직 내로 전달된 후에만 발현을 시작하기 위해 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적인 조직-특이적 프로모터는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, Nphsl 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 및 WASP 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, PEgRNA (또는 프라임 편집과 관련하여 사용되는 임의의 가이드 RNA)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 적어도 1개의 전사 또는 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 적어도 1개의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 III (Pol III)에 의해 인식될 수 있다. Pol III 프로모터의 비제한적 예는 U6, HI 및 tRNA 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 또는 인간 U6 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 또는 인간 HI 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 또는 인간 tRNA 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 1개 초과의 가이드 RNA를 갖는 실시양태에서, 발현을 구동하는데 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA의 crRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 및 가이드 RNA의 tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드는 동일한 벡터 상에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 및 tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드는 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 전사체로 전사될 수 있다. 예를 들어, crRNA 및 tracr RNA는 단일 전사체로부터 프로세싱되어 이중-분자 가이드 RNA를 형성할 수 있다. 대안적으로, crRNA 및 tracr RNA는 단일-분자 가이드 RNA로 전사될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 PE 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 동일한 벡터 상에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA 및 PE 융합 단백질의 발현은 그의 상응하는 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA의 발현은 PE 융합 단백질의 발현을 구동하는 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA 및 PE 융합 단백질 전사체는 단일 전사체 내에 함유될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 Cas9 단백질 전사체의 비번역 영역 (UTR) 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 PE 융합 단백질 전사체의 5' UTR 내에 있을 수 있다. 다른 실시양태에서, 가이드 RNA는 PE 융합 단백질 전사체의 3' UTR 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, PE 융합 단백질 전사체의 세포내 반감기는 가이드 RNA를 그의 3' UTR 내에 함유시켜 그의 3' UTR의 길이를 단축시킴으로써 감소될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 가이드 RNA는 PE 융합 단백질 전사체의 인트론 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA가 전사체로부터 적절하게 스플라이싱되도록 가이드 RNA가 위치하는 인트론에 적합한 스플라이스 부위가 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일한 벡터 상에서의 아주 근접한 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 발현은 CRISPR 복합체의 보다 효율적인 형성을 용이하게 할 수 있다.
프라임 편집제 벡터 시스템은 1개의 벡터, 또는 2개의 벡터, 또는 3개의 벡터, 또는 4개의 벡터, 또는 5개의 벡터, 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터 시스템은 PE 융합 단백질 및 PEgRNA 둘 다를 코딩하는 1개의 단일 벡터를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 벡터 시스템은 2개의 벡터를 포함할 수 있고, 여기서 하나의 벡터는 PE 융합 단백질을 코딩하고, 다른 벡터는 PEgRNA를 코딩한다. 추가의 실시양태에서, 벡터 시스템은 3개의 벡터를 포함할 수 있고, 여기서 제3 벡터는 본원의 방법에 사용되는 제2 가닥 닉킹 gRNA를 코딩한다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자 (본원에서 고려되는 임의의 형태)를 포함하는 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한 적절한 제약 비히클 중에 제제화된다.
제약상 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-무함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 벌킹제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산 (23) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알콜, 예컨대 에탄올; 및 (23) 제약 제제에 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질. 습윤제, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제, 퍼퓸제, 보존제 및 항산화제가 또한 제제에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "제약상 허용되는 담체" 등과 같은 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
전달 방법
일부 측면에서, 본 발명은 1개 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 벡터, 그의 1개 이상의 전사체, 및/또는 그로부터 전사된 1개 이상의 단백질을 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 또는 그로부터 생산된 유기체 (예컨대 동물, 식물, 또는 진균)를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열과 조합된 (및 임의로 그와 복합체화된) 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집제가 세포에 전달된다.
예시적인 전달 전략은 본원의 다른 곳에 기재되어 있으며, 이는 벡터-기반 전략, PE 리보핵단백질 복합체 전달, 및 mRNA 방법에 의한 PE의 전달을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 전달 방법은 뉴클레오펙션, 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증진된 흡수를 포함한다.
핵산의 예시적인 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 전기천공, 안정한 게놈 통합 (예를 들어, 피기백), 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증진된 흡수를 포함한다. 리포펙션은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)™, 리포펙틴(Lipofectin)™ 및 SF 세포주 4D-뉴클레오펙터 X 키트™ (론자(Lonza))). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 파이너(Feigner), WO 91/17424; WO91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체내 투여)에 대한 것일 수 있다. 전달은 RNP 복합체의 사용을 통해 달성될 수 있다.
표적화된 리포솜, 예컨대 면역지질 복합체를 포함한 지질:핵산 복합체의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참조).
다른 실시양태에서, 본원에 제공된 전달 방법 및 벡터는 RNP 복합체이다. 융합 단백질의 RNP 전달은 염기 편집의 DNA 특이성을 현저하게 증가시킨다. 융합 단백질의 RNP 전달은 온- 및 오프-타겟 DNA 편집의 탈커플링으로 이어진다. RNP 전달은 플라스미드 전달과 대등한 온-타겟 편집을 유지시키면서 비-반복 부위에서의 오프-타겟 편집을 제거하고, 심지어 고도로 반복적인 VEGFA 부위에서도 오프-타겟 DNA 편집을 크게 감소시킨다 2. 문헌 [Rees, H.A. et al., Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery, Nat. Commun. 8, 15790 (2017)], 2016년 12월 27일에 허여된 미국 특허 번호 9,526,784, 및 2017년 8월 22일에 허여된 미국 특허 번호 9,737,604를 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
핵산을 세포에 전달하기 위한 추가의 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 US 2003/0087817을 참조한다.
본 개시내용의 다른 측면은 프라임 편집제 구축물을 세포 내로 전달하여 세포 내에서 완전하고 기능적인 프라임 편집제를 형성하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, 분할 Cas9 또는 분할 프라임 편집제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이러한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 벡터를 함유하는 AAV 입자를 포함하는 조성물)과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 접촉은 이러한 뉴클레오티드 서열의 세포 내로의 전달을 발생시키며, 여기서 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 N-말단 부분 및 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 C-말단 부분은 세포에서 발현되고, 연결되어, 완전한 Cas9 단백질 또는 완전한 프라임 편집제를 형성한다.
본원에 제공된 임의의 rAAV 입자, 핵산 분자 또는 조성물은 임의의 적합한 방식으로, 안정적으로 또는 일시적으로 세포 내로 도입될 수 있음을 인지하여야 한다. 일부 실시양태에서, 개시된 단백질은 세포를 형질감염시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 핵산 분자로 형질도입 또는 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 세포는 (예를 들어, 분할 단백질을 코딩하는 바이러스로) 형질도입될 수 있거나, 또는 분할 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 (예를 들어, 분할 단백질을 코딩하는 플라스미드로), 또는 1개 이상의 핵산 분자를 코딩하는 바이러스 게놈을 함유하는 rAAV 입자로 형질감염될 수 있다. 이러한 형질도입은 안정한 또는 일시적 형질도입일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분할 단백질을 발현하거나 또는 분할 단백질을 함유하는 세포는, 예를 들어 분할 Cas9 (예를 들어, nCas9) 단백질의 전달 시 1개 이상의 가이드 RNA 서열로 형질도입 또는 형질감염될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분할 단백질을 발현하는 플라스미드는 전기천공, 일시적 (예를 들어, 리포펙션) 및 안정한 게놈 통합 (예를 들어, 피기백) 및 바이러스 형질도입 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 지질 및/또는 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 지질 및/또는 중합체는 양이온성이다. 이러한 지질 입자의 제조는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,880,635; 4,906,477; 4,911,928; 4,917,951; 4,920,016; 4,921,757; 및 9,737,604를 참조하고; 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
가이드 RNA 서열은 15-100개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 적어도 10, 적어도 15, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 가이드 RNA는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 게놈, 예를 들어 진핵 게놈 내의 DNA 서열이다. 특정 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 포유동물 (예를 들어, 인간) 게놈 내에 있다.
본 개시내용의 조성물은 예를 들어 단위 용량으로서 투여 또는 패키징될 수 있다. 용어 "단위 용량"은 본 개시내용의 제약 조성물과 관련하여 사용되는 경우에 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 요구되는 희석제, 즉, 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 함유한다.
질환 또는 장애의 치료는 질환의 발생 또는 진행의 지연, 또는 질환 중증도의 감소를 포함한다. 질환을 치료하는 것은 반드시 치유적 결과를 요구하는 것은 아니다.
본원에 사용된 질환의 발생의 "지연"은 질환의 진행을 연기, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 및/또는 늦추는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료될 질환 및/또는 개체의 병력에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 질환의 발생을 "지연" 또는 완화시키거나, 또는 질환의 발병을 지연시키는 방법은, 방법을 사용하지 않는 것과 비교하여, 주어진 시간 프레임에서 질환의 1종 이상의 증상이 발생할 확률을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 다수의 대상체를 사용하는 임상 연구에 기초한다.
질환의 "발생" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 뒤이은 진행을 의미한다. 질환의 발생은 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 표준 임상 기술을 사용하여 검출가능하고 평가될 수 있다. 그러나, 발생은 또한 검출불가능할 수 있는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적상, 발생 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발생"은 출현, 재발, 및 발병을 포함한다.
본원에 사용된 질환의 "발병" 또는 "출현"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다. 치료될 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 의약 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 단리된 폴리펩티드 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다.
추가의 상술 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 개시내용을 그의 최대 정도로 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적이며, 어떠한 방식으로도 나머지 개시내용을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 공개물은 본원에 언급된 목적 또는 주제를 위해 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1. 게놈 내 정확한 뉴클레오티드 변화의 설치를 위한 프라임 편집 (PE)
목적은 포유동물 게놈에서 단일 뉴클레오티드 변화의 정확하고 일반적인 설치를 위해 형질전환 게놈 편집 기술을 개발하는 것이다. 이 기술은 조사자가 사실상 임의의 포유동물 유전자에서 단일 뉴클레오티드 변경의 효과를 연구할 수 있게 하고, 인간 환자에서 병원성 점 돌연변이를 교정하기 위한 치료적 개입을 잠재적으로 가능하게 할 것이다.
게놈 편집을 위한 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 시스템의 채택은 생명 과학을 혁신시켰다1-3. CRISPR을 사용한 유전자 파괴가 현재 일상적이지만, 단일 뉴클레오티드 편집의 정확한 설치는 다수의 질환-원인 돌연변이를 연구 또는 교정하는데 필요함에도 불구하고 주요 도전과제로 남아있다. 상동성 지정 복구 (HDR)는 이러한 편집을 달성할 수 있지만, 낮은 효율 (종종 <5%), 공여자 DNA 복구 주형에 대한 요건, 및 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB) 형성의 유해 효과를 겪는다. 최근에, 리우(Liu) 실험실은 염기 편집을 개발하였고, 이는 DSB 없이 효율적인 단일 뉴클레오티드 편집을 달성한다. 염기 편집제 (BE)는 CRISPR 시스템을 염기-변형 데아미나제 효소와 조합하여 표적 C·G 또는 A·T 염기 쌍을 각각 A·T 또는 G·C로 전환시킨다4-6. 전세계 연구원들에 의해 이미 널리 사용되기는 하였지만 (애드진에 의해 > 5,000개의 리우 실험실 BE 구축물이 배포됨), 현재의 BE는 12개의 가능한 염기 쌍 전환 중 단지 4개만을 가능하게 하고, 작은 삽입 또는 결실은 교정할 수 없다. 더욱이, 염기 편집의 표적화 범주는 표적 염기에 인접한 비-표적 C 또는 A 염기의 편집 ("방관자 편집")에 의해, 그리고 PAM 서열이 표적 염기로부터 15±2 bp에 존재해야 한다는 요건에 의해 제한된다. 따라서, 이들 제한을 극복하는 것은 게놈 편집의 기본 연구 및 치료 용도를 크게 확장시킬 것이다.
여기서, 염기 편집의 주요 제한을 극복하면서 그의 많은 이익-즉, 이중 가닥 파괴 및 공여자 DNA 복구 주형의 회피-을 제공하는 새로운 정밀 편집 접근법을 개발하는 것이 제안된다. 이러한 자명한 목적을 달성하기 위해, 표적-프라이밍 역전사 (TPRT)를 사용하여 표적 게놈 부위에 편집된 DNA 가닥을 직접 설치하는 것을 목표로 한다. 본원에 논의된 설계에서, CRISPR 가이드 RNA (gRNA)는 회합된 리버스 트랜스크립타제 (RT) 효소에 의해 실행될, 돌연변이유발 DNA 가닥 합성을 코딩하는 주형을 운반하도록 조작될 것이다. CRISPR 뉴클레아제 (Cas9)-닉킹된 표적 부위 DNA는 역전사를 위한 프라이머로서의 역할을 하여, 임의의 목적하는 뉴클레오티드 편집의 직접 혼입을 가능하게 할 것이다.
섹션 1
돌연변이유발 DNA 가닥의 가이드 RNA-주형화된 역전사를 확립한다. 이전의 연구는 DNA 절단 후에 그러나 복합체 해리 전에, Cas9가 비-표적 DNA 가닥을 방출하여 유리 3' 말단을 노출시킨다는 것을 보여주었다. 이 DNA 가닥은 폴리머라제 효소에 의해 연장부에 접근가능하고, gRNA는 DNA 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하도록 그의 5' 또는 3' 말단의 연장부를 통해 조작될 수 있는 것으로 가설화된다. 예비 시험관내 연구에서, Cas9:gRNA-결합된 복합체 내의 닉킹된 DNA 가닥은 주형으로서 결합된 gRNA를 사용하여 역전사를 실제로 프라이밍할 수 있다는 것이 확립되었다 (RT 효소는 트랜스로). 다음으로, 상이한 gRNA 링커, 프라이머 결합 부위, 및 합성 주형을 연구하여 시험관내에서 최적 설계 규칙을 결정할 것이다. 이어서, 트랜스로 또는 Cas9에 대한 융합체로서 작용하는 상이한 RT 효소가 시험관내에서 평가될 것이다. 마지막으로, 세포에서 효율적인 결합 및 절단 활성을 보유하는 조작된 gRNA 설계가 확인될 것이다. 이러한 목표의 성공적인 입증은 세포에서 돌연변이유발 가닥 합성을 수행하기 위한 토대를 제공할 것이다.
섹션 2
인간 세포에서 프라임 편집을 확립한다. DNA 프로세싱 및 복구 메카니즘에 기초하여, 돌연변이유발 DNA 가닥 (단일 가닥 플랩)이 표적 뉴클레오티드의 특이적이고 효율적인 편집을 지시하는데 사용될 수 있는 것으로 가설화된다. 예비 연구를 장려함에 있어서, 이러한 전략에 대한 실행가능성은 돌연변이유발 플랩을 함유하는 모델 플라스미드 기질에 의한 편집을 입증함으로써 확립되었다. 목표 1과 공동으로, 돌연변이유발 플랩의 길이, 서열 조성, 표적 뉴클레오티드 정체, 및 3' 말단을 체계적으로 변화시킴으로써 복구 결과를 추가로 평가할 것이다. 작은 1 내지 3개의 뉴클레오티드 삽입 및 결실이 또한 시험될 것이다. 병행하여, 그리고 목표 1로부터 구축하여, 융합 단백질 및 비-공유 동원 전략을 포함한 Cas9-RT 아키텍처가 평가될 것이다. Cas9-RT 아키텍처 및 연장된 gRNA는 인간 게놈 내의 다중 표적 부위에서 세포 편집에 대해 검정될 것이고, 이어서 높은 효율을 위해 최적화될 것이다. 성공적인 경우에, 이 목표는 기초 과학 적용을 위한 TPRT 게놈 편집 (즉, 프라임 편집)을 즉시 확립할 것이다.
섹션 3
배양된 인간 세포에서 병원성 돌연변이의 부위-특이적 편집을 달성한다. 이러한 기술의 잠재적 일반성은 BE에 의해 현재 교정가능하지 않은 전환 돌연변이 및 indel의 편집을 가능하게 할 수 있다. 목표 1 및 목표 2의 결과에 따라, 베타 글로빈에서의 겸상 적혈구 질환 창시자 돌연변이 (교정을 위해 A·T에서 T·A로의 전환이 필요함) 및 ATP7B에서의 가장 보편적인 윌슨병 돌연변이 (교정을 위해 G·C에서 T·A로의 전환이 필요함)를 포함한 병원성 전환 돌연변이가 배양된 인간 세포에서 표적화될 것이다. 낭성 섬유증을 유발하는 CFTR에서의 3-뉴클레오티드 ΔF508 결실을 포함한 작은 삽입 및 결실 돌연변이의 교정을 또한 검사할 것이다. 성공적인 경우에, 이는 이들 중요한 인간 질환을 다루는 강력한 치료 접근법을 개발하는 토대를 마련할 것이다.
접근법
목적은 표적화된 게놈 부위에 점 돌연변이를 직접 설치하는 게놈 편집 전략을 개발하는 것이다. 기술 개발 단계에서, 노력은 TPRT 기능성을 CRISPR/Cas 시스템 내로 혼입시키기 위한 단백질 및 RNA 조작에 포커스를 맞출 것이다. 시험관내 검정을 사용하여 기초부터 구축되는 TPRT의 각각의 단계의 기능을 주의깊게 프로빙할 것이다 (목표 1). 제2 포커스 영역은 모델 기질 및 조작된 CRISPR/Cas 시스템의 조합을 사용하여 포유동물 세포에서의 편집 결과를 평가할 것이다 (목표 2). 마지막으로, 적용 단계는 다른 방법에 의한 게놈 편집에 난치성인 돌연변이를 교정하기 위해 기술을 사용할 것이다 (목표 3).
일반적 편집 설계가 도 1a-1b에 제시된다. Cas9 닉카제는 HNH 뉴클레아제 도메인에 대한 불활성화 돌연변이를 함유하여 (Spy Cas9 H840A 또는 N863A), DNA 절단을 PAM 함유 가닥 (비-표적 가닥)으로 제한한다. 가이드 RNA (gRNA)는 역전사를 위한 주형을 함유하도록 조작된다 (설계는 슬라이드 5에서 상세화됨). gRNA의 5' 연장부가 제시되지만, 3' 연장부가 또한 구현될 수 있다. Cas9 닉카제는 C-말단 또는 N-말단을 통해 리버스 트랜스크립타제 (RT) 효소에 융합된다. gRNA:Cas9-RT 복합체는 관심 DNA 영역을 표적화하고, 비-표적 가닥을 대체한 후에 R 루프를 형성한다. Cas9는 비-표적 DNA 가닥을 닉킹한다. 닉킹된 가닥의 방출은 주형으로서 연장된 gRNA를 사용하여 역전사를 프라이밍하는데 적격인 유리 3'-OH 말단을 노출시킨다. 이러한 DNA 합성 반응은 융합된 RT 효소에 의해 수행된다. gRNA 주형은 편집을 위해 표적화된 뉴클레오티드를 제외하고는, 원래의 DNA 듀플렉스와 상동인 DNA 서열을 코딩한다. 역전사의 생성물은 목적하는 편집을 코딩하는 단일 가닥 DNA 플랩이다. 유리 3' 말단을 함유하는 이 플랩은 인접한 DNA 가닥과 평형화되어 5' 플랩 종을 생성할 수 있다. 후자의 종은 지체 가닥 DNA 합성 동안 오카자키 단편으로부터 5' 플랩을 자연적으로 절제하고, 긴-패치 염기 절제 복구 동안 발생하는 가닥 대체 합성 후에 5' 플랩을 제거하는 효소인 FEN1 (플랩 엔도뉴클레아제1)에 대한 효율적인 기질로서의 역할을 하는 것으로 가설화된다. 닉킹된 DNA의 라이게이션은 미스매치된 염기 쌍을 생성한다. 이 중간체는 원래의 염기 쌍으로의 복귀 또는 미스매치 복구 (MMR) 과정을 통한 목적하는 편집된 염기 쌍으로의 전환을 겪을 수 있다. 대안적으로, 반보존적 DNA 복제는 각각의 복귀 및 편집의 1개의 카피를 생성할 수 있다.
1. 돌연변이유발 DNA 가닥의 가이드 RNA-주형화된 역전사를 확립한다.
배경 및 근거
제안된 게놈 편집 전략에서, Cas9-닉킹된 비-표적 DNA 가닥 (R-루프를 형성하는 PAM-함유 가닥)은 DNA 합성을 위한 프라이머로서 작용한다. 이는 생화학적 및 구조적 데이터의 여러 조각에 기초하여 가능한 것으로 가설화된다. 뉴클레아제 보호 실험32, 결정학적 연구33, 및 염기 편집 윈도우4,24는 Cas9-결합된 복합체의 소위 R-루프 내에서 비-표적 가닥 뉴클레오티드 -20 내지 -10에 대한 큰 정도의 유연성 및 불규칙성을 입증하였다 (넘버링은 제1 PAM 뉴클레오티드로부터 5' 거리를 나타냄). 또한, 절단된 비-표적 가닥의 PAM-원위 부분은 상보적 ssDNA가 트랜스로 부가될 경우 치밀하게 결합된 3원 복합체로부터 대체될 수 있다20. 이들 연구는 비-표적 가닥이 고도로 유연하고, 효소에 접근가능하고, 닉킹 후에 PAM-원위 단편의 3' 말단이 Cas9 해리 전에 방출된다는 것을 지지한다. 또한, gRNA는 DNA 합성의 주형화를 위해 연장될 수 있는 것으로 가설화된다. 선행 연구는 SpCas9, SaCas9, 및 LbCas12a (이전에 Cpf1)에 대한 gRNA가 RNA 압타머34, 리간드-유도성 자기-절단 리보자임35, 및 긴 비-코딩 RNA36를 갖는 gRNA 연장부를 용인한다는 것을 제시하였다. 이 문헌은 이용될 2가지 주요 특색에 대한 선례를 확립한다. 이 전략을 평가하는데 있어서, 여러 CRISPR-Cas 시스템은 시험관내 및 세포 검정의 조합을 사용하여 5' 및 3' 연장된 gRNA 설계와 함께 평가될 것이다 (도 2a-2c).
TRT 편집을 위한 조작된 gRNA에 대한 설계는 도 3a-3b에 제시된다. DNA 합성은 5'에서 3'으로 진행되고, 따라서 RNA 주형을 3'에서 5' 방향으로 카피한다. 5' 연장부를 위한 설계는 링커 영역, 닉킹된 DNA 가닥이 어닐링되는 프라이머 결합 부위, 및 역전사에 의한 DNA 합성을 위한 주형을 함유한다. 3' 연장된 gRNA는 프라이머 결합 부위 및 역전사 주형을 함유한다. 일부 경우에, gRNA 코어의 3' RNA 헤어핀은 DNA 표적 서열과 매칭되도록 변형되는데, 이는 시험관내 실험이 역전사가 3' 연장된 gRNA 구축물의 경우에 gRNA 코어 내로 ~3개의 뉴클레오티드를 연장시킨다는 것을 보여주었기 때문이다 (헤어핀 RNA 구조를 유지하는 보상적 변화가 이루어지는 한, 헤어핀 서열의 변형은 잘 용인되는 것으로 보임). DNA 합성은 5'에서 3'으로 진행되고, 뉴클레오티드는 성장하는 DNA 가닥의 3' OH에 부가된다.
예비 결과
Cas9 닉킹된 DNA는 gRNA 주형의 역전사를 프라이밍한다. 닉킹된 비-표적 DNA 가닥의 접근성을 평가하기 위해, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제 (SpCas9) 및 Cy5 형광 표지된 듀플렉스 DNA 기질 (51개 염기 쌍)을 사용하여 시험관내 생화학적 검정을 수행하였다. 먼저, 다양한 합성 주형 길이를 갖는 5' 연장부를 함유하는 일련의 gRNA를 시험관내 전사에 의해 제조하였다 (전체 설계는 도 2b에 제시됨). 뉴클레아제 기능상실 Cas9 (dCas9)를 사용한 전기영동 이동성 변화 검정 (EMSA)은 5' 연장된 gRNA가 표적 결합 친화도를 유지한다는 것을 확립하였다 (데이터는 제시되지 않음). 다음으로, dCas9, 5'-연장된 gRNA, 및 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV) 리버스 트랜스크립타제 (슈퍼스크립트 III)를 사용하여 사전-닉킹된 Cy5-표지된 듀플렉스 DNA 기질 상에서 TPRT 활성을 시험하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후에, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 생성물을 평가하고, Cy5 형광을 사용하여 영상화하였다 (도 4a). 각각의 5'-연장된 gRNA 변이체는 유의한 생성물 형성으로 이어졌고, 관찰된 DNA 생성물 크기는 연장부 주형의 길이와 일치하였다 (도 4b). 중요한 것으로, dCas9의 부재 하에, 사전-닉킹된 기질이 DNA 기질의 전장 51-bp 길이까지 연장되었으며, 이는 gRNA가 아닌 상보적 DNA 가닥이 dCas9가 존재하지 않는 경우에 DNA 합성을 위한 주형으로서 사용되었음을 강하게 시사한다 (도 4c). 시스템은 새로 합성된 DNA 가닥이 표적 부위 편집에 요구될 생성물 (단일 뉴클레오티드 변화를 갖는 상동 가닥)을 반영하도록 설계되었음에 주목한다. 이 결과는 Cas9:gRNA 결합이 닉킹된 비-표적 가닥의 3' 단부를 노출시키고, 비-표적 가닥이 역전사에 접근가능하다는 것을 확립한다.
다음으로, 비-표적 DNA 가닥을 닉킹하는 Cas9(H840A) 돌연변이체를 사용하여 비-닉킹된 dsDNA 기질을 평가하였다. 먼저, 5'-연장된 gRNA와 함께 Cas9(H840A) 닉카제 활성을 시험하기 위해, 이전에 기재된 바와 같이 시험관내 절단 검정을 수행하였다37. 닉킹은 표준 gRNA와 비교하여 손상되었지만, 상당한 절단 생성물이 형성되었다 (도 4d). 중요한 것으로, 5'-연장된 gRNA 및 Cas9(H840A)를 이용하여 TPRT 반응을 수행한 경우에도, 아마도 감소된 닉킹 활성에 의해 설명될 비록 보다 낮은 수율이기는 하지만, RT 생성물이 관찰되었다 (도 4d). 이 결과는 5'-연장된 gRNA:Cas9(H840A) 복합체가 DNA를 닉킹하고 역전사의 주형이 될 수 있다는 것을 확립한다.
마지막으로, 3' gRNA 연장부를 Cas9(H840A) 닉킹 및 TPRT에 대해 평가하였다. 5'-연장된 gRNA와 비교하여, 3'-연장된 gRNA에 의한 DNA 절단은 표준 gRNA와 비교하여 어떠한 검출가능한 정도로 손상되지 않았다. 유의하게, 3'-연장된 gRNA 주형은 또한 M-MLV RT가 트랜스로 공급된 경우에 사전-닉킹된 것 및 무손상 듀플렉스 DNA 기질 둘 다에 의한 효율적인 역전사를 지지하였다 (도 4e). 놀랍게도, 3'-연장된 주형에 대해 단일 생성물만이 관찰되었으며, 이는 역전사가 gRNA 스캐폴드를 따라 특정 위치에서 종결된다는 것을 나타낸다. 말단 트랜스퍼라제에 의한 생성물의 단독중합체 테일링에 이은 클레나우 연장 및 생어 서열분석은 전장 gRNA 합성 주형이 gRNA 코어의 말단 3개 뉴클레오티드에 더하여 카피되었음을 밝혀내었다. 향후, 플랩 말단은 말단 gRNA 서열을 변형시키는 것에 의해 재프로그램화될 것이다38,39. 이러한 결과는 3'-연장된 gRNA가 효율적인 뉴클레아제 표적화 가이드로서의 역할을 할 수 있고, 역전사의 주형이 될 수 있다는 것을 입증한다.
Cas9-TPRT는 닉킹된 DNA 및 gRNA를 시스로 사용한다. 이중 색상 실험을 사용하여 RT 반응이 gRNA와 시스로 (동일한 복합체에서 결합됨) 우선적으로 발생하는지 결정하였다 (도 8 참조). 5'-연장된 gRNA 및 3'-연장된 gRNA에 대해 2개의 별개의 실험을 수행하였다. 주어진 실험을 위해, dCas9, gRNA, 및 DNA 기질의 3원 복합체를 별개의 튜브에서 형성하였다. 하나의 튜브에서, gRNA는 긴 RT 생성물을 코딩하고, DNA 기질은 Cy3 (적색)으로 표지되고; 다른 튜브에서, gRNA는 짧은 RT 생성물을 코딩하고, DNA 기질은 Cy5 (청색)로 표지된다. 짧은 인큐베이션 후에, 복합체를 혼합한 다음, RT 효소 및 dNTP로 처리하였다. 생성물을 우레아-변성 PAGE에 의해 분리하고, Cy3 및 Cy5 채널에서 형광에 의해 가시화하였다. 반응 생성물은 DNA 기질과 사전-복합체화된 gRNA 주형을 사용하여 우선적으로 형성되는 것으로 확인되었고, 이는 RT 반응이 시스로 발생할 가능성이 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 단일 Cas9:gRNA 복합체가 DNA 부위를 표적화하고, 돌연변이유발 DNA 가닥의 역전사의 주형이 될 수 있음을 지지한다.
다른 Cas 시스템을 사용한 TPRT 시험
에스. 아우레우스로부터의 Cas9 및 엘. 박테리움(L. bacterium)으로부터의 Cas12a를 포함한 다른 Cas 시스템을 사용하여 이전 섹션에 제시된 것과 유사한 실험을 수행할 것이다 (도 2a-2c 참조). TRPT가 또한 이들 Cas 변이체에 대해 입증될 수 있는 경우에, 세포에서의 잠재적 편집 범주 및 전반적 성공 가능성은 증가할 것이다.
RT-Cas9 융합 단백질을 사용한 TPRT 시험
일련의 상업적으로 입수가능하거나 정제가능한 RT 효소는 먼저 TPRT 활성에 대해 트랜스로 평가될 것이다. M-MLV로부터의 이미 시험된 RT에 더하여, 조류 골수모구증 바이러스 (AMV), 게오바실루스 스테아로써모필루스 군 II 인트론 (GsI-IIC)41,42, 및 유박테리움 렉탈레 군 II 인트론 (Eu.re.I2)43,44으로부터의 RT가 평가될 것이다. 유의하게, 후자의 2개의 RT는 그의 천연 생물학적 상황에서 TPRT를 수행한다. 관련된 경우에, RNAse 불활성화 돌연변이 및 다른 잠재적으로 유익한 RT 효소 변형이 시험될 것이다. 기능적 RT가 트랜스로 공급된 경우에 확인되면, 각각은 Cas9 변이체에 대한 융합 단백질로서 평가될 것이다. N-말단 및 C-말단 융합 배향 둘 다가 다양한 링커 길이 및 아키텍처와 함께 시험될 것이다. RT 효소를 시스로 사용하여 TPRT가 발생할 수 있는지를 동역학적 시간 경과 실험을 사용하여 결정할 것이다. 효율적인 TPRT 화학을 가능하게 하는 RT-Cas9 융합 아키텍처가 구축될 수 있는 경우에, 이는 세포와 관련하여 기능적 편집의 가능성을 크게 증가시킬 것이다.
세포에서 조작된 gRNA를 사용한 Cas9 표적화
이전의 하위-목표에서 개발된 후보 조작된 gRNA를 인간 세포 배양 실험 (HEK293)에서 평가하여 Cas9 표적화 효율을 확인할 것이다. 야생형 SpCas9를 사용하는 확립된 indel 형성 검정을 사용하여45, 조작된 gRNA를 인간 게놈 내의 5개 이상의 부위에 걸쳐 표준 gRNA와 나란히 비교할 것이다. 게놈 편집 효율은 실험실에 수용된 일루미나 MiSeq 플랫폼을 사용하여 멀티플렉스에서의 앰플리콘 서열분석에 의해 특징화될 것이다. 본 섹션 및 선행 섹션으로부터의 결과는 설계-구축-시험 주기의 후속 반복에 대한 정보를 제공하는 통찰을 생성할 것으로 예상되며, 여기서 gRNA는 세포에서 역전사의 주형이 되는 것 및 효율적인 Cas9 표적화 둘 다에 대해 최적화될 수 있다.
시험관내 검증의 결과를 도 5-7에 제시한다. 시험관내 실험은 닉킹된 비-표적 DNA 가닥이 유연하고, DNA 합성을 프라이밍하는데 이용가능하며, gRNA 연장부가 역전사를 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있음을 입증하였다 (도 5 참조). 이 실험 세트는 다양한 길이의 합성 주형 (좌측에 열거됨)을 갖는 5'-연장된 gRNA (도 3a-3b에 제시된 바와 같이 설계됨)를 사용하였다. 형광 표지된 (Cy5) DNA 표적을 기질로서 사용하였고, 이 실험 세트에서 사전-닉킹하였다. 이들 실험에 사용된 Cas9는 촉매 기능상실 Cas9 (dCas9)이므로, DNA를 절단할 수 없지만, 여전히 효율적으로 결합할 수 있다. 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 유래된 상업적 RT인 슈퍼스크립트 III은 트랜스로 공급되었다. 먼저, 정제된 성분으로부터 dCas9:gRNA 복합체를 형성하였다. 이어서, 형광 표지된 DNA 기질을 dNTP 및 RT 효소와 함께 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후에, 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 반응 생성물을 분석하였다. 겔 영상은 역전사 주형의 길이와 일치하는 길이까지의 원래의 DNA 가닥의 연장을 보여준다. dCas9의 부재 하에 수행된 반응은 사용된 gRNA와 상관없이 길이 51개 뉴클레오티드의 DNA 생성물을 생산하였음에 주목한다. 이 생성물은 RNA가 아닌 DNA 합성을 위한 주형으로서의 상보적 DNA 가닥의 사용에 상응한다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, Cas9 결합은 DNA 합성을 RNA 주형으로 지시하는데 요구된다. 이러한 세트의 시험관내 실험은, DNA 기질이 사전-닉킹되지 않고 Cas9 닉카제 (SpyCas9 H840A 돌연변이체)가 사용된 것을 제외하고, 도 5에 제시된 것과 밀접하게 대응한다. 겔에 제시된 바와 같이, 닉카제는 표준 gRNA가 사용된 경우에 (gRNA_0, 레인 3) DNA 가닥을 효율적으로 절단한다. 다중 절단 생성물이 관찰되며, 이는 SpyCas9의 이전의 생화학적 연구와 일치한다. 5' 연장부는 닉킹 활성을 손상시키지만 (레인 4-8), 일부 RT 생성물은 여전히 관찰된다. 도 7은 3' 연장부가 DNA 합성을 지지하고 Cas9 닉카제 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 사전-닉킹된 기질 (흑색 화살표)은 dCas9 또는 Cas9 닉카제가 사용된 경우 RT 생성물로 거의 정량적으로 전환된다 (레인 4 및 5). RT 생성물 (적색 화살표)로의 50% 초과의 전환이 전장 기질에 의해 관찰된다 (레인 3). RT 생성물의 길이 및 서열을 결정하기 위해, 겔로부터 생성물 밴드를 절제하고, 추출하고, 서열분석하였다. 이는 RT가 gRNA 코어의 3' 말단 헤어핀 내로 3개의 뉴클레오티드를 연장시켰음을 밝혀내었다. 후속 실험 (제시되지 않음)은 헤어핀 RNA 구조를 유지하는 상보적 변화가 이루어지는 한, 이들 3개의 뉴클레오티드는 표적 DNA 서열과 매칭되도록 변화될 수 있다는 것을 입증하였다.
잠재적 어려움 및 대안
(1) RT는 융합체로서 기능하지 않는다: 분자 밀집 및/또는 불리한 기하구조는 Cas9-융합된 RT 효소에 의한 폴리머라제 연장을 방해할 수 있다. 먼저, 링커 최적화를 시험할 수 있다. DNA 프라이머, gRNA, 및 RT 효소 사이의 공간적 관계를 재배향시킬 수 있는 Cas9의 원형 순열 변이체를 평가할 것이다. 목표 2에 상술된 바와 같은 비-공유 RT 동원 전략을 시험할 수 있다. (2) 연장된 gRNA 변이체에 의한 감소된 Cas 표적화 효율: 이는 5'-연장된 gRNA에 대한 이슈일 가능성이 가장 크다. 구조적 데이터에 기초하여24, Cas9 돌연변이체를 설계하고 스크리닝하여 gRNA 연장부를 보다 크게 용인하는 변이체를 확인할 수 있다. 또한, gRNA 라이브러리는 표적화 활성을 개선시키는 링커에 대해 세포에서 스크리닝될 수 있다.
유의성
이들 예비 결과는 Cas9 닉카제 및 연장된 gRNA가 트랜스로 공급된 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 결합된 DNA 표적 상에서 표적-프라이밍된 역전사를 개시할 수 있다는 것을 확립한다. 중요한 것으로, Cas9 결합은 생성물 형성에 결정적으로 중요한 것으로 밝혀졌다. 아마도 세포에서의 게놈 편집을 위한 절대 요건은 아니지만, RT 효소 기능을 시스로 혼입시키는 시스템의 추가의 개발은 세포-기반 적용에서 성공 가능성을 유의하게 증가시킬 것이다. 이러한 목표의 나머지 측면의 달성은 인간 게놈과 관련하여 정밀 게놈 편집을 수행하기 위한 분자적 토대를 제공할 것이다.
2. 인간 세포에서 프라임 편집을 확립한다.
배경 및 근거
제안된 전략에서, 조작된 RT-Cas9:gRNA 복합체는 게놈 표적 부위에 돌연변이유발 3' DNA 플랩을 도입할 것이다. 단일 미스매치를 함유하는 돌연변이유발 3' 플랩은 우선적으로 제거될 인접한 5' 플랩과의 에너지적으로 접근가능한 평형을 통해 DNA 복구 기구에 의해 혼입될 것으로 가설화된다 (도 1c-1d). DNA 복제 및 복구 기구는 오카자키 단편을 프로세싱할 때46 및 긴-패치 염기 절제 복구 (LP-BER) 동안47 5' ssDNA 플랩과 마주친다. 5' 플랩은 동종삼량체 슬라이딩 클램프 복합체 PCNA에 의해 DNA 복구 부위로 동원되는, 광범위하게 발현되는 플랩 엔도뉴클레아제 FEN1에 대한 바람직한 기질이다48. PCNA는 또한 DNA 리가제 Lig1을 포함한 다른 복구 인자의 동시 동원을 위한 스캐폴드로서의 역할을 한다49. '툴벨트'로서 작용하여, PCNA는 모든 세포 분열 동안 생성된 수백만개의 오카자키 단편을 프로세싱하는데 필수적인 연속 플랩 절단 및 라이게이션을 가속화한다50,51. 이들 천연 DNA 중간체에 대한 유사성에 기초하여, 돌연변이유발 가닥은 5' 플랩과의 평형을 통해 혼입된 다음, 배위된 5' 플랩 절제 및 라이게이션이 이어질 것으로 가설화된다. 이어서, 미스매치 복구 (MMR)가 어느 하나의 가닥 상에서 동등한 확률로 발생하여, 편집 또는 복귀로 이어질 것이다 (도 1c-1d). 대안적으로, DNA 복제가 먼저 일어날 수 있고, 새롭게 합성된 딸 가닥에서의 편집의 혼입으로 직접 이어질 수 있다. 이 과정으로부터의 최고 예상 수율은 50%이지만, 다중 기질 편집 시도는 편집 복구의 비가역성으로 인해 반응을 완료쪽으로 구동할 수 있다.
예비 결과
DNA 플랩은 효모 및 HEK 세포에서 플라스미드 모델 기질에서 부위-특이적 돌연변이유발을 유도한다. 제안된 편집 전략을 시험하기 위해, TPRT의 생성물과 유사한 돌연변이유발 3' 플랩을 함유하는 모델 플라스미드 기질을 사용하여 연구를 개시하였다. GFP와 mCherry 사이의 정지 코돈을 코딩하는 이중 형광 단백질 리포터를 생성하였다. 돌연변이유발 플랩은 정지 코돈에 대한 교정을 코딩하여 (도 9a), mCherry 합성을 가능하게 한다. 따라서, 돌연변이유발 효율은 GFP:mCherry 비에 의해 정량화될 수 있다. 플라스미드 기질을 시험관내에서 제조하고, 효모 (에스. 세레비지아에) 또는 인간 세포 (HEK293) 내로 도입하였다. 둘 다의 시스템에서 높은 빈도의 돌연변이유발이 관찰되었고 (도 9b), 단리된 효모 콜로니는 복귀된 염기, 돌연변이된 염기, 또는 둘 다의 생성물의 혼합물을 함유하였다 (도 9c). 후자의 검출은 이들 경우에 플라스미드 복제가 MMR 전에 일어났음을 시사하고, 추가로 플랩 절제 및 라이게이션이 MMR에 선행함을 시사한다. 이 결과는 3' 돌연변이유발 가닥을 사용한 DNA 편집의 실행가능성을 확립한다.
Figure pct00362
모델 플랩 기질을 이용한 체계적인 연구
상기 기재된 예비 결과에 기초하여, 효율적인 편집의 원리를 추론하기 위해 보다 넓은 스펙트럼의 플랩 기질이 HEK 세포에서 평가될 것이다. 3' ssDNA 플랩은 미스매치 쌍 형성의 영향, 플랩을 따른 돌연변이유발 뉴클레오티드의 위치, 및 말단 뉴클레오티드의 정체를 결정하기 위해 체계적으로 달라질 것이다 (도 9d). 단일 뉴클레오티드 삽입 및 결실이 또한 시험될 것이다. 앰플리콘 서열분석은 편집 정밀도를 분석하기 위해 사용될 것이다. 이들 결과는 gRNA 역전사 주형의 설계에 대한 정보를 제공하는 것을 도울 것이다.
플라스미드 기질 상의 시험관내 TPRT는 효율적인 편집 결과로 이어진다. 목표 1에서 개발된 TPRT 반응을 사용하여 플라스미드 기질 내에서 돌연변이유발을 유도하였다. 반응을 원형 DNA 플라스미드 기질 상에서 수행하였다 (도 10 참조). 이는 이전의 시험관내 실험에서 RT 연장을 위한 메카니즘으로서 DNA 가닥 해리의 가능성을 배제한다. 이는 또한 세포에서 플랩 기질의 DNA 복구의 시험을 가능하게 하였다. 효모 (에스. 세레비지아에) 발현을 위해 이중-형광 리포터 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드는 개재 정지 코돈 (TGA)을 갖는 GFP (녹색 형광 단백질) 및 mCherry (적색 형광 단백질)를 코딩한다. 효모에서의 이러한 구축물의 발현은 GFP만을 생산한다. 플라스미드를 시험관내 TRT [Cas9(H840A) 닉카제, 조작된 gRNA, MLV RT 효소, dNTPS]에 대한 기질로서 사용하였다. gRNA 연장부는 정지 코돈에 대한 돌연변이를 코딩한다. 플랩 가닥은 정지 코돈의 복구에 사용되고, 융합 단백질로서 GFP 및 mCherry 둘 다를 발현하는 플라스미드를 생산할 것으로 예상된다. 효모 이중-FP 플라스미드 형질전환체를 도 10에 제시한다. 모 플라스미드 또는 시험관내 Cas9(H840A) 닉킹된 플라스미드의 형질전환은 녹색 GFP 발현 콜로니만을 생성한다. 5'-연장된 또는 3'-연장된 gRNA와의 TRT 반응은 녹색 및 황색 콜로니의 혼합물을 생산한다. 후자는 GFP 및 mCherry 둘 다를 발현한다. 보다 많은 황색 콜로니가 3'-연장된 gRNA에 의해 관찰된다. 정지 코돈을 함유하지 않는 양성 대조군이 또한 제시된다.
이 결과는 긴 이중 가닥 기질이 TPRT를 겪을 수 있고, TPRT 생성물이 진핵 세포에서 편집을 유도한다는 것을 확립한다.
상기 프라임 편집 실험과 유사한 또 다른 실험을 수행하였지만, 정지 코돈에 점 돌연변이를 설치하는 대신, TRT 편집은 프레임시프트 돌연변이를 복구하고 하류 mCherry의 합성을 가능하게 하는 단일 뉴클레오티드 삽입 (좌측) 또는 결실 (우측)을 설치한다 (도 11 참조). 둘 다의 실험은 3' 연장된 gRNA를 사용하였다. TRT 형질전환으로부터의 개별 콜로니를 선택하고, 생어 서열분석에 의해 분석하였다 (도 12 참조). 녹색 콜로니는 원래의 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 함유한 반면, 황색 콜로니는 TRT 편집 gRNA에 의해 설계된 정확한 돌연변이를 함유하였다. 다른 점 돌연변이 또는 indel은 관찰되지 않았다.
RT-Cas9 아키텍처를 사용한 HEK 세포에서의 프라임 편집의 확립
이전의 목표로부터 최적화된 구축물은 인간 게놈 내의 표적화된 부위에서 포유동물 발현 및 편집을 위해 적합화될 것이다. 2차 gRNA (닉킹을 방지하기 위해 말단절단됨)로의 인접한 표적화에 더하여, 다중 RT 효소 및 융합 아키텍처가 시험될 것이다. 비-공유 RT 동원이 또한 선-태그 시스템52 및 MS2 압타머 시스템53을 사용하여 평가될 것이다. 표준 gRNA 및 RT-Cas9 융합체 (상기와 같음)를 사용한 표적화 효율을 평가하기 위해 Indel 형성 검정이 사용될 것이다. 이어서, 각각의 게놈 부위에 대해, 연장된 gRNA 및 RT-Cas9 쌍을 단일 뉴클레오티드 편집에 대해 검정할 것이다. 편집 결과는 MiSeq로 평가될 것이다.
HEK 세포에서의 초기 실험을 Cas9-RT 융합체를 사용하여 수행하였다. 세포 내에서 발현된 성분에 의한 편집은 Cas9(H840A) 닉카제, 리버스 트랜스크립타제 (융합체로서 발현되거나 또는 트랜스로 공급됨), 및 3' 연장부를 갖는 조작된 gRNA를 필요로 한다 (도 14 참조). 예비 연구는 gRNA 연장부 내의 프라이머 결합 부위의 길이가 인간 세포에서 편집 효율을 증가시키는데 중요함을 나타내었다 (도 15 참조).
HEK 세포에서의 프라임 편집 파라미터의 최적화
세포에서 프라임 편집을 수행할 수 있는 Cas9-RT 아키텍처를 확인한 후에, 고효율 편집을 달성하도록 성분 및 설계가 최적화될 것이다. 코딩된 점 돌연변이의 위치 및 뉴클레오티드 정체, 및 새로 합성된 DNA 가닥의 총 길이는 편집 범주 및 잠재적 제한을 평가하기 위해 달라질 것이다. 짧은 삽입 및 결실 돌연변이가 또한 평가될 것이다. 단백질 발현 구축물은 코돈 최적화될 것이다. 성공적인 경우에, 이는 포유동물 세포에서의 효율적인 프라임 편집을 확립할 것이다.
예비 결과. 융합된 RT 효소에 의한 분자내 역전사가 가능하지 않은 경우에, 편집 유전자좌에서 RT 효소를 보다 높은 국부 농도로 만들기 위해 추가의 gRNA를 설계하였다. 이들 보조 가이드는 5' 단부 (14-15 nt 스페이서)에서 말단절단되며, 이는 이전에 Cas9 절단을 방지하지만 결합은 보유하는 것으로 제시된 바 있다 (도 16 참조). HEK3 유전자좌를 선택하여 이 전략을 연구하였다.
잠재적 어려움 및 대안
1) 세포에서의 gRNA 분해: 연장된 gRNA 말단이 세포에서 말단절단된 경우에, 안정화 2차 구조가 설치될 수 있거나, 또는 안정화 변형을 갖는 합성 gRNA가 시험될 수 있다. (2) 인간 세포에서 관찰된 편집 없음: 인접한 게놈 부위에 대한 RT-Cas9 융합체의 2차 표적화를 포함한 추가의 전략이 연구될 것이다54. 또한, 이. 콜라이 또는 에스. 세레비지아에에서 잠재적 방향적 진화 전략이 연구될 수 있다.
유의성
프라임 편집이 실험 세포주에서 확립될 수 있다면, 이는 인간 유전자에서 다수의 점 돌연변이의 신속한 생성 및 특징화를 가능하게 함으로써 기초 생의학 연구에 즉각적인 영향을 미칠 것이다. 방법의 일반성, 및 염기 편집제에 관한 그의 직교 편집 윈도우는 많은 현재의 접근불가능한 돌연변이를 설치하기 위한 접근법을 제공할 것이다. 더욱이, 프라임 편집이 높은 효율 및 생성물 순도를 위해 최적화될 수 있다면, 다른 인간 세포 유형에서 질환 돌연변이를 교정하는 그의 잠재적 적용가능성은 유의할 것이다.
3. 배양된 인간 세포에서 병원성 돌연변이의 부위-특이적 편집을 달성한다.
배경 및 근거.
다수의 병원성 돌연변이는 PAM 제한, 또는 전환 또는 indel 돌연변이 교정에 대한 필요로 인해 현재의 염기 편집제에 의해 교정될 수 없다. 프라임 편집에 의하면, 모든 전이 및 전환은 작은 삽입 및 결실일 수 있기 때문에 이론적으로 가능하다. 더욱이, PAM과 관련하여, 프라임 편집 윈도우 (예상 -3 내지 +4)는 염기 편집제의 것 (-18 내지 -12)과 구별된다 (도 13). 염기 편집제에 의해 현재 교정가능하지 않은 멘델 상태는 (1) 헤모글로빈 베타에서의 겸상 적혈구 질환 Glu6Val 창시자 돌연변이 (A·T에서 T·A로의 전환을 필요로 함); (2) ATP7B에서의 가장 흔한 윌슨병 변이체 His1069Gln (G·C에서 T·A로의 전환을 필요로 함); 및 (3) 낭성 섬유증을 유발하는 CFTR에서의 ΔPhe508 돌연변이 (3-뉴클레오티드 삽입을 필요로 함)를 포함한다. 이들 표적 각각은 SpCas9 표적화 및 프라임 편집을 위해 적절하게 위치한 PAM을 함유한다.
예비 결과.
Figure pct00363
HEK3 세포에서의 T에서 A로의 편집은 현행 염기 편집에 의해 달성가능하지 않지만, TRPT 편집에 의해서는 달성가능하다 (도 17a-17c 참조).
도 17a는 인간 배아 신장 (HEK) 세포에서의 성분의 형질감염 후 표적 뉴클레오티드에서의 % T에서 A로의 전환을 나타내는 그래프를 보여준다. 이 데이터는 Cas9(H840A) 닉카제 (32-아미노산 링커)에 대한 야생형 MLV 리버스 트랜스크립타제의 N-말단 융합을 사용한 결과를 제시한다. 편집 효율은 프라이머 결합 부위의 길이가 7개 뉴클레오티드에서 11 또는 12개 뉴클레오티드로 연장된 경우에 현저하게 개선되었다. 추가적으로, 편집 유전자좌의 바로 상류에 위치하는 보조 가이드 A (도 16 참조)는, 특히 보다 짧은 길이의 프라이머 결합 부위에 대해 편집 활성을 유의하게 개선시킨다. 편집 효율을 일루미나 MiSeq 플랫폼을 사용하여 앰플리콘 서열분석에 의해 정량화하였다. 도 17b도 또한 인간 배아 신장 (HEK) 세포에서의 성분의 형질감염 후 표적 뉴클레오티드에서의 % T에서 A로의 전환을 보여주지만, 이 데이터는 RT 효소의 C-말단 융합을 사용한 결과를 제시한다. 여기서, 보조 가이드 A는 그만큼의 효과를 갖지 않고, 편집 효율이 전체적으로 더 높다. 도 17c는 도 17a에서 사용된 것과 유사한 Cas9(H840A) 닉카제에 대한 야생형 MLV 리버스 트랜스크립타제의 N-말단 융합을 사용한 결과를 제시하는 데이터를 보여주지만; MLV RT와 Cas9 사이의 링커는 32개 아미노산 대신 60개 아미노산 길이이다.
Figure pct00364
TRPT 편집 결과에 의한 HEK3 부위에서의 T에서 A로의 편집은 높은 순도를 나타낸다.
도 18은 고처리량 앰플리콘 서열분석에 의한 서열 분석의 산출을 보여준다. 산출은 편집된 세포의 가장 풍부한 유전자형을 나타낸다. 어떠한 주요 indel 생성물도 수득되지 않고, 목적하는 점 돌연변이 (T에서 A로)는 방관자 편집 없이 깔끔하게 설치됨에 주목한다. 제1 서열은 참조 유전자형을 보여준다. 상단의 2개의 생성물은 내인성 다형성 (G 또는 A)을 함유하는 출발 유전자형이다. 하단의 2개의 생성물은 정확하게 편집된 유전자형을 나타낸다.
Figure pct00365
MLV RT 돌연변이체는 편집을 개선시킨다.
문헌 [Baranauskas, et al., (doi:10.1093/protein/gzs034)]에 기재된 돌연변이체 리버스 트랜스크립타제를 인간 배아 신장 (HEK) 세포에서 표적 뉴클레오티드 편집을 위한 Cas9(H840A) 닉카제에 대한 C-말단 융합체로서 시험하였다. Cas9-RT 편집제 플라스미드를 역전사의 주형이 되는 3'-프라임 편집 가이드 RNA를 코딩하는 플라스미드와 함께 공동-형질감염시켰다. 표적 뉴클레오티드에서의 편집 효율 (청색 막대)을 도 19에서 indel 비율 (오렌지색 막대)과 함께 제시한다. WT는 야생형 MLV RT 효소를 지칭한다. 돌연변이체 효소 (M1 내지 M4)는 우측에 열거된 돌연변이를 함유한다. 편집 속도를 게놈 DNA 앰플리콘의 고처리량 서열분석에 의해 정량화하였다.
제2 gRNA에 의한 상보적 가닥 닉킹은 편집을 개선시킨다.
이 실험은 단일 가닥 닉이 표적 뉴클레오티드에 근접한 상보적 DNA 가닥에 도입되는 경우의 표적 뉴클레오티드의 편집 효율을 평가하며, 이는 미스매치 복구를 지시하여 원래의 뉴클레오티드를 우선적으로 제거하고 염기 쌍을 목적하는 편집으로 전환시킬 것으로 가설화된다. Cas9(H840A)-RT 편집 구축물을 2개의 가이드 RNA 코딩 플라스미드와 함께 공동-형질감염시켰고, 그 중 하나는 역전사 반응의 주형이 되고, 다른 것은 닉킹을 위한 상보적 DNA 가닥을 표적화한다. 표적 뉴클레오티드로부터 다양한 거리에서 닉킹을 시험하였다 (오렌지색 삼각형) (도 20 참조). 표적 염기 쌍 (청색 막대)에서의 편집 효율은 indel 형성 속도 (오렌지색 막대)와 함께 제시된다. "부재" 예는 상보적 가닥 닉킹 가이드 RNA를 함유하지 않는다. 편집 속도를 게놈 DNA 앰플리콘의 고처리량 서열분석에 의해 정량화하였다.
도 21은 목적하는 T에서 A로의 전환 돌연변이 및 다른 주요 게놈 편집 부산물의 일반적 부재를 보여주는 프로세싱된 고처리량 서열분석 데이터를 보여준다.
범주. 새로운 편집 기술에 대한 잠재적 범주를 도 13에 제시하며, 이를 데아미나제-매개된 염기 편집제 기술과 비교한다. 이전에 개발된 염기 편집제는 PAM의 ~15 ± 2 bp 상류 영역을 표적화한다. 표적 C 또는 A 뉴클레오티드를 각각 T 또는 G로 전환시킴으로써, 이전에 개발된 염기 편집제는 모든 전이 돌연변이 (A:T에서 G:C로의 전환)를 가능하게 한다. 그러나, 이전에 개발된 염기 편집제는 전환 돌연변이 (A에서 T로, A에서 C로, G에서 T로, G에서 C로, T에서 A로, T에서 G로, C에서 A로, C에서 G로)를 설치할 수 없다. 더욱이, 편집 윈도우에 다중 표적 뉴클레오티드가 존재하는 경우에, 추가의 바람직하지 않은 편집이 발생할 수 있다.
새로운 프라임 편집 기술은 이론적으로 임의의 뉴클레오티드 및 염기 쌍 전환, 및 또한 잠재적으로 작은 삽입 및 결실 편집을 설치할 수 있다. PAM과 관련하여, 프라임 편집 윈도우는 DNA 닉킹 부위 (PAM의 3개 염기 상류)에서 시작하고, PAM의 아직 결정되지 않은 위치 하류에서 끝난다. 이러한 편집 윈도우는 데아미나제 염기 편집제의 편집 윈도우와 구별됨에 주목한다. TPRT 시스템은 DNA 폴리머라제 효소를 사용하여 편집을 수행하기 때문에, 이는 잠재적으로 일반성, 정밀도, 및 충실도를 포함한 모든 그의 이익을 갖는다.
환자-유래 세포주에서 병원성 돌연변이를 교정한다.
관련 돌연변이를 보유하는 세포주 (겸상 적혈구 질환: CD34+ 조혈 줄기 세포; 윌슨병: 배양된 섬유모세포; 낭성 섬유증: 배양된 기관지 상피)는 ATCC, 코리엘 바이오뱅크(Coriell Biobank), 또는 협력 하버드/브로드(Harvard/Broad) 제휴 실험실로부터 입수할 것이다. 편집 효율은 고처리량 서열분석에 의해 평가될 것이고, 교정된 유전자형의 효능은 표현형 검정 (헤모글로빈 HPLC, ATP7B 면역염색, 및 CFTR 막 전위 검정)을 사용하여 시험될 것이다.
오프-타겟 편집 활성을 특징화한다.
잠재적 오프-타겟 편집은 야생형 Cas9와 쌍형성된 표적 gRNA를 사용하여 확립된 방법, 예컨대 가이드-seq(GUIDE-seq)55 및 서클-seq(CIRCLE-seq)56에 의해 스크리닝될 것이다. 잠재적 오프-타겟이 확인되는 경우에, 이들 유전자좌는 진정한 오프-타겟 편집 사건을 확인하기 위해 TPRT 편집된 세포에서 프로빙될 것이다.
잠재적 어려움 및 대안.
(1) 낮은 편집 효율: 프라임 편집제 (PE)는 각각의 표적에 대한 최적화를 필요로 할 수 있다. 이러한 경우에, gRNA 라이브러리는 특정한 적용을 위한 가장 높은 기능적 변이체를 확인하기 위해 시험될 수 있다. RT-Cas 융합체 발현 및 핵 국재화가 최적화될 수 있다. 리포솜 RNP 전달은 오프-타겟 편집을 제한하는데 사용될 수 있다.
앞으로의 실험.
gRNA 설계의 최적화는 프라이머 결합 부위 길이 및 합성 주형의 연장의 추가의 연구에 의해 달성될 수 있다. 시험 범주 및 일반성은 상이한 뉴클레오티드 전환, 작은 삽입 및 결실, 뿐만 아니라 PAM에 관한 상이한 편집 위치, 및 인간 게놈 내의 다중 부위를 포함할 것이다. RT 성분의 최적화는 활성을 증진시키기 위한 MLV RT에서의 돌연변이 (Rnase H 불활성화, 프라이머-주형 결합 친화도 증가, 프로세싱성에 대한 조정), 및 새로운 RT 효소 (군 II 인트로 RT, 다른 레트로바이러스 RT)를 연구하는 것을 포함할 것이다.
유의성.
수많은 유전 장애는 개별 유전자에서의 단일 뉴클레오티드 변화로부터 발생한다. 본원에 기재된 게놈 편집 기술을 개발하고, 이를 질환-관련 세포 유형에 적용하는 것은 임상으로의 번역을 위한 토대를 확립할 것이다. 일부 질환, 예컨대 겸상 적혈구 질환의 경우, 단일 점 돌연변이는 집단 전반에 걸쳐 우성 유전자형을 나타낸다. 그러나, 많은 다른 유전 장애의 경우, 단일 유전자 내의 상이한 점 돌연변이의 큰 이질성이 환자 집단 전반에 걸쳐 관찰되고, 이들 각각은 유사한 질환 표현형을 발생시킨다. 따라서, 이론상 다수의 이러한 돌연변이를 표적화할 수 있는 일반적 게놈 편집 방법으로서, 본 기술은 많은 이들 환자 및 그의 가족에게 막대한 잠재적 이익을 제공할 수 있다. 이들 적용에 대한 원리의 증명이 세포에서 확립될 수 있다면, 이는 질환의 동물 모델에서의 연구에 대한 기반을 확립할 것이다.
이점
정밀도: 목적하는 편집은 핵산 서열에서 코딩되고 지시된다. 일반성: 이론상, 전환 편집 뿐만 아니라 작은 삽입 또는 결실을 포함한 임의의 염기 쌍 전환을 만드는 것이 가능할 수 있다. Cas9 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열과 관련하여 염기 편집제의 것과 별개의 편집 윈도우가 존재한다. 이 방법은 상동성-지정 복구 (HDR)의 편집 능력 중 많은 것을 달성하지만, HDR의 주요 제한 (대부분의 세포 유형에서 비효율적이고, 통상적으로 과량의 바람직하지 않은 부산물 예컨대 indel을 동반함)은 받지 않는다. 또한, 이는 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB)를 일으키지 않고, 따라서 indel, 전위, 큰 결실, p53 활성화 등을 거의 일으키지 않는다.
실시예 2 - 오류-유발 프라임 편집 (PE)
본원에 기재된 프라임 편집 (PE) 시스템은 또한 게놈에 돌연변이를 설치하기 위해 오류-유발 리버스 트랜스크립타제 효소와 함께 사용될 수 있다.
한 실시양태가 도 22에 도시되며, 이는 연장된 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 사용하여 표적 유전자좌 상에서 오류-유발 리버스 트랜스크립타제로 표적화된 돌연변이유발을 수행하기 위한 예시적인 과정의 개략도이다. 이 과정은 표적화된 돌연변이유발을 위한 프라임 편집의 실시양태로서 지칭될 수 있다. 연장된 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에, 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, gRNA는 napDNAbp가 돌연변이유발될 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의함), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 특정 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않은 가닥에 상응하는 DNA의 가닥에서 생성된다. 단계 (c)에서, 3' 단부 DNA 가닥은 역전사를 프라이밍하기 위해 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 특정 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 RT 프라이밍 서열에 혼성화한다. 단계 (d)에서, DNA의 돌연변이유발된 단일 가닥을 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 가이드 RNA의 3' 단부쪽으로 합성하는 오류-유발 리버스 트랜스크립타제가 도입된다. 예시적인 돌연변이는 별표 "*"로 표시된다. 이는 목적하는 돌연변이유발된 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 돌연변이유발된 영역이 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩 (돌연변이유발된 영역을 포함함)의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 다른 가닥 상의 상보적 서열에 침입하고 혼성화하면 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써 목적하는 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다. 과정은 또한 도 1f에 예시된 바와 같이 제2 가닥 닉킹에 의해 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다. 내인성 DNA 복구 및/또는 복제 과정 후에, 돌연변이유발된 영역은 DNA 유전자좌의 DNA의 양쪽 가닥 내로 혼입된다.
실시예 3 -PE에 의한 트리뉴클레오티드 반복부 축소
본원에 기재된 프라임 편집 시스템 또는 프라임 편집 (PE) 시스템은 헌팅톤병 및 다른 트리뉴클레오티드 반복 장애와 같은 상태를 치료하기 위해 트리뉴클레오티드 반복 돌연변이 (또는 "트리플렛 확장 질환")를 축소시키는데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 트리플렛 확장은 DNA 복제 동안 또는 DNA 복구 합성 동안 슬리피지에 의해 유발된다. 탠덤 반복부는 서로 동일한 서열을 갖기 때문에, 2개의 DNA 가닥 사이의 염기 쌍형성은 서열을 따라 다중 지점에서 일어날 수 있다. 이는 DNA 복제 또는 DNA 복구 합성 동안 "루프 아웃" 구조의 형성으로 이어질 수 있다. 이는 반복 서열의 반복 카피를 유도하여, 반복부의 수를 확장시킬 수 있다. 하이브리드 RNA:DNA 중간체를 수반하는 추가의 메카니즘이 제안되었다. 프라임 편집은 1개 이상의 또는 문제의 반복 코돈 트리플렛을 결실시킴으로써 이들 트리플렛 확장 영역을 감소 또는 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 용도의 한 실시양태에서, 도 23은 프라임 편집으로 트리뉴클레오티드 반복 서열을 축소 또는 감소시키기 위한 PEgRNA 설계의 개략도를 제공한다.
따라서, 프라임 편집은 헌팅톤병, 유약 X 증후군, 및 프리드라이히 운동실조를 포함한 임의의 트리뉴클레오티드 반복 장애를 교정하는데 사용될 수 있다.
가장 흔한 트리뉴클레오티드 반복부는 CAG 트리플렛을 함유하지만, GAA 트리플렛 (프리드라이히 운동실조) 및 CGG 트리플렛 (유약 X 증후군)이 또한 발생한다. CAG 트리플렛은 글루타민 (Q)을 코딩하고, 따라서 CAG 반복부는 이환된 단백질의 코딩 영역에 폴리글루타민 트랙을 생성한다. 이러한 특정한 부류의 트리뉴클레오티드 반복 장애는 또한 "폴리글루타민 (폴리Q) 질환"으로 불린다. 다른 트리뉴클레오티드 반복은 유전자 조절에서 변경을 유발할 수 있고, "비-폴리글루타민 질환"으로 지칭된다. 확장에 대한 소인을 유전하거나, 또는 이미 확장된 모 대립유전자를 획득하는 것은 질환을 획득할 가능성을 증가시킨다. 트리뉴클레오티드 반복부의 병원성 확장은 가설상 프라임 편집을 사용하여 교정될 수 있다.
프라임 편집은 절단 부위에 적절하게 표적화된 PEgRNA를 포함하는 프라임 편집제로 트리플렛 반복 영역의 상류 영역을 닉킹함으로써 트리플렛 확장 영역을 축소시키도록 구현될 수 있다. 이어서, 프라임 편집제는 건강한 수의 트리플렛 반복부 (이는 특정한 유전자 및 질환에 의존함)를 코딩하는 주형 (즉, 그의 편집 주형)으로서 PEgRNA에 기초하여 새로운 DNA 가닥 (ssDNA 플랩)을 합성한다. 건강한 트리플렛 반복 서열을 포함하는 새로 합성된 ssDNA 가닥은 또한 반복부의 다른 단부 (적색 가닥)에 인접한 서열에 매칭되는 짧은 상동성 스트레치 (즉, 상동성 아암)를 포함하도록 합성된다. 새로 합성된 가닥의 침입, 및 내인성 DNA의 새로 합성된 ssDNA 플랩으로의 후속 대체는 축소된 반복 대립유전자로 이어진다.
실시예 4 - PE에 의한 펩티드 태그부착
본원에 기재된 프라임 편집 시스템 (즉, PE 시스템)은 또한 다양한 펩티드 태그를 단백질 코딩 유전자 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 태그는 헥사히스티딘 태그, FLAG-태그, V5-태그, GCN4-태그, HA-태그, Myc-태그 등을 포함할 수 있다. 이러한 접근법은 단백질 형광 표지, 면역침전, 이뮤노블롯팅, 면역조직화학, 단백질 동원, 유도성 단백질 데그론, 및 게놈-전반 스크리닝과 같은 적용에 유용할 수 있다. 실시양태는 도 25 및 26에 도시된다.
도 25는 내인성 게놈 유전자좌에서의 펩티드 태그부착 유전자 및 TPRT 게놈 편집 (즉, 프라임 편집)에 의한 펩티드 태그부착에 대한 gRNA 설계를 보여주는 개략도이다. FlAsH 및 ReAsH 태그부착 시스템은 2개의 부분을 포함한다: (1) 형광단-비아르세니칼 프로브, 및 (2) 서열 FLNCCPGCCMEP (서열식별번호: 1)로 예시되는, 테트라시스테인 모티프를 함유하는 유전자 코딩된 펩티드. 세포 내에서 발현되는 경우에, 테트라시스테인 모티프를 함유하는 단백질은 형광단-비소 프로브로 형광 표지될 수 있다 (참고문헌 [J. Am. Chem. Soc., 2002, 124 (21), pp 6063-6076. DOI: 10.1021/ja017687n] 참조). "소르태깅" 시스템은 표지된 펩티드 프로브를 적합한 펩티드 기질을 함유하는 단백질에 공유 접합시키는 박테리아 소르타제 효소를 사용한다 (참고문헌 [Nat. Chem. Biol. 2007 Nov;3(11):707-8. DOI: 10.1038/nchembio.2007.31] 참조). FLAG-태그 (DYKDDDDK (서열식별번호: 2)), V5-태그 (GKPIPNPLLGLDST (서열식별번호: 3)), GCN4-태그 (EELLSKNYHLENEVARLKK (서열식별번호: 4)), HA-태그 (YPYDVPDYA (서열식별번호: 5)), 및 Myc-태그 (EQKLISEEDL (서열식별번호: 6))가 면역검정을 위한 에피토프 태그로서 통상적으로 사용된다. 파이-클램프는 펜타플루오로-방향족 기질로 표지될 수 있는 펩티드 서열 (FCPF) (서열식별번호: 622)을 코딩한다 (참고문헌 [Nat. Chem. 2016 Feb;8(2):120-8. doi: 10.1038/nchem.2413]).
도 26은 게놈 DNA 내로의 His6-태그 및 FLAG-태그의 정확한 설치를 보여준다. 18-nt His-태그 삽입 또는 24-nt FLAG-태그 삽입을 코딩하는 역전사 주형을 사용하여 HEK3 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 설계하였다. 형질감염된 HEK 세포에서의 편집 효율을 앰플리콘 서열분석을 사용하여 평가하였다. FLAG-태그의 전장 24-nt 서열은 보이는 프레임의 외부에 있다는 것을 주목한다 (서열분석으로 완전하고 정확한 삽입을 확인함).
실시예 5 - PE에 의한 프리온 질환의 예방 또는 치료
본 발명은 인간, 가축, 및 야생동물에서의 프리온 질환 문제를 다루는 것을 도울 수 있다. 이전에 기재된 편집 전략은 보호 돌연변이를 설치하거나 또는 PRNP를 신뢰가능하게 녹다운시키기에 충분히 효율적이지 않고 깔끔하지 않다. Cas9 뉴클레아제 및 HDR이 사용될 수 있지만, 대부분 PRNP indel 변이체의 혼합물을 생성할 것이며, 이들 중 일부는 병원성인 것으로 생각된다. 또한, HDR은 대부분의 세포 유형에서 작동하지 않는다. 프라임 편집은 과량의 이중 가닥 DNA 파괴 또는 결과적인 indel을 생성하지 않으면서 둘 다의 유형의 돌연변이를 설치하는데 있어서 신뢰할 수 있고 효율적이다.
본 발명은 프리온 질환의 진행을 예방하거나 정지시키는, PRNP에 보호 돌연변이를 설치하는 방법을 기재한다. 이러한 부위는 포유동물에 보존되어 있으므로, 인간 질환을 치료하는 것에 더하여, 프리온 질환에 면역성인 소 및 양을 생성하는데 또한 사용될 수 있거나, 또는 심지어 프리온 질환을 앓고 있는 야생 집단 동물을 치유하는 것을 도울 수 있다. 프라임 편집은 인간 세포에서 자연 발생 보호 대립유전자의 ~25% 설치를 달성하는데 이미 사용되어 왔고, 이전 마우스 실험은 이러한 설치 수준이 대부분의 프리온 질환으로부터 면역을 유발하기에 충분하다는 것을 나타낸다. 이러한 방법은 대부분의 세포 유형에서 이러한 대립유전자를 이러한 높은 효율로 설치하기 위한 최초의, 잠재적으로 유일한 현재의 방식이다. 또 다른 가능한 치료 전략은 프라임 편집을 사용하여 유전자에 초기 정지 코돈을 설치함으로써 PRNP의 발현을 감소 또는 제거하는 것이다. 많은 연구원들은 그렇게 하는 것이 질환을 치료할 것으로 예측한다.
3가지의 잠재적 치료 전략은 PrP의 발현을 감소시키기 위한 프라임 편집을 포함한다. 이러한 목적은 PRNP에서 조기 정지 코돈을 유발하거나, 개시 코돈을 제거하거나, 필수 아미노산 코돈을 돌연변이 또는 결실시키거나, 스플라이스 부위를 도입 또는 제거하여 이상 전사체를 생성하거나, 또는 전사체 수준을 감소시키는 조절 요소를 변경시키는 돌연변이의 도입에 의해 달성될 수 있다. 질환 돌연변이를 제거하기 위한 프라임 편집. 질환에 걸릴 증가된 가능성으로 이어지는 PRNP의 많은 변이체가 기재되어 있다 (ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6097508/#b154-ndt-14-2067). 프라임 편집은 모든 가능한 유형의 점 돌연변이, 국부 삽입, 및 국부 결실을 만들 수 있기 때문에, 각각의 공지된 변이체는 프라임 편집을 사용하여 역전될 수 있다. 프리온 형성 및/또는 전달을 방해하는 PRNP에의 1개 이상의 보호 돌연변이를 도입하기 위한 프라임 편집. 예를 들어, 인간 PRNP 유전자에서의 G127V는 많은 형태의 프리온 질환을 보호하는 것으로 입증되었다 (ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4486072/). 이 돌연변이는 이후에 안정한 베타 시트 및 이량체의 형성을 방지함으로써 프리온 형성을 방해하는 것으로 기재되었다 (ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30181558, ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26906032). 단일 뉴클레오티드 다형성의 도입에 더하여, 프리온 형성을 방해할 PRNP 내 서열의 삽입 또는 결실도 또한 프리온 질환으로부터 보호하거나 또는 이를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
제3 치료 전략은, 보호 변이체의 도입이 비교적 적은 수의 세포가 편집을 경험하는 경우에도 이익을 부여할 수 있기 때문에 특히 유리하다. 또한, 보호 변이체, 특히 G127V와 같은 인간 집단에서 자연 발생하는 것을 도입하는 것은 어떠한 해로운 결과를 가질 것으로 예상되지 않는 반면에, 전략 1에서와 같이 프리온 단백질의 발현을 감소시키는 것은 PRNP 녹-아웃 마우스에서 입증된 바와 같이 일부 해로운 표현형을 가질 수 있다 (ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4601510/, ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2634447/).
대략 2:1의 야생형 인간 프리온 단백질:인간 프리온 단백질의 보호 G127V 변이체의 비를 발현하는 (보호 변이체의 대략 33% 발현) 마우스는 대부분의 시험된 형태의 프리온 질환에 대해 전적으로 면역성이었고, 또한 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 광우병)으로부터 전염되는 인간 질환인 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD)에 대하여 저항성인 것으로 이전에 입증되었다91. 보호 G127V 변이체만을 발현하는 마우스는 vCJD를 포함한 모든 시험된 프리온 질환 시험감염에 대하여 전적으로 면역성이었다.
보호 G127V 돌연변이가 프라임 편집을 사용하여 조직 배양물 내의 인간 세포에 효율적으로 설치될 수 있다는 것이 본원에서 입증된다 (도 27 참조).
이들 결과에 의해 제공된, PRNP 편집이 사용될 수 있는 3가지 설정이 기재되어 있다. PRNP 편집이 사용될 수 있는 1가지 설정은 프리온 질환을 예방 또는 치료하기 위한 인간 환자에서의 프라임 편집이다. PRNP 편집이 사용될 수 있는 제2 설정은 프리온 질환의 발생 및 확산을 방지하기 위한 가축에서의 프라임 편집이다. 소 및 양 가축 둘 다는 PRNP 유전자에 의해 생성된 단백질에 의해 유발된 프리온 질환의 산발적 발생을 경험하였다. 동물이 쇠약하고 치명적인 질환에 고통받는 것에 더하여, 이들 사례는 또한 부분적으로는, 극도의 감염성 질환의 확산을 방지하기 위해 취해져야 하는 관리로 인해 경제 파괴적이다. 워싱턴 주의 단일 낙농 소가 2003년 12월에 BSE에 대해 양성으로 시험되었고, 이는 다음 해 소고기 판매에서 2.8-4.2 십억 달러의 예상되는 손실로 이어졌다 (bookstore.ksre.ksu.edu/pubs/MF2678.pdf). PRNP 유전자는 포유동물에서 고도로 보존된다. PRNP 돌연변이, 예컨대 G127V를 가축 배선 내로 도입하는 것은 BSE 또는 양에서의 프리온 질환의 징후인 스크래피의 발생을 제거할 수 있다. PRNP 편집이 사용될 수 있는 제3 설정은 야생 프리온 질환의 확산을 방지할 수 있는 야생동물에서의 프라임 편집이다. 현재, 북아메리카의 사슴, 엘크, 및 무스를 포함한 사슴과의 집단은 이들 종에서 PNRP에 의해 유발되는 프리온 질환의 징후인 만성 소모성 질환 (CWD)을 앓고 있다. 발생은 일부 집단에서 25%만큼 높은 것으로 보고되었다 (cdc.gov/prions/cwd/occurrence.html). CWD는 또한 노르웨이, 핀란드, 및 대한민국에서 보고되었다. 질환이 이들 종으로부터 인간 (cdc.gov/prions/cwd/transmission.html) 또는 가축으로 전염성인지 여부는 아직 공지되지 않았다. 이들 종의 배선에의 PRNP 돌연변이, 예컨대 G127V의 도입은 이들을 CWD로부터 보호하고 인간을 비롯한 다른 종으로의 전파 위험을 감소시킬 수 있다.
이 방법은 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 쿠루병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커병, 치명적 가족성 불면증 (FFI), 소 해면상 뇌병증 (BSE; 광우병), 스크래피 (양), 및 만성 소모성 질환 (CWD; 사슴, 엘크, 및 무스)을 치료하는데 사용될 수 있다.
방법은 배아 또는 성체 뉴런에 대한 전달 방법론, 예컨대 미세주사, 지질 나노입자, 또는 AAV 벡터와 조합될 필요가 있을 것이다.
실시예 6 - PE를 사용한 RNA 태그부착 및 조작
포유동물, 진핵, 및 박테리아 세포 내에서 RNA를 태그부착하거나 또는 달리 조작하는 유전자 서열 내로 모티프를 삽입하기 위한 새로운 방법이 본원에 기재된다. 인간 게놈의 1%만이 단백질을 코딩하는 것으로 추정되지만, 실질적으로 모든 게놈이 일부 수준으로 전사된다. 대부분의 이들 추정 RNA의 역할이 무엇인지는 물론, 생성된 비-코딩 RNA (ncRNA)가 얼마나 많이 기능적 역할을 하는지는 해결되지 않은 의문이다. 유용한 특성을 갖는 신규 RNA-코딩 서열의 관심 유전자 내로의 삽입을 통한 이들 RNA 분자의 "태그부착"은 세포에서 RNA 분자의 생물학적 기능을 연구하기 위한 유용한 방법이다. 이는 또한 mRNA 변형이 어떻게 세포 기능에 영향을 미칠 수 있는지를 교란하고, 이에 따라 더 잘 이해하기 위한 수단으로서 단백질-코딩 mRNA 상에 태그를 설치하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 편재성 천연 RNA 태그 - 폴리아데닐화 - 는 세포에 의해 mRNA의 세포질 내로의 수송에 영향을 미치는데 사용된다. 상이한 유형의 폴리아데닐화 신호는 상이한 수송 속도 및 상이한 mRNA 수명 및 - 이에 따라 - 코딩된 단백질이 발현되는 수준의 차이를 발생시킨다.
세포 내에서 태그부착된 RNA를 발현시키기 위한 통상적인 접근법은 (i) 종종 초생리학적 수준에서 유전자 발현의 단기 버스트를 생성하는 일시적 플라스미드 형질감염; 또는 (ii) 연장된 발현을 가능하게 하는 렌티바이러스 통합 또는 트랜스포손을 사용한 게놈 내로의 태그부착된 RNA 유전자의 영구적 통합 (무작위 부위)을 사용하여 합성 구축물을 외인적으로 도입하는 것이다. 이들 접근법 둘 다는 변경된 발현 수준의 생산에 의해, 및 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 천연 메카니즘의 부재에 의해 제한된다. 대안적 전략은 Cas9 또는 다른 표적화된 DNA 뉴클레아제에 의해 유도된 이중 가닥 DNA 파괴의 상동성-지정 복구 (HDR)를 사용하여 그의 내인성 유전자좌에서 관심 유전자를 직접 태그부착하는 것이다. 이러한 접근법은 광범위한 내인성으로 태그부착된 유전자의 생성을 가능하게 하지만, HDR은 현저하게 비효율적이고, 따라서 성공적으로 태그부착된 목적하는 세포의 클론 집단을 확인하기 위해 유의한 스크리닝을 필요로 한다. 더욱이, HDR은 전형적으로 다수의 세포 유형, 가장 특히 유사분열후 세포에서 매우 비효율적이거나 또는 전적으로 불활성이다. HDR의 낮은 효율은 바람직하지 않은 indel 생성물의 생성에 의해 추가로 복잡해지고, RNA 유전자의 경우에 특히 문제가 될 수 있는데, 이는 그의 활성이 정상 대립유전자의 기능을 방해하는 RNA의 생산으로 이어질 수 있기 때문이다. 마지막으로, 연구원들은 종종 최적의 성능을 달성하기 위해 RNA 분자 내의 다양한 태그부착 위치를 스크리닝할 필요가 있다. 이들 결점의 합은 HDR을 RNA에 태그를 설치하는데 덜 바람직한 방법으로 만든다.
프라임 편집은 RNA로부터 DNA로의 유전자 정보의 전달을 통해 게놈 유전자좌의 표적화된 편집을 가능하게 하는 새로운 게놈 편집 기술이다. 프라임 편집을 사용하여, RNA 유전자는 다양한 성분, 예컨대 RNA 압타머, 리보자임, 또는 다른 RNA 모티프로 태그부착될 수 있다. 프라임 편집은 HDR 전략과 비교하여 보다 빠르고, 보다 저렴하고, 보다 다양한 세포 유형에서 효과적인 잠재력을 갖는다. 따라서, 기재된 발명은 건강 및 질환에서 RNA 유전자의 생물학을 조사하기 위한 신규하고 유용하며 비-자명한 도구를 나타낸다. 프라임 편집제 (PE)를 사용하여 RNA를 태그부착하거나 또는 달리 조작하는 유전자 서열 내로의 RNA 모티프의 삽입을 위한 새로운 방법이 본원에 기재된다. PE는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 표적화가능한 목적하는 게놈 유전자좌에서 다중 뉴클레오티드를 부위-특이적으로 삽입, 돌연변이, 및/또는 결실시킬 수 있다. PE는 Cas9 뉴클레아제 도메인과 리버스 트랜스크립타제 도메인 사이의 융합체로 구성된다. 이들은 DNA 표적화를 위한 가이드 스페이서 부분, 뿐만 아니라 목적하는 게놈 편집을 코딩하는 역전사를 위한 주형을 함유하는 조작된 PEgRNA (프라임 편집 가이드 RNA)에 의해 그의 게놈 표적으로 가이드된다 (도 28a 참조). PE는 비-코딩 RNA 또는 mRNA를 태그부착하거나 또는 달리 조작하기 위해 RNA 수준에서 기능적인 모티프 (이하 RNA 모티프)를 삽입하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이들 모티프는 유전자 발현을 증가시키거나, 유전자 발현을 감소시키거나, 스플라이싱을 변경하거나, 전사후 변형을 변화시키거나, RNA의 세포하 위치에 영향을 미치거나, RNA의 단리 또는 세포내 또는 세포외 위치의 결정을 가능하게 하거나 (예를 들어, 형광 RNA 압타머, 예컨대 스피니치, 스피니치2, 베이비 스피니치, 또는 브로콜리를 사용함), 내인성 또는 외인성 단백질 또는 RNA 결합제를 동원하거나, sgRNA를 도입하거나, 또는 자기-절단 또는 RNAse에 의한 RNA의 프로세싱을 유도하는 역할을 할 수 있다 (도 28b 참조). 프라임 편집의 유연성으로 인해, 게놈 내에 설치될 수 있는 RNA 모티프의 포괄적인 목록을 제공하는 것은 가능하지 않다. RNA 유전자를 태그부착하는데 사용될 수 있는 PE-설치된 RNA 모티프의 예측 범주를 광범위하게 예시하는 일련의 예가 본원에 제시된다. PE 이외의 임의의 다른 보고된 게놈 편집 방법을 사용하여 대부분의 유형의 세포 (HDR을 지지하지 않는 많은 것 포함)에서 이들 변화를 효율적이고 상당히 깔끔하게 만드는 것은 현재 가능하지 않다.
유전자 발현은 핵 수송 또는 체류 또는 mRNA 수명에서 변화를 발생시키는 3' 비번역 영역 (UTR)을 코딩하는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 폴리오마바이러스 원숭이 바이러스 40 (SV40)으로부터의 폴리A 테일은 효율적인 전사 종결을 가능하게 하고 다른 3' UTR에 비해 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 추가의 헬퍼 서열을 갖는다57, 58. SV40 폴리A 테일의 예시적 서열:
Figure pct00366
폴리아데닐화 신호 이외의 번역후 변형 신호가 또한 PE에 의해 코딩될 수 있다. 이들은 N6-메틸아데노신, N1-메틸아데노신, 5-메틸시토신, 및 슈도우리딘 변형을 포함하는 신호를 포함한다59. PE를 사용하여 RNA 전사체 내에 이들 변형을 기록 또는 제거하는 효소에 의해 결합된 서열을 포함시킴으로써, 그의 기록 또는 소거를 유도하는 것이 가능할 것이다. 이는 이들 마커의 효과를 연구하거나, 세포 분화를 유도하거나, 스트레스 반응에 영향을 미치거나, 또는 이들 마커의 기능이 아직 조사 중이라면 다른 방식으로 표적화된 세포에 영향을 미치기 위한 도구로서 사용될 수 있다.
PE는 세포하 국재화에 영향을 미치는 돌연변이를 코딩할 수 있다. 예를 들어, mRNA 내의 tRNA-Lys의 혼입은 이론적으로 미토콘드리아로의 수송을 발생시킬 수 있는 한편60, 다양한 3' UTR은 핵 체류 또는 수송을 발생시킬 수 있다61.
예:
SV40 폴리A 신호는 수송을 발생시킨다.
Figure pct00367
U1 snRNA 3' 박스는 체류를 발생시킨다.
Figure pct00368
내인성 RNA의 세포하 국재화를 결정하는 것은 도전과제일 수 있고, 이는 FISH의 경우에서와 같이 외인성, 형광-태그부착된 뉴클레오티드 프로브의 부가, 또는 시간-소모적이고 잠재적으로 부정확한 세포 분획화에 이은 RNA 검출을 필요로 한다. 내인성 RNA 내에 프로브를 코딩하는 것은 이들 이슈 중 많은 것을 제거할 것이다. 한 예는 내인성 RNA 내에 형광 RNA 압타머, 예컨대 스피니치62 또는 브로콜리를 코딩함으로써, 소분자 원-형광단의 부가를 통해 그러한 RNA의 존재를 가시화하는 것일 것이다.
브로콜리 압타머:
Figure pct00369
PE는 RNA 결합 단백질에 의해 인식되는 RNA를 코딩하는 서열을 삽입하거나 제거하여, RNA 안정성, 발현, 국재화, 또는 변형에 영향을 미칠 수 있다 (예를 들어, 열거된 단백질 참조63).
PE는 바이러스 또는 암 방어 메카니즘으로서 게놈 내에 sgRNA를 코딩하는 서열을 삽입할 수 있다. 유사하게, 이는 마이크로RNA (예를 들어, 프리-마이크로RNA)를 삽입하여 표적화된 유전자의 침묵을 지시하는데 사용될 수 있다.
PE는 RNA의 다양한 부분의 기능을 연구하기 위한 요법 또는 도구로서, RNA를 그 자체로 또는 외부 인자에 의해 프로세싱하는 서열을 삽입할 수 있다. 예를 들어, HDV 리보자임64은 RNA 서열 내에 포함되는 경우에 리보자임의 바로 5'의 RNA의 프로세싱을 발생시키는 한편, 해머헤드 리보자임은 리보자임 내의 제3 스템 전에 절단한다65. 다른 자기-절단 리보자임은 피스톨66, 해체트66, 헤어핀67, 뉴로포라 바르쿠드(Neuropora Varkud) 위성68, glmS69, 트위스터70, 및 트위스터 시스터66를 포함한다. 이들 서열은 리보자임의 야생형 또는 조작된 또는 진화된 버전을 포함할 수 있다. 대다수의 이들 리보자임은 리보자임 절단 부위가 위치하는 곳에 따라, 이들이 회합된 RNA의 영역에 따라 상이한 서열을 가질 수 있다. 외부 인자에 의한 RNA의 프로세싱을 지시할 서열, 예컨대 서열 특이적 RNAse71, 특이적 구조를 인식하는 RNAse72 - 예컨대 다이서73 및 드로샤74가 또한 달성될 수 있다.
HDV 리보자임:
Figure pct00370
실시예 6에 대한 참고문헌
하기 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00371
실시예 7 - PE에 의한 유전자 라이브러리의 생성
규정된 또는 가변 삽입, 결실, 또는 규정된 아미노산/뉴클레오티드 전환을 갖는 단백질- 또는 RNA-코딩 유전자의 고도로 정교한 라이브러리의 세포 생성을 위한 새로운 방법, 및 고처리량 스크리닝 및 방향적 진화에서의 그의 사용이 본원에 기재된다. 실시예에서 인용된 참고문헌은 본 실시예의 말미에 포함된 참고문헌의 목록을 기초로 한다.
가변 유전자 라이브러리의 생성은 돌연변이유발 PCR을 통해 가장 통상적으로 달성되었다1. 이 방법은 DNA 폴리머라제의 충실도를 감소시키는 반응 조건을 사용하는 것, 또는 보다 높은 돌연변이율을 갖는 변형된 DNA 폴리머라제를 사용하는 것에 의존한다. 따라서, 이들 폴리머라제에서의 편향은 라이브러리 생성물에 반영된다 (예를 들어, 전이 돌연변이 대 전환에 대한 선호도). 라이브러리 구축에 대한 이러한 접근법에 내재하는 제한은 다양화될 유전자의 크기에 영향을 미치는 상대적 무능이다. 대부분의 DNA 폴리머라제는 극도로 낮은 비율의 indel 돌연변이2 (삽입 또는 결실)를 갖고, 이들 대부분은 단백질-코딩 영역에서 프레임시프트 돌연변이를 발생시켜, 라이브러리의 구성원이 임의의 하류 선택을 통과할 가능성이 없게 할 것이다. 추가적으로, PCR 및 클로닝에서의 편향은 상이한 크기의 유전자로 이루어진 단일 라이브러리를 생성하는 것을 어렵게 만들 수 있다. 이들 제한은 기존의 단백질 기능을 증진시키거나 또는 신규 단백질 기능을 조작하기 위한 방향적 진화의 효능을 심각하게 제한할 수 있다. 자연 진화에서, 단백질 기능 또는 효능에서의 큰 변화는 돌연변이유발을 위한 정규 라이브러리 생성 동안 발생할 가능성이 없는 삽입 및 결실 돌연변이와 전형적으로 연관된다. 또한, 이들 돌연변이는 소수성 코어와 대조적으로 루프를 형성할 것으로 예측되는 해당 단백질의 영역에서 가장 통상적으로 발생한다. 따라서, 전통적인 비편향 접근법을 사용하여 생성된 대부분의 indel은 유해하거나 비효과적일 가능성이 있다.
이러한 돌연변이를 이들이 유익할 가능성이 가장 큰 단백질 내의 부위, 즉 루프 영역으로 편향시킬 수 있는 라이브러리는, 모든 라이브러리가 단지 가능한 돌연변이 공간의 일부에만 접근한다는 것을 고려하면, 전통적인 라이브러리에 비해 유의한 이점을 가질 것이다. 마지막으로, NNK 프라이머를 사용한 다단계 PCR 및 클론 조립을 통해 또는 DNA 셔플링을 통해 부위-특이적 indel 돌연변이를 갖는 유전자 라이브러리를 생성하는 것이 가능하지만, 이들 라이브러리는 연속 진화에서 추가의 라운드의 'indel 유발'을 거칠 수 없다. 연속 진화는 최소 사용자 개입을 갖는 방향적 진화의 유형이다. 하나의 이러한 예는 PACE이다3. 연속 진화는 최소 사용자 개입 하에 일어나기 때문에, 진화 동안 라이브러리 다양성에서의 임의의 증가는 천연 복제 기구를 사용하여 일어나야 한다. 따라서, 특이적 유전자좌로서 삽입 또는 제거된 코돈을 갖는 유전자의 라이브러리가 PACE에서 생성되고 스크리닝될 수 있지만, 추가의 라운드의 'indel 유발'은 가능하지 않다.
프라임 편집 (PE)의 프로그램가능성은 고처리량 스크리닝 및 방향적 진화에 사용하기 위한 고도로 정교한, 프로그램화된 유전자 라이브러리를 생성하는데 활용될 수 있는 것으로 고려된다 (도 29a 참조). PE는 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)에 코딩된 정보를 사용하여 명시된 유전자좌로부터 규정된 수의 뉴클레오티드를 삽입, 변화 또는 제거할 수 있다 (도 29b 참조). 이는 비기능적 프레임시프트 돌연변이의 배경 도입 없이, 돌연변이가 기능의 변화를 발생시킬 가능성이 가장 큰 루프 영역으로부터 1개 이상의 아미노산이 삽입 또는 제거된 표적화된 라이브러리의 생성을 가능하게 한다 (도 29c 참조). PE는 DNA 폴리머라제 또는 돌연변이되는 서열에 내재하는 편향에 관계없이 특정 세트의 돌연변이를 설치하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, CCC 코돈을 정지 코돈으로 전환시키는 것은, 이것이 2개의 전환을 포함한 3개의 연속 돌연변이를 필요로 할 것이기 때문에 정규 라이브러리 생성을 통해서는 발생할 가능성이 없을 것이지만, PE는 임의의 주어진 표적화된 코돈을 TGA 정지 코돈으로 1 단계로 전환시키는데 사용될 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어 임의의 다른 것은 코딩하지 않으면서 임의의 소수성 아미노산을 코딩하는 코돈을 주어진 부위에 혼입시킴으로써, 주어진 위치에 프로그램화된 다양성을 설치하는데 사용될 수 있다. 또한, PE의 프로그램가능성으로 인해, 다중 PEgRNA를 이용하여 다중 부위에서 다중의 상이한 편집을 동시에 생성할 수 있고, 이는 고도로 프로그램화된 라이브러리의 생성을 가능하게 한다 (도 29d 참조). 추가적으로, 달리 불변인 라이브러리 내에 돌연변이유발 영역을 생성하기 위해 보다 낮은 충실도를 갖는 리버스 트랜스크립타제 (예컨대 HIV-I 리버스 트랜스크립타제4 또는 보르데텔라 파지 리버스 트랜스크립타제5)를 사용하는 것이 가능하다.
동일한 부위 상에서의 반복 라운드의 PE의 가능성이 또한 고려되어, 예를 들어 단일 부위에서의 코돈의 반복된 삽입을 가능하게 한다. 마지막으로, 상기 기재된 접근법 모두가 연속 진화 내로 혼입되어, 신규한 계내 진화 라이브러리의 생성을 가능하게 할 수 있는 것으로 고려된다 (도 30 참조). 이들은 또한 달리 대형 라이브러리를 조립하는 것이 곤란할 다른 세포 유형 내에서, 예를 들어 포유동물 세포 내에서 이들 라이브러리를 구축하는데 사용될 수 있다. 방향적 진화를 위해 최적화된 PE-코딩 박테리아 균주의 생성은 개선된 또는 신규한 기능성을 갖는 단백질 및 RNA의 확인을 위한 유용한 추가의 도구일 것이다. PE의 모든 이들 용도는 PE의 신규한 성질로 인해 명백하지 않다. 결론적으로, PE를 통한 라이브러리 생성은 합성 생물학 및 방향적 진화에서, 뿐만 아니라 단백질 및 RNA 조합 돌연변이체의 고처리량 스크리닝을 위한 고도로 유용한 도구일 것이다.
경쟁 접근법
현재 다양한 라이브러리가 생성되는 주요 방법은 상기 기재된 돌연변이유발 PCR1에 의하는 것이다. 삽입 또는 결실은 PCR 동안 규정된 부위에서 축중성 NNK 프라이머를 통해 도입될 수 있지만, 다중 부위에서의 이러한 돌연변이의 도입은 다중 라운드의 반복 PCR 및 클로닝 후 돌연변이유발 PCR을 통해 보다 다양한 라이브러리를 구축하는 것을 필요로 하며, 이는 방법을 느리게 한다. 대안적인 상보적 방법은 DNA 셔플링으로, 여기서 DNase 처리를 통해 생성된 유전자의 라이브러리의 단편은 프라이머 없이 PCR 반응 내로 도입되어, 서로 상이한 단편의 어닐링 및 돌연변이유발 PCR 단독을 통하는 것보다 더 다양한 라이브러리의 신속한 생성을 유발한다6. 이러한 접근법은 이론적으로 indel 돌연변이를 생성할 수 있지만, 이는 보다 종종 유전자 기능을 파괴하는 프레임시프트 돌연변이를 발생시킨다. 또한, DNA 셔플링은 유전자 단편 사이의 고도의 상동성을 필요로 한다. 이들 방법 둘 다는 시험관내에서 수행되어야 하며, 생성된 라이브러리로 세포를 형질전환시키는 반면, PE에 의해 생성된 라이브러리는 계내에서 구축될 수 있으며, 이는 연속 진화에서의 그의 사용을 가능하게 한다. 라이브러리는 생체내 돌연변이유발을 통해 계내에서 구축될 수 있지만, 이들 라이브러리는 숙주 세포 기구에 의존하고, indel에 대해 편향을 나타낸다. 유사하게, 전통적인 클로닝 방법을 사용하여 부위-특이적 돌연변이 프로파일을 생성할 수 있지만, 이는 계내에서 사용될 수 없고, 일반적으로 세포를 형질전환시키기 전에 시험관내에서 한 번에 하나씩 조립된다. 원핵 및 진핵 세포 유형 둘 다에서의 PE의 효율 및 광범위한 기능성은, 모델 유기체 예컨대 이. 콜라이 내로 클로닝된 후 관심 세포 또는 유기체 내로 전달되는 것과 대조적으로, 이들 라이브러리가 관심 세포 유형에서 직접 구축될 수 있다는 것을 추가로 시사한다. 표적화된 다양화를 위한 또 다른 경쟁 접근법은 자동화 멀티플렉스 게놈 조작, 또는 MAGE로, 여기서 다중 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 복제 포크 내에 혼입되어 프로그램가능한 돌연변이를 생성할 수 있다7. 그러나, MAGE는 숙주 균주의 유의한 변형을 필요로 하고, 오프-타겟 또는 배경 돌연변이의 100배 증가로 이어질 수 있는 반면에8, PE는 보다 고도로 프로그램화되고, 보다 적은 오프-타겟 효과를 발생시킬 것으로 예상된다. 추가적으로, MAGE는 포유동물 세포를 비롯한 매우 다양한 세포 유형에서 입증되지 않았다. 프라임 편집은 라이브러리 생성을 위한 신규하고 비-자명한 상보적 기술이다.
유전자 라이브러리 구축을 위한 방향적 진화에서의 PE의 예
한 예에서, PE를 방향적 진화 실험에 사용하여 PACE를 사용한 연속 진화 실험 동안 단백질 변이체를 유전자 라이브러리 내로 도입할 수 있으며, 이는 전통적인 접근법을 통해서는 가능하지 않은 방식으로 점 돌연변이 및 indel 둘 다의 반복 축적을 허용한다. PE가 이. 콜라이의 유전자 서열 내로 뉴클레오티드를 부위-특이적으로 및 프로그램가능하게 삽입할 수 있다는 것은 이미 밝혀졌다. 약술된 방향적 진화에서, 변형된 2-하이브리드 단백질:단백질 결합 PACE 선택을 통해 특이적 에피토프에 대한 결합이 개선된 모노바디를 확인하는 것이 제안된다. 이들 모노바디 내의 특이적이고 고도로 가변적인 루프는 친화도 및 특이성에 유의하게 기여한다. 개선된 모노바디 결합은 표적화된 방식으로 이들 루프의 길이 및 조성을 변화시킴으로써 PACE에서 신속하게 수득될 수 있다. 그러나, 다양한 서열 길이는 PACE의 확립된 기능이 아니다. 다양화된 루프 크기의 라이브러리가 PACE를 위한 출발점으로서 사용될 수 있지만, PACE 선택 전반에 걸쳐 길이에 대한 어떠한 후속 개선도 발생하지 않을 것이어서, 점 돌연변이 및 indel 돌연변이의 유익한 상승작용적 조합에 대한 접근이 차단된다. PE를 PACE 선택에 도입하는 것은 다양한 루프 길이를 갖는 모노바디의 계내 생성 및 진화를 가능하게 할 것이다. 이를 위해, PE 효소 및 1개 이상의 PEgRNA를 코딩하는 추가의 PE 플라스미드를 숙주 이. 콜라이 균주에 도입하는 것이 고려된다. PE 효소 및 PEgRNA의 발현은 실험자에 의해 선택된 속도로 PACE 라군에게 전달되는 소분자의 제어 하에 있을 것이다.
다양한 실시양태에서, PEgRNA 성분은 PE를 선택 파지 상의 관심 부위로 지시하는 스페이서를 함유할 것이고, 새로운 PEgRNA 결합 부위가 도입되어 표적화된 부위에서 1개 이상의 코돈의 반복적인 삽입을 가능하게 하도록 다중의 3개의 뉴클레오티드가 표적 부위에 삽입될 수 있도록 설계될 것이다.
병행하여, 또 다른 숙주 이. 콜라이 균주는 1개 이상의 코돈의 제거를 주형화하여 진화 동안 루프 크기를 축소시킬 수 있는 PEgRNA를 포함할 수 있다. PACE 실험은 루프 서열의 느리고 제어된 부가 또는 제거를 허용하기 위해 둘 다의 균주의 혼합물을 이용하거나 또는 둘을 교대할 수 있다.
이러한 기술은 또한 항체의 진화에 적용될 수 있음에 주목한다. 항체를 지배하는 결합 원리는 모노바디를 지배하는 것과 매우 유사하다: 항체 보체-결정 영역 루프의 길이는 그의 결합 기능에 중요하다. 추가로, 보다 긴 루프 길이는 HIV-1 및 다른 바이러스 감염에 대한 광범위한 보호 활성을 갖는 희귀 항체의 개발에 중요한 것으로 확인되었다9. 항체 또는 항체-유래 분자에 대한 상기 기재된 바와 같은 PE의 적용은 다양한 루프 길이 및 다양화된 루프 서열을 갖는 항체의 생성을 허용할 것이다. PACE와 조합하여, 이러한 접근법은 표준 PACE에 접근가능하지 않은 루프 기하구조를 통해 증진된 결합을 허용할 것이고, 따라서 고도로 기능적인 항체의 진화를 허용할 것이다.
실험은 연속 진화에서 PE를 사용하는데 필요한 제1 단계인 파지-보조 비-연속 진화 (PANCE)에서 박테리오파지 M3 내의 유해 돌연변이를 교정하기 위해 PE를 사용하는 능력을 보여줄 것이다 (도 69 참조).
실시예 7에 대한 참고문헌
하기 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00372
실시예 8 - PE에 의한 이뮤노에피토프 삽입
CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 정확한 게놈 표적화 기술은 최근, 조작된 DNA 서열의 표적화된 게놈 유전자좌 내로의 삽입을 포함한 광범위한 적용에서 연구되었다. 이전에는 상동성-지정 복구 (HDR)가 이러한 적용에 사용되어 왔으며, 이는 ssDNA 공여자 주형 및 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB)에 의한 복구 개시를 필요로 하였다. 이러한 전략은 세포에서 이루어지는 가장 넓은 범위의 가능한 변화를 제공하고, 대형 DNA 서열을 포유동물 세포 내로 삽입하는데 이용가능한 유일한 방법이다. 그러나, HDR은 그의 개시 DSB로부터 초래되는 바람직하지 않은 세포 부작용, 예컨대 높은 수준의 indel 형성, DNA 전위, 대형 결실, 및 P53 활성화에 의해 방해받는다. 이들 결점에 더하여, HDR은 많은 세포 유형에서의 낮은 효율에 의해 제한된다 (T 세포는 이러한 관찰에 대한 주목할 만한 예외임). 이들 단점을 극복하기 위한 최근의 노력은 인간 Rad51 돌연변이체를 Cas9 D10A 닉카제에 융합시켜 (RDN), 개선된 HDR 생성물:indel 비 및 보다 낮은 오프 타겟 편집을 특색으로 하는 DSB-부재 HDR 시스템을 생성하는 것을 포함하지만, 이는 여전히 세포-유형 의존성 및 단지 보통의 HDR 편집 효율에 의해 방해받는다.
PEgRNA와 커플링된 리버스 트랜스크립타제에 대한 Cas9의 최근에 개발된 융합체 ("프라임 편집제")는 부위-특이적 방식으로 임의의 단일 뉴클레오티드 치환을 설치하고 임의의 짧은 스트레치의 뉴클레오티드 (최대 적어도 수십개의 염기)를 삽입 또는 결실시키는 능력을 포함하여, 기존의 게놈 편집 방법에 비해 다수의 이점을 제공하는 신규한 게놈 편집 기술을 나타낸다. 특히, PE 편집은 일반적으로 낮은 비율의 비의도된 indel로 달성된다. 따라서, PE는 이전에 불가능하였거나 비실용적이었던 표적화된 삽입-기반 편집 적용을 가능하게 한다.
이러한 특정한 발명은 공지된 면역원성 에피토프를 내인성 또는 외래 게놈 DNA에 삽입하여, 치료 또는 생명공학적 적용을 위한 상응하는 단백질의 변형을 발생시키는 수단으로서 프라임 편집을 사용하는 방법을 기재한다 (도 31 및 32 참조). 프라임 편집의 발명 전에, 이러한 삽입은 단지 비효율적으로, DSB로부터의 높은 비율의 indel 형성으로 달성될 수 있다. 프라임 편집은 일반적으로 HDR보다 더 높은 효율을 제공하면서 삽입 편집으로부터의 높은 indel 형성의 문제를 해결한다. 이러한 보다 낮은 비율의 indel 형성은, 특히 면역원성 에피토프를 삽입하는 기재된 적용에서 표적화된 DNA 삽입을 위한 방법으로서 HDR에 비해 프라임 편집의 주요 이점을 제공한다. 에피토프의 길이는 수개의 염기 내지 수백개의 염기의 범위이다. 프라임 편집제는 포유동물 세포에서 이러한 표적화된 삽입을 달성하기 위한 가장 효율적이고 가장 흠없는 기술이다.
본 발명의 주요 개념은 이전에 기재된 면역원성 에피토프를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 내인성 또는 외래 게놈 DNA 내에 그의 단백질 생성물 및/또는 발현 세포 유형의 하향조절 및/또는 파괴를 위해 삽입하기 위한 프라임 편집제의 사용이다. 면역원성 에피토프 삽입을 위한 뉴클레오티드 서열은 표적화된 유전자의 코딩된 단백질 및 삽입된 면역원성 에피토프의 상응하는 단백질 번역의 융합 단백질을 생산하는 방식으로 유전자에 표적화될 것이다. 환자의 면역계는 예를 들어 파상풍 또는 디프테리아 또는 홍역에 대한 상용 백신접종으로부터의 표준 사전 면역화의 결과로서 이들 에피토프를 인식하도록 이전에 훈련되었을 것이다. 융합된 에피토프의 면역원성 성질의 결과로서, 환자의 면역계는 프라임 편집된 단백질 (삽입된 에피토프만이 아님) 및 잠재적으로 그것이 발현되는 세포를 인식하고 이를 무력화할 것으로 예상될 것이다.
표적화된 유전자에 대한 융합은 삽입된 에피토프 단백질 번역이 면역계 인식을 위해 노출되는 것을 보장하기 위해 필요에 따라 조작될 것이다. 이는 표적화된 유전자에 대한 면역원성 에피토프의 C-말단 융합체, 표적화된 유전자에 대한 면역원성 에피토프의 N-말단 융합체, 또는 면역원성 에피토프가 단백질 구조의 표면-노출 영역 내에 코딩되도록 하는 유전자 내로의 뉴클레오티드의 삽입을 생성하는 단백질 번역을 발생시키는 표적화된 뉴클레오티드 삽입을 포함할 수 있다.
표적 유전자 서열과 삽입된 면역원성 에피토프 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입된 뉴클레오티드로서 코딩된 단백질 링커는 표적화된 유전자의 면역계 인식, 세포 트래픽킹, 단백질 기능, 또는 단백질 폴딩을 용이하게 하기 위해 본 발명의 일부로서 조작될 필요가 있을 수 있다. 이들 삽입된 뉴클레오티드-코딩된 단백질 링커는 XTEN 링커의 가변 길이 및 서열 또는 글리신-세린 링커의 가변 길이 및 서열을 포함할 수 있다 (그러나 이에 제한되지는 않음). 이들 조작된 링커는 단백질 융합을 성공적으로 용이하게 하기 위해 이전에 사용되었다.
본 발명의 구별되는 특색은 특정 아미노산 서열에 대해 이전에 획득된 면역 반응을 달리 비-면역원성 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 수단으로서 사용하는 능력을 포함한다. 또 다른 구별되는 특색은 부산물 편집으로서 원치 않는 indel을 높은 수준으로 유도하지 않고 그의 삽입에 있어서 효율적인 방식으로 이들 면역원성 에피토프의 뉴클레오티드 서열을 표적에 삽입하는 능력이다. 본원에 논의된 본 발명은 또한 세포 유형-특이적 전달 방법 (예컨대 AAV 혈청형)을 조합하여 관심 세포 유형 내에 에피토프를 삽입하여 그에 대한 면역 반응을 촉발하는 능력을 갖는다.
면역원성 에피토프를 병원성 유전자 내로 삽입하는 수단으로서의 프라임 편집은 환자의 면역계가 매우 다양한 질환 (면역-종양학 전략에 의하는 것과 같이 암으로 제한되지는 않음)과 싸우도록 프로그램화하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술의 즉각적인 관련 사용은 관련 종양유전자 예컨대 HER2 또는 성장 인자 예컨대 EGFR에 대한 면역 반응을 유발함으로써 종양의 면역 회피 메카니즘을 손상시킬 수 있기 때문에, 암 치료제로서의 사용일 것이다. 이러한 접근법은 T-세포 조작과 유사한 것으로 보일 수 있지만, 이러한 접근법의 한가지 신규 진전은 이것이 조작된 T-세포를 생성하여 환자 내로 도입할 필요 없이 많은 세포 유형에서, 그리고 암 이외의 질환에 대해 사용될 수 있다는 것이다.
PE를 사용하여 대부분의 사람들이 이미 백신접종된 면역원성 에피토프 (파상풍, 백일해, 디프테리아, 홍역, 볼거리, 풍진 등)를 질환을 구동하는 외래 또는 내인성 유전자 내로 삽입하여, 환자의 면역계가 그러한 단백질을 무력화하도록 학습시킨다.
상기 언급된 전략으로부터 잠재적 치료 이익을 갖는 것으로 여겨지는 질환은, 예컨대 치명적 가족성 불면증에서 독성 단백질의 응집에 의해 유발되는 것을 포함한다. 유익할 수 있는 다른 질환은 달리 비독성인 내인성 단백질의 병원성 과다발현에 의해 유발되는 것, 및 외래 병원체에 의해 유발되는 것을 포함한다.
1차 치료 적응증은 상기 언급된 것, 예컨대 암, 프리온 및 다른 신경변성 질환, 감염성 질환을 위한 치료, 및 예방적 의학을 포함한다. 2차 치료 적응증은 후기-발병 유전 질환을 갖는 환자에 대한 예방적 관리를 포함할 수 있다. 현행 표준 관리 의학은 일부 질환, 예컨대 특히 공격성 암에 대해, 또는 의약이 질환 증상의 완화를 돕는 경우에 질환이 완전히 치유될 때까지 프라임 편집과 함께 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
하기는 프라임 편집에 의해 삽입될 수 있는 면역원성 에피토프의 예이며, 이는 하기를 달성하는데 사용될 수 있다:
Figure pct00373
Figure pct00374
Figure pct00375
Figure pct00376
하기는 이뮤노에피토프 태그부착을 위한 표적 유전자 내로 통합될 수 있는 에피토프의 추가의 예이다:
실시예 8에 인용된 참고문헌
하기 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
Figure pct00377
실시예 9 - PE 작용제의 생체내 전달
CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 정확한 게놈 표적화 기술은 최근, 유전자 요법을 포함한 광범위한 적용에서 연구되었다. 유전자 요법에서의 Cas9 및 Cas9-기반 게놈-편집 작용제의 적용에 대한 주요 제한은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 통한 그의 효율적인 전달을 방해하는 Cas9의 크기 (>4 kb)이다. 리버스 트랜스크립타제에 대한 Cas9의 최근에 개발된 융합체 ("프라임 편집제")는 부위-특이적 방식으로 임의의 단일 뉴클레오티드 치환을 설치하고 임의의 임의적으로-규정된 짧은 (<~20) 스트레치의 뉴클레오티드를 삽입 또는 결실시키는 능력을 포함하여, 기존의 게놈 편집 방법에 비해 다수의 이점을 보유하는 신규한 게놈 편집 기술을 나타낸다. 따라서, 본 방법은 이전에 교정에 난치성이었던 인간 병원성 변이체의 편집을 가능하게 한다. 프라임 편집 시약의 전달은 인간 질환을 유발하는 유전자 서열의 교정을 가능하게 할 수 있거나, 또는 질환-예방 유전자 변이체의 설치를 허용할 수 있다.
본 발명은 프라임 편집제를 세포 내로 시험관내 및 생체내 전달하는 방법을 기재한다. 프라임 편집제는 배양된 세포에서만 개발되고 특징화되었다. 공지된 방법은 프라임 편집제를 생체내 전달할 수 없다. rAAV 또는 사전-조립된 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 통해 프라임 편집제를 전달하는 본원에 개시된 방법은 생체내 전달에 대한 여러 장벽을 극복할 것이다. 예를 들어, 프라임 편집제를 코딩하는 DNA는 rAAV 패키징 제한보다 더 크고, 따라서 특별한 해결책을 필요로 한다. 하나의 이러한 해결책은 세포에 공동-전달되는 경우에 기능적 편집제 단백질을 재구성하는 2개의 개별 rAAV 입자 내로 패키징된 분할 인테인 쌍에 융합된 편집제를 제제화하는 것이다. 제2-부위 닉킹 표적의 최적화 및 렌티바이러스 및 rAAV를 포함한 바이러스 벡터 내로의 프라임 편집제의 적절한 패키징을 포함한, 프라임 편집의 고유한 특색을 설명하기 위한 여러 다른 특별한 고려사항이 기재된다.
구별되는 특색은 리보핵단백질 (RNP) 전달 제제를 사용하는 것을 포함하고, 프라임 편집제 및 근처의 닉킹 표적은 그의 특이적 sgRNA / PEgRNA와 사전-복합체화될 수 있다. 이는 가능한 표적화가능한 부위의 범위를 증진시킬 것이고, DNA 전달을 사용한 현재 데이터에 비해 편집 효율의 보다 큰 최적화를 가능하게 할 것이다. RNP 또는 mRNA 전달 제제를 사용하여, 각각 그 자신의 가이드 RNA 변이체와 복합체화한 변이체 Cas 단백질을 사용할 수 있다. 이는 또한 잠재적인 닉킹 유전자좌의 보다 큰 다양성을 허용할 것이므로, 임의의 주어진 적용에서 보다 큰 효율을 위한 최적화가 달성될 수 있을 것으로 예상된다. RNP를 사용하는 것은, 이전 RNP 보고에 기초하여 편집 특이성을 증가시킬 것으로 예상된다 (Rees et al., 2017). 이는 오프-타겟 프라임 편집을 감소시킬 것이다. 생체내 또는 생체외 전달을 위해 프라임 편집제를 2개의 AAV 벡터로 분할하기 위한 잠재적 아키텍처가 기재된다. 프라임 편집제를 이중 AAV 시스템 내로 패키징하는 것은 분할 부위, 재구성 방법 (예컨대 인테인), 및 가이드 발현 아키텍처를 포함한 설계 고려사항의 최적화를 필요로 한다. 프라임 편집제의 전달을 위해 바이러스 및 RNP의 혼합물을 사용하는 것은, RNP가 더 이상 공급되지 않은 후에는 RNP가 결국 생체내에서 분해되어 프라임 편집이 정지될 것이기 때문에 편집이 시간 경과에 따라 제어될 것으로 예상된다.
프라임 편집제 리보핵단백질 (RNP), 프라임 편집제 가이드 RNA 동반 mRNA, 또는 DNA는 지질 나노입자, rAAV, 또는 렌티바이러스 내로 패키징될 수 있고, 인간 질환의 동물 모델을 확립하고, 인간 질환의 동물 모델에서 치료적 및 과학적 가설을 시험하고, 인간에서 질환을 치료하기 위한 목적을 포함하여, 생체내 및 생체외에서 게놈 DNA를 변경시키기 위해 주사, 섭취, 또는 흡입될 수 있다.
생체내 관련 세포 유형으로의 적합한 전달 수단이 개발되는 경우에, 프라임 편집제는 모든 유전 질환의 큰 분율 (클린바(Clinvar)에서 병원성 인간 유전자 변이체의 ~89%)을 교정하는데 실현가능하게 사용될 수 있다. 혈액 질환, 망막 질환, 및 간 질환은 다른 시약에 대한 확립된 전달 시스템으로 인해 가장 가능성 있는 최초의 적용분야이다. AAV 캡시드, 다른 진화된 또는 조작된 바이러스 벡터, 및 지질 나노입자 제제는 본 발명과 조합되어 사용될 필요가 있을 것이다.
특정 실시양태에서, 프라임 편집제 도메인 (예를 들어, napDNAbp 도메인 또는 RT 도메인) 중 1개 이상은 인테인 서열로 조작될 수 있다.
실시예 10 - 오프-타겟 편집의 확인을 위한 PE의 사용
프라임 편집제를 사용하여 오프-타겟 편집을 검출하는 방법은 현재 기재된 바 없다 (프라임 편집 자체가 아직 공개되지 않았음). 이들 방법은 연구원이 프라임 편집제를 사용하여 오프-타겟 편집의 잠재적 부위를 확인하는 것을 가능하게 할 것이며, 이는 이러한 기술을 환자에서 유전 질환을 치료하는데 사용할 경우 중요한 고려사항일 것이다.
본원에 기재된 방법은 또한 Cas 뉴클레아제의 오프-타겟을 확인하는데 유용할 수 있다. 이들 오프-타겟은 이전에 BLESS, 가이드-Seq, 서클-Seq, 및 디게놈-Seq(Digenome-Seq)를 사용하여 확인되었다. 그러나, 본 방법은 감도 및 과정의 단순성에 있어서 유리하다.
이러한 측면의 주요 개념은 Cas 뉴클레아제 또는 프라임 편집제의 게놈 오프-타겟 변형 부위의 신속한 확인을 가능하게 하기 위해, PEgRNA로부터 주형화된 어댑터 서열 또는 프라이머 결합 부위를 삽입하기 위해 프라임 편집을 사용하는 아이디어이다.
프라임 편집 오프-타겟 부위를 비편향 방식으로 확인하는 방법은 공지되어 있지 않다. 본 방법은 어댑터 서열이 DNA 결합 및 닉킹과 동일한 사건으로 삽입되어 하류 프로세싱을 단순화하기 때문에 뉴클레아제 오프-타겟 부위를 확인하는 다른 기술과 구별된다.
본 발명은 조직 배양 또는 동물 모델에서 살아있는 세포 내부에서 편집할 때의 오프-타겟 편집 부위의 확인을 포함한다 (도 33 참조). 본 방법을 수행하기 위해, 최종 목적 편집제와 동일한 프로토스페이서 (및, 프라임 편집 오프-타겟을 검토하는 경우에, 최종 목적 편집제와 동일한 프라이머-결합 부위 서열)를 갖지만, 프라임 편집에 의한 역전사 후에 어댑터 또는 프라이머 결합 부위를 설치하는데 필요한 서열을 포함하는 PEgRNA를 생성한다. 생체내 편집은 프라임 편집제 또는 RT-융합된 뉴클레아제를 사용하여 수행되고, 게놈 DNA를 단리한다. 게놈 DNA는 효소적 또는 기계적 수단에 의해 단편화되고, DNA 단편화 부위에 상이한 어댑터를 부가한다. PCR을 사용하여 하나의 어댑터로부터 PEgRNA를 통해 설치된 어댑터까지 증폭시킨다. 생성된 생성물을 심층-서열분석하여 모든 변형된 부위를 확인한다.
본 발명은 또한 게놈 DNA의 시험관내 변형을 사용한 오프-타겟 편집 부위의 확인을 포함한다 (도 33 참조). 이러한 방법을 수행하기 위해, 어댑터 또는 프라이머 결합 서열을 설치할 정제된 프라임 편집제 단백질의 RNP 및 PEgRNA가 조립되며, 이는 그 외에는 관심 PEgRNA와 동일하다. 이러한 RNP는 DNA의 단편화 및 DNA 파괴 부위에의 상이한 어댑터의 부착 전 또는 후에 추출된 게놈 DNA와 함께 인큐베이션된다. PCR을 사용하여 단편화된 부위로부터 PE에 의해 설치된 어댑터까지 증폭시킨다. 변형 부위를 확인하기 위한 심층 서열. 세포 DNA 복구는 프라임 편집제에 의해 부가된 역전사된 DNA 어댑터를 결코 제거하지 않을 것이기 때문에 이러한 시험관내 편집 방법은 검출 감도를 증진시켜야 한다.
이들 방법은 임의의 프라임 편집제, 또는 표적 절단 부위 (대부분의 Cas 뉴클레아제)를 인식하기 위해 가이드RNA를 사용하는 임의의 게놈 편집제에 대한 오프-타겟 편집을 확인하는데 사용될 수 있다.
이들 방법은 게놈 편집제를 치료에 사용하는 것이 고려되는 모든 유전 질환에 적용될 수 있다.
실시예 11 - 생체내 표적 단백질의 화학적-유도된 이량체화를 가능하게 하기 위한 PE의 사용
본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 프라임 편집을 사용한 소분자 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 게놈 통합에 의해 편리한 소분자 약물의 제어 하에 이량체화-유도된 생물학적 과정, 예컨대 수용체 신호전달을 배치하는데 사용될 수 있고, 이는 본원에 기재된다. 본원에 기재된 프라임 편집제를 사용하여, 소분자 결합 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 살아있는 세포 또는 환자에서 관심 표적 단백질을 코딩하는 유전자 내에 삽입될 수 있다. 이러한 편집 단독은 생리학적 효과를 갖지 않아야 한다. 전형적으로 각각이 표적 단백질의 카피에 융합된 2개의 약물-결합 단백질 도메인에 동시에 결합할 수 있는 이량체 소분자인 소분자 약물의 투여 시, 소분자는 표적화된 단백질의 이량체화를 유도한다. 이어서, 이러한 표적 단백질 이량체화 사건은 생물학적 신호전달 사건, 예컨대 적혈구생성 또는 인슐린 신호전달을 유도한다.
실시예 12 - 프라임 편집: 이중 가닥 DNA 파괴가 없는, 인간 세포에서의 고도로 다재다능하고 정확한 검색-및-대체 게놈 편집
현재의 게놈 편집 방법은 프로그램가능한 뉴클레아제를 사용하여 이중 가닥 DNA 파괴의 부산물을 동반하면서 표적 유전자를 붕괴시키거나, 결실시키거나, 또는 삽입하고, 염기 편집제를 사용하여 표적 유전자좌에 4개의 전이 점 돌연변이를 설치할 수 있다. 그러나, 작은 삽입, 작은 결실, 및 8개의 전환 점 돌연변이는 집합적으로 대부분의 병원성 유전자 변이체를 나타내지만, 대부분의 세포 유형에서 과잉의 부산물 없이 효율적으로 교정될 수 없다. 표적 부위를 명시하고 또한 목적하는 편집을 코딩하는 조작된 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)에 의해 프로그램화된, 조작된 리버스 트랜스크립타제에 융합된 촉매적으로 손상된 Cas9를 사용하여 새로운 유전자 정보를 명시된 DNA 부위 내로 직접 기록하는, 고도로 다재다능하고 정확한 게놈 편집 방법인 프라임 편집이 본원에 기재된다. 프라임 편집이 표적화된 삽입, 결실, 모든 12가지의 가능한 유형의 점 돌연변이, 및 그의 조합을 효율적으로 (전형적으로, 비분류된 세포에서 20-60%, 최대 77%), 적은 부산물 (전형적으로, 1-10%)로, 이중 가닥 파괴 또는 공여자 DNA 주형을 필요로 하지 않으면서 만들 수 있다는 것을 확립하기 위해 인간 세포에서 175가지 초과의 별개의 편집을 수행하였다. 프라임 편집은 겸상 적혈구 질환 (HBB에서 A·T에서 T·A로의 전환을 필요로 함) 및 테이-삭스병 (HEXA에서 4-염기 결실을 필요로 함)의 1차 유전적 원인을 교정하기 위해 인간 세포에서 적용되었으며, 둘 다의 경우에서 병원성 게놈 대립유전자는 야생형으로, 최소 부산물로 효율적으로 복귀되었다. 또한 프라임 편집을 사용하여 이들 병원성 HBB 전환 및 HEXA 삽입 돌연변이를 갖는 인간 세포주를 생성하고, 프리온 질환에 대한 저항성을 부여하는 (G·C에서 T·A로의 전환을 필요로 함) PRNP 내에 G127V 돌연변이를 설치하고, His6 태그, FLAG 에피토프 태그, 및 연장된 LoxP 부위를 인간 세포의 표적 유전자좌 내로 효율적으로 삽입하였다. 프라임 편집은 HDR에 비해 효율 및 생성물 순도 이점, 및 염기 편집과 비교하여 상보적 강점 및 약점을 제공한다. 3개의 별개의 염기-쌍형성 사건을 필요로 하는 그의 검색-및-대체 메카니즘과 일치하게, 프라임 편집은 Cas9보다 공지된 Cas9 오프-타겟 부위에서 오프-타겟 DNA 변형에 훨씬 덜 취약하다. 프라임 편집은 게놈 편집의 범주 및 능력을 실질적으로 확장시키고, 원칙적으로 공지된 병원성 인간 유전자 변이체의 ~89%를 교정할 수 있다.
임의의 살아있는 세포 또는 유기체의 게놈에서 실질적으로 임의의 표적화된 변화를 만드는 능력은 생명 과학의 오랜 열망이다. 게놈 편집 기술의 급속한 진보에도 불구하고, 질환과 연관된 >75,000개의 공지된 인간 유전자 변이체의 대다수는111 대부분 치료상 적절한 세포에서 교정되거나 설치될 수 없다 (도 38a). 프로그램가능한 뉴클레아제, 예컨대 CRISPR-Cas9는 표적 부위에서 삽입 및 결실 (indel)의 혼합을 유도함으로써 유전자를 파괴할 수 있는 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB)를 만든다112-114. 뉴클레아제는 또한 상동성-비의존성 과정을 통해 표적 유전자를 결실시키거나115,116, 또는 외인성 유전자를 삽입하는데117-119 사용될 수 있다. 그러나, 이중 가닥 DNA 파괴는 또한 생성물의 복합 혼합물, 전위120, 및 p53 활성화121,122를 비롯한 바람직하지 않은 결과와 연관된다. 또한, 대다수의 병원성 대립유전자는 교정을 위해 훨씬 더 정확한 편집 기술을 필요로 하는 작은 삽입, 결실, 또는 염기 치환에 의해 그의 비-병원성 대응물과 상이하다 (도 38a). 뉴클레아제-유도된 DSB에 의해 자극된 상동성-지정 복구 (HDR)123는 다양한 정확한 DNA 변화를 설치하는데 널리 사용되어 왔다. 그러나, HDR은 외인성 공여자 DNA 복구 주형에 의존하고, 전형적으로 DSB의 단부-연결 복구로부터 과량의 indel 부산물을 생성하고, 대부분의 치료상 적절한 세포 유형에서 비효율적이다 (T 세포 및 일부 줄기 세포는 중요한 예외임)124,125. DSB-매개된 게놈 편집의 효율 및 정밀도를 증진시키는 것은 유망한 노력 포커스로 남아있지만126-130, 이들 도전과제는 대안적 정밀 게놈 편집 전략의 탐구를 필요로 한다.
염기 편집은 포유동물을 포함한 매우 다양한 세포 유형 및 유기체에서 DSB를 필요로 하지 않으면서 4가지 유형의 전이 돌연변이 (C에서 T로, G에서 A로, A에서 G로, 및 T에서 C로)를 효율적으로 설치하거나 교정할 수 있지만128-131, 현재 8가지 전환 돌연변이 (C에서 A로, C에서 G로, G에서 C로, G에서 T로, A에서 C로, A에서 T로, T에서 A로, 및 T에서 G로) 중 임의의 것, 예컨대 겸상 적혈구 질환의 가장 흔한 원인을 직접 교정하는데 필요한 T·A에서 A·T 돌연변이 (HBB E6V)는 달성할 수 없다132. 또한, 표적 결실, 예컨대 테이-삭스병을 유발하는 4-염기 중복의 제거 (HEXA 1278+TATC)133, 또는 표적화된 삽입, 예컨대 낭성 섬유증의 가장 흔한 원인을 직접 교정하는데 요구되는 정확한 3-염기 삽입 (CFTR ΔF508)134을 수행하는 DSB-무함유 방법은 보고된 바 없다. 따라서, 표적화된 전환 점 돌연변이, 삽입, 및 결실은 이들이 집합적으로 대부분의 공지된 병원성 대립유전자를 차지하지만, 대부분의 세포 유형에서 과잉의 부산물 없이 효율적으로 설치하거나 교정하기 어렵다 (도 38a).
이중 가닥 DNA 파괴 또는 공여자 DNA 주형을 필요로 하지 않으면서 인간 세포 내 표적화된 유전자좌에서 표적화된 삽입, 결실, 및 모든 12개의 가능한 염기-대-염기 전환을 매개하는 새로운 "검색-및-대체" 게놈 편집 기술인 프라임 편집의 개발이 본원에 기재된다. 초기에 PE1에 의해 예시된 프라임 편집제는 프로그램가능한 닉카제에 융합된 리버스 트랜스크립타제 및 프라임 편집 연장된 가이드 RNA (PEgRNA)를 사용하여 유전자 정보를 PEgRNA 상의 연장부로부터 표적 게놈 유전자좌 내로 직접 카피한다. 제2 세대 프라임 편집제 (PE2)는 조작된 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 최소 (전형적으로 <2%) indel 형성 하에 편집 효율을 실질적으로 증가시키는 한편, 제3 세대 PE3 시스템은 제2 가이드 RNA를 부가하여 비-편집된 가닥을 닉킹함으로써, 비-편집된 가닥의 대체를 선호하고, 추가로 편집 효율을 약 1-10% indel 형성 하에 인간 세포에서 전형적으로 약 20-50%로 증가시킨다. PE3은 최적화된 Cas9 뉴클레아제-개시된 HDR과 비교하여 훨씬 더 적은 부산물 및 더 높거나 유사한 효율을 제공하고, 현-세대 염기 편집제와 비교하여 상보적 강점 및 약점을 제공한다.
PE3은 HBB E6V의 야생형 HBB로의 효율적인 전환, HEXA 1278+TATC를 야생형 HEXA로 복원하기 위한 삽입된 TATC의 결실, 프리온 질환135에 대한 저항성을 부여하는 (G·C에서 T·A로의 전환을 필요로 함) G127V 돌연변이의 PRNP 내 설치, 및 His6 태그 (18 bp), FLAG 에피토프 태그 (24 bp), 및 Cre-매개된 재조합을 위한 연장된 LoxP 부위 (44 bp)의 표적화된 삽입을 달성하기 위해 인간 HEK293T 세포 내의 게놈 유전자좌에 적용되었다. 프라임 편집은 또한 3종의 다른 인간 세포주, 뿐만 아니라 유사분열후 1차 마우스 피질 뉴런에서 다양한 효율로 성공적이었다. 초기 닉과 편집 위치 사이의 거리에서의 높은 유연성 정도로 인해, 프라임 편집은 Cas9의 PAM 요건에 의해 실질적으로 제약받지 않고, 원칙적으로 대다수의 게놈 유전자좌를 표적화할 수 있다. 오프-타겟 프라임 편집은 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌에서 오프-타겟 Cas9 편집보다 훨씬 드물고, 이는 아마도 생산적 프라임 편집이 일어나기 위한 3개의 별개의 DNA 염기 쌍형성 사건의 요건 때문일 것이다. DSB 또는 공여자 DNA 주형에 대한 필요 없이 매우 다양한 게놈 유전자좌에서 정확한 표적화된 삽입, 결실, 및 모든 12가지의 가능한 부류의 점 돌연변이를 가능하게 함으로써, 프라임 편집은 많은 유전자 변이체의 연구 및 교정을 진행시킬 잠재력을 갖는다.
결과
연장된 가이드 RNA로부터 표적 DNA 유전자좌로 정보를 전달하기 위한 전략
Cas9는 표적 DNA 부위에 혼성화하는 스페이서 서열을 함유하는 가이드 RNA를 사용하여 DNA를 표적화한다112-114,136,137. 목표는 천연 CRISPR 시스템에서와 같이 DNA 표적을 명시하고138,139, 또한 표적 유전자좌에서 상응하는 DNA 뉴클레오티드를 대체하는 새로운 유전자 정보를 함유하도록 가이드 RNA를 조작하는 것이었다. 연장된 가이드 RNA로부터 명시된 DNA 부위로의 유전자 정보의 직접 전달에 이은 원래의 비편집된 DNA의 대체는, 원칙적으로 DSB 또는 공여자 DNA 주형에 대한 의존없이 살아있는 세포에 표적화된 DNA 서열 변화를 설치하는 일반적 수단을 제공할 수 있다. 이러한 직접 정보 전달을 달성하기 위해, 목표는 표적 부위에서 닉킹된 게놈 DNA를 사용하여 3'-히드록실 기를 노출시키고, 조작된 가이드 RNA (이하에서 프라임 편집 가이드 RNA 또는 PEgRNA로 지칭됨) 상의 연장부로부터 표적 부위 내로 직접 유전자 정보의 역전사를 프라이밍하는 것이었다 (도 38a).
일부 천연 이동형 유전 요소에 의해 사용되는 메카니즘과 유사한140, 닉킹 및 역전사의 이들 초기 단계는 1개의 가닥 상에 2개의 중복 단일 가닥 DNA 플랩: 비편집된 DNA 서열을 함유하는 5' 플랩, 및 PEgRNA로부터 카피된 편집된 서열을 함유하는 3' 플랩을 갖는 분지형 중간체를 생성한다 (도 38b). 성공적인 편집을 달성하기 위해, 이 분지형 중간체는 편집된 3' 플랩이 비편집된 5' 플랩을 대체하도록 분해되어야 한다. 편집된 3' 플랩이 비편집된 가닥과 더 적은 염기 쌍을 만들 수 있기 때문에 5' 플랩과 비편집된 가닥의 혼성화가 열역학적으로 선호될 가능성이 있지만, 5' 플랩은 지체-가닥 DNA 합성 및 긴-패치 염기 절제 복구 동안 생성된 5' 플랩을 절제하는 구조-특이적 엔도뉴클레아제, 예컨대 FEN1141에 대한 바람직한 기질이다. 우선적 5' 플랩 절제 및 3' 플랩 라이게이션이 편집된 DNA 가닥의 혼입을 구동시켜, 1개의 편집된 가닥 및 1개의 비편집된 가닥을 함유하는 헤테로듀플렉스 DNA를 생성할 수 있는 것으로 추론되었다 (도 38b).
편집의 영구적 설치는 편집된 가닥 내의 정보를 상보적 DNA 가닥에 카피하는 방식으로 2개의 DNA 가닥 사이의 미스매치를 분해하는 후속 DNA 복구로부터 발생할 수 있다 (도 38c). DNA 염기 편집의 효율을 최대화하기 위해 개발된 유사한 전략에 기초하여131-133, 비-편집된 DNA 가닥을, 이중 가닥 파괴 형성을 최소화하기 위해 초기 닉의 부위로부터 충분히 멀리에서 닉킹하는 것은 DNA 복구를 비-편집된 가닥을 우선적으로 대체하는 것으로 편향시킬 수 있는 것으로 고려되었다.
시험관내 및 효모 세포에서의 프라임 편집 단계의 검증
Cas9의 RuvC 뉴클레아제 도메인에 의한 PAM-함유 DNA 가닥의 절단 후에, 이 가닥의 PAM-원위 단편은 달리 안정한 Cas9:sgRNA:DNA 복합체로부터 해리될 수 있다143. 이러한 유리된 가닥의 3' 단부는 DNA 중합을 프라이밍하기 위해 충분히 접근가능할 수 있는 것으로 가설화되었다. 가이드 RNA 조작 노력144-146 및 Cas9:sgRNA:DNA 복합체의 결정 구조147-149는 sgRNA의 5' 및 3' 말단이 Cas9:sgRNA 활성을 없애지 않고 연장될 수 있음을 시사한다. PEgRNA는 2개의 중요한 성분: 닉킹된 DNA 가닥의 3' 단부가 PEgRNA에 혼성화하도록 하는 프라이머 결합 부위 (PBS), 및 닉킹된 DNA 가닥의 3' 단부가 폴리머라제에 의해 RNA 주형에 걸쳐 연장됨에 따라 게놈 DNA 부위 내로 직접 카피될 목적하는 편집을 함유하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형을 포함하도록 sgRNA를 연장시킴으로써 설계되었다 (도 38c).
이들 가설을 정제된 에스. 피오게네스 Cas9 단백질을 사용하여 시험관내에서 시험하였다. PBS 서열 (5 내지 6개의 뉴클레오티드, nt) 및 RT 주형 (7 내지 22개의 nt)을 갖는 어느 하나의 말단 상의 sgRNA를 연장시킴으로써 일련의 PEgRNA 후보를 구축하였다. 5'-연장된 PEgRNA는 표적 DNA에 대한 Cas9 결합을 지시하고, 5'-연장된 PEgRNA 및 3'-연장된 PEgRNA 둘 다는 시험관내에서 Cas9-매개된 표적 닉킹 및 포유동물 세포에서 DNA 절단 활성을 지지한다는 것이 확인되었다 (도 44a-44c). 이들 후보 PEgRNA 설계를 사전-닉킹된 5'-Cy5-표지된 dsDNA 기질, 촉매 기능상실 Cas9 (dCas9), 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV) 리버스 트랜스크립타제의 상업적 변이체를 사용하여 시험하였다 (도 44d). 모든 성분이 존재할 때, RT 주형을 따른 역전사와 일치하는, 형광 표지된 DNA 가닥의 겔 이동성을 갖는 보다 긴 DNA 생성물로의 효율적인 전환이 관찰되었다 (도 38d, 도 44d-44e). 5'-연장된 또는 3'-연장된 PEgRNA에 의해 목적하는 길이의 생성물이 형성되었다 (도 38d-38e). dCas9의 생략은 DNA 주형 상에서의 리버스 트랜스크립타제-매개된 DNA 중합으로부터 유래된 닉 번역 생성물을 발생시켰고, PEgRNA 정보 전달은 없었다 (도 38d). PEgRNA를 통상적인 sgRNA로 대체한 경우 어떠한 DNA 중합 생성물도 관찰되지 않았고, 이는 PEgRNA의 PBS 및 RT 주형 성분의 필요성을 확인시켜준다 (도 38d). 이들 결과는 Cas9-매개된 DNA 용융이, 닉킹되는 경우에 5'-연장된 또는 3'-연장된 PEgRNA로부터의 역전사를 프라이밍하는데 적격인 단일 가닥 R-루프를 노출시킨다는 것을 입증한다.
다음으로, 비-닉킹된 dsDNA 기질을 PAM-함유 가닥만을 독점적으로 닉킹하는 Cas9 닉카제 (H840A 돌연변이체)를 사용하여 시험하였다112. 이들 반응에서, 5'-연장된 PEgRNA는 아마도 손상된 Cas9 닉카제 활성으로 인해 역전사 생성물을 비효율적으로 생성하였다 (도 44f). 그러나, 3'-연장된 PEgRNA는 강건한 Cas9 닉킹 및 효율적인 역전사를 가능하게 하였다 (도 38e). 3'-연장된 PEgRNA의 사용은, 원칙적으로 역전사가 PEgRNA의 나머지 내의 어디에서든 종결되는 잠재력에도 불구하고, 단지 단일의 명백한 생성물만을 생성하였다. Cas9 닉카제, RT, 및 3'-연장된 PEgRNA와의 반응 생성물의 DNA 서열분석은 완전한 RT 주형 서열이 DNA 기질로 역전사되었음을 밝혀내었다 (도 44g). 이들 실험은 3'-연장된 PEgRNA가 Cas9 닉카제 활성을 지시하는 능력을 보유하면서 새로운 DNA 가닥의 역전사의 주형이 될 수 있다는 것을 확립하였다.
시험관내 PEgRNA-프로그램화된 역전사에 의해 생산된 3' 플랩의 진핵 세포 DNA 복구 결과를 평가하기 위해, 시험관내 리포터 플라스미드 기질 상의 PEgRNA, Cas9 닉카제, 및 RT를 사용하여 DNA 닉킹 및 역전사를 수행한 후, 반응 생성물로 효모 (에스. 세레비지아에) 세포를 형질전환시켰다 (도 45a). 고무적으로, 조기 정지 코돈을 교정하는 T·A에서 A·T 전환을 코딩하는 3'-연장된 PEgRNA로 플라스미드를 시험관내 편집한 경우에, 효모 형질전환체의 37%가 GFP 및 mCherry 단백질 둘 다를 발현하였다 (도 38f, 도 45c). 도 38e 및 도 44f의 결과와 일치하게, 5'-연장된 PEgRNA를 사용하여 시험관내 수행된 편집 반응은 3'-연장된 PEgRNA를 사용한 것보다 더 적은 GFP 및 mCherry 이중-양성 콜로니 (9%)를 생성하였다 (도 38f 및 도 45d). 또한 프레임시프트 돌연변이를 교정하기 위해 단일 뉴클레오티드를 삽입하거나 (15% 이중-양성 형질전환체) 또는 단일 뉴클레오티드를 결실시키는 (29% 이중-양성 형질전환체) 3'-연장된 PEgRNA를 사용하여 생산적 편집을 관찰하였다 (도 38f 및 도 45e-45f). 이중-양성 효모 콜로니로부터 회수한 편집된 플라스미드의 DNA 서열분석으로 코딩된 전환 편집이 목적하는 서열 위치에서 일어났음을 확인하였다 (도 45g). 이들 결과는 진핵 세포에서의 DNA 복구가 전환, 삽입, 및 결실을 포함한 정확한 DNA 편집을 혼입하기 위해 프라임 편집으로부터 발생하는 3' DNA 플랩을 분해할 수 있다는 것을 입증한다.
프라임 편집제 1 (PE1)의 설계
시험관내 및 효모에서의 결과에 의해 고무되어, 포유동물 세포에서 게놈 DNA를 편집할 수 있는 최소 개수의 성분을 갖는 프라임 편집 시스템의 개발이 추구되었다. 3'-연장된 PEgRNA (이하 간단히 PEgRNA로 지칭됨, 도 39a) 및 가요성 링커를 통한 리버스 트랜스크립타제에의 Cas9 H840A의 직접 융합체가 기능적 2-성분 프라임 편집 시스템을 구성할 수 있는 것으로 가설화되었다. HEK293T (불멸화 인간 배아 신장) 세포를 Cas9 H840A 닉카제의 어느 하나의 말단에 대한 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 융합체를 코딩하는 하나의 플라스미드, 뿐만 아니라 PEgRNA를 코딩하는 제2 플라스미드로 형질감염시켰다. 초기 시도는 HEK3 표적 유전자좌에서 검출가능한 T·A에서 A·T로의 전환으로 이어지지 않았다.
그러나, PEgRNA에서의 PBS의 8-15개 염기로의 연장 (도 39a)은 HEK3 표적 부위에서의 검출가능한 T·A에서 A·T로의 편집으로 이어졌고 (도 39b), N-말단 RT-Cas9 닉카제 융합체 (1.3% 최대 T·A에서 A·T로의 전환)와 비교하여 RT가 Cas9 닉카제의 C-말단에 융합된 프라임 편집제 구축물의 경우에 효율이 더 높았다 (3.7% 최대 T·A에서 A·T로의 전환, PBS 길이는 8-15 nt 범위임) (도 39b; 본원의 모든 포유동물 세포 데이터는 달리 명시되지 않는 한 선택 또는 분류 없이 전체 처리된 세포 집단에 대한 값을 보고함). 이들 결과는 Cas9에 융합된 야생형 M-MLV RT가 트랜스로 공급된 M-MLV RT의 상업적 변이체를 사용한 경우 시험관내 요구되는 것과 비교하여 인간 세포에서의 게놈 편집을 위해 보다 긴 PBS 서열을 필요로 한다는 것을 시사한다. Cas9 H840A 닉카제의 C-말단에 융합된 이러한 제1 세대 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제를 PE1로 지정하였다.
PEgRNA에 의해 명시된 4개의 추가의 게놈 표적 부위에 전환 점 돌연변이를 정확하게 도입하는 PE1의 능력 (도 39c)을 시험하였다. HEK3 유전자좌에서의 편집과 유사하게, 이들 게놈 부위에서의 효율은 PBS 길이에 좌우되었고, 최대 편집 효율은 0.7-5.5% 범위였다 (도 39c). PE1로부터의 indel은 낮았고, 각각의 부위의 편집 효율을 최대화하는 조건 하에 5개의 부위에 대해 평균 0.2±0.1%였다 (도 46a). PE1은 또한 HEK3 유전자좌에서 단일-뉴클레오티드 결실 (4.0% 효율), 단일-뉴클레오티드 삽입 (9.7%), 및 3-뉴클레오티드 삽입 (17%)에 의해 예시되는, 표적화된 삽입 및 결실을 설치할 수 있었다 (도 39c). 이들 결과는 이중 가닥 DNA 파괴 또는 DNA 주형을 필요로 하지 않으면서 표적화된 전환, 삽입, 및 결실을 직접 설치하는 PE1의 능력을 확립한다.
프라임 편집제 2 (PE2)의 설계
PE1이 HEK293T 세포 내의 여러 유전자좌에서 다양한 편집을 설치할 수 있지만, 편집 효율은 일반적으로 낮았다 (전형적으로 ≤5%) (도 39c). PE1에서 리버스 트랜스크립타제를 조작하는 것이 프라임 편집 복합체의 고유한 입체형태적 제약 내에서 DNA 합성의 효율을 개선시켜, 보다 높은 게놈 편집 수율을 생성할 수 있는 것으로 가설화되었다. 효소 열안정성150,151, 프로세싱성150, 및 DNA:RNA 헤테로듀플렉스 기질 친화도152를 증가시키고, RNaseH 활성을 불활성화시키는153 M-MLV RT 돌연변이가 이전에 보고되었다. 인간 세포에서의 그의 프라임 편집 효율을 평가하기 위해 다양한 리버스 트랜스크립타제 돌연변이를 함유하는 19종의 PE1 변이체를 구축하였다.
먼저, 실험실 진화로부터 이전에 발생된 일련의 M-MLV RT 변이체를 승온에서 역전사를 지지하는 그의 능력150에 대해 조사하였다. 이들 아미노산 치환 중 3개 (D200N, L603W, 및 T330P)의 M-MLV RT 내로의 연속 도입 (이하에서 M3으로 지칭됨)은 PE1의 것과 비교하여 HEK293T 세포에서 5개의 게놈 유전자좌에 걸쳐 전환 및 삽입 편집 효율의 6.8배 평균 증가를 발생시켰다 (도 47a-47s).
다음으로, M3과 조합하여, 주형:PBS 복합체에 대한 결합, 효소 프로세싱성, 및 열안정성을 증진시키는 것으로 이전에 밝혀진 추가의 리버스 트랜스크립타제 돌연변이152를 시험하였다. 분석된 14개의 추가의 돌연변이체 중에서, M3 돌연변이에 더하여 T306K 및 W313F 치환을 갖는 변이체가 인간 세포에서 5개의 게놈 부위에 걸쳐 6개의 전환 또는 삽입 편집에 대해 M3과 비교하여 편집 효율을 추가로 1.3배 내지 3.0배 개선시켰다 (도 47a-47s). PE1 아키텍처 내로 혼입된 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 이러한 오중돌연변이체 (Cas9 H840A-M-MLV RT (D200N L603W T330P T306K W313F))는 이후 PE2로 지칭된다.
PE2는 PE1보다 실질적으로 더 높은 효율로 단일-뉴클레오티드 전환, 삽입, 및 결실 돌연변이를 설치하고 (도 39c), 보다 짧은 PBS PEgRNA 서열과 상용성이고 (도 39c), 이는 일시적 게놈 DNA:PBS 복합체에 생산적으로 관여하는 증진된 능력과 일치한다. 평균적으로, PE2는 PE1에 비해 프라임 편집 점 돌연변이 효율의 1.6- 내지 5.1배 개선을 발생시켰고 (도 39c), 일부 경우에는 편집 수율을 최대 46배까지 현저하게 개선시켰다 (도 47f 및 도 47i). PE2는 또한 PE1보다 더 효율적으로 표적화된 삽입 및 결실을 발생시켜, HEK3 유전자좌에서의 24-bp FLAG 에피토프 태그의 표적화된 삽입을 4.5% 효율로 달성하였고, 이는 PE1에 의한 이러한 삽입의 설치 효율에 비해 15배 개선된 것이며 (도 47d), HEK3에서 1-bp 결실을 8.6% 효율로 매개하였고, 이는 PE1의 것보다 2.1배 더 높았다 (도 39c). 이들 결과는 PE2를 PE1보다 더 효율적인 프라임 편집제로서 확립한다.
PEgRNA 특색의 최적화
PEgRNA 아키텍처와 프라임 편집 효율 사이의 관계를 HEK293T 세포의 5개의 게놈 유전자좌에서 PE2를 사용하여 체계적으로 프로빙하였다 (도 39c). 일반적으로, 보다 낮은 GC 함량을 갖는 프라이밍 부위는 보다 긴 PBS 서열 (EMX1 및 RNF2, 닉의 처음 10 nt 상류에서 각각 40% 및 30% GC 함량을 함유함)을 필요로 하는 반면, 보다 큰 GC 함량을 갖는 것은 보다 짧은 PBS 서열 (HEK4 및 FANCF, 닉의 처음 10 nt 상류에서 각각 80% 및 60% GC 함량을 함유함)을 사용한 프라임 편집을 지지하였고 (도 39c), 이는 닉킹된 DNA 가닥의 PEgRNA PBS에 대한 혼성화를 위한 에너지 요건과 일치한다. PBS 길이 또는 GC 함량 수준은 프라임 편집 효율을 엄격하게 예측하지 못했고, 다른 인자, 예컨대 DNA 프라이머에서의 2차 구조 또는 PEgRNA 연장부가 또한 편집 활성에 영향을 미칠 수 있다. 전형적인 표적 서열에 대해 ~13 nt의 PBS 길이로 시작하고, 서열이 ~40-60% GC 함량에서 벗어나는 경우에 상이한 PBS 길이를 조사하는 것이 권장된다. 필요한 경우에, 최적 PBS 서열은 실험적으로 결정되어야 한다.
다음으로, PEgRNA의 RT 주형 부분의 성능 결정인자를 연구하였다. 10-20 nt 길이 범위의 RT 주형을 갖는 PEgRNA를 PE2를 사용하여 5개의 게놈 표적 부위에서 체계적으로 평가하였고 (도 39d), 3개의 게놈 부위에서는 31 nt만큼 긴 RT 주형을 사용하여 평가하였다 (도 48a-48c). PBS 길이와 같이, RT 주형 길이도 또한 프라임 편집 효율을 최대화하기 위해 달라질 수 있지만, 일반적으로 ≥10 nt 길이의 많은 RT 주형 길이가 보다 효율적인 프라임 편집을 지지한다 (도 39d). 일부 표적 부위는 보다 높은 편집 효율을 달성하기 위해 보다 긴 RT 주형 (>15 nt) (FANCF, EMX1)을 선호하는 반면, 다른 유전자좌는 짧은 RT 주형 (HEK3, HEK4)을 선호하기 때문에 (도 39d), PEgRNA를 최적화할 때 ~10-16 nt로 시작하여 짧은 RT 주형 및 긴 RT 주형 둘 다를 시험하는 것이 권장된다.
중요한 것으로, sgRNA 스캐폴드의 말단 헤어핀에 인접한 뉴클레오티드로서 C를 배치하는 RT 주형은 일반적으로 유사한 길이의 RT 주형을 갖는 다른 PEgRNA와 비교하여 보다 낮은 편집 효율을 발생시켰다 (도 48a-48c). Cas9에 결합된 sgRNA의 구조에 기초하여148,149, 정규 sgRNA의 3' 연장부의 제1 뉴클레오티드로서 C의 존재는 천연적으로 Cas9에서 Tyr 1356과 파이 스택을 형성하는 뉴클레오티드인 G81과 쌍형성하고 sgRNA A68과의 비-정규 염기 쌍에 의해 sgRNA 스캐폴드 폴드를 파괴할 수 있는 것으로 추측되었다. 많은 RT 주형 길이가 프라임 편집을 지지하기 때문에, 3' 연장부의 제1 염기 (RT 주형의 마지막 역전사된 염기)가 C가 아닌 PEgRNA를 선택하는 것이 권장된다.
프라임 편집제 3 시스템 (PE3 및 PE3b)의 설계
PE2가 PEgRNA로부터의 유전자 정보를 PE1보다 더 효율적으로 표적 유전자좌로 전달할 수 있는 한편, 세포가 1개의 편집된 가닥 및 1개의 비편집된 가닥에 의해 생성된 헤테로듀플렉스 DNA를 분해하는 방식은 편집이 지속적인지 여부를 결정한다. 염기 편집의 이전 개발은 시토신 또는 아데닌 탈아미노화의 초기 생성물이 1개의 편집된 가닥 및 1개의 비-편집된 가닥을 함유하는 헤테로듀플렉스 DNA이기 때문에 유사한 도전과제에 직면하였다. 염기 편집의 효율을 증가시키기 위해, Cas9 D10A 닉카제를 사용하여 닉을 비-편집된 가닥 내로 도입하고, 편집된 가닥을 주형으로서 사용하여 DNA 복구를 그 가닥으로 지시하였다129,130,142. 프라임 편집 효율을 증진시키기 위해 이 원리를 이용하기 위해, PE2에 이미 존재하는 Cas9 H840A 닉카제 및 세포에 의한 비-편집된 가닥의 우선적 대체를 유도하기 위한 단순 sgRNA를 사용하여 비-편집된 가닥을 닉킹하는 유사한 전략을 시험하였다 (도 40a). 프라임 편집을 개시하기 위해 편집된 DNA 가닥도 또한 닉킹되기 때문에, indel로 이어지는 이중 가닥 DNA 파괴의 생산을 최소화하기 위해 비-편집된 가닥 상에서 다양한 sgRNA-프로그램화된 닉 위치를 시험하였다.
이러한 PE3 전략은 먼저 PAM의 5' 또는 3'의 PEgRNA-유도된 닉의 부위로부터 14 내지 116개 염기에 위치한 닉을 유도하는 sgRNA를 스크리닝함으로써 HEK293T 세포의 5개의 게놈 부위에서 시험하였다. 시험된 5개의 부위 중 4개에서, 비-편집된 가닥을 닉킹하는 것은 PE2 시스템과 비교하여 indel-무함유 프라임 편집 생성물의 양을 1.5- 내지 4.2배만큼, 55%만큼 높게 증가시켰다 (도 40b). 최적 닉킹 위치는 게놈 부위에 따라 달라졌지만, PEgRNA-유도된 닉으로부터 대략 40-90 bp의 PAM의 3' (도 40b에서 양의 거리)에 위치한 닉은 일반적으로 과도한 indel 형성 없이 프라임 편집 효율의 유리한 증가 (평균 41%)를 생성하였다 (시험된 5개의 부위 각각에 대해 가장 높은 편집 효율을 생성하는 sgRNA의 경우 6.8% 평균 indel) (도 40b). 예상된 바와 같이, 일부 부위에서, 비-편집된 가닥 닉을 PEgRNA-유도된 닉의 40 bp 내에 배치하면, indel 형성에서 최대 22%의 큰 증가가 초래되었는데 (도 40b), 이는 아마도 양쪽 가닥을 함께 가까이에서 닉킹하는 것으로부터 이중 가닥 파괴가 형성되기 때문일 것이다. 그러나, 다른 부위에서, PEgRNA-유도된 닉으로부터 14 bp만큼 가까운 닉킹은 단지 5% indel을 생산하였고 (도 40b), 이는 유전자좌-의존성 인자가 근위 이중 닉이 이중 가닥 DNA 파괴로 전환되는 것을 제어한다는 것을 시사한다. 하나의 시험된 부위 (HEK4)에서, 상보적 가닥 닉은 이익을 제공하지 않거나, 또는 심지어 PEgRNA-유도된 닉으로부터 >70 bp의 거리에 위치하는 경우에도 편집 효율을 능가하는 indel 수준 (최대 26%)을 발생시켰으며, 이는 그 부위에서 편집된 가닥이 세포에 의해 닉킹되거나 또는 비효율적으로 라이게이션되는 비통상적인 성향과 일치하였다. PEgRNA-매개된 닉으로부터 대략 50 bp의 비-편집된 가닥 닉으로 시작하고, indel 빈도가 허용되는 수준을 초과하는 경우에 대안적 닉 위치를 시험하는 것이 권장된다.
상보적 가닥 닉킹이 프라임 편집 효율을 어떻게 개선시키는지에 대한 이러한 모델 (도 40a)은 편집된 가닥 플랩 분해 후에만 비-편집된 가닥을 닉킹하는 것이 공동 닉의 존재를 최소화하여, 계속 진행되면 indel을 형성하는 이중 가닥 파괴의 빈도를 감소시킬 수 있을 것으로 예측하였다. 비-편집된 가닥 닉킹에 대한 시간적 제어를 달성하기 위해, 편집된 가닥과 매칭되지만 원래의 대립유전자와는 매칭되지 않는 스페이서 서열을 갖는 sgRNA를 설계하였다. 이후 PE3b로 지칭되는 이 전략을 사용하면, 스페이서와 비편집된 대립유전자 사이의 미스매치는 PAM 가닥 상에서 편집 사건이 발생한 후까지 sgRNA에 의한 닉킹을 선호하지 않을 것이다. 이러한 PE3b 접근법을 HEK293T 세포 내의 3개의 게놈 부위에서 5개의 상이한 편집으로 시험하였고, 결과를 PE2 및 PE3 시스템에 의해 달성된 것과 비교하였다. 모든 경우에, PE3b는 PE3과 비교하여 전체 편집 효율의 임의의 명백한 감소 없이, PE3과 비교하여 실질적으로 더 낮은 수준의 indel (3.5- 내지 30배, 평균 12배 더 낮은 indel, 또는 0.85%)과 연관되었다 (도 40c). 따라서, 편집이 제2 프로토스페이서 내에 설정된 경우에, PE3b 시스템은 PE2와 비교하여 편집 효율을 여전히 개선시키면서, 종종 PE3의 것과 유사한 수준으로 indel을 감소시킬 수 있었다 (도 40c).
종합하면, 이들 발견은 PE3 시스템 (Cas9 닉카제-최적화된 리버스 트랜스크립타제 + PEgRNA + sgRNA)이 PE2와 비교하여 편집 효율을 ~3배 개선시킨다는 것을 확립하였다 (도 40b-40c). PE3은 PE3의 추가의 닉킹 활성을 고려하여 예상된 바와 같이 PE2보다 더 넓은 범위의 indel을 동반하였다. PE3의 사용은 프라임 편집 효율을 우선시할 때 권장된다. indel의 최소화가 중요한 경우에, PE2는 ~10배 더 낮은 indel 빈도를 제공한다. 비-편집된 가닥을 닉킹하기 위해 설치된 편집을 인식하는 sgRNA를 사용하는 것이 가능한 경우에, PE3b 시스템은 indel 형성을 크게 감소시키면서 PE3-유사 편집 수준을 달성할 수 있다.
PE3을 사용한 프라임 편집의 표적화 범주 및 다재다능성을 입증하기 위해, 10-뉴클레오티드 RT 주형을 갖는 PE3 및 PEgRNA를 사용하여 HEK3 표적 부위의 +1 내지 +8 위치 (PEgRNA-유도된 닉의 3'의 제1 염기를 위치 +1로서 카운팅함)에 걸친 모든 가능한 단일 뉴클레오티드 치환의 설치를 조사하였다 (도 41a). 집합적으로, 이들 24개의 별개의 편집은 모든 4개의 전이 돌연변이 및 모든 8개의 전환 돌연변이를 커버하고, 평균 33±7.9% (14% 내지 48% 범위)의 편집 효율 (indel은 함유하지 않음)로, 평균 7.5±1.8% indel로 진행된다.
중요한 것으로, 장거리 RT 주형은 또한 PE3과 효율적인 프라임 편집을 일으킬 수 있다. 예를 들어, PE3과 34-nt RT 주형을 사용하여, HEK3 유전자좌 내의 위치 +12, +14, +17, +20, +23, +24, +26, +30, 및 +33 (PEgRNA-유도된 닉으로부터 12 내지 33개 염기)에 평균 36±8.7% 효율 및 8.6±2.0% indel로 점 돌연변이를 설치하였다 (도 41b). 다른 유전자좌에서는 +10 위치를 넘어서는 편집이 시도되지 않았지만, 3개의 대안적 부위에서 ≥30 nt인 다른 RT 주형도 또한 효율적인 편집을 지지한다 (도 48a-c). 긴 RT 주형의 실행가능성은 초기 닉 부위로부터 수십개의 뉴클레오티드에 대한 효율적인 프라임 편집을 가능하게 하였다. 어느 하나의 DNA 가닥 상의 NGG PAM은 효율적인 프라임 편집을 지지하는 PAM과 편집 사이의 최대 거리보다 훨씬 적은, 평균 ~8 bp마다 발생하기 때문에, 프라임 편집은 다른 정밀 게놈 편집 방법과 대조적으로 근처 PAM 서열의 이용가능성에 의해 실질적으로 제약받지 않는다125,142,154. RNA 2차 구조와 프라임 편집 효율 사이의 추정되는 관계를 고려하면, 긴-범위 편집을 위해 PEgRNA를 설계할 때, 편집 효율을 최적화하기 위해 다양한 길이의 RT 주형, 및 필요한 경우에, 서열 조성 (예를 들어, 동의 코돈)을 시험하는 것이 현명하다.
전이 및 전환 점 돌연변이를 도입하기 위해 PE3 시스템의 범주 및 한계를 추가로 시험하기 위해, 6개의 추가의 게놈 표적 부위에 걸쳐 모든 12개의 가능한 유형의 점 돌연변이를 커버하는 72개의 추가의 편집 (도 41c-41h)을 시험하였다. 전반적으로, indel-무함유 편집 효율은 평균 25±14%인 한편, indel 형성은 평균 8.3±7.5%였다. PEgRNA RT 주형이 PAM 서열을 포함하였기 때문에, 프라임 편집은 PAM 서열에 대해 변화를 유도할 수 있었다. 이들 경우에, 보다 높은 편집 효율 (평균 39±9.7%) 및 보다 낮은 indel 생성 (평균 5.0±2.9%)이 관찰되었다 (도 41a-41k, 위치 +5 또는 +6에서의 점 돌연변이). PAM 편집에 대한 이러한 효율의 증가 및 indel 형성의 감소는 상보적 가닥의 복구 전에 Cas9 닉카제가 편집된 가닥에 재결합하고 닉킹하지 못하는 것으로부터 발생할 수 있다. 프라임 편집은 편집 효율의 명백한 상실 없이 조합 편집을 지지하기 때문에, 가능한 경우에 다른 목적하는 변화에 더하여 PAM을 편집하는 것이 권장된다.
다음으로, PE3을 사용하여 7개의 게놈 부위에서 14개의 표적화된 작은 삽입 및 14개의 표적화된 작은 결실을 수행하였다 (도 41i). 표적화된 1-bp 삽입은 32±9.8%의 평균 효율로 진행되었고, 3-bp 삽입은 39±16%의 평균 효율로 설치되었다. 표적화된 1-bp 및 3-bp 결실이 또한 효율적이었고, 각각 29±14% 및 32±11%의 평균 수율로 진행되었다. (표적화된 삽입 또는 결실을 넘어선) indel 생성은 평균 6.8±5.4%였다. 위치 +1과 +6 사이에 도입된 삽입 및 결실은 PAM의 위치 또는 구조를 변경시키기 때문에, PAM을 편집하는 점 돌연변이와 유사하게, 상보적 가닥의 복구 전에 Cas9 닉카제가 편집된 DNA 가닥에 재결합하고 닉킹하지 못함으로 인해 이 범위에서의 삽입 및 결실 편집이 전형적으로 보다 효율적인 것으로 추측되었다.
PE3을 또한 HEK3 부위에서 5 bp 내지 80 bp의 보다 큰 정확한 결실을 매개하는 그의 능력에 대해 시험하였다 (도 41j). 13-nt PBS, 및 각각 표적 유전자좌에 대해 29, 24, 또는 19 bp의 상동성을 함유하는 RT 주형을 사용한 경우에 5-, 10-, 및 15-bp 결실에 대해 매우 높은 편집 효율 (52 내지 78%)이 관찰되었다. 26-nt RT 주형을 사용하는 것은 25 bp의 보다 큰 결실을 72±4.2% 효율로 지지한 한편, 20-nt RT 주형은 80-bp 결실을 52±3.8% 효율로 가능하게 하였다. 이들 표적화된 결실은 평균 11±4.8%의 indel 빈도를 동반하였다 (도 41j).
마지막으로, 삽입 및 결실, 삽입 및 점 돌연변이, 결실 및 점 돌연변이, 또는 3개의 게놈 부위에 걸친 2개의 점 돌연변이로 이루어진 동일한 표적 유전자좌에서의 다중 편집의 12개의 조합을 매개하는 PE3의 능력을 시험하였다. 이들 조합 편집은 평균 55%의 표적 편집, 6.4% indel로 매우 효율적이었고 (도 41k), 이는 개별 표적 부위에서 높은 효율 및 낮은 indel 빈도로 정밀 삽입, 결실, 및 점 돌연변이의 조합을 만드는 프라임 편집의 능력을 입증하였다.
종합하여, 도 41a-41k의 예는 7개의 인간 게놈 유전자좌에 걸친 156개의 별개의 전이, 전환, 삽입, 결실, 및 조합 편집을 나타낸다. 이들 발견은 프라임 편집의 다재다능성, 정밀도, 및 표적화 유연성을 확립한다.
염기 편집과 비교한 프라임 편집
현-세대 시티딘 염기 편집제 (CBE) 및 아데닌 염기 편집제 (ABE)는 높은 효율 및 낮은 indel로 C·G에서 T·A 전이 돌연변이 및 A·T에서 G·C 전이 돌연변이를 설치할 수 있다129,130,142. 염기 편집의 적용은 원치않는 방관자 편집을 발생시키는 염기 편집 활성 윈도우 (전형적으로 ~5-bp 폭) 내의 다중 시티딘 또는 아데닌 염기의 존재에 의해129,130,142,155, 또는 표적 뉴클레오티드로부터 대략 15±2 nt에 위치한 PAM의 부재에 의해142,156 제한될 수 있다. 프라임 편집은 방관자 편집 없이 전이 돌연변이의 정확한 설치에 특히 유용할 수 있거나, 또는 적합하게 위치한 PAM의 결여가 CBE 또는 ABE 활성 윈도우 내에 표적 뉴클레오티드를 유리하게 위치시키는 것을 배제하는 경우에 특히 유용할 수 있는 것으로 예상되었다.
닉카제 활성이 없는 (BE2max) 또는 닉카제 활성이 있는 (BE4max) 최적화된 CBE157를 사용하거나, 또는 유사한 PE2 및 PE3 프라임 편집 시스템을 사용하여 정규 염기 편집 윈도우 (프로토스페이서 위치 4-8, PAM을 위치 21-23으로서 카운팅함)에서 다중 표적 시티딘을 함유하는 3개의 게놈 유전자좌를 편집함으로써 프라임 편집 및 시토신 염기 편집을 비교하였다. 3개의 부위의 염기 편집 윈도우 내의 9개의 총 표적 시토신 중에서, BE4max는 염기 편집 윈도우의 중심 (프로토스페이서 위치 5-7, 도 42a)의 염기에 대해 PE3보다 평균 2.2배 더 높은 총 C·G에서 T·A 전환을 발생시켰다. 마찬가지로, 비-닉킹 BE2max는 이들 잘-위치된 염기에서 PE2를 평균 1.4배 능가하였다 (도 42a). 그러나, 염기 편집 윈도우의 중심을 넘어선 시토신에 대해서는, PE3은 BE4max를 2.7배 능가하였고, PE2는 BE2max를 2.0배 능가하였다 (PE3의 경우 40±17% 대 BE4max의 경우 15±18%, 및 PE2의 경우 22±11% 대 BE2max의 경우 11±13%의 평균 편집). 전체적으로, PE2의 경우 indel 빈도는 매우 낮았고 (평균 0.86±0.47%), PE3의 경우 BE4max의 것과 유사하거나 그보다 약간 더 높았다 (BE4max 범위: 2.5% 내지 14%; PE3 범위: 2.5% 내지 21%) (도 42b).
정확한 C·G에서 T·A 편집의 설치에 대해 염기 편집의 효율을 프라임 편집과 비교할 경우 (임의의 방관자 편집 부재), 프라임 편집의 효율은, 대부분의 게놈 DNA 부위와 유사하게, ~5-bp 염기 편집 윈도우 내에 다중 시토신을 함유하는 상기 부위에서 염기 편집의 효율을 크게 초과하였다 (도 42c). 이들 부위, 예컨대 프로토스페이서 위치 C5, C6, 및 C7에 시토신을 함유하는 EMX1에서, BE4max는 방관자 편집 없이 오직 단일 표적 염기 쌍 전환만을 함유하는 생성물은 거의 생성하지 않았다. 대조적으로, 이 부위에서의 프라임 편집은 임의의 위치 또는 위치의 조합 (C5, C6, C7, C5+C6, C6+C7, C5+C7, 또는 C5+C6+C7)에서 C·G에서 T·A 편집을 선택적으로 설치하는데 사용될 수 있었다 (도 42c). 모든 정확한 1-염기 또는 2-염기 편집 (즉, 임의의 다른 근처 염기를 변형시키지 않는 편집)은 각각 BE4max 또는 BE2보다 PE3 또는 PE2에 의해 훨씬 더 효율적이었던 반면에, 3-염기 C·G에서 T·A 편집은 BE4max에 의해 더 효율적이었으며 (도 42c), 이는 활성 윈도우 내의 모든 표적 염기를 편집하는 염기 편집제의 경향을 반영한다. 종합하면, 이들 결과는 시토신 염기 편집제가 PE2 또는 PE3보다 최적으로 위치된 표적 염기에서 보다 높은 수준의 편집을 발생시킬 수 있지만, 프라임 편집은 비-최적으로 위치된 표적 염기에서 염기 편집을 능가할 수 있고, 다중 편집가능한 염기로 훨씬 더 높은 정밀도로 편집할 수 있음을 입증한다.
A·T에서 G·C 편집을 최적화된 비-닉킹 ABE (Cas9 닉카제 대신에 dCas9를 갖는 ABEmax152, 이하 ABEdmax로 지칭됨) 대 PE2에 의해, 및 최적화된 닉킹 아데닌 염기 편집제 ABEmax 대 PE3에 의해 2개의 게놈 유전자좌에서 비교하였다. 염기 편집 윈도우에 2개의 표적 아데닌을 함유하는 부위에서 (HEK3), ABE는 A5의 전환의 경우 PE2 또는 PE3보다 더 효율적이었지만, PE3은 ABEmax 편집 윈도우의 변연에 있는 A8의 전환의 경우에 더 효율적이었다 (도 42d). 단일 아데닌만을 전환시키는 정밀도 편집의 효율을 비교할 경우, PE3은 A5 및 A8 둘 다에서 ABEmax를 능가하였다 (도 42e). 전반적으로, ABE는 프라임 편집제보다 HEK3에서 훨씬 더 적은 indel을 생산하였다 (ABEdmax의 경우 0.19±0.02% 대 PE2의 경우 1.5±0.46%, 및 ABEmax의 경우 0.53±0.16% 대 PE3의 경우 11±2.3%, 도 42f). 단지 단일 A만이 염기 편집 윈도우 내에 존재하는 FANCF에서, ABE2 및 ABEmax는 총 표적 염기 쌍 전환에서 그의 프라임 편집 대응물을 1.8- 내지 2.9배만큼 능가하였고, 여기서 염기 편집 및 프라임 편집 둘 다로부터의 사실상 모든 편집된 생성물은 오직 정확한 편집만을 함유하였다 (도 42d-42e). HEK3 부위와 같이, ABE는 FANCF 부위에서 훨씬 더 적은 indel을 생산하였다 (도 42f).
집합적으로, 이들 결과는 염기 편집 및 프라임 편집이 표적화된 전이 돌연변이를 제조하기 위한 상보적 강점 및 약점을 제공한다는 것을 나타낸다. 단일 표적 뉴클레오티드가 염기 편집 윈도우 내에 존재하는 경우, 또는 방관자 편집이 허용되는 경우에, 현재 염기 편집제가 전형적으로 보다 효율적이고, 프라임 편집제보다 더 적은 indel을 생성한다. 다중 시토신 또는 아데닌이 존재하고 방관자 편집이 바람직하지 않은 경우, 또는 표적 염기가 이용가능한 PAM에 비해 염기 편집에 불량하게 위치하는 경우에, 프라임 편집제가 실질적인 이점을 제공한다.
오프-타겟 프라임 편집
생산적 편집을 발생시키기 위해, 프라임 편집은 Cas9 도메인이 결합하는 것에 대해 상보적인 표적 유전자좌:PEgRNA 스페이서, PEgRNA-프라이밍된 역전사를 개시하는 것에 대해 상보적인 표적 유전자좌:PEgRNA PBS, 및 플랩 분해에 대해 상보적인 표적 유전자좌:리버스 트랜스크립타제 생성물을 필요로 한다. 이들 3가지 별개의 DNA 혼성화 요건은 다른 게놈 편집 방법의 것과 비교하여 오프-타겟 프라임 편집을 최소화할 수 있는 것으로 가설화되었다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, HEK293T 세포를 4개의 온-타겟 게놈 유전자좌를 표적화하도록 설계된 PE3 또는 PE2 및 16개의 총 PEgRNA로, Cas9 및 동일한 프로토스페이서를 표적화하는 4개의 상응하는 sgRNA로, 또는 Cas9 및 동일한 16개의 PEgRNA로 처리하였다. 이들 4개의 표적 유전자좌는, 이들 각각이 HEK293T 세포에서 Cas9 및 상응하는 온-타겟 sgRNA가 실질적인 오프-타겟 DNA 변형을 유발하는 것으로 공지된 적어도 4개의 잘-특징화된 오프-타겟 부위를 갖기 때문에 선택되었다118,159. 처리 후에, 각각의 온-타겟 스페이서에 대한 4개의 온-타겟 유전자좌 및 상위 4개의 공지된 Cas9 오프-타겟 부위를 총 16개의 오프-타겟 부위에 대해 서열분석하였다 (표 1).
이전의 연구와 일치하게118, Cas9 및 4개의 표적 sgRNA는 이전에 보고된 모든 16개의 오프-타겟 유전자좌를 변형시켰다 (도 42g). HEK3 표적 유전자좌에 대한 4개의 오프-타겟 부위 중 Cas9 오프-타겟 변형 효율은 평균 16%였다. Cas9 및 HEK4를 표적화하는 sgRNA는 4개의 시험된 공지된 오프-타겟 부위의 평균 60% 변형을 발생시켰다. 마찬가지로, EMX1 및 FANCF에 대한 오프-타겟 부위는 Cas9:sgRNA에 의해 각각 48% 및 4.3%의 평균 빈도로 변형되었다 (도 42g). Cas9 뉴클레아제를 갖는 PEgRNA는 sgRNA와 비교하여 평균적으로 유사한 (1- 내지 1.5배 더 낮은) 효율로 온-타겟 부위를 변형시킨 반면, Cas9 뉴클레아제를 갖는 PEgRNA는 sgRNA 보다 ~4배 더 낮은 평균 효율로 오프-타겟 부위를 변형시켰음에 주목한다.
놀랍게도, 이들 4개의 표적 스페이서를 함유하는 동일한 16개의 시험된 PEgRNA를 갖는 PE3 또는 PE2는 훨씬 더 낮은 오프-타겟 편집을 발생시켰다 (도 42h). Cas9+sgRNA에 의해 오프-타겟 편집을 겪은 것으로 공지된 16개의 부위 중에서, PE3+PEgRNA 또는 PE2+PEgRNA는 16개의 오프-타겟 부위 중 단지 3개에서 검출가능한 오프-타겟 프라임 편집을 발생시켰으며, 16개 중 단지 1개만이 ≥1%의 오프-타겟 편집 효율을 나타내었다 (도 42h). 이들 16개의 공지된 Cas9 오프-타겟 부위에서 HEK3, HEK4, EMX1, 및 FANCF를 표적화하는 PEgRNA의 경우 평균 오프-타겟 프라임 편집은 각각 <0.1%, <2.2±5.2%, <0.1%, 및 <0.13±0.11%였다 (도 42h). 특히, Cas9+PEgRNA1이 97% 효율로 편집하는 HEK4 오프-타겟 3 부위에서, PE2+PEgRNA1은 동일한 스페이서 서열을 공유함에도 불구하고 오직 0.7% 오프-타겟 편집만을 발생시켰고, 이는 Cas9 편집과 비교하여 프라임 편집에 요구되는 2개의 추가의 DNA 혼성화 사건이 오프-타겟 편집을 얼마나 크게 감소시킬 수 있는지 입증한다. 종합하면, 이들 결과는 PE3 및 PEgRNA가 동일한 프로토스페이서를 표적화하는 Cas9 및 sgRNA보다 인간 세포에서 훨씬 더 낮은 오프-타겟 DNA 편집을 유도한다는 것을 시사한다.
3'-연장된 PEgRNA의 역전사는 원칙적으로 가이드 RNA 스캐폴드로 진행될 수 있다. 생성된 3' 플랩이 그의 3' 단부에서 비편집된 DNA 가닥과의 상보성의 결여에도 불구하고 표적 유전자좌 내로 혼입되는 경우에, 그 결과는 indel 빈도에 기여하는 PEgRNA 스캐폴드 뉴클레오티드의 삽입이다. 본 발명자들은 HEK293T 세포의 4개의 유전자좌에서 66회의 PE3-매개된 편집 실험으로부터의 서열분석 데이터를 분석하였고, 평균 1.7±1.5%의 임의의 수의 PEgRNA 스캐폴드 뉴클레오티드의 총 삽입으로, 낮은 빈도의 PEgRNA 스캐폴드 삽입을 관찰하였다 (도 56a-56d). Cas9 도메인 결합으로 인한 리버스 트랜스크립타제에 대한 가이드 RNA 스캐폴드의 접근불가능성, 뿐만 아니라 PEgRNA 스캐폴드 역전사로부터 생성된 3' 플랩의 미스매칭된 3' 단부의 플랩 분해 동안의 세포 절제는 PEgRNA 스캐폴드 뉴클레오티드를 혼입시키는 생성물을 최소화하는 것으로 추측된다. 이러한 사건은 드물지만, PEgRNA 스캐폴드 혼입을 최소화하는 PEgRNA 또는 프라임 편집제 단백질을 조작하기 위한 향후 노력은 indel 빈도를 추가로 감소시킬 수 있다.
일부 염기 편집제에서 데아미나제는 Cas9-비의존성 방식으로 작용하여, 제1-세대 CBE (ABE는 아님) 사이의 낮은 수준이지만 광범위한 오프-타겟 DNA 편집160-162 및 제1-세대 CBE 및 ABE 사이의 오프-타겟 RNA 편집163-165을 발생시킬 수 있지만, 조작된 데아미나제를 갖는 보다 새로운 CBE 및 ABE 변이체는 Cas9-비의존성 오프-타겟 DNA 및 RNA 편집을 크게 감소시킨다163-165. 프라임 편집제는 염기-변형 효소, 예컨대 데아미나제가 결여되어 있고, 따라서 Cas9-비의존성 방식으로 DNA 또는 RNA 염기를 변형시키는 고유 능력을 갖지 않는다.
프라임 편집제 내의 리버스 트랜스크립타제 도메인은 원칙적으로 세포에서 적절하게 프라이밍된 RNA 또는 DNA 주형을 프로세싱할 수 있지만, 레트로트랜스포손, 예컨대 LINE-1 패밀리166, 내인성 레트로바이러스167,168, 및 인간 텔로머라제의 레트로트랜스포손은 모두 활성 내인성 인간 리버스 트랜스크립타제를 제공하였음에 주목하였다. 인간 세포에서의 그의 천연 존재는 리버스 트랜스크립타제 활성 자체가 실질적으로 독성이 아님을 시사한다. 실제로, 리버스 트랜스크립타제를 불활성화시키는 dCas9, Cas9 H840A 닉카제, 또는 R110S+K103L를 갖는 PE2 (PE2-dRT) 돌연변이를 발현하는 대조군의 것과 비교하여 HEK293T 세포 생존율에서 PE3-의존적 차이는 관찰되지 않았다169 (도 49a-49b).
상기 데이터 및 분석에도 불구하고, 비편향된, 게놈-전반 방식으로 오프-타겟 프라임 편집을 평가하고, 뿐만 아니라 프라임 편집제 또는 프라임 편집 중간체에서 리버스 트랜스크립타제 변이체가 세포에 영향을 미칠 수 있는 정도를 특징화하기 위한 추가의 연구가 필요하다.
인간 세포에서의 프라임 편집 병원성 전환, 삽입, 및 결실 돌연변이
인간 세포에서 유전 질환을 유발하는 전환, 작은 삽입, 및 작은 결실 돌연변이를 직접 설치하거나 또는 이를 교정하는 PE3의 능력을 시험하였다. 겸상 적혈구 질환은 가장 통상적으로 베타-글로빈에서 Glu6→Val의 돌연변이를 발생시키는 HBB에서의 A·T에서 T·A 전환 돌연변이에 의해 유발된다. 생체외 조혈 줄기 세포를 Cas9 뉴클레아제 및 HDR을 위한 공여자 DNA 주형으로 처리한 다음, 편집된 세포를 풍부화하고, 이식하고, 생착시키는 것은 겸상 적혈구 질환의 치료를 위한 유망한 잠재적 전략이다170. 그러나, 이러한 접근법은 정확하게 편집된 HBB 대립유전자에 더하여 많은 indel-함유 부산물을 여전히 생성한다170-171. 염기 편집제는 일반적으로 훨씬 더 적은 indel을 생산하지만, 이는 현재 HBB의 정상 서열을 직접 복원하는데 필요한 T·A에서 A·T 전환 돌연변이를 만들 수 없다.
PE3을 사용하여 HEK293T 세포에서 44% 효율 및 4.8% indel로 HBB E6V 돌연변이를 설치하였다 (도 43a). PE3-처리된 세포의 혼합물로부터, 본 발명자들은 HBB E6V 대립유전자에 대해 동형접합 (삼배체)인 6종의 HEK293T 세포주를 단리하였으며 (도 53a-53d), 이는 병원성 돌연변이를 갖는 인간 세포주를 생성하는 프라임 편집의 능력을 입증한다. HBB E6V 대립유전자를 야생형 HBB로 교정하기 위해, 본 발명자들은 동형접합 HBB E6V HEK293T 세포를 PE3, 및 HBB E6V 돌연변이를 야생형 HBB로 직접 복귀시키도록 프로그램화된 PEgRNA로 처리하였다. 총 14개의 PEgRNA 설계를 시험하였다. 3일 후, DNA 서열분석은 모든 14개의 PEgRNA가 PE3과 조합된 경우 HBB E6V의 야생형 HBB로의 효율적인 교정 (≥26% 야생형 HBB, indel 부재), 및 평균 2.8±0.70%의 indel 수준을 제공함을 밝혀내었다 (도 50a). 최상의 PEgRNA는 HBB E6V를 야생형으로, 2.4% indel로 52% 교정시켰다 (도 43a). PEgRNA에 의해 인식되는 PAM을 변형시키는 침묵 돌연변이의 도입은 편집 효율 및 생성물 순도를 1.4% indel로 58% 교정까지 약간 개선시켰다 (도 43a). 이들 결과는 프라임 편집이 인간 세포주에서 병원성 전환 점 돌연변이를 높은 효율 및 최소 부산물로 설치하고 교정할 수 있음을 확립한다.
테이-삭스병은 가장 종종 HEXA 유전자 내로의 4-bp 삽입에 의해 유발된다 (HEXA 1278+TATC)136. PE3을 사용하여 HEK293T 세포 내에 이러한 4-bp 삽입을 31% 효율 및 0.8% indel로 설치하였고 (도 43b), HEXA 1278+TATC 대립유전자에 대해 동형접합인 2개의 HEK293T 세포주를 단리하였다 (도 53a-53d). 이들 세포를 사용하여, 야생형 대립유전자로의 완벽한 복귀에 의해 또는 PAM을 파괴하고 침묵 돌연변이를 설치하는 이동된 4-bp 결실에 의해 HEXA에서의 병원성 삽입을 교정하기 위한 PE3 또는 PE3b 시스템과 함께 43개의 PEgRNA 및 3개의 닉킹 sgRNA를 시험하였다 (도 50b). 시험된 43개의 PEgRNA 중 19개는 ≥20% 편집을 발생시켰다. PE3 또는 PE3b 및 최상의 PEgRNA를 사용한 야생형 HEXA로의 완벽한 교정은 유사한 평균 효율 (PE3의 경우 30% 대 PE3b의 경우 33%)로 진행되었지만, PE3b 시스템은 5.3배 더 적은 indel 생성물 (PE3의 경우 1.7% 대 PE3b의 경우 0.32%)을 동반하였다 (도 43b 및 도 50b). 이들 발견은 포유동물 세포에서 병원성 대립유전자를 효율적으로 및 최소의 부산물로 설치하거나 교정하는 정확한 작은 삽입 및 결실을 만드는 프라임 편집의 능력을 입증한다.
마지막으로, 인간 프리온 단백질 (PrP)을 코딩하는 유전자인 PRNP에의 보호 SNP의 설치를 시험하였다. PrP 미스폴딩은 PRNP 유전자에서의 유전성 우성 돌연변이를 통해, 또는 미스폴딩된 PrP에 대한 노출을 통해 자발적으로 발생할 수 있는 진행성 및 치명적 신경변성 프리온 질환을 유발한다172. 자연 발생 PRNP G127V 돌연변이체 대립유전자는 인간138 및 마우스173에서 프리온 질환에 대한 저항성을 부여한다. PE3을 사용하여 HEK293T 세포에서 인간 PRNP 대립유전자 내로 G127V를 설치하였으며, 이는 G·C에서 T·A 전환을 필요로 한다. 4개의 PEgRNA 및 3개의 닉킹 sgRNA를 PE3 시스템으로 평가하였다. 가장 효과적인 PE3 및 PEgRNA에 대한 노출 3일 후에, DNA 서열분석은 53±11%의 G127V 돌연변이 설치 효율 및 1.7±0.7%의 indel 수준을 밝혀내었다 (도 43c). 종합하면, 이들 결과는 질환에 대한 저항성을 효율적으로 유발하거나 부여하고 최소의 부산물을 갖는, 인간 세포에서 전환, 삽입, 또는 결실 돌연변이를 설치하거나 교정하는 프라임 편집의 능력을 확립한다.
다양한 인간 세포주 및 1차 마우스 뉴런에서의 프라임 편집
다음으로, 프라임 편집을 3종의 추가의 인간 세포주에서 내인성 부위를 편집하는 그의 능력에 대해 시험하였다. K562 (백혈병성 골수) 세포에서, PE3을 사용하여 HEK3, EMX1, 및 FANCF 부위에서의 전환 편집, 뿐만 아니라 HEK3에서의 6xHis 태그의 18-bp 삽입을 수행하였다. 이들 4개의 PE3-매개된 편집 각각에 대해 15-30%의 평균 편집 효율이 관찰되었으며, indel은 평균 0.85-2.2%였다 (도 43a). U2OS (골육종) 세포에서, HEK3 및 FANCF에서의 전환 돌연변이, 뿐만 아니라 HEK3 내로의 3-bp 삽입 및 6xHis 태그 삽입이 7.9-22% 편집 효율로 설치되었고, 이는 indel 형성을 10- 내지 76배 초과하였다 (도 43a). 마지막으로, HeLa (자궁경부암) 세포에서, HEK3 내로의 3-bp 삽입은 12% 평균 효율 및 1.3% indel로 수행되었다 (도 43a). 집합적으로, 이들 데이터는, 편집 효율이 세포 유형에 따라 달라지고 일반적으로 HEK293T 세포에서보다 덜 효율적이기는 하지만, HEK293T 세포 이외의 다중 세포주가 프라임 편집을 지지한다는 것을 나타낸다. 편집:indel 비는 모든 시험된 인간 세포주에서 높게 유지되었다.
프라임 편집이 유사분열후, 말단 분화된 1차 세포에서 가능한지 결정하기 위해, E18.5 마우스로부터 수거한 1차 피질 뉴런을 이중 분할-PE3 렌티바이러스 전달 시스템으로 형질도입하였고, 여기서 분할-인테인 스플라이싱203은 N-말단 및 C-말단 절반으로부터 PE2 단백질을 재구성하며, 각각은 개별 바이러스로 전달되었다. 유사분열후 뉴런에 대한 편집을 제한하기 위해, 성숙 뉴런에 고도로 특이적인 인간 시냅신 프로모터204를 사용하여 PE2 단백질 성분 둘 다의 발현을 구동시켰다. GFP를 자기-절단 P2A 펩티드205를 통해 PE2의 N-말단 절반에 융합시켰다. 이중 바이러스 형질도입 2주 후에 뉴런으로부터의 핵을 단리하고, 직접 서열분석하거나, 또는 서열분석 전에 GFP 발현에 대해 분류하였다. DNMT1 유전자좌에서 평균 7.1±1.2%로 전환을 설치하는 프라임 편집이, 분류된 핵에서 0.58±0.14% 평균 indel로 (도 43d) 관찰되었다. 동일한 분할-인테인 이중 렌티바이러스 시스템에서의 Cas9 뉴클레아제는 분류된 피질 뉴런 핵 사이에서 31±5.5% indel을 발생시켰다 (도 43d). 이들 데이터는 유사분열후, 말단 분화된 1차 세포가 프라임 편집을 지지할 수 있음을 나타내고, 따라서 프라임 편집이 세포 복제를 필요로 하지 않는다는 것을 확립한다.
Cas9-개시된 HDR과 비교한 프라임 편집
PE3의 성능을 HDR128을 지지하는 유사분열 세포주에서 최적화된 Cas9-개시된 HDR128,125의 성능과 비교하였다. HEK293T, HeLa, K562 및 U2OS 세포를 Cas9 뉴클레아제, sgRNA, 및 다양한 전환 및 삽입 편집을 설치하도록 설계된 ssDNA 공여자 올리고뉴클레오티드 주형으로 처리하였다 (도 43e-43g, 및 도 51a-51f). 모든 경우에 Cas9-개시된 HDR은 성공적으로 목적하는 편집을 설치하였지만, 이중 가닥 파괴를 유발하는 처리로부터 예상된 바와 같이, 훨씬 더 높은 수준의 부산물 (우세하게 indel)을 가졌다. HEK293T 세포에서 PE3을 사용한 것은, HBB E6V 설치 및 교정이 각각 42% 및 58% 평균 편집 효율 및 2.6% 및 1.4% 평균 indel로 진행되었다 (도 43e 및 도 43g). 대조적으로, Cas9 뉴클레아제 및 HDR 주형을 사용한 동일한 편집은 79% 및 51% 평균 indel 빈도로 5.2% 및 6.7% 평균 편집 효율을 발생시켰다 (도 43e 및 도 43g). 유사하게, PE3은 PRNP G127V를 53% 효율 및 1.7% indel로 설치한 반면, Cas9-개시된 HDR은 이러한 돌연변이를 6.9% 효율 및 53% indel로 설치하였다 (도 43e 및 도 43g). 따라서, HBB E6V 설치, HBB E6V 교정, 및 PRNP G127V 설치에 대한 편집:indel의 비는 평균적으로 Cas9-개시된 HDR보다 PE3의 경우 270배 더 높았다.
HEK293T 이외의 인간 세포주에서의 PE3과 HDR 사이의 비교는 PE3 편집 효율이 더 낮긴 하지만 유사한 결과를 나타내었다. 예를 들어, K562 세포에서, HEK3 내로의 PE3-매개된 3-bp 삽입은 Cas9-개시된 HDR의 경우의 17% 편집 및 72% indel과 비교하여 25% 효율 및 2.8% indel로 진행되었고, 40배의 편집:indel 비 이익으로 PE3이 선호된다 (도 43f-43g). U2OS 세포에서, PE3은 이러한 3-bp 삽입을 22% 효율 및 2.2% indel로 수행한 반면, Cas9-개시된 HDR은 49배 더 낮은 편집:indel 비인 15% 편집 및 74% indel을 발생시켰다 (도 43f-43g). HeLa 세포에서, PE3은 이러한 삽입을 12% 효율 및 1.3% indel로 행한 반면, Cas9-개시된 HDR의 경우에는 3.0% 편집 및 69% indel이었고, 이는 210배 편집:indel 비 차이였다 (도 43f-43g). 집합적으로, 이들 데이터는 HDR이 전형적으로 시험된 4종의 세포주에서 PE3과 유사하거나 또는 그보다 더 낮은 편집 효율 및 훨씬 더 높은 indel을 발생시킨다는 것을 나타내었다 (도 51a-51f).
논의 및 향후 방향
DNA 서열을 단일-뉴클레오티드 정밀도로 삽입하는 능력은 특히 프라임 편집 능력을 가능하게 한다. 예를 들어, PE3을 사용하여 HEK293T 세포의 HEK3 유전자좌 내로 His6 태그 (18 bp, 65% 평균 효율), FLAG 에피토프 태그 (24 bp, 18% 평균 효율), 및 Cre 레콤비나제에 대한 천연 기질인 확장된 LoxP 부위 (44 bp, 23% 평균 효율)를 정확하게 삽입하였다. 평균 indel은 이들 실시예에 대해 3.0% 내지 5.9% 범위였다 (도 43h). 많은 생명공학, 합성 생물학, 및 치료 용도는 새로운 DNA 서열을 살아있는 세포의 관심 표적 부위 내로 효율적이고 정확하게 도입하는 능력으로부터 발생하는 것으로 고려된다.
집합적으로, 본원에 기재된 프라임 편집 실험은 명백한 이중 가닥 DNA 파괴를 만들지 않으면서 PAM의 출발의 3 bp 상류 내지 29 bp 하류 범위의 위치에서 인간 및 마우스 게놈의 12개의 내인성 유전자좌에 걸쳐, 최대 44 bp의 18개의 삽입, 최대 80 bp의 22개의 결실, 77개의 전환을 포함한 113개의 점 돌연변이, 및 18개의 조합 편집을 설치하였다. 이들 결과는 현저하게 다재다능한 게놈 편집 방법으로서 프라임 편집을 확립한다. 클린바에서의 삽입, 결실, indel, 및 중복의 압도적인 다수 (85-99%)가 ≤30 bp이기 때문에 (도 52a-52d), 원칙적으로 프라임 편집은 클린바에서의 현재 공지된 75,122개의 병원성 인간 유전자 변이체 (도 38a에서의 전이, 전환, 삽입, 결실, indel, 및 중복)의 최대 ~89%를 교정할 수 있고, 이는 카피수 획득 또는 손실에 의해 유발된 질환을 호전시키는 추가의 잠재력을 갖는다.
중요한 것으로, 임의의 목적하는 편집에 대해, 본원에서 광범위하게 입증된 바와 같이, 프라임 편집의 유연성은 PEgRNA-유도된 닉 위치, sgRNA-유도된 제2 닉 위치, PBS 길이, RT 주형 길이, 및 먼저 편집할 가닥의 많은 가능한 선택을 제공한다. 다른 정밀 게놈 편집 방법에 대해 전형적으로 이용가능한 보다 제한된 옵션과 대조되는 이러한 유연성은125,142,154, 다양한 프라임 편집 전략을 포괄한 14 및 43개의 PEgRNA를 시험하여 각각 병원성 HBB 및 HEXA 대립유전자의 교정을 최적화한 도 50a-50b에 제시된 바와 같이, 편집 효율, 생성물 순도, DNA 특이성, 또는 다른 파라미터를 주어진 적용의 필요에 적합하도록 최적화되게 한다.
프라임 편집을 추가로 이해하고 개선시키기 위해 많은 추가의 연구가 필요하다. 프라임 편집제 시스템의 추가의 변형은 그의 상용성을 다른 세포 유형, 예컨대 유사분열후 세포를 포함하도록 확장시키는데 요구될 수 있다. 프라임 편집을 바이러스 및 비-바이러스 시험관내 및 생체내 전달 전략과 결부시키는 것은 유전 질환의 연구 및 치료를 포함한 광범위한 적용을 가능하게 하기 위해 프라임 편집의 잠재력을 충분히 조사하는데 필요하다. 그러나, 이중 가닥 파괴 또는 HDR을 필요로 하지 않으면서 포유동물 세포의 게놈에서 고도로 정확한 표적화된 전이, 전환, 작은 삽입, 및 작은 결실을 가능하게 함으로써, 프라임 편집은 게놈 편집의 범주를 실질적으로 확장시키는 새로운 "검색-및-대체" 능력을 제공한다.
방법
일반적 방법
달리 나타내지 않는 한, 퓨전 U 그린 멀티플렉스(Phusion U Green Multiplex) PCR 마스터 믹스 (써모피셔 사이언티픽) 또는 Q5 핫 스타트 하이-피델리티(Q5 Hot Start High-Fidelity) 2x 마스터 믹스 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용한 PCR에 의해 DNA 증폭을 수행하였다. Cy5-표지된 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함한 DNA 올리고뉴클레오티드, dCas9 단백질, 및 Cas9 H840A 단백질을 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스로(Integrated DNA Technologies)부터 입수하였다. 효모 리포터 플라스미드를 이전에 기재된 플라스미즈64(plasmids64)로부터 유도하고, 깁슨 조립 방법에 의해 클로닝하였다. 본원에 사용된 모든 포유동물 편집제 플라스미드를 이전에 기재된 바와 같은 USER 클로닝 방법을 사용하여 조립하였다175. 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 BsmBI-소화된 수용자 벡터 내로 라이게이션하여 sgRNA를 발현하는 플라스미드를 구축하였다. PEgRNA를 발현하는 플라스미드는 맞춤 수용자 플라스미드를 사용하여 깁슨 조립 또는 골든 게이트 조립에 의해 구축하였다 (보충 '골든 게이트 조립' 개요 참조). 본원에 사용된 sgRNA 및 PEgRNA 구축물의 서열은 표 2A-2C 및 표 3A-3R에 열거된다. 포유동물 세포 실험을 위한 모든 벡터는 플라스미드 플러스 미디프렙(Plasmid Plus Midiprep) 키트 (퀴아젠) 또는 퓨어일드(PureYield) 플라스미드 미니프렙 키트 (프로메가)를 사용하여 정제하였고, 이는 내독소 제거 단계를 포함한다. 살아있는 동물을 사용한 모든 실험은 브로드 인스티튜트 동물 실험 윤리 위원회(Broad Institute Institutional and Animal Care and Use Committees)의 승인을 받았다. 야생형 C57BL/6 마우스를 찰스 리버(Charles River) (#027)로부터 입수하였다.
시험관내 생화학적 검정
PEgRNA 및 sgRNA를 T7 프로모터 서열을 함유하는 PCR-증폭된 주형으로부터 하이스크라이브 T7 시험관내 전사 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 시험관내 전사시켰다. RNA를 변성 우레아 PAGE에 의해 정제하고, 사용 전에 분석용 겔에 의해 품질-확인하였다. 5'-Cy5-표지된 DNA 듀플렉스 기질을 비-닉킹된 기질의 경우 2개의 올리고뉴클레오티드 (Cy5-AVA024 및 AVA025; 1:1.1 비) 또는 사전-닉킹된 기질의 경우 3개의 올리고뉴클레오티드 (Cy5-AVA023, AVA025 및 AVA026; 1:1.1:1.1)를 사용하여 95℃로 3분 동안 가열한 다음 실온으로 천천히 냉각시킴으로써 어닐링하였다 (표 2A-2C). Cas9 절단 및 역전사 반응을 dNTP (20 mM HEPES-K, pH 7.5; 100 mM KCl; 5% 글리세롤; 0.2 mM EDTA, pH 8.0; 3 mM MgCl2; 0.5 mM dNTP 믹스; 5 mM DTT)가 보충된 1x 절단 완충제205 중에서 수행하였다. dCas9 또는 Cas9 H840A (최종 5 μM) 및 sgRNA 또는 PEgRNA (최종 5 μM)를 실온에서 5 μL 반응 혼합물 중에서 10분 동안 사전-인큐베이션한 후, 듀플렉스 DNA 기질 (최종 400 nM)을 첨가하고, 이어서 적용가능한 경우에 개시되지 않은 M-MLV RT 변이체인 슈퍼스크립트 III 리버스 트랜스크립타제 (써모피셔 사이언티픽)를 첨가하였다. 반응을 37℃에서 1시간 동안 수행한 다음, 물로 10 μL의 부피로 희석하고, 0.2 μL의 프로테이나제 K 용액 (20 mg/mL, 써모피셔 사이언티픽)으로 처리하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 95℃에서 10분 동안 열 불활성화시킨 후, 반응 생성물을 2x 포름아미드 겔 로딩 완충제 (90% 포름아미드; 10% 글리세롤; 0.01% 브로모페놀 블루)와 합하고, 95℃에서 5분 동안 변성시키고, 변성 우레아-PAGE 겔 (15% TBE-우레아, 55℃, 200V)에 의해 분리하였다. DNA 생성물을 타이푼 FLA 7000 생체분자 영상화기를 사용하여 Cy5 형광 신호에 의해 가시화하였다.
사전-인큐베이션된 dCas9:sgRNA 또는 dCas9:PEgRNA 복합체 (최종 5 nM 내지 1 μM 농도 범위) 및 Cy5-표지된 듀플렉스 DNA (Cy5-AVA024 및 AVA025; 20 nM 최종)를 사용하여 1x 결합 완충제 (1x 절단 완충제 + 10 μg/mL 헤파린) 중에서 전기영동 이동성 변화 검정을 수행하였다. 37℃에서 15분 인큐베이션 후에, 샘플을 천연 PAGE 겔 (10% TBE)에 의해 분석하고, Cy5 형광에 대해 영상화하였다.
역전사 생성물의 DNA 서열분석을 위해, 형광 밴드를 절제하고, 우레아-PAGE 겔로부터 정제한 다음, 제조업체의 프로토콜에 따라 dGTP 또는 dATP의 존재 하에 말단 트랜스퍼라제 (TdT; 뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 3' 테일링하였다. 테일링된 DNA 생성물을 결합 완충제 (40% 포화 수성 구아니디늄 클로라이드 + 60% 이소프로판올)로 10배 희석하고, 퀴아퀵(QIAquick) 스핀 칼럼 (퀴아젠(Qiagen))에 의해 정제한 다음, 프라이머 AVA134 (A-테일링된 생성물) 또는 AVA135 (G-테일링된 생성물)를 사용하는 클레나우 단편 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 의한 프라이머 연장을 위한 주형으로서 사용하였다 (표 2A-2C). 프라이머 AVA110 및 AVA122를 사용하여 10 사이클 동안 PCR에 의해 연장부를 증폭시킨 후, 생어 방법을 사용하여 AVA037로 서열분석하였다 (표 2A-2C).
효모 형광 리포터 검정
인-프레임 정지 코돈, +1 프레임시프트, 또는 -1 프레임시프트를 함유하는 이중 형광 리포터 플라스미드를 상기 기재된 바와 같이 시험관내에서 5'-연장된 PEgRNA 또는 3'-연장된 PEgRNA 프라임 편집 반응에 적용하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 반응물을 물로 희석하고, 플라스미드 DNA를 0.3 M 아세트산나트륨 및 70% 에탄올로 침전시켰다. 이전에 기재된 바와 같이 전기천공에 의해 재현탁된 DNA로 에스. 세레비지아에를 형질전환시키고67, 류신이 없는 합성 완전 배지 (SC(글루코스), L-) 상에 플레이팅하였다. GFP 및 mCherry 형광 신호를 타이푼 FLA 7000 생체분자 영상화기를 사용하여 콜로니로부터 가시화하였다.
일반적 포유동물 세포 배양 조건
HEK293T (ATCC CRL-3216), U2OS (ATTC HTB-96), K562 (CCL-243), 및 HeLa (CCL-2) 세포를 ATCC로부터 구입하고, 각각 10% (v/v) 태아 소 혈청 (깁코(Gibco), 검증됨) 및 1x 페니실린 스트렙토마이신 (코닝(Corning))으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 플러스 글루타맥스 (써모피셔 사이언티픽), 맥코이 5A 배지 (깁코), RPMI 배지 1640 플러스 글루타맥스 (깁코), 또는 이글 최소 필수 배지 (EMEM, ATCC)에서 각각 배양 및 계대배양하였다. 모든 세포 유형을 인큐베이션하고, 유지시키고, 5% CO2 하에 37℃에서 배양하였다. 세포주는 그의 각각의 공급업체에 의해 인증되었고, 미코플라스마에 대해 음성으로 시험되었다.
HEK293T 조직 배양 형질감염 프로토콜 및 게놈 DNA 제조
성장시킨 HEK293T 세포를 48-웰 폴리-D-리신 코팅된 플레이트 (코닝) 상에 시딩하였다. 시딩 16 내지 24시간 후에, 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000 (써모 피셔 사이언티픽) 1 μL 및 PE 플라스미드 750 ng, PEgRNA 플라스미드 250 ng, 및 sgRNA 플라스미드 83 ng (PE3 및 PE3b의 경우)으로 대략 60% 전면생장률로 형질감염시켰다. 달리 언급되지 않는 한, 세포를 형질감염 후 3일 배양하였고, 그 후에 배지를 제거하고, 세포를 1x PBS 용액 (써모 피셔 사이언티픽)으로 세척하고, 150 μL의 새로 제조된 용해 완충제 (10 mM 트리스-HCl, pH 7.5; 0.05% SDS; 25 μg/mL 프로테이나제 K (써모피셔 사이언티픽))를 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 직접 첨가함으로써 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA 혼합물을 37℃에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션한 후, 80℃ 효소 불활성화 단계를 30분 동안 수행하였다. 포유동물 세포 게놈 DNA 증폭에 사용된 프라이머를 표 4에 열거하였다. HEK293T 세포에서의 HDR 실험을 위해, 231 ng의 뉴클레아제-발현 플라스미드, 69 ng의 sgRNA 발현 플라스미드, 50 ng (1.51 pmol)의 100-nt ssDNA 공여자 주형 (PAGE-정제됨; 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스)을 웰당 1.4μL 리포펙타민 2000 (써모피셔)을 사용하여 리포펙션시켰다. 모든 HDR 실험으로부터의 게놈 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 아젠코트 디엔어드밴스 키트(Agencourt DNAdvance Kit) (베크만 쿨터)를 사용하여 정제하였다.
게놈 DNA 샘플의 고처리량 DNA 서열분석
관심 게놈 부위를 게놈 DNA 샘플로부터 증폭시키고, 하기 변형과 더불어 이전에 기재된 바와 같이 일루미나 MiSeq 상에서 서열분석하였다129,130. 간략하게, 일루미나 정방향 및 역방향 어댑터를 함유하는 증폭 프라이머 (표 4)를 관심 게놈 영역을 증폭시키는 제1 라운드의 PCR (PCR 1)에 사용하였다. 25 μL PCR 1 반응을 0.5 μM의 각각의 정방향 및 역방향 프라이머, 1 μL의 게놈 DNA 추출물 및 12.5 μL의 퓨전 U 그린 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스를 사용하여 수행하였다. PCR 반응을 하기와 같이 수행하였다: 98℃에서 2분, 이어서 [98℃에서 10초, 61℃에서 20초, 및 72℃에서 30초]의 30 사이클, 이어서 최종 72℃에서 2분 연장. 고유한 일루미나 바코딩 프라이머 쌍을 2차 PCR 반응 (PCR 2)에서 각각의 샘플에 첨가하였다. 구체적으로, 25 μL의 주어진 PCR 2 반응물은 0.5 μM의 각각의 고유한 정방향 및 역방향 일루미나 바코딩 프라이머 쌍, 1 μL의 비정제 PCR 1 반응 혼합물, 및 12.5 μL의 퓨전 U 그린 멀티플렉스 PCR 2x 마스터 믹스를 함유하였다. 바코딩 PCR 2 반응을 하기와 같이 수행하였다: 98℃에서 2분, 이어서 [98℃에서 10초, 61℃에서 20초, 및 72℃에서 30초]의 12 사이클, 이어서 최종 72℃에서 2분 연장. PCR 생성물을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분석적으로 평가하였다. PCR 2 생성물 (공통 앰플리콘에 의해 풀링됨)을 퀴아퀵 겔 추출 키트 (퀴아젠)를 사용하여 1.5% 아가로스 겔에 의한 전기영동에 의해, 40 μL의 물로 용리시켜 정제하였다. DNA 농도를 형광측정 정량화 (큐비트(Qubit), 써모피셔 사이언티픽) 또는 qPCR (카파 라이브러리 정량화 키트- 일루미나, 카파 바이오시스템즈(KAPA Biosystems))에 의해 측정하고, 일루미나 MiSeq 기기 상에서 제조업체의 프로토콜에 따라 서열분석하였다.
서열분석 판독물을 MiSeq 리포터 (일루미나)를 사용하여 탈멀티플렉스화하였다. CRISPResso2178를 사용하여 참조 서열에 대한 앰플리콘 서열의 정렬을 수행하였다. 점 돌연변이 편집의 정량화에 대해, CRISPResso2를 표준 모드로 "폐기_indel_판독물"을 온으로 하여 실행하였다. 편집 효율을 (비-폐기된 판독물에서의 명시된 점 돌연변이의 빈도) x (비-폐기된 판독물의 #) ÷ 총 판독물로서 계산하였다. 삽입 또는 결실 편집에 대해서는, CRISPResso2를 예상된 대립유전자로서 목적하는 대립유전자를 사용하여 HDR 모드로 (e flag), "폐기_indel_판독물"을 온으로 하여 실행하였다. 편집 수율은 HDR 정렬된 판독물의 수를 총 판독물로 나눔으로써 계산하였다. 모든 편집에 대해, indel 수율은 폐기된 판독물의 수를 총 판독물로 나눔으로써 계산하였다.
U2OS, K562, 및 HeLa 세포의 뉴클레오펙션
K562, HeLa, 및 U2OS 세포를 사용하여 모든 실험에서 뉴클레오펙션을 수행하였다. 이들 세포 유형에서의 PE 조건을 위해, 800ng 프라임 편집제-발현 플라스미드, 200ng PEgRNA-발현 플라스미드, 및 83 ng 닉킹 플라스미드를 16-웰 뉴클레오큐벳 스트립 (론자)에서 20 μL의 최종 부피로 뉴클레오펙션시켰다. 이들 3가지 세포 유형에서 HDR 조건을 위해, 350 ng 뉴클레아제-발현 플라스미드, 150 ng sgRNA-발현 플라스미드 및 200 pmol (6.6 μg) 100-nt ssDNA 공여자 주형 (PAGE-정제됨; 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스)을 16-웰 뉴클레오큐벳 스트립 (론자)에서 샘플당 20 μL의 최종 부피로 뉴클레오펙션시켰다. K562 세포를 SF 세포주 4D-뉴클레오펙터 X 키트 (론자)를 사용하여 샘플당 5 x 105개 세포 (프로그램 FF-120)로 제조업체 프로토콜에 따라 뉴클레오펙션시켰다. U2OS 세포를 SE 세포주 4D-뉴클레오펙터 X 키트 (론자)를 사용하여 샘플당 3-4 x 105개 세포 (프로그램 DN-100)로 제조업체 프로토콜에 따라 뉴클레오펙션시켰다. HeLa 세포를 SE 세포주 4D-뉴클레오펙터 X 키트 (론자)를 사용하여 샘플당 2 x 105개 세포 (프로그램 CN-114)로 제조업체 프로토콜에 따라 뉴클레오펙션시켰다. 세포를 게놈 DNA 추출을 위해 뉴클레오펙션 72시간 후에 수거하였다.
HDR 실험을 위한 게놈 DNA 추출
HEK293T, HEK293T HBB E6V, K562, U2OS, 및 HeLa 세포에서의 모든 HDR 비교 실험으로부터의 게놈 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 아젠코트 디엔어드밴스 키트 (베크만 쿨터)를 사용하여 정제하였다.
PE2, PE3, BE2, BE4max, ABEdmax, 및 ABEmax 사이의 비교
HEK293T 세포를 48-웰 폴리-D-리신 코팅된 플레이트 (코닝) 상에 시딩하였다. 16 내지 24시간 후, 세포를 대략 60% 전면생장률로 형질감염시켰다. CBE 또는 ABE 구축물을 사용한 염기 편집을 위해, 세포를 염기 편집제 플라스미드 750 ng, sgRNA 발현 플라스미드 250 ng, 및 리포펙타민 2000 (써모 피셔 사이언티픽) 1 μL로 형질감염시켰다. PE 형질감염을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. PE 및 BE에 대한 게놈 DNA 추출을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
공지된 Cas9 오프-타겟 부위에서의 PE3 활성의 결정
공지된 Cas9 오프-타겟 부위에서의 PE3 오프-타겟 편집 활성을 평가하기 위해, PE3으로의 형질감염 3일 후에 HEK293T 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 16개의 이전에 보고된 Cas9 오프-타겟 게놈 부위의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다118,159 (HEK3, EMX1, FANCF, 및 HEK4 스페이서에 대한 각각 상위 4개의 오프-타겟 부위; 프라이머 서열은 표 4에 열거됨). 이들 게놈 DNA 샘플은 도 41a-41k에 제시된 온-타겟 PE3 편집 활성을 정량화하는데 사용된 것과 동일하였고; PEgRNA 및 닉킹 sgRNA 서열은 표 3A-3R에 열거된다. 오프-타겟 부위의 PCR 증폭 후에, 앰플리콘을 상기 기재된 바와 같이 일루미나 MiSeq 플랫폼 상에서 서열분석하였다 (HTS 분석). Cas9 뉴클레아제, Cas9 H840A 닉카제, dCas9, 및 PE2-dRT 온-타겟 및 오프-타겟 편집 활성을 결정하기 위해, HEK293T 세포를 750 ng의 편집제 플라스미드 (Cas9 뉴클레아제, Cas9 H840A 닉카제, dCas9, 또는 PE2-dRT), 250 ng의 PEgRNA 또는 sgRNA 플라스미드, 및 1 μL의 리포펙타민 2000으로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 상기 기재된 바와 같이 형질감염 3일 후에 세포로부터 단리하였다. 온-타겟 및 오프-타겟 게놈 유전자좌를 표 4의 프라이머 서열을 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 일루미나 MiSeq 상에서 서열분석하였다.
CRISPResso2178를 사용하여 HTS 데이터 분석을 수행하였다. Cas9 뉴클레아제, Cas9 H840A 닉카제, 및 dCas9의 편집 효율을 indel을 함유하는 총 서열분석 판독물의 퍼센트로서 정량화하였다. PE3 및 PE3-dRT 오프-타겟의 정량화를 위해, 정렬된 서열분석 판독물을 Cas9 닉 부위에서 개시된 PEgRNA 역전사의 예상 생성물과 일치하는 점 돌연변이, 삽입, 또는 결실에 대해 검사하였다. 샘플 내의 총 판독물 중에서 <0.1% 전체 빈도로 발생하는 단일 뉴클레오티드 변경은 분석에서 제외하였다. ≥ 0.1%의 빈도로 발생하였고 또한 PEgRNA-코딩된 편집과 부분적으로 일치하는 단일 뉴클레오티드 변경을 함유하는 판독물의 경우에는, 변이체가 동일한 스페이서를 함유하지만 상이한 편집을 코딩하는 PEgRNA로 처리된 샘플과 비교하여 유의하게 더 높은 수준으로 발생하였는지 t-검정 (독립표본, 단측, α = 0.5)을 사용하여 결정하였다. 서열분석 오류에서의 차이를 피하기 위해, 동일한 MiSeq 실행 내에서 동시에 서열분석된 샘플들 사이에 비교를 수행하였다. p-값 > 0.05의 기준을 충족시키지 않는 변이체는 제외하였다. 이어서, 오프-타겟 PE3 편집 활성을 상기 기준을 충족시키는 총 서열분석 판독물의 백분율로서 계산하였다.
Cas9-개시된 HDR을 사용한 HBB E6V 돌연변이를 함유하는 HEK293T 세포주의 생성
HEK293T 세포를 48-웰 플레이트에 시딩하고, 1.5 μL의 리포펙타민 2000, 300 ng의 Cas9 D10A 닉카제 플라스미드, 100 ng의 sgRNA 플라스미드, 및 200 ng의 100-mer ssDNA 공여자 주형으로 대략 60% 전면생장률로 형질감염시켰다 (표 5). 형질감염 3일 후에, 배지를 신선한 배지로 교체하였다. 형질감염 4일 후에, 세포를 30 μL의 트리플(TrypLE) 용액을 사용하여 해리시키고, 1.5 mL의 배지 중에 현탁시켰다. 단일 세포를 형광-활성화 세포 분류 (FACS) (베크만-쿨터 아스트리오스)에 의해 2개의 96-웰 플레이트의 개별 웰 내로 단리하였다. 대표적인 FACS 분류 실시예에 대해서는 도 53a-53b를 참조한다. 세포를 상기 기재된 바와 같은 게놈 DNA 서열분석 전에 14일 동안 확장시켰다. 단리된 클론 집단 중에서 어떠한 것도 HBB E6V 돌연변이에 대해 동형접합인 것으로 발견되지 않았으므로, 부분적으로 편집된 세포주에서 리포펙션, 분류, 및 성장에 의한 제2 라운드의 편집을 반복하여 E6V 대립유전자에 대해 동형접합인 세포주를 수득하였다.
PE3을 사용한 HBB E6V 돌연변이를 함유하는 HEK293T 세포주의 생성
항생제의 부재 하에 성장시킨 2.5 x 104개의 HEK293T 세포를 48-웰 폴리-D-리신 코팅된 플레이트 (코닝) 상에 시딩하였다. 시딩 16 내지 24시간 후에, 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000 (써모 피셔 사이언티픽) 1 μL 및 PE2-P2A-GFP 플라스미드 750 ng, PEgRNA 플라스미드 250 ng, 및 sgRNA 플라스미드 83 ng으로 대략 70% 전면생장률로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후, 세포를 포스페이트-완충 염수 (깁코)로 세척하고, 트리플 익스프레스(TrypLE Express) (깁코)를 사용하여 해리시켰다. 이어서, 세포를 10% (v/v) FBS (깁코)로 보충된 DMEM 플러스 글루타맥스 (써모 피셔 사이언티픽)로 희석하고, 분류 전에 35-μm 세포 스트레이너 (코닝)를 통과시켰다. 유동 세포측정법을 LE-MA900 세포 분류기 (소니(Sony)) 상에서 수행하였다. 분류 15분 전에 세포를 3 nM DAPI (바이오레전드(BioLegend))로 처리하였다. 더블렛 배제에 대해 게이팅한 후, GFP-음성 대조군 세포 집단의 것을 초과하는 GFP 형광을 갖는 단일 DAPI-음성 세포를 10% FBS로 보충된 글루타맥스를 함유하는 사전-냉각된 DMEM으로 충전된 96-웰 편평-바닥 세포 배양 플레이트 (코닝) 내로 분류하였다. 대표적인 FACS 분류 실시예에 대해서는 도 53a-53b를 참조한다. 세포를 10일 동안 배양한 후, 상기 기재된 바와 같이 게놈 DNA 추출하고 HTS에 의해 특징화하였다. HBB에서 E6V 돌연변이에 대해 동형접합인 총 6개의 클론 세포주가 확인되었다.
PE3을 사용한 HEXA 1278+TATC 삽입을 함유하는 HEK293T 세포주의 생성
HEXA 1278+TATC 대립유전자를 함유하는 HEK293T 세포를 HBB E6V 세포주의 생성에 대해 상기 기재된 프로토콜에 따라 생성하였고; PEgRNA 및 sgRNA 서열을 표 2A-2C에 도 43a-43h 부표제 하에 열거한다. 형질감염 및 분류 후에, 세포를 10일 동안 배양한 후, 상기 기재된 바와 같이 게놈 DNA 추출하고 HTS에 의해 특징화하였다. 50% HEXA 1278+TATC 대립유전자를 함유하는 2개의 이형접합 세포주를 단리하고, 100% HEXA 1278+TATC 대립유전자를 함유하는 2개의 동형접합 세포주를 회수하였다.
세포 생존율 검정
HEK293T 세포를 48-웰 플레이트에 시딩하고, 상기 기재된 바와 같이 750 ng의 편집제 플라스미드 (PE3, PE3 R110S K103L, Cas9 H840A 닉카제, 또는 dCas9), 250 ng의 HEK3-표적화 PEgRNA 플라스미드, 및 1 μL의 리포펙타민 2000으로 대략 70% 전면생장률로 형질감염시켰다. 세포 생존율을 셀타이터-글로 2.0 검정 (프로메가)을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 형질감염후 24시간마다 3일 동안 측정하였다. 발광을 96-웰 편평-바닥 폴리스티렌 마이크로플레이트 (코닝)에서 M1000 프로 마이크로플레이트 판독기 (테칸)를 사용하여 1-초 통합 시간으로 측정하였다.
렌티바이러스 생산
렌티바이러스를 이전에 기재된 바와 같이 생산하였다206. 신속하게 분열 중인 HEK293T 세포 (ATCC; 미국 버지니아주 마나사스)의 T-75 플라스크를 제조업체의 지시에 따라 퓨진 에이치디(FuGENE HD) (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 인테인-분할 PE2 편집제를 보유하는 변형된 렌티CRISPR_v2 게놈과 조합된 렌티바이러스 생산 헬퍼 플라스미드 pVSV-G 및 psPAX2로 형질감염시켰다. 4개의 분할-인테인 편집제 구축물을 설계하였다: 1) Npu N-인테인, 자기-절단 P2A 펩티드, 및 GFP-KASH에 융합된 Cas9 H840A 닉카제의 N-말단 부분 (1-573) 및 U6-PEgRNA 발현 카세트를 코딩하는 바이러스 게놈; 2) PE2의 C-말단 나머지에 융합된 Npu C-인테인을 코딩하는 바이러스 게놈; 3) Cas9 대조군에 대한 Cas9의 C-말단 나머지에 융합된 Npu C-인테인을 코딩하는 바이러스 게놈; 및 4) DNMT1에 대한 닉킹 sgRNA. 분할-인테인은 트랜스 스플라이싱을 매개하여 PE2 또는 Cas9의 2개의 절반을 연결하는 한편, P2A GFP-KASH는 핵 막-국재화된 GFP의 공동-번역 생산을 가능하게 한다. 48시간 후, 상청액을 수집하고, 500 g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 0.45 μm 필터를 사용하여 여과하였다. 여과된 상청액을 PEG-it 바이러스 침전 용액 (시스템 바이오사이언시스(System Biosciences), 미국 캘리포니아주 팔로 알토)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 농축시켰다. 생성된 펠릿을 Opti-MEM (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬) 중에 원래 배지 부피의 1%를 사용하여 재현탁시켰다. 재현탁된 펠릿을 급속-동결시키고, 사용시까지 -80℃에서 저장하였다.
마우스 1차 피질 뉴런 절개 및 배양
E18.5 해리된 피질 배양물을 시한-임신 C57BL/6 마우스 (찰스 리버)로부터 수거하였다. CO2에 의한 안락사에 이은 단두 후, 임신한 마우스로부터 배아를 수거하였다. 피질 캡을 페니실린/스트렙토마이신 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))으로 보충된 빙냉 하이버네이트-E에서 해부하였다. 빙냉 하이버네이트-E로 헹군 후, 조직을 37℃에서 8분 동안 파파인/DNase (워싱턴/시그마) 중에서 소화시켰다. 조직을 DNase가 보충된 NBActiv4 (브레인비츠(BrainBits))에서 연화처리하였다. 세포를 카운팅하고, 24-웰 플레이트에 웰당 100,000개 세포로 플레이팅하였다. 배지의 절반을 1주에 2회 교체하였다.
1차 뉴런에서의 프라임 편집 및 핵 단리
DIV 1에서, 15 μL의 렌티바이러스를 10:10:1 비의 N-말단:C-말단:닉킹 sgRNA로 첨가하였다. DIV 14에서, 뉴런 핵을 제조업체의 프로토콜에 따라 EZ-PREP 완충제 (시그마 D8938)를 사용하여 단리하였다. 모든 단계는 얼음 상에서 또는 4℃에서 수행하였다. 해리된 배양물로부터 배지를 제거하고, 배양물을 빙냉 PBS로 세척하였다. PBS를 흡인하고, 200 μL EZ-PREP 용액으로 대체하였다. 얼음 상에서 5-분 인큐베이션한 후, EZ-PREP를 웰의 표면을 가로질러 피펫팅하여 나머지 세포를 축출하였다. 샘플을 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 샘플을 200 μL EZ-PREP로 세척하고, 500 g에서 5분 동안 다시 원심분리하였다. 샘플을 1xPBS 중 100 μg/mL BSA 및 3.33 μM 비브란트 다이사이클 루비(Vybrant DyeCycle Ruby) (써모 피셔)로 이루어진 200 μL 빙냉 핵 현탁 완충제 (NSB) 중에 부드럽게 피펫팅하여 재현탁시킨 다음, 500 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 핵을 100 μL NSB 중에 재현탁시키고, 브로드 인스티튜트 유동 세포측정 설비에서 모플로 아스트리오스(MoFlo Astrios) (베크만 쿨터)를 사용하여 100 μL 아젠코트 디엔어드밴스 용해 완충제 내로 분류하였다. 게놈 DNA를 제조업체 아젠코트 디엔어드밴스 지침에 따라 정제하였다.
RNA-서열분석 및 데이터 분석
HEK293T 세포를 PRNP-표적화 또는 HEXA-표적화 PEgRNA 및 PE2, PE2-dRT, 또는 Cas9 H840A 닉카제로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후에, 총 RNA를 세포로부터 트리졸(TRIzol) 시약 (써모 피셔)을 사용하여 수거하고, 온-칼럼 DNaseI 처리를 포함하는 RN이지 미니 키트 (퀴아젠)로 정제하였다. 리보솜을 총 RNA로부터 TruSeq 가닥 총 RNA 라이브러리 프렙 키트 (일루미나)의 rRNA 제거 프로토콜을 사용하여 고갈시키고, 후속적으로 RNA클린 XP 비드 (베크만 쿨터)로 세척하였다. 서열분석 라이브러리를 제조업체의 프로토콜에 따라 스마터 프렙엑스 아폴로(SMARTer PrepX Apollo) NGS 라이브러리 프렙 시스템 (타카라(Takara)) 상에서 리보-고갈된 RNA를 사용하여 제조하였다. 생성된 라이브러리를 2200 테이프스테이션(2200 TapeStation) (애질런트 테크놀로지스) 상에서 가시화하고, 큐비트 dsDNA HS 검정 (써모 피셔)을 사용하여 정규화하고, NextSeq 550 상에서 고출력 v2 유동 셀 (일루미나)을 사용하여 75-bp 쌍형성된-단부 판독물로서 서열분석하였다. bcl2fastq2 버전 2.20으로 Fastq 파일을 생성하고, TrimGalore 버전 0.6.2 (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore)를 사용하여 트리밍하여 저품질 염기, 비쌍형성 서열, 및 어댑터 서열을 제거하였다. 트리밍된 판독물을 RSEM 버전 1.3.1207을 사용하여 맞춤 Cas9 H840A 유전자 입력을 갖는 호모 사피엔스 게놈 조립 GRCh148에 대해 정렬하였다. 림마-붐(limma-voom)208 패키지를 사용하여 유전자 발현 수준을 정규화하고, 배치 효과 교정 하에 차등 발현 분석을 수행하였다. FDR-교정된 p-값 <0.05 및 배수-변화 > 2 컷오프를 갖는 차등 발현된 유전자를 호출하고, 결과를 R에서 가시화하였다.
클린바 분석
클린바 변이체 요약본을 NCBI (2019년 7월 15일 엑세스)로부터 다운로드하고, 그 안에 담긴 정보를 모든 하류 분석에 사용하였다. 모든 보고된 변이체의 목록을 대립유전자 ID에 의해 필터링하여 중복을 제거하고, 임상 유의성에 의해 필터링하여 분석을 병원성 변이체로 제한하였다. 삽입, 결실 등인 병원성 변이체의 분율을 계산하기 위해 병원성 변이체의 목록을 변이체 유형에 의해 순차적으로 필터링하였다. 보고된 참조 대립유전자 및 대안적 대립유전자에 기초하여 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)를 2개의 카테고리 (전이 및 전환)로 분리하였다. 참조 대립유전자 또는 대안적 대립유전자가 보고되지 않은 SNV는 분석에서 제외하였다.
보고된 삽입, 결실, 및 중복의 길이는 참조/대안적 대립유전자, 변이체 시작/정지 위치, 또는 변이체 명칭에서의 적절한 확인 정보를 사용하여 계산하였다. 상기 정보 중 임의의 것이 보고되지 않은 변이체는 분석에서 제외하였다. 보고된 indel (참조 게놈에 비해 삽입 및 결실 둘 다를 포함하는 단일 변이체)의 길이는 참조 대립유전자 및 대안적 대립유전자 사이의 최상의 쌍별 정렬에서 미스매치 또는 갭의 수를 결정함으로써 계산하였다. 변이체 길이의 빈도 분포를 그래프패드 프리즘 8을 사용하여 계산하였다.
데이터 이용가능성
고처리량 서열분석 데이터는 NCBI 서열 판독 아카이브 데이터베이스에 기탁되어 있다. PE1, PE2/PE3, 및 PEgRNA 발현 벡터를 코딩하는 플라스미드는 애드진으로부터 입수가능할 것이다.
코드 이용가능성
PEgRNA 스캐폴드 삽입을 정량화하는데 사용된 스크립트를 도 60a-60b에 제공한다.
보충 정보: 표 및 서열
표 1: HEK3, HEK4, EMX1, 및 FANCF 온-타겟 및 오프-타겟 부위에서의 프라임 편집제, Cas9 뉴클레아제, Cas9 H840A 닉카제, 및 PE2-dRT의 활성. PE2/PE3 편집은 % 프라임 편집으로서 % indel (괄호 안)과 함께 제시된다. 상위 4개의 이전에 특징화된 오프-타겟 부위에서 Cas9, Cas9 H840A 닉카제 (nCas9), 및 PE2-dRT에 대한 % indel이 제시된다179,180. sgRNA 및 PEgRNA 서열은 도 42a-42h 표제 하에 표 3A-3R에서 확인할 수 있다. 모든 값은 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균이다.
Figure pct00378
표 2A-2C: 시험관내 실험에 사용된 DNA 올리고뉴클레오티드, PEgRNA, 및 sgRNA의 서열.
표 2A: DNA 올리고뉴클레오티드
Figure pct00379
표 2B: 5'-연장된 PEgRNA
Figure pct00380
표 2C: 3'-연장된 PEgRNA
Figure pct00381
표 3A-3R: 포유동물 세포 실험에 사용된 PEgRNA 및 sgRNA의 서열. 모든 서열은 5'에서 3' 배향으로 제시된다. PEgRNA를 구축하기 위해, 하기 열거된 스페이서 서열을 sgRNA 스캐폴드의 5' 단부에 부가하고, 프라이머 결합 부위 및 RT 주형을 함유하는 하기 열거된 3' 연장부를 sgRNA 스캐폴드의 3' 단부에 부가하였다. sgRNA 스캐폴드 서열은
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열식별번호: 131)이다.
표 3A: 도 39a-39d PEgRNA
Figure pct00382
Figure pct00383
Figure pct00384
Figure pct00385
Figure pct00386
표 3B: 도 40a-40c PEgRNA
Figure pct00387
표 3C: 도 40a-40c 닉킹 sgRNA 서열
Figure pct00388
표 3D: 도 41a-41k PEgRNA
Figure pct00389
Figure pct00390
Figure pct00391
Figure pct00392
Figure pct00393
Figure pct00394
Figure pct00395
Figure pct00396
표 3E: 도 41a-41k 닉킹 sgRNA 서열
Figure pct00397
표 3F: 도 42a-42h PEgRNA
Figure pct00398
표 3G: 도 42a-42h 닉킹 sgRNA
Figure pct00399
표 3H: 도 42a-42h 염기 편집 sgRNA
Figure pct00400
표 3I: 도 42a-42h 온-타겟 sgRNA
Figure pct00401
표 3J: 도 42a-42h 온-타겟 PEgRNA
Figure pct00402
표 3K: 도 49a-49b PEgRNA
Figure pct00403
Figure pct00404
표 3L: 도 47a-74d PEgRNA
Figure pct00405
표 3M: 도 48a-48c PEgRNA
Figure pct00406
Figure pct00407
Figure pct00408
Figure pct00409
Figure pct00410
표 3N: 도 48a-48c PEgRNA
Figure pct00411
표 3O: 도 48a-48c 닉킹 sgRNA
Figure pct00412
표 3P: 도 50a-50b PEgRNA
Figure pct00413
Figure pct00414
Figure pct00415
표 3Q: 도 50a-50b 닉킹 sgRNA
Figure pct00416
표 3R: 도 51a-51f PEgRNA
Figure pct00417
표 4: 포유동물 세포 게놈 DNA 증폭 및 HTS에 사용된 프라이머의 서열181.
Figure pct00418
Figure pct00419
Figure pct00420
표 5: HDR 실험 및 HBB E6V HEK293T 세포주의 생성에 사용된 100-mer 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 공여자 주형의 서열. 올리고뉴클레오티드는 길이가 100-103 nt이고, 상동성 아암이 대략 편집 부위의 중심이 된다. 올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스로부터 입수하였고, PAGE에 의해 정제하였다.
Figure pct00421
추가의 서열
본원에 사용된 효모 이중 형광 리포터 플라스미드의 서열
p425-GFP_정지_mCherry:
Figure pct00422
Figure pct00423
Figure pct00424
Figure pct00425
Figure pct00426
Figure pct00427
Figure pct00428
Figure pct00429
Figure pct00430
Figure pct00431
Figure pct00432
설명:
GFP 오픈 리딩 프레임
정지 코돈 +1 프레임시프트, 또는 -1 프레임시프트를 함유하는 링커
mCherry 오픈 리딩 프레임
플라스미드 백본 (GPD 프로모터, Leu2 마커, 및 AmpR 함유)
프로토스페이서 (밑줄표시됨)
PAM (볼드체)
포유동물 프라임 편집제 플라스미드 및 예시적 PEgRNA 플라스미드의 DNA 서열
pCMV-PE1:
Figure pct00433
Figure pct00434
Figure pct00435
Figure pct00436
Figure pct00437
Figure pct00438
Figure pct00439
Figure pct00440
N-말단 NLS + Cas9 H840A
가요성 링커
M-MLV 리버스 트랜스크립타제 + C-말단 NLS
플라스미드 백본 (CMV 프로모터 및 AmpR 함유)
pU6-HEK3_PEgRNA_CTTins:
Figure pct00441
U6 프로모터 서열
스페이서 서열
sgRNA 스캐폴드
3' 연장부 (PBS 및 RT 주형 함유)
백본 (AmpR 함유)
pLenti-hSyn-N-PE2-NpuN-P2A-GFP-KASH_U6-DNMT1-PEgRNA:
Figure pct00442
Figure pct00443
Figure pct00444
Figure pct00445
Figure pct00446
U6프로모터
PEgRNA
hSyn프로모터
N-termPE2
N-termNpu
P2A-GFP-KASH
pLenti-hSyn-C-PE2-NpuC:
Figure pct00447
Figure pct00448
Figure pct00449
Figure pct00450
Figure pct00451
hSyn프로모터
C-termNpu
C-termwtCas9
pLenti-U6-DNMT1_닉킹_sgRNA:
Figure pct00452
Figure pct00453
Figure pct00454
Figure pct00455
U6프로모터
sgRNA
본원에 사용된 말로니 뮤린 백혈병 바이러스 리버스 트랜스크립타제 (M-MLV RT) 변이체의 아미노산 서열.
PE1 M-MLV RT:
Figure pct00456
M3 M-MLV RT (D200N, T330P, L603W) (문헌 [Baranauskas et al.]182 참조):
Figure pct00457
PE2 M-MLV RT (D200N, T306K, W313F, T330P, L603W):
Figure pct00458
M3-기능상실RT M-MLV RT:
Figure pct00459
실시예 12에 대한 참고문헌
각각의 하기 참고문헌이 실시예 12에 인용되며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00460
Figure pct00461
Figure pct00462
Figure pct00463
Figure pct00464
실시예 13 - PE에 의한 세포 데이터 기록 및 계통 추적
배경기술
게놈 변형은 세포 과정 및 발달을 연구하고 기록하는데 사용될 수 있다. 세포 분열 또는 신호전달 캐스케이드 활성화와 같은 세포 사건을 DNA 서열 변형과 연관시키는 것은 특정 세포 사건이 일어났는지 여부를 설명하는 해석가능한 DNA 서열 변화로서 세포 이력을 저장한다. DNA는 RNA 및 단백질이 아닌 방식으로 하나의 세포로부터 다음 세포로 충실하게 전달되기 때문에 이들 적용에 DNA 편집이 필요하다. 세포 상태 및 계통에 관한 정보는 일반적으로 변형이 짧은 수명의 단백질 및 RNA 분자에 대해 이루어질 경우 상실된다. 단일 세포 내 세포 사건을 기록하는 것은 건강한 대조군에 비해 질환 상태가 어떻게 개시, 유지, 및 변화되는지를 이해하는 강력한 방법이다. 이들 질문을 프로빙하는 능력은 암, 신경계 질환, 및 인간 건강에서의 다른 중요한 문제의 숙주의 발생을 이해하기 위한 의미를 갖는다. 프라임 편집 (PE)은 표적화되고 서열-명시된 게놈 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 생성하기 위한 시스템을 제공한다. 표적화된 앰플리콘 서열분석 및/또는 RNA 서열분석에 의해 서열분석될 수 있는 DNA 표적의 반복된 변형은 (이는 단일 세포 기록 실험에 특히 가치가 있음) 신호전달 캐스케이드의 활성화, 대사 상태, 및 세포 분화 프로그램을 포함한 중요한 생물학적 과정의 숙주를 기록하는데 사용될 수 있다. 내부 및 외부 세포 신호를 게놈 내의 서열 변형과 연결하는 것은, 이론상, 신호 반응성 프로모터가 존재하는 임의의 신호에 대해 가능하다. PE는 배양 조건 및 생체내 둘 다에서 진핵 및 원핵 세포의 세포 계통 및 신호전달 이력을 프로빙하기 위한 크게 확장된 툴키트를 가능하게 하는 것으로 여겨진다.
이전 표준
표적화된 서열 삽입, 결실, 또는 돌연변이는 계통 추적 및 세포 자극의 기록을 비롯한 다수의 중요한 생물학적 의문을 연구하는데 사용될 수 있다. 게놈에서 이들 서명을 생성하기 위한 현재의 툴키트는 제한적이다. 표적 유전자좌의 돌연변이유발은 지금까지 DNA-뉴클레아제 및 염기 편집제 둘 다를 사용하여 개발되어 왔다.
표적 서열의 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 절단은 확률적 서열 변화를 생성하여 다수의 삽입 또는 결실 (indel) 생성물을 생성한다. Cas9 절단으로부터 발생하는 다수의 서열 결과는 뉴클레아제에 의해 절단된 서열의 명확한 결정을 가능하게 한다. 절단 대 비-절단 서열을 구별하는 능력은 2가지의 우세한 방식으로 사용되어 왔다.
먼저, Cas9 뉴클레아제 및/또는 그의 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 발현을 세포 신호와 연관시켰다. 추가적으로, 그러한 신호가 Cas9 표적화된 게놈 유전자좌에 대한 서열 변형에 기초하여 발생하였는지 여부를 기록하였다. 그러나, 각각의 신호는 고유한 표적 유전자좌를 필요로 하기 때문에 이러한 접근법은 제한적이고, 다중 신호의 상대적인 타이밍의 추적하여 해석하는 것을 어렵게 만든다. 이러한 접근법에 대한 또 다른 제한은 indel의 생성이 종종 표적 유전자좌의 추가의 돌연변이유발을 심각하게 방해하기 때문에 특정 sgRNA를 위해 다중 표적 유전자좌가 바람직하다는 것이며; 이는 종종 편집을 위해 내인성 유전자좌의 직접 돌연변이유발 대신 사전-조작된 표적 유전자좌가 세포 내로 통합된다는 것을 의미한다.
둘째로, Cas9 indel을 세포 계통을 추적하는데 사용하여 왔다. 본원에 기재된 바와 같이, Cas9 뉴클레아제 활성에 의해 생성된 다수의 가능한 indel 상태는 어떠한 세포가 시간 경과에 따라 서로로부터 발생하였는지를 시사하는 세포 발생 트리의 생성을 가능하게 한다. 이러한 접근법은 세포가 서로로부터 어떻게 발생하는지를 이해하는 강력한 방식이며, 선택된 세포 풀 상에서 RNA 서열분석을 수행함으로써 발생 시간에 걸쳐 고유한 세포 상태 및 유형을 확인하는 것을 돕는데 사용되어 왔다. 이러한 접근법은 세포 신호전달 사건, 그의 순서를 독립적으로 보고할 수 없고, 전구체 대 최종 분화 세포 상태의 보고 시 편향이 있을 수 있다.
Cas9 뉴클레아제 매개된 계통 추적 및 신호 기록은 일부 중요한 경고와 함께 제공되는 강력한 기술이다. Cas9 뉴클레아제를 사용한 신호 기록은 종종 매우 기술적으로 도전과제이다. Cas9 절단은 표적 유전자좌를 소진시켜 (indel이 생성되면 반복 절단이 어려움), 단일 세포 수준에서 장기간 자극을 기록하는 것을 어렵게 만든다. Cas9 절단의 동역학은 장기간 기록 사건을 가능하게 하도록 조정될 수 있지만, 다중 자극의 순서, 강도, 및 지속기간을 통합하는 능력은 이러한 도구로 달성가능하지 않을 수 있는 매우 도전적인 기술적 문제로 남아있다. Cas9 계통 추적 실험은 매우 강력하였지만, 표적 유전자좌에서의 동시 Cas9 절단으로 인한 서열 붕괴의 부차적인 기술적 도전과제를 겪고 있다. 이들 계통-추적 실험은 미리 설계된 표적 유전자좌의 편집을 필요로 하며, 이는 이러한 접근법의 유연성을 제한한다.
DNA 염기 편집이 또한 세포 신호전달 사건을 추적하는데 사용되어 왔다. 염기 편집은 Cas9 indel에 의해 생성되는 상태의 수에 비해 편집 사건에 의해 생성되는 낮은 수의 결과 상태로 인해 계통 추적에 잘 적합하지는 않지만; 염기 편집제에 의해 이루어진 서열 변형의 미리-규정된 성질은 내부 및 외부 세포 자극을 추적하는데 특히 유용하다. 본원에 기재된 바와 같이, 염기 편집제 또는 sgRNA 발현은 특정한 생물학적 또는 화학적 자극과 연관될 수 있다. 염기 편집 활성은 포유동물 및 박테리아 세포 둘 다에서 다수의 개별 자극을 추적하는데 사용되어 왔다. 이러한 접근법은 또한 제2 편집이 일어날 수 있기 전에 제1 편집 사건이 필요한 연속 자극을 추적하는데 사용되어 왔다.
염기 편집 신호 기록은 기술분야에서 중요한 제1 단계이지만, 이는 다수의 제한을 갖는다. 하나의 이러한 제한은 염기 편집이 편집 후에 그의 표적을 소진시켜, 기술의 동적 범위를 제한한다는 것이다. 이는 사건을 기록하기 위해 내인성 표적을 사용하는 것이 종종 어렵고, 단일 세포 수준에서의 활성 대신 벌크 활성을 기록하는 것으로 제한된다는 것을 의미한다. 이에 대한 대안은 미리-설계된 반복 기록 유전자좌의 도입이지만, 이는 지금까지 수행되지 않았다. 또한 2-신호 기록과도 이슈가 존재한다. 이들 2가지 신호-기록 실험은 제1 자극 후 제2 자극의 존재에 대해서만 보고하며; 어느 자극이 제1로 발생하였는지 또는 얼마나 오랫동안 자극이 존재하였는지는 보고하지 않는다. 이는 기본적으로 실험으로부터 수집되는 생물학적 이해를 제한한다.
PE 계통 추적은 게놈 표적 서열 뿐만 아니라 통합되는 미리 설계된 서열을 변형시킴으로써 계통 추적 및 세포 신호전달 기록 둘 다를 수행할 수 있는 것으로 제안되었다. PE는 Cas9 닉카제 단편 (종종 SpCas9 H840A 변이체) 및 리버스 트랜스크립타제 (RT) 도메인을 조작된 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)와 함께 포함하는 합성 융합 단백질을 사용한다. 함께, 이들 성분은 특정 게놈 서열을 표적화하고, 미리 결정된 편집을 설치한다. PEgRNA는 표적 게놈 서열 및 편집 결과 둘 다를 명시하기 때문에, 고도로 특이적이고 제어된 게놈 변형이 동일한 세포 내에서 다중 PEgRNA를 사용하여 동시에 달성될 수 있다. 접근가능한 게놈 변형은 모든 단일 뉴클레오티드 치환, 작은 내지 중간 크기의 서열 삽입, 및 작은 내지 중간 크기의 서열 결실을 포함한다. 이러한 게놈 편집 기술의 다재다능성은 세포 내에서 일시적으로 커플링된 신호-특이적 기록을 가능하게 할 것이다.
PE 계통 및 세포 신호전달 기록의 유용성
세포 신호전달의 기록은 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 이러한 접근법의 하나의 중요한 제1 적용은 세포 시계를 생성할 수 있는 세포 수명 단계에 특이적인 시클린, CDK, 또는 다른 단백질의 발현과 같은 세포 주기 연관 신호에 DNA 변형 사건을 연결하는 것이다. 세포 시계는 연구원들이 개별 세포에 의해 수신 및 프로세싱되는 다양한 신호의 순서를 이해하게 한다. 분자 시계는 또한 장기 신호전달 대 단기 신호전달 버스트의 결정을 가능하게 할 것이다. 세포 주기를 오직 1회만 편집할 수 있는 프라임 편집 성분을 사용하는 것도 또한 분자 시계로 이어질 수 있다. 편집이 계속적인 DNA 변형 없이 (아마도 비-편집된 DNA 가닥을 닉킹하지 않음으로써) 세포 주기에서 오직 1번만 진행될 수 있다면, 후속 세포 분열에서 제2 표적화 PEsgRNA에 의해서만 편집될 수 있는 시스템을 상상할 수 있다. PE는 미리 결정된 방식으로 유전자좌를 반복적으로 삽입, 결실, 또는 돌연변이시킬 수 있기 때문에 세포 시계로서 특히 유용하며, 임의의 표적 게놈 유전자좌에서 반복적인 규칙적 삽입이 이루어질 수 있기 때문에 삽입이 특히 가치가 있다.
세포 신호의 기록과 관련된 또 다른 중요한 적용은 다수의 세포 입력의 병렬 기록이다. 세포 신호전달 사건을 DNA 변형과 연관시키는 것은 이러한 신호전달 사건이 발생했는지의 기록을 가능하게 한다. Cas9 뉴클레아제-기반 또는 염기 편집-기반 기록 시스템과 유사하게, 세포 사건의 기록은 gRNA 또는 편집제 발현에 테더링될 수 있다. 이들 다른 접근법과 달리, 계통 프라임 편집은 정렬된 편집을 위해 엄격한 서열 모티프를 필요로 하지 않으면서 신호전달 사건의 순서, 강도, 및 지속기간을 기록할 수 있을 것이다. 실제로, 계통 프라임 편집은 생물학적 신호의 순서, 강도, 및 지속기간을 연구하기 위해 상기 기재된 세포 카운터를 신호 특이적 삽입, 결실, 또는 돌연변이와 통합할 수 있을 것이다. 프라임 편집의 프로그램가능한 성질로 인해, 이러한 접근법은 관심 표적 세포의 기존 게놈 유전자좌에서 달성될 수 있다 (이것이 박테리아, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 인간, 제브라피쉬, 씨. 엘레간스 등에 존재하는지 관계 없이). 프라임 편집 기록은 바코드를 가이드 RNA 의존성 방식으로 설치하고, 입력의 수는 신뢰가능한 신호 특이적 가이드 RNA 발현 카세트가 존재하는 신호의 수 (이는 이들 발현을 RNA Pol II 프로모터의 활성에 테더링하는 능력으로 인해 매우 높을 것임)로 제한된다는 것에 또한 주목하는 것이 중요하다. 기록가능한 신호의 수는 필요한 PEgRNA의 수에 따라 선형으로 규모화된다.
PE는 또한 세포 계통을 추적하는데 사용될 수 있다. 반복된 서열 변형을 사용하여 고유한 세포 바코드를 생성하여 개별 세포를 추적할 수 있다. 바코드의 어레이, 그의 순서, 및 크기는 모두 Cas9 뉴클레아제에 의해 생성된 다수의 indel 상태에 상보적일 수 있는 방식으로 세포 계통을 추론하는데 사용될 수 있다.
반복 서열 변형을 위한 프라임 편집 방법론
프라임 편집 (PE)을 사용한 반복 서열 변형을 위한 다수의 별개의 양식이 고려되었다: DNA 돌연변이유발; 서열 결실; 및 서열 삽입. 특히, 이들 적용은 기존 게놈 DNA 표적 또는 연구원들이 표적 세포 내로 통합시키는 미리 설계된 DNA 서열에 대해 사용될 수 있다. 이들 연속 서열 변형 기술은 정보를 기록하고 표적 유전자좌를 연속적인 방식으로 설계적 또는 확률적 변형시키는데 가치를 갖는다. 일련의 표적화된 유전자좌 변형은 다양한 숙주에서 변이체의 라이브러리를 생성하는데 특히 유용할 수 있다.
반복 서열 돌연변이를 사용하여 게놈 DNA 또는 미리 설계된 통합된 DNA 서열을 반복적인 방식으로 변경시켜 세포 신호전달 사건에 대해 보고할 수 있다. 이러한 패러다임에서, PE gRNA 활성에 의해 설치된 돌연변이는 세포 신호의 존재에 상응할 것이다. 이들 점 돌연변이는 연속 편집 사건에 필요한 PAM 모티프, 뿐만 아니라 특정 신호의 존재에 상응하는 점 돌연변이를 설치할 수 있다. 이러한 시스템은 각각의 연속 가이드 RNA가 신규 프로토스페이서를 사용할 것이기 때문에 사용 전 gRNA 설계를 필요로 할 것이지만; 이는 특정한 관심 개별 자극 또는 소수의 자극을 검사하는데 특히 강력할 수 있다. 이들 돌연변이의 설치는 개별 생물학적 자극에 의존할 수 있거나 또는 세포 시간을 표시하는 일관된 세포 과정과 연결될 수 있다. 하기 서열은 서열식별번호: 743, 744, 744, 및 745에 상응한다.
Figure pct00465
또 다른 유사한 PE 가이드 RNA-집약적 방법은 표적 서열의 반복 결실이다. 표적 유전자좌로부터의 개별 서열의 제거는 DNA 모티프의 상실을 통해 신호전달 사건을 재구축하는 능력을 허용할 것이다. 연속 서열을 결실시키는 PEgRNA의 설계는 연속 신호의 추적을 가능하게 할 것이다. 이는 연구원이 하나의 신호에 이어 또 다른 신호가 이어지는 경우를 확인하게 할 것이며, 연구원이 신호전달 사건이 어떠한 순서로 발생하는지 프로빙하게 할 것이다. 이러한 시스템은 카메라(CAMERA)를 사용하여 시험되었지만; 이는 고유한 서열 요건을 갖는 특정한 유전자좌의 사전-선택을 필요로 하였다. PE를 사용한 연속적인 서열 결실은 특정 서열 결정기를 필요로 하지 않기 때문에 개별 세포에서 쌍별 사건의 병행 기록을 허용할 것이다. 이는 연구원이 임의의 관심 표적 세포 내부에서 멀티플렉스화 방식으로 쌍별 신호전달 사건을 프로빙하는 능력을 허용할 것이다. 하기 서열은 서열식별번호: 746, 747, 및 748에 상응한다.
Figure pct00466
서열 삽입은 세포 신호전달 사건을 추적하기 위한 제3 접근법이다. 이러한 전략의 일부 변이체는 돌연변이유발 또는 결실보다 덜 PEgRNA-의존성이다. 다수의 상이한 삽입 전략이 존재한다 - 짧은 서열의 삽입, 프로토스페이서의 삽입, 프로토스페이서 및 바코드의 삽입, 신규 상동성 서열의 삽입, 및 바코드와 함께 상동성 서열의 삽입.
짧은 반복 서열의 삽입은 세포에서 시간의 경과를 측정하기 위해 표적 서열의 크기를 점증적으로 증가시키는 방법이다. 이러한 시스템에서, 5개 이상의 뉴클레오티드의 반복 서열의 삽입은 시간의 경과 또는 미리 결정된 자극의 계속된 존재와 관련하여 반복부 확장을 유발할 수 있다. 계통 PE의 유전자좌-불문 성질은 다시 별개의 생물학적 신호와 관련하여 다수의 고유한 서열 확장의 병행 추적을 가능하게 한다. 이는 개별 세포에서 세포 시간에 걸쳐 다중 생물학적 신호의 강도의 측정을 가능하게 할 것이다. 하기 서열은 서열식별번호: 749, 750, 및 751에 상응한다.
Figure pct00467
상이한 짧은 서열의 삽입은 결실 공간과 유사한 방식으로 소수의 PEgRNA를 필요로 할 것이다. 기록되는 신호의 수 및 삽입 서열의 크기는 필요한 PEgRNA의 조합의 수를 결정할 것이다. 이러한 시스템에서 다중 서열을 기록하는 것의 하나의 도전과제는 그의 화물 서열을 삽입하는데 있어서 각각의 PEgRNA의 상이한 효율일 것이다.
세포 신호의 지표로서의 프로토스페이서의 삽입이 매력적이지만, 기술적 도전과제가 이러한 접근법의 효율을 방해할 수 있다. 단일 PEgRNA 시스템은 PEgRNA 카세트가 그 자체에 대한 기질이어서, 연속 편집의 효율 및 충실도를 손상시키는 PEgRNA 내로의 삽입을 유발할 것이기 때문에 사용하는 것이 도전과제일 것이다. 이러한 동일한 문제는 2 또는 3개의 PEgRNA 시스템에 대해서도 지속되는데, 이는 각각의 가이드가 또 다른 가이드에 대한 기질이어서 다른 서열의 가이드 카세트 자체 내로의 삽입을 가능하게 하고, 이는 잘못된 신호와 관련하여 프로토스페이서 서열의 부적절한 삽입으로 이어질 수 있기 때문이다. 이들 프로토스페이서 삽입 시스템은 또한 바코드 서열이 포함되면 상상하기가 어렵다. 단일 PEgRNA 바코드 시스템은 단순히 사용된 바코드를 덮어써서, 제1 편집에 저장된 데이터를 제거할 것이다. 다중 가이드 시스템은 다시 다른 PEgRNA 발현 구축물 내로의 삽입을 겪어, 그의 유용성을 제한한다 (특히 생체내). 하기 서열은 서열식별번호: 752, 752, 753, 754, 754, 755, 및 756에 상응한다.
Figure pct00468
상동성 서열 (즉, Cas9 닉 위치의 3' 서열), 및 특히 연관된 바코드를 갖는 상동성 서열의 삽입은 특히 유용한 계통 PE 전략인 것으로 보인다. 이 시스템은 연속 라운드의 편집이 동일한 세포에서 다른 PEgRNA 편집 사건에 의해 변형될 수 없는 PEgRNA 카세트로부터의 바코드의 삽입을 발생시키는 것을 보장함으로써 프로토스페이서 삽입과 연관된 이슈를 회피한다. 바코딩 시스템은 다중 바코드가 주어진 자극과 연관될 수 있기 때문에 가치가 있다. 이 시스템은 표적 프로토스페이서의 대부분을 보존하지만, 시드 서열, PAM, 및 하류 인접 뉴클레오티드는 변경시킨다. 이는 사용될 PEgRNA의 유의한 재-설계 없이 다중 신호가 1개의 편집 유전자좌에 연결되는 것을 가능하게 한다. 이러한 전략은 단일 유전자좌에서 다수의 세포 자극 (내부 또는 외부)에 반응하여 멀티플렉스화 바코드 삽입을 가능하게 할 것이다. 이는 고유 바코드가 존재하는 만큼 많은 신호의 강도, 지속기간, 및 순서의 기록을 가능하게 할 수 있다 (4^N개의 가능한 바코드를 생성하기 위해 다중 N개의 뉴클레오티드로 설계될 수 있음; 즉 5-nt 바코드는 한 번에 4^5 또는 1024개의 고유 신호의 기록을 가능하게 할 것임). 이 시스템은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 사용될 수 있다.
실시예 13에 인용된 참고문헌
각각의 하기 참고문헌은 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00469
실시예 14 - PE에 의한 생체분자 활성 및/또는 국재화의 조정
생체분자의 세포하 국재화 및 변형 상태는 그의 활성을 조절한다. 특정 생물학적 기능, 예컨대 전사 제어, 세포 대사, 및 신호 전달 캐스케이드는 모두 세포 내의 특정한 위치에서 조심스럽게 조직된다. 따라서, 단백질의 세포 국재화 및 변형 상태를 조정하는 것은 질환의 치료를 위한 잠재적 치료 전략을 나타낸다. 일부 기존 치료는 표적 단백질의 국재화를 변경시키기 위해 개발되었다. 예를 들어, 파르네실화 억제제는 KRAS와 같은 중요한 종양원성 단백질의 지질화 및 막 표적화를 방지하기 위해 설계된다. 유사하게, 표적 단백질의 소분자-유도된 유비퀴틴화는 이를 분해를 위해 프로테아솜으로 지시한다. 단백질을 이들 및 다른 고유한 세포 구획으로 수송하는 능력은 다수의 생물학적 과정을 변경할 기회를 제공한다. 치료 목적으로 유전자 코딩된 신호를 갖는 생체분자 (예를 들어, 단백질, 지질, 당, 및 핵산)의 변형 상태 및 세포하 트래픽킹을 변경하기 위한 유전자 코딩된 핸들을 설치하기 위해 프라임 편집 (PE)을 사용하는 것이 본원에 제안된다.
PE는 Cas9 효소로 표적화가능한 임의의 게놈 유전자좌 내로의 짧은 DNA 서열의 설치, 결실, 또는 대체를 가능하게 하는 게놈 편집 기술이다. 이 기술을 사용하여, 원칙적으로 이들 중요한 생체분자의 활성을 변화시키는 중요한 DNA, RNA, 또는 단백질 코딩 서열을 설치 또는 제거할 수 있다. 보다 구체적으로, 프라임 편집은 생체분자의 국재화 또는 변형 특성을 변화시키는 모티프 또는 신호를 설치하는데 사용될 수 있다. 일부 예는 단백질 아미노산 서열; 번역후 변형을 위한 모티프; 폴딩 또는 국재화를 변화시키는 RNA 모티프에 대한 변형; 및 주위 DNA의 국부 염색질 상태 또는 아키텍처를 변화시키는 DNA 서열의 설치를 포함한다.
PE-매개된 변형을 위한 하나의 표적 생체분자는 DNA이다. DNA에 대한 변형은 표적 유전자좌의 접근성을 변화시키는 다수의 DNA 서열을 설치하기 위해 이루어질 수 있다. 염색질 접근성은 유전자 전사 산출을 제어한다. 염색질 압축 효소를 동원하기 위한 마크의 설치는 이웃 유전자의 전사 산출을 감소시킬 것인 반면, 염색질 개방과 연관된 서열의 설치는 영역을 보다 접근가능하게 하여 이어서 전사를 증가시킬 것이다. 천연 조절 서열을 반영한 보다 복잡한 서열 모티프의 설치는 전형적으로 특정한 생물학적 전례를 갖지 않을 수 있는 많은 수의 단일 유형의 마크를 설치하는 상이한 후성 판독기, 기록기, 또는 지우기 효소-도구에 대한 현재 이용가능한 dCas9 융합체보다 더 미묘하고 생물학적으로 민감한 조절을 제공할 것이다. 2개의 유전자좌를 근접하게 만들거나 또는 유전자좌를 핵막과 접촉시킬 서열의 설치는 또한 급성장중인 3-D 게놈 아키텍처 분야에서 입증된 바와 같이 그러한 유전자좌의 전사 산출을 변경시킬 것이다.
RNA에 대한 변형은 또한 그의 세포 국재화, 상호작용 파트너, 구조적 역학, 또는 폴딩 열역학을 변화시킴으로써 그의 활성을 변경시키기 위해 이루어질 수 있다. 번역 중지 또는 프레임시프팅을 유발할 모티프의 설치는 다양한 mRNA 프로세싱 메카니즘을 통해 mRNA 종의 존재비를 변화시킬 수 있다. 컨센서스 스플라이스 서열을 변형시키는 것은 또한 상이한 RNA 종의 존재비 및 우세도를 변경시킬 것이다. 상이한 스플라이스 이소형의 상대비를 변화시키는 것은 예측가능하게 단백질 번역 생성물의 비에서의 변화로 이어질 것이며, 이는 많은 생물학적 경로를 변경시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 대 핵 DNA 복구 단백질의 균형을 이동시키는 것은 화학요법 시약에 대한 상이한 암의 복원력을 변경시킬 것이다. 또한, RNA는 신규 단백질 표적에 대한 결합을 가능하게 하는 서열로 변형될 수 있다. 세포 단백질에 고친화도로 결합하는 다수의 RNA 압타머가 개발되었다. 이들 압타머 중 하나의 설치는 그의 번역, 생물학적 활성을 막을 단백질 표적에 대한 결합을 통해 상이한 RNA 종을 격리시키거나, 또는 RNA 종을 특정 세포하 구획으로 가져오는데 사용될 수 있다. 생체분자 분해는 또 다른 부류의 국재화 변형이다. 예를 들어, RNA 메틸화는 세포 내에서 RNA를 조절하는데 사용된다. 메틸화를 위한 컨센서스 모티프는 PE에 의해 표적 RNA 코딩 서열 내로 도입될 수 있다. RNA는 또한 넌센스 매개된 붕괴 기구 또는 다른 핵산 대사 경로를 지시하여 표적 RNA 종을 분해하는 서열을 포함하도록 변형될 수 있으며, 이는 세포에서 RNA의 풀을 변화시킬 것이다. 추가적으로, RNA 종은 그의 응집 상태를 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 서열은 관심 단일 RNA 또는 다중 RNA 상에 설치되어, 번역 또는 신호전달에 비효과적인 기질이 되게 할 RNA 엉킴을 생성할 수 있다.
번역후 변형 (PTM)을 통한 단백질에 대한 변형은 또한 PE에 의해 수행될 수 있는 생체분자 조작의 중요한 부류를 나타낸다. RNA 종과 같이, 세포 내의 단백질의 존재비를 변화시키는 것은 PE의 중요한 능력이다. 편집은 오픈 리딩 프레임 내에 정지 코돈을 설치하기 위해 수행될 수 있고-이는 편집된 DNA 서열에 의해 전장 생성물이 생산되는 것을 제거할 것이다. 대안적으로, 표적 단백질에 대해 단백질 분해 속도가 변경되도록 하는 펩티드 모티프가 설치될 수 있다. 유전자 본체 내로의 분해 태그의 설치는 세포 내의 단백질의 존재비를 변경시키는데 사용될 수 있다. 또한, 소분자에 의해 유도되는 데그론의 도입은 단백질 분해에 대한 시간적 제어를 가능하게 할 수 있다. 이는 연구원이 주어진 표적의 소분자-매개된 치료 단백질 분해가 실행가능한 치료 전략이었는지 여부를 용이하게 평가할 수 있기 때문에 연구 및 치료 둘 다에 중요한 영향을 미칠 수 있다. 단백질 모티프는 또한 단백질의 세포하 국재화를 변화시키기 위해 설치될 수 있다. 아미노산 모티프는 핵, 미토콘드리아, 세포막, 퍼옥시솜, 리소솜, 프로테아솜, 엑소솜 등을 포함한 다수의 세포하 구획으로 단백질을 우선적으로 트래픽킹하도록 설치될 수 있다.
PTM 기구에 의해 변형된 모티프를 설치하거나 파괴하는 것은 단백질 번역후 변형을 변경시킬 수 있다. 인산화, 유비퀴틸화, 글리코실화, 지질화 (예를 들어 파르네실화, 미리스토일화, 팔미토일화, 프레닐화, GPI 앵커), 히드록실화, 메틸화, 아세틸화, 크로토닐화, SUMO화, 디술피드 결합 형성, 측쇄 결합 절단 사건, 폴리펩티드 백본 절단 사건 (단백질분해), 및 다수의 다른 단백질 PTM이 확인되었다. 이들 PTM은 종종 세포하 국재화를 변화시킴으로써 단백질 기능을 변화시킨다. 실제로, 키나제는 종종 인산화 사건을 통해 하류 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. 표적 포스포사이트의 제거는 신호 전달을 방지할 것이다. 전장 단백질 발현을 유지하면서 임의의 PTM 모티프를 부위-특이적으로 제거하거나 설치하는 능력은 기본 연구 및 치료 둘 다에 대한 중요한 진보일 것이다. PE의 서열 설치 범주 및 표적 윈도우는 이를 넓은 PTM 변형 공간에 매우 적합하게 만든다.
지질화 부위의 제거는 세포 막으로의 단백질의 트래픽킹을 방지할 것이다. 번역후 변형 과정을 표적화하는 현행 치료에 대한 주요 한계는 그의 특이성이다. 파르네실 트랜스퍼라제 억제제는 세포 막에서 KRAS 국재화를 제거하는 그의 능력에 대해 광범위하게 시험되었다. 불행하게도, 파르네실화의 전반적인 억제는 이들 소분자의 광범위한 사용을 막는 수많은 오프 타겟 효과를 가져온다. 유사하게, 소분자를 사용한 단백질 키나제의 특이적 억제는 인간 게놈의 큰 크기 및 다양한 키나제 사이의 유사성으로 인해 매우 도전과제일 수 있다. PE는 전반적인 효소 억제 대신 변형 부위의 제거에 의해 표적 단백질의 변형의 억제를 가능하게 하기 때문에, 이러한 특이성 문제에 대한 잠재적 해결책을 제공한다. 예를 들어, KRAS에서의 지질화된 펩티드 모티프의 제거는 파르네실 트랜스퍼라제 억제 대신에 사용될 수 있는 표적화된 접근법일 것이다. 이러한 접근법은 막 결합되도록 설계되지 않은 단백질 상에 지질-표적화 모티프를 설치함으로써 표적 단백질 활성을 억제하는 것의 기능적 반전이다.
PE는 또한 단백질-단백질 복합체화 사건을 촉발하는데 사용될 수 있다. 단백질은 종종 그의 생물학적 활성을 실행하기 위해 복합체 내에서 기능한다. PE는 이들 복합체 내에 존재하는 단백질의 능력을 생성하거나 파괴하는데 사용될 수 있다. 복합체 형성 사건을 제거하기 위해, 복합체화를 불리하게 하도록 단백질:단백질 계면을 따른 아미노산 치환 또는 삽입이 설치될 수 있다. SSX18은 중요한 히스톤-재형성 복합체인 BAF 복합체의 단백질 성분이다. SSX18에서의 돌연변이는 활막 육종을 구동한다. PE는 SSX18이 복합체에서 그의 단백질 파트너에 결합하는 것을 방지하는 측쇄를 설치하여 그의 종양원성 활성을 방지하는데 사용될 수 있다. PE는 또한 병원성 돌연변이를 제거하여 이 단백질의 WT 활성을 회복시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, PE는 단백질을 그의 천연 복합체 내에 유지시키거나, 또는 그의 활성을 억제하기 위해 그의 천연 활성과 비관련된 상호작용에 참여하도록 유도하는데 사용될 수 있다. 하나의 상호작용 상태를 또 다른 것에 비해 유지시키는 복합체를 형성하는 것은 중요한 치료 양식을 나타낼 수 있다. 단백질: 단백질 계면을 변경시켜 상호작용 Kd를 감소시키는 것은 이들 단백질을 서로 더 오래 점착 상태로 유지시킬 것이다. 단백질 복합체는 질환에서 신경모세포종 신호전달 캐스케이드를 구동하지만 달리 다른 세포에서는 건강한 전사 제어에 참여하는 n-myc와 같은 다중 신호전달 복합체를 가질 수 있다. PE는 건강한 상호작용 파트너와의 n-myc 회합을 구동하고 종양원성 상호작용 파트너에 대한 그의 친화도는 감소시키는 돌연변이를 설치하는데 사용될 수 있다.
실시예 14에 인용된 참고문헌
각각의 하기 참고문헌은 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00470
실시예 15 - PEgRNA의 설계 및 조작
프라임 편집 (PE) 효율을 개선시킬 수 있는 일련의 PEgRNA 설계 및 전략이 본원에 기재된다.
프라임 편집 (PE)은 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA) 내에 코딩된 정보를 사용하여 표적화된 유전자좌 내의 규정된 DNA 서열을 대체, 삽입, 또는 제거할 수 있는 게놈 편집 기술이다. 프라임 편집제 (PE)는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 효소에 융합된 뉴클레아제 활성을 갖는 서열-프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (Cas9)로 이루어진다. PE는, 그의 스페이서 서열 내에 특정 DNA 유전자좌를 표적화하기 위한 정보, 뿐만 아니라 표준 sgRNA 스캐폴드 내로 구축된 조작된 연장부 내에 목적하는 편집을 명시한 정보를 함유하는 PEgRNA와 복합체를 형성한다. PE:PEgRNA 복합체는 프로그램화된 표적 DNA 유전자좌에 결합하고 닉킹하여, 닉킹된 DNA 가닥이 PEgRNA의 조작된 프라이머 결합 서열 (PBS)에 혼성화하도록 한다. 이어서, 리버스 트랜스크립타제 도메인은 DNA 중합을 위한 프라이머로서 닉킹된 게놈 DNA를 사용하여 PEgRNA의 RT 주형 부분 내의 편집-코딩 정보를 카피한다. 후속 DNA 복구 과정은 새롭게 합성된 편집된 DNA 가닥을 게놈 유전자좌 내로 혼입시킨다. 프라임 편집의 다재다능성은 연구 도구 및 잠재적 치료제로서 큰 유망성을 보유하지만, 편집에 요구되는 다단계 과정으로 인해 효율 및 범주에서 여러 제한이 존재한다. 예를 들어, PEgRNA 내에서 형성되는 불리한 RNA 구조는 PEgRNA로부터 게놈 유전자좌로의 DNA 편집의 카피를 억제할 수 있다. PE 기술을 개선시키기 위한 하나의 잠재적인 방법은 중요한 PEgRNA 성분의 재설계 및 조작을 통한 것이다. 이들 PEgRNA의 설계에 대한 개선은 개선된 PE 효율을 위해 필요할 뿐만 아니라, 게놈 내로 보다 긴 삽입된 서열의 설치를 가능하게 할 가능성이 있다.
PE의 효능을 개선시키기 위해 고려되는 일련의 PEgRNA 설계를 본원에 기재한다. 이들 설계는 sgRNA 효능 및/또는 안정성을 개선시키기 위한 다수의 이전에 공개된 접근법을 이용할 뿐만 아니라 다수의 신규한 전략을 활용한다. 이들 개선은 다수의 상이한 카테고리 중 1가지 이상에 속할 수 있다:
(1) 보다 긴 PEgRNA. 이 카테고리는 부담스러운 서열 요건 없이 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할, 비-폴리머라제 III (pol III) 프로모터로부터 기능적 PEgRNA의 효율적인 발현을 가능하게 하는 개선된 설계에 관한 것이다;
(2) 코어 개선. 이 카테고리는 효능을 개선시킬 수 있는, 코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드에 대한 개선에 관한 것이다;
(3) RT 프로세싱성. 이 카테고리는 RT 프로세싱성을 개선시켜, 표적화된 게놈 유전자좌에서 보다 긴 서열의 삽입을 가능하게 하는 PEgRNA에 대한 변형에 관한 것이다;
(4) 말단 모티프. 이 카테고리는 PEgRNA 안정성을 개선시키거나, RT 프로세싱성을 증진시키거나, PEgRNA의 미스-폴딩을 방지하거나, 또는 게놈 편집에 중요한 추가의 인자를 동원하는 RNA 모티프를 PEgRNA의 5' 및/또는 3' 말단에 부가하는 것에 관한 것이다.
각각의 카테고리 내의 다수의 잠재적인 이러한 PEgRNA 설계가 본원에 기재된다. 이들 설계 중 몇몇은 Cas9에 의한 sgRNA 활성을 개선시키는 것에 관하여 이전에 기재되었고, 이는 그대로 표시된다. 또한, PEgRNA 스캐폴드의 폴리싱을 가능하게 하고 PE 활성을 증진시킬, 주어진 서열 표적에 대한 PEgRNA의 진화를 위한 플랫폼이 본원에 기재된다 (5). 특히, 이들 설계는 또한 임의의 Cas9 또는 그의 진화된 변이체에 의해 인식되는 PEgRNA를 개선시키기 위해 쉽게 적용될 수 있다.
(1) 보다 긴 PEgRNA.
sgRNA는 전형적으로 U6 snRNA 프로모터로부터 발현된다. 이러한 프로모터는 pol III을 동원하여 회합된 RNA를 발현시키고, 이는 핵 내에 보유된 짧은 RNA의 발현에 유용하다. 그러나, pol III은 고도로 프로세싱성이 아니고, 수백개의 뉴클레오티드 길이보다 더 긴 RNA를 효율적인 게놈 편집에 요구되는 수준으로 발현할 수 없다183. 추가적으로, pol III은 U 스트레치에서 멈추거나 종결될 수 있으며, 이는 잠재적으로 PEgRNA를 사용하여 삽입될 수 있는 서열 다양성을 제한한다. 여분의 서열폴리머라제 II (예컨대 pCMV) 또는 폴리머라제 I (예컨대 U1 snRNA 프로모터)을 동원하는 다른 프로모터를 보다 긴 sgRNA를 발현하는 그의 능력에 대해 검사하였다183. 그러나, 이들 프로모터는 전형적으로 부분적으로 전사되고, 이는 발현된 PEgRNA에서 스페이서의 5'의 여분의 서열을 생성할 것이며, 이는 부위-의존성 방식으로 현저하게 감소된 Cas9:sgRNA 활성을 생성하는 것으로 제시되었다. 추가적으로, pol III-전사된 PEgRNA는 단순히 연속 6-7개 U에서 종결될 수 있지만, pol II 또는 pol I로부터 전사된 PEgRNA는 상이한 종결 신호를 필요로 할 것이다. 종종 이러한 신호는 또한 폴리아데닐화를 발생시키며, 이는 핵으로부터 PEgRNA의 바람직하지 않은 수송을 발생시킬 것이다. 유사하게, pol II 프로모터, 예컨대 pCMV로부터 발현된 RNA는 전형적으로 5'-캡핑되며, 이는 또한 그의 핵 유출을 발생시킨다.
이전에, 린 및 동료들은 긴-비코딩 RNA- (lncRNA) 태그부착된 sgRNA의 생산을 위해 다양한 발현 플랫폼을 스크리닝하였다183. 이들 플랫폼은 pCMV로부터 발현되고 인간으로부터의 MALAT1 ncRNA로부터의 ENE 요소184, KSHV로부터의 PAN ENE 요소185, 또는 U1 snRNA로부터의 3' 박스186에서 종결하는 RNA를 포함한다. 특히, MALAT1 ncRNA 및 PAN ENE는 폴리A-테일을 보호하는 삼중 나선을 형성한다184, 187. RNA의 발현을 가능하게 하는 것에 더하여, 이들 구축물은 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있을 것으로 예상된다 (섹션 iv 참조). U1 snRNA로부터의 프로모터를 사용하여 이들 보다 긴 sgRNA의 발현을 가능하게 하는 것183을 또한 연구하였다. 이들 발현 시스템은 또한 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할 것으로 예상된다. 또한, 자기-절단 리보자임, 예컨대 해머헤드188, 피스톨189, 해체트189, 헤어핀190, VS191, 트위스터192, 또는 트위스터 시스터192 리보자임, 또는 전사된 가이드를 프로세싱하기 위한 다른 자기-절단 요소, 또는 Csy4193에 의해 인식되고 또한 가이드의 프로세싱으로 이어지는 헤어핀을 부가하는, PEgRNA의 일부로서 전사될 pol II 프로모터의 부분의 절단을 위한 일련의 방법이 설계되었다. 또한, 다중 ENE 모티프의 혼입은 KSHV PAN RNA 및 요소에 대해 이전에 입증된 바와 같이 개선된 PEgRNA 발현 및 안정성으로 이어질 수 있는 것으로 가설화된다185. 또한, PEgRNA를 원형 인트론 RNA (ciRNA)의 형태로 원형화하는 것은 또한 증진된 RNA 발현 및 안정성, 뿐만 아니라 핵 국재화로 이어질 수 있는 것으로 예상된다194.
pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 MALAT1 ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00471
pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 PAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00472
pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3xPAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00473
pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00474
pU1, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00475
(2) 코어 개선.
코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드는 PE 활성을 증진시키기 위해 개선될 가능성이 있다. 여러 이러한 접근법은 이미 입증되었다. 예를 들어, 스캐폴드의 제1 쌍형성 요소 (P1)는 GTTTT-AAAAC 쌍형성 요소를 함유한다. 이러한 연속 T는 pol III 일시정지 및 RNA 전사체의 조기 종결을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. P1의 이러한 부분에서 T-A 쌍 중 1개의 G-C 쌍으로의 합리적 돌연변이는 sgRNA 활성을 증진시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 이러한 접근법이 또한 PEgRNA에 대해 실행가능할 것임을 시사한다195. 추가적으로, P1의 길이를 증가시키는 것은 또한 sgRNA 폴딩을 증진시키고 개선된 활성으로 이어지는 것으로 밝혀졌고195, 이는 이것이 PEgRNA 활성의 개선을 위한 또 다른 방안임을 시사한다. 마지막으로, 주어진 DNA 표적 상에서의 PEgRNA의 방향적 진화를 통한 PEgRNA 스캐폴드의 폴리싱이 또한 개선된 활성을 발생시킬 가능성이 있다. 이는 섹션 (v)에 기재되어 있다.
P1에 대해 6 nt 연장부를 함유하는 PEgRNA
Figure pct00476
P1 내에 T-A에서 G-C로의 돌연변이를 함유하는 PEgRNA
Figure pct00477
(iii) PEgRNA의 주형 영역에 대한 변형을 통한 RT 프로세싱성의 개선
PEgRNA에 의해 주형화되는 삽입의 크기가 증가함에 따라, 엔도뉴클레아제에 의해 분해되거나, 자발적 가수분해를 겪거나, 또는 RT에 의해 역전사될 수 없거나 또는 PEgRNA 스캐폴드의 폴딩 및 후속 Cas9-RT 결합을 파괴하는 2차 구조로 폴딩될 가능성이 더 크다. 따라서, 전체 유전자의 삽입과 같은 대규모 삽입에 영향을 미치기 위해서는 PEgRNA의 주형에 대한 변형이 필요할 가능성이 있다. 이를 위한 일부 전략은 RNA를 분해 또는 가수분해에 대해 보다 저항성이게 하거나 또는 억제성 2차 구조를 채택할 가능성을 낮추는, 합성 또는 반합성 PEgRNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 혼입을 포함한다196. 이러한 변형은 G-풍부 서열에서 RNA 2차 구조를 감소시킬 8-아자-7-데아자구아노신; 분해를 감소시키고 특정 종류의 RNA 2차 구조를 증진시키는 잠금 핵산 (LNA); RNA 안정성을 증진시키는 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 또는 2'-O-메톡시에톡시 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 또한 안정성 및 활성을 증진시키기 위해 PEgRNA의 다른 곳에 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, PEgRNA의 주형은 목적하는 단백질 생성물을 코딩하고 또한 RT에 의해 언폴딩될 수 있는 간단한 2차 구조를 채택할 가능성이 더 크도록 설계될 수 있다. 이러한 단순한 구조는 열역학적 싱크로서 작용할 것이며, 이는 역전사를 막을 보다 복잡한 구조가 발생할 가능성을 줄인다. 마지막으로, 또한 주형을 2개의 별개의 PEgRNA로 분할하는 것을 상상할 수 있다. 이러한 설계에서, PE는 전사를 개시하고 또한 Cas9에 융합된 RNA-결합 단백질 또는 PEgRNA 자체 상의 RNA 인식 요소, 예컨대 MS2 압타머를 통해 표적화된 부위에 별개의 주형 RNA를 동원하는데 사용될 것이다. RT는 이러한 별개의 주형 RNA에 직접 결합할 수 있거나, 또는 제2 주형으로 스와핑하기 전에 원래의 PEgRNA 상에서 역전사를 개시할 수 있다. 이러한 접근법은 긴 주형의 부가 시 PEgRNA의 미스폴딩을 방지함으로써, 또한 아마도 PE-기반 긴 삽입을 억제할 수 있는, 긴 삽입이 이루어지는 게놈으로부터 Cas9의 해리를 필요로 하지 않음으로써 긴 삽입을 가능하게 할 수 있다.
(iv) 5' 또는 3' 말단에의 추가의 RNA 모티프의 설치
PEgRNA 설계는 또한 RNA의 말단의 어느 하나의 단부에 추가의 모티프를 설치하는 것을 통해 개선될 수 있다. 여러 이러한 모티프 - 예컨대 KSHV로부터의 PAN ENE 및 MALAT1로부터의 ENE는 비-pol III 프로모터로부터의 보다 긴 PEgRNA의 발현을 종결시키기 위한 가능한 수단으로서 앞서 파트 (i)184,185에서 논의되었다. 이들 요소는 폴리A 테일을 에워싸는 RNA 삼중 나선을 형성하여, 이들이 핵 내에 보유되게 한다184,187. 그러나, 말단 뉴클레오티드를 폐쇄하는 PEgRNA의 3' 말단에 복합체 구조를 형성함으로써, 이들 구조는 또한 아마도 PEgRNA의 엑소뉴클레아제-매개된 분해를 방지하는 것을 도울 것이다. 3' 말단에 삽입된 다른 구조적 요소도 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있지만, 비-pol III 프로모터로부터의 종결은 가능하게 하지 않는다. 이러한 모티프는 3' 말단을 폐쇄할 헤어핀 또는 RNA 쿼드로플렉스197, 또는 3' 말단에서 2'-3'-시클릭 포스페이트의 형성을 발생시키고 또한 잠재적으로 PEgRNA가 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 가능성을 낮출 자기-절단 리보자임, 예컨대 HDV198를 포함할 수 있다. PEgRNA를 불완전한 스플라이싱을 통해 고리화하도록 유도하여 - ciRNA를 형성하는 것은 - 또한 PEgRNA 안정성을 증가시키고 PEgRNA가 핵 내에 보유되도록 할 수 있다194.
추가의 RNA 모티프는 또한 RT 프로세싱성을 개선시키거나 또는 DNA-RNA 듀플렉스에 대한 RT 결합을 증진시킴으로써 PEgRNA 활성을 증진시킬 수 있다. 그의 동족 레트로바이러스 게놈에서 RT에 의해 결합된 천연 서열의 부가는 RT 활성을 증진시킬 수 있다199. 이는 레트로바이러스 게놈 이량체화 및 전사의 개시에 수반되는 천연 프라이머 결합 부위 (PBS), 폴리퓨린 트랙 (PPT), 또는 키싱 루프를 포함할 수 있다199. PEgRNA의 5' 및 3' 말단에서의 이량체화 모티프 - 예컨대 키싱 루프 또는 GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체 쌍200 - 의 부가는 또한 PEgRNA의 효과적인 원형화를 발생시켜 안정성을 개선시킬 수 있다. 추가적으로, 이들 모티프의 부가가 PEgRNA 스페이서 및 프라이머의 물리적 분리를 가능하게 하여, PE 활성을 방해할 스페이서의 폐쇄를 방지할 수 있는 것으로 고려된다. 스페이서 영역에서 작은 토홀드 헤어핀을 형성하는 PEgRNA에 대한 짧은 5' 연장부는 또한 스페이서에 결합하는 PEgRNA의 어닐링 영역과 유리하게 경쟁할 수 있다. 마지막으로, 키싱 루프는 또한 다른 주형 RNA를 게놈 부위로 동원하고 RT 활성을 하나의 RNA로부터 다른 것으로 스와핑하는 것을 가능하게 하는데 사용될 수 있다 (섹션 iii).
PEgRNA-HDV 융합체
Figure pct00478
PEgRNA-MMLV 키싱 루프
Figure pct00479
PEgRNA-VS 리보자임 키싱 루프
Figure pct00480
PEgRNA-GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체
Figure pct00481
PEgRNA 주형 스위칭 2차 RNA-HDV 융합체
Figure pct00482
(v) PEgRNA의 진화
PEgRNA 스캐폴드는 SpCas9 및 염기 편집제가 개선되는 방법201과 유사한 방식으로 방향적 진화를 통해 추가로 개선될 수 있을 가능성이 있다. 방향적 진화는 Cas9 또는 진화된 Cas9 변이체에 의한 PEgRNA 인식을 증진시킬 수 있다. 추가적으로, 상이한 PEgRNA 스캐폴드 서열은 상이한 게놈 유전자좌에서 최적이어서, 해당 부위에서 PE 활성을 증진시키거나, 오프-타겟 활성을 감소시키거나, 또는 둘 다일 가능성이 있다. 마지막으로, 다른 RNA 모티프가 부가된 PEgRNA 스캐폴드의 진화는 비진화된 융합 RNA에 비해 융합된 PEgRNA의 활성을 거의 확실히 개선시킬 것이다. 예를 들어, c-디-GMP-I 압타머 및 해머헤드 리보자임으로 구성된 알로스테릭 리보자임의 진화는 현저하게 개선된 활성으로 이어졌고202, 이는 진화가 해머헤드-PEgRNA 융합체의 활성을 또한 개선시킬 것임을 시사한다. 또한, Cas9는 현재 일반적으로 sgRNA의 5' 연장을 용인하지 않지만, 방향적 진화는 아마도 이러한 불용인을 완화시켜 추가의 RNA 모티프가 이용되도록 하는 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, Cas9:sgRNA 복합체와 함께 사용하기 위한 다수의 이들 접근법이 이미 기재되었지만, PEgRNA 활성을 개선시키기 위한 어떠한 설계도 보고되지 않았다. 게놈 내로의 프로그램가능한 돌연변이의 설치를 위한 다른 전략은 염기-편집, 상동성-지정 재조합 (HDR), 정확한 미세상동성-매개된 단부-연결 (MMEJ), 또는 트랜스포사제-매개된 편집을 포함한다. 그러나, 이들 접근법은 모두 PE와 비교 시 유의한 결점을 갖는다. 현행 염기 편집제는 기존 PE보다 더 효율적이지만, 단지 특정 부류의 게놈 돌연변이만을 설치할 수 있고, 관심 부위에서 추가의 바람직하지 않은 뉴클레오티드 전환을 발생시킬 수 있다. HDR은 단지 매우 소수의 세포 유형에서만 실현가능하며, 비교적 높은 비율의 무작위 삽입 및 결실 돌연변이 (indel)를 발생시킨다. 정확한 MMEJ는 이중 가닥 파괴의 예측가능한 복구로 이어질 수 있지만, 주로 결실의 설치로 제한되고, 매우 부위-의존성이고, 또한 비교적 높은 비율의 바람직하지 않은 indel을 가질 수 있다. 트랜스포사제-매개된 편집은 지금까지 박테리아에서만 기능하는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, PE에 대한 개선은 아마도 광범위한 게놈 돌연변이의 치료적 교정을 위한 최선의 경로를 나타낸다.
실시예 15에 인용된 참고문헌
각각의 하기 참고문헌이 실시예 15에 인용되며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00483
실시예 16 - SPCAS9 이외의 DNA 결합 단백질을 사용한 PE의 표적화 범주 확장
스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9)를 사용한 프라임 편집 (PE)은 SpCas9가 효율적으로 결합할 수 있는 적합하게-배치된 NGG 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)가 존재하는 게놈 유전자좌에서 모든 단일 염기 치환, 삽입, 결실, 및 그의 조합을 효율적으로 설치할 수 있다. 본원에 기재된 방법은 접근가능한 PAM을 확장시킴으로써 PE의 표적화 능력을 넓히고, 따라서 효율적인 PE에 접근가능한 표적화가능한 게놈 유전자좌를 넓힌다. SpCas9 이외의 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질을 사용하는 프라임 편집제는 상이한 PAM에 대한 접근을 허용함으로써 게놈 유전자좌의 확장된 표적화가능한 범주를 가능하게 한다. 또한, SpCas9보다 작은 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질의 사용은 또한 보다 효율적인 바이러스 전달을 가능하게 한다. SpCas9 이외의 Cas 단백질 또는 다른 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질을 갖는 PE는 SpCas9-기반 PE를 사용해서는 접근불가능하거나 비효율적인 고효율 치료 편집을 가능하게 할 것이다.
이는 SpCas9-기반 PE가 NGG PAM에 비해 편집의 비-이상적 간격으로 인해 비효율적이거나 또는 SpCas9-기반 구축물의 전체 크기가 세포 발현 및/또는 전달에 금지되는 상황에서 사용될 것으로 예상된다. 특정 질환-관련 유전자좌, 예컨대 표적 영역 근처의 SpCas9에 대한 NGG PAM이 거의 없고 불량하게 위치하는 헌팅틴 유전자는 PE 시스템 내의 상이한 Cas 단백질, 예컨대 NGA PAM을 인식하는 SpCas9-VRQR을 사용하여 용이하게 표적화될 수 있다. 보다 작은 Cas 단백질은 AAV 벡터 내로 보다 효율적으로 패키징될 수 있는 보다 작은 PE 구축물을 생성하는데 사용되어, 표적 조직으로의 보다 우수한 전달을 가능하게 할 것이다. 도 61은 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질로서 스타필로코쿠스 아우레우스 CRISPR-Cas를 사용하는 프라임 편집의 실시에 대한 감소를 보여준다. NT는 비처리 대조군이다.
도 62a-62b는 프라임 편집에 의한 정확한 위치에서의 목적하는 편집의 효율적인 설치를 위한 프로토스페이서의 입증된 중요성을 제공한다. 이는 이러한 기술의 신규 특색으로서의 대안적 PAM 및 프로토스페이서의 중요성을 강조한다. 도 62a에서의 "n.d."는 "검출되지 않음"이다.
도 63은 프라임 편집제 시스템에서 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질로서 SpCas9(H840A)-VRQR 및 SpCas9(H840A)-VRER을 사용하는 PE의 실시에 대한 감소를 보여준다. SpCas9(H840A)-VRQR napDNAbp는 본원에서 서열식별번호: 87로 개시된다. SpCas9(H840A)-VRER napDNAbp는 본원에서 서열식별번호: 88로 개시된다. SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RT 융합 단백질은 본원에서 서열식별번호: 516으로 개시되며, 여기서 MMLV RT는 야생형 MMLV RT 대비 D200N, L603W, T330P, T306K, 및 W313F 치환을 포함한다. SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT 융합 단백질은 본원에서 서열식별번호: 515로 개시되며, 여기서 MMLV RT는 야생형 MMLV RT 대비 D200N, L603W, T330P, T306K, 및 W313F 치환을 포함한다. 인간 게놈 내의 7개의 상이한 유전자좌가: 4개는 SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT 프라임 편집제 시스템에 의해, 3개는 SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RT 시스템에 의해 표적화된다. 시험된 구축물의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00484
Figure pct00485
Figure pct00486
도 63에 제시된 바와 같이, SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT는 "AGAG" 및 "GGAG"를 포함하는 PAM 부위에서 작동하였고, "GGAT" 및 "AGAT" PAM 서열에서 일부 편집 활성을 가졌다. SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RT는 "AGCG" 및 "GGCG"를 포함하는 PAM 부위에서 작동하였고, "TGCG"에서 일부 편집 활성을 가졌다.
데이터는 프라임 편집이 상이한 PAM 특이성을 보유하는 napDNAbp, 예컨대 본원에 기재된 Cas9 변이체를 사용하여 수행될 수 있음을 입증한다.
실시예 17 - PE에 의한 레콤비나제 표적 부위의 도입
본 실시예는 프라임 편집 (PE)을 사용하여 포유동물 및 다른 게놈에 높은 특이성 및 효율로 레콤비나제 표적 부위 (SSR 표적 부위)를 도입함으로써 유전 질환을 다루거나 맞춤형 동물 또는 식물 모델을 생성하는 방법을 기재한다.
본 실시예는 부위-특이적 레콤비나제(들)에 대한 노출 후에 정확하고 효율적인 게놈 변형을 지시할, 인간 또는 다른 게놈 내의 고가치 유전자좌에 레콤비나제 인식 서열을 도입하기 위한 PE의 사용을 기재한다 (도 64). 도 64에 제시된 다양한 실시양태에서, PE는 (b) DNA 공여자 주형의 게놈 통합을 위한 부위로서 사용하기 위한 단일 SSR 표적을 삽입하는데 사용될 수 있다. (c)는 게놈의 일부를 결실시키기 위해 SSR 표적 부위의 탠덤 삽입이 어떻게 사용될 수 있는지 보여준다. (d)는 게놈의 일부를 역전시키기 위해 SSR 표적 부위의 탠덤 삽입이 어떻게 사용될 수 있는지 보여준다. (e)는 2개의 원위 염색체 영역에서의 2개의 SSR 표적 부위의 삽입이 염색체 전위를 어떻게 발생시킬 수 있는지 보여준다. (f)는 게놈 내의 2개의 상이한 SSR 표적 부위의 삽입이 DNA 공여자 주형으로부터 카세트를 교환하는데 어떻게 사용될 수 있는지 보여준다. SSR 표적을 삽입하기 위해 PE를 사용하는 것에 의한 각각의 유형의 게놈 변형이 고려되지만, 이 목록은 또한 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
많은 대규모 게놈 변화, 예컨대 유전자 삽입, 결실, 역위, 또는 염색체 전위는 유전 질환에 연루된다1-7. 또한, 진핵 게놈의 맞춤형 및 표적화된 조작은 인간 질환에 대한 연구, 뿐만 아니라 트랜스제닉 식물8,9 또는 다른 생명공학적 생성물의 생성에 중요하다. 예를 들어, 염색체의 미세결실은 질환으로 이어질 수 있고, 중요한 DNA 요소의 삽입에 의한 이들 결실의 대체는 질환의 영구적 개선으로 이어질 수 있다. 또한, 역위, 유전자 카피수 변화, 또는 염색체 전위로 인해 발생한 질환은 이환 세포에서 이전 유전자 구조를 회복시킴으로써 다루어질 수 있다. 대안적으로, 산업상 사용되는 식물 또는 다른 고가치 진핵 유기체에서, 재조합 DNA의 도입 또는 표적화된 게놈 재배열은 개선된 생성물, 예를 들어 보다 적은 자원을 필요로 하거나 병원체에 저항성인 작물을 생성할 수 있다. 대규모 게놈 변화를 달성하기 위한 현재의 기술은 무작위 또는 확률적 과정, 예를 들어 트랜스포손 또는 레트로바이러스의 사용에 의존하며, 한편 다른 목적하는 게놈 변형은 오직 상동 재조합 전략에 의해서만 달성되었다.
표적화되고 효율적인 게놈 변형을 달성하기 위한 하나의 매력적인 단백질 부류는 부위-특이적 레콤비나제 (SSR)이다. SSR은 게놈 변형을 위한 도구로서 사용되어 온 오랜 역사를 갖는다10-13. SSR은 indel, 전위, 다른 DNA 재배열, 또는 p53 활성화를 유도할 수 있는 이중 가닥 파괴의 내인성 복구에 의존하지 않으면서15-18 규정된 재조합 표적에서 DNA 단편의 정확한 절단, 가닥 교환, 및 재연결을 촉매하기 때문에14 유전자 요법을 위한 유망한 도구로 간주된다. SSR에 의해 촉매되는 반응은 상동성-지정 복구의 것을 초과하는 효율로 표적 DNA 단편의 직접 대체, 삽입, 또는 결실을 발생시킬 수 있다14,19.
SSR은 많은 이점을 제공하지만, 그의 동족 표적 서열에 대해 강한 선천적 선호도를 갖기 때문에 널리 사용되지 않는다. SSR의 인식 서열은 전형적으로 ≥ 20개 염기 쌍이고, 따라서 인간 또는 모델 유기체의 게놈에서 발생할 가능성이 없다. 추가로, SSR의 천연 기질 선호도는 심지어 광범위한 실험실 조작 또는 진화에 의해서도 용이하게 변경되지 않는다20. 이러한 제한은 PE를 사용하여 레콤비나제 표적을 게놈 내로 직접 도입하거나 또는 천연적으로 레콤비나제 표적과 유사한 내인성 게놈 서열을 변형시킴으로써 극복된다. 레콤비나제 단백질에 대한 세포의 후속 노출은 레콤비나제 표적(들)의 위치 및 배향에 의해 지시된 정확하고 효율적인 게놈 변형을 허용할 것이다 (도 64).
레콤비나제 표적의 PE-매개된 도입은 대규모 게놈 결함, 예컨대 유전자 상실, 역위, 또는 중복, 또는 염색체 전위에 의해 유발되는 유전 질환의 치료에 특히 유용할 수 있다1-7 (표 6). 예를 들어, 윌리암스-보이렌 증후군은 염색체 721에서의 24의 결실에 의해 유발되는 발달 장애이다. 살아있는 세포에의 다중 전체 유전자의 효율적이고 표적화된 삽입을 위한 기술은 현재 존재하지 않지만 (이러한 전장 유전자 삽입을 행하는 PE의 잠재력이 현재 연구되고 있지만, 아직 확립되지 않았음); PE에 의해 삽입된 표적에서의 레콤비나제-매개된 통합은 이러한 질환 및 다른 질환에 대한 영구적인 치유를 위한 하나의 접근법을 제공한다. 또한, 레콤비나제 인식 서열의 표적화된 도입은 트랜스제닉 식물, 동물 연구 모델, 생물생산 세포주, 또는 다른 통상의 진핵 세포주의 생성을 포함한 적용을 고도로 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 식물에서 PE-특이적 표적에서의 레콤비나제-매개된 게놈 재배열은 개선된 특성을 갖는 농업 작물을 생성하기 위한 병목 중 하나를 극복할 수 있다8,9.
천연 및 조작된 티로신 레콤비나제 (표 7), 대형 세린 인테그라제 (표 8), 세린 레솔바제 (표 9), 및 티로신 인테그라제 (표 10)를 포함한 다수의 SSR 패밀리 구성원이 특징화되었고, 그의 표적 서열이 기재되었다. 증진된 비율의 게놈 통합을 입증한 변형된 표적 서열이 또한 여러 SSR에 대해 기재되었다22-30. 천연 레콤비나제에 더하여, 별개의 특이성을 갖는 프로그램가능한 레콤비나제가 개발되었다31-40. PE를 사용하여, 이들 인식 서열 중 1개 이상을 목적하는 적용에 따라 게놈 내 명시된 위치, 예컨대 세이프 하버 유전자좌에 도입할 수 있다41-43.
예를 들어, 게놈 내 단일 레콤비나제 표적의 도입은 DNA 공여자 주형과의 통합 재조합을 발생시킬 것이다 (도 64b). 인간 세포에서 강건하게 작동하는 세린 인테그라제는 유전자 통합에 특히 매우 적합할 수 있다44,45. 추가적으로, 2개의 레콤비나제 표적의 도입은 표적의 정체 및 배향에 따라 개재 서열의 결실, 개재 서열의 역위, 염색체 전위, 또는 카세트 교환을 발생시킬 수 있다 (도 64c-f). 레콤비나제 표적과 충분히 밀접하게 유사한 내인성 서열을 선택하는 것에 의해, 완전한 레콤비나제 표적을 도입하는데 필요한 편집의 범주가 감소될 것이다.
마지막으로, 여러 레콤비나제는 천연 발생 유사부위에서 인간 또는 진핵 게놈 내로 통합되는 것으로 입증되었다46-64. PE 편집은 이들 유전자좌를 변형시켜 이들 천연 유사부위에서의 통합 속도를 증진시키거나, 또는 대안적으로 원치 않는 오프-타겟 서열로서 작용할 수 있는 유사부위를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 보고는 PE를 사용하여 진핵 게놈에 레콤비나제 표적 서열을 도입하기 위한 일반적 방법론을 기재하며, 그의 적용은 거의 무한하다. 게놈 편집 반응은 맞춤형 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 이용하는 CRISPR/Cas9 단백질 및 리버스 트랜스크립타제 도메인의 키메라 융합체인 "프라임 편집제"와 함께 사용하기 위해 의도된다. 더 나아가, 여러 기술을 사용하여 indel의 비율을 낮춤으로써 DNA 주형을 통해 레콤비나제 표적을 도입하기 위해 Cas9 도구 및 상동성-지정 복구 (HDR) 경로가 또한 이용될 수 있다65-67. 인간 세포 배양물에서의 개념 증명 실험이 도 65에 제시된다.
표 6. 대규모 게놈 변형과 연관된 유전 질환의 예.
Figure pct00487
표 7. 티로신 레콤비나제 및 SSR 표적 서열.
Figure pct00488
표 8. 대형 세린 인테그라제 및 SSR 표적 서열.
Figure pct00489
Figure pct00490
Figure pct00491
표 9. 세린 레솔바제 및 SSR 표적 서열.
Figure pct00492
표 10. 티로신 인테그라제 및 표적 서열.
Figure pct00493
실시예 17에 인용된 참고문헌
각각의 하기 참고문헌이 실시예 17에 인용되며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00494
Figure pct00495
Figure pct00496
Figure pct00497
Figure pct00498
Figure pct00499
Figure pct00500
Figure pct00501
Figure pct00502
Figure pct00503
실시예 18 - 프라이머 결합 부위 (PBS)에의 3' 토루프의 혼입은 PEgRNA 활성을 개선시킨다
PE 활성을 추가로 개선시키기 위해, 본 발명자들은 3' 연장 아암을 갖는 PEgRNA의 3' 단부에 토루프 서열을 부가하는 것을 고려하였다. 도 71a는 3' 연장 아암을 갖는 일반적인 SpCas9 PEgRNA의 예를 제공한다 (상단 분자). 3' 연장 아암은 차례로 RT 주형 (목적하는 편집을 포함함) 및 분자의 3' 단부에 프라이머 결합 부위 (PBS)를 포함한다. 분자는 3개의 U 핵염기를 포함하는 폴리(U) 서열로 종결된다 (즉, 5'-UUU-3').
대조적으로, 도 71a의 하단 부분은 도 71a의 상단 부분과 동일한 PEgRNA 분자를 제시하지만, 여기서 프라이머 결합 부위의 3' 단부와 말단 폴리(U) 서열의 5' 단부 사이에 5'-GAAANNNNN-3'의 9-핵염기 서열이 삽입되었다. 이 구조는 그 자체를 180°만큼 뒤로 폴딩시켜 "토루프" RNA 구조를 형성하며, 여기서 9-핵염기 삽입 중 5'-NNNNN-3' 서열은 프라이머 결합 부위의 상보적 서열과 어닐링하고, 5'-GAAA-3' 부분은 180° 턴을 형성한다. 도 71a에 도시된 토루프 서열의 특색은 그 자리에 사용될 수 있는 가능한 토루프의 범주를 제한하거나 좁히도록 의도되지 않는다. 추가로, 토루프의 서열은 프라이머 결합 부위의 상보적 서열에 좌우될 것이다. 본질적으로, 다양한 실시양태에서, 토루프 서열은 180°를 형성하는 제1 서열 부분, 및 프라이머 결합 부위의 일부에 상보적인 서열을 갖는 제2 서열 부분을 가질 수 있다.
이론에 얽매이지는 않지만, 토루프 서열은 달리 가능한 것보다 더욱 더 긴 프라이머 결합 부위를 갖는 PEgRNA의 사용을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 더 긴 PBS 서열은 다시, PE 활성을 개선시키는 것으로 생각된다. 보다 특히, 토루프의 가능한 기능은 PBS가 스페이서와 상호작용하는 것을 폐쇄하거나 또는 적어도 최소화하는 것이다. PBS와 스페이서 사이의 안정한 헤어핀 형성은 불활성 PEgRNA로 이어질 수 있다. 토루프의 부재 하에, 이러한 상호작용은 PBS의 길이를 제한하는 것을 필요로 할 수 있다. 3' 단부 토루프를 사용하여 스페이서와 PBS 사이의 상호작용을 차단하거나 최소화하는 것은 PE 활성의 개선으로 이어질 수 있다.
실시예 19 - 대안적 핵산 주형 및 편집제 단백질 구축물에 의한 프라임 편집
본 실시예 이전에, 프라임 편집은 PEgRNA를 필요로 하는 것으로 기재되어 있다. 프라임 편집에 사용하기에 적합한 PEgRNA의 가능한 구성을 기재한 예시적인 실시양태가 도 3a (5' 연장 아암을 갖는 PEgRNA), 도 3b (3' 연장 아암을 갖는 PEgRNA), 도 3c (내부 연장된 PEgRNA), 도 3d (3' 연장 아암을 갖고, 프라이머 결합 부위, 편집 주형, 상동성 아암, 및 임의적인 3' 및 5' 변형제 영역, 및 DNA 합성 주형으로 표시된 영역을 포함하는 PEgRNA), 및 도 3e (5' 연장 아암을 갖고, 프라이머 결합 부위, 편집 주형, 상동성 아암, 및 임의적인 3' 및 5' 변형제 영역, 및 DNA 합성 주형으로 표시된 영역을 포함하는 PEgRNA)에 도시된다. 또한, PEgRNA 구조 및 조성은 본원의 상세한 설명 및 전반에 걸쳐 광범위하게 기재된다.
본 실시예는 본 명세서의 프라임 편집제와 함께 작업하는 것이 고려되는 PEgRNA-일부 경우에, 세포 외부에서 완전히 또는 부분적으로 화학적으로 합성된 PEgRNA-의 추가의 설계 변경을 기재한다. 이러한 대안적 설계는 프라임 편집에 의한 보다 긴 DNA 서열의 삽입, 잠재적으로 증가된 효율 및/또는 충실도로 작동하는 대안적 폴리머라제 (즉, 리버스 트랜스크립타제에 대한 대안)의 사용, 및 프라임 편집을 증진 또는 증대시키기 위한 대안적 및/또는 추가의 프라임 편집제 단백질 이펙터 성분의 사용 또는 동원을 포함하여, 프라임 편집의 다양한 측면을 개선시킬 수 있다. 또한, 화학적으로 합성된 PEgRNA의 사용은 잠재적으로 보다 안정하고 프라임 편집 효율 및 능력을 증진시키는 바람직한 특색을 보유하는 분자의 생산으로 이어질 수 있다.
PEgRNA는 표적 부위 내로 혼입될 목적하는 편집된 유전자 정보를 코딩하는 핵산 주형으로서의 역할을 한다. 한 측면에서, PEgRNA는 sgRNA의 5' 단부 또는 3' 단부에 연장 아암을 부가하는 것에 의해 (예를 들어, 도 3a, 3b, 3d, 또는 3e의 실시양태에 제시된 바와 같음), 또는 sgRNA 내에 내부적으로 유사한 서열을 삽입하는 것에 의해 (예를 들어, 도 3c의 실시양태에 제시된 바와 같음) 생성되며, 여기서 연장 아암은 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 ssDNA 생성물을 코딩할 수 있고 편집된 관심 유전자 정보를 포함하는 DNA 합성 주형을 포함한다. 연장 아암은 napDNAbp-닉킹된 게놈 DNA 가닥에의 어닐링을 위한 프라이머 결합 부위 (PBS), 및 대응물 DNA 가닥을 대체함으로써 내인성 DNA 표적 부위 내로 혼입되는, 편집된 관심 DNA 가닥을 코딩하는 DNA 합성 주형을 포함한다. PEgRNA는 플라스미드 DNA 또는 게놈에 통합된 DNA 카세트로부터 세포 내에서 발현될 수 있거나, 또는 시험관내 전사에 의해 또는 화학적 합성에 의해 세포 외부에서 만들어진 다음 후속적으로 세포 내로 전달될 수 있다. 특히 화학적 합성에 의한 세포 외부에서의 PEgRNA의 제조는 PEgRNA를 실질적으로 변형시킬 기회를 제공한다. 본 발명은 프라임 편집 주형을 위한 대안적 설계를 기재한다 (도 72).
(A) 가이드 RNA로부터 별개의 분자로서 발현된 DNA 합성 주형 (즉, 프라임 편집제 복합체에 트랜스로 제공된 DNA 합성 주형 (napDNAbp + 가이드 RNA)).
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 프라임 편집은 프로그램가능한 표적화 분자 및 편집-코딩 분자 둘 다로서의 역할을 하는 단일 PEgRNA를 이용한다. 이러한 실시양태가 도 72(a)에 도시되며, PEgRNA는 3' 연장 아암을 갖는다. 그러나, 일부 경우에, 이는 특히 보다 복잡한 PEgRNA 분자, 예컨대 큰 삽입을 코딩하는 것에 대해 불리할 수 있다. 이들 RNA는 PEgRNA 스캐폴드 구조 및 Cas9와의 상호작용을 방해하는 확장 2차 구조를 함유할 수 있다. 대안적으로, 프라임 편집은, 도 72(b)에 도시된 바와 같이, PEgRNA를 2개의 별개의 RNA 분자: sgRNA, 및 트랜스 프라임 편집 RNA 주형 (tPERT)으로 치환함으로써 수행될 수 있다. sgRNA는 Cas9 (또는 보다 일반적으로, napDNAbp)를 목적하는 게놈 표적 부위에 표적화하는 역할을 하는 반면, tPERT는 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 새로운 DNA 서열을 표적 유전자좌에 기록하는데 사용된다.
일반적으로, tPERT의 단순 발현은 PEgRNA와 비교하여 보다 낮은 편집 효율로 이어진다. 그러나, 트랜스 프라임 편집의 효율은 프라임 편집제 단백질에의 MS2 코트 단백질 (MS2cp)의 융합 (MS2cp-Cas9-RT를 제조함)과 함께, tPERT RNA 내로의 1개 이상의 MS2 RNA 압타머의 도입에 의해 증진될 수 있다. 이는 MS2 RNA 압타머가 MS2cp에 결합하게 함으로써, tPERT (DNA 합성 주형을 포함함)를 프라임 편집제 복합체에 의한 편집 부위에 공동-국재화시킨다. MS2 압타머는 바람직하게는 압타머 서열의 역전사를 피하기 위해 tPERT의 3' 단부에 위치한다.
본 실시예는 MS2 태그부착 기술 (프라임 편집제에 융합된 MS2cp 단백질과 쌍형성된 tPERT 상의 MS2 RNA 압타머를 포함함)을 이용하지만, 다른 RNA-단백질 동원 시스템이 대안적으로 사용될 수 있다. 본원에서 고려되는 일반적 개념은 tPERT가 tPERT 분자 상의 RNA 동원 제2 구조를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 RNA-결합 단백질을 추가로 포함하는 변형된 프라임 편집제 융합 단백질에 의해 동원될 수 있도록 tPERT의 DNA 합성 주형이 RNA 동원 2차 구조 (예를 들어, MS2 압타머와 같은 특수화된 헤어핀)를 함유하도록 변형된다는 것이다. 다른 RNA-단백질 동원 도메인의 검토는 관련 기술분야에, 예를 들어 문헌 [Johansson et al., "RNA recognition by the MS2 phage coat protein," Sem Virol., 1997, Vol. 8(3): 176-185; Delebecque et al., "Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies," Science, 2011, Vol. 333: 470-474; Mali et al., "Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering," Nat. Biotechnol., 2013, Vol.31: 833-838; 및 Zalatan et al., "Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds," Cell, 2015, Vol.160: 339-350]에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다른 시스템은 PCP 단백질을 특이적으로 동원하는 PP7 헤어핀, 및 Com 단백질을 특이적으로 동원하는 "com" 헤어핀을 포함한다. 문헌 [Zalatan et al.]을 참조한다. 이들 널리 공지된 동원 시스템 중 임의의 것은 본원에 기재된 바와 같은 트랜스 프라임 편집과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 tPERT 트랜스 프라임 편집 시스템의 효율을 시험하였다. 단일 3' MS2 압타머, 13-nt 프라이머 결합 부위, 및 삽입 서열 및 유전자좌에 대해 34 nt의 상동성을 함유하는 RT 주형을 함유하는 tPERT를 PE2의 N-말단에 융합된 MS2cp를 함유하는 편집제와 함께 사용하여 HEK293T 세포 내의 HEK3 부위에서 최대 20% 효율의 His6 삽입 (18 bp)을 달성하였다. 도 73을 참조한다. 트랜스 프라임 편집 전략은 PEgRNA 설계와 연관된 합병증을 다루는 잠재력을 갖고, 보다 긴 RT 주형은 프라임 편집제 닉 부위로부터 추가의 거리에서 보다 큰 삽입, 결실, 또는 편집을 달성하는데 보다 적합할 수 있다.
(B) RNA 및 DNA 합성 주형을 갖는 화학적으로 합성된 PEgRNA
대안적 핵산 주형이 화학적으로 합성된 PEgRNA 내에서 사용될 수 있다 (도 72c). 예를 들어, 합성 PEgRNA는 스페이서 서열 및 sgRNA 스캐폴드가 RNA 뉴클레오티드로 구성되고 프라이머 결합 부위 및 합성 주형 (도 72c에서 3' 연장부로 제시됨)이 DNA 뉴클레오티드로 구성된 RNA/DNA 하이브리드로서 구축될 수 있다. 이는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 프라임 편집제 내에서 리버스 트랜스크립타제 대신 사용되도록 할 수 있다. 이는 또한 sgRNA 스캐폴드 서열에 의해 주형화되는 DNA의 합성을 방지할 수 있다. 다른 설계에서, 비-주형화 뉴클레오티드 또는 다른 적합한 링커 모이어티로 구성된 화학적 링커가 핵산 편집 주형 (RNA 또는 DNA로 구성됨)을 sgRNA 스캐폴드에 테더링하는데 사용될 수 있다. 이는 sgRNA 스캐폴드의 계속적인 DNA 중합을 방지할 수 있고, 연장부에 유연성을 허용하여 보다 효율적인 주형화된 합성을 허용할 수 있다. 마지막으로, 핵산 합성 주형의 방향성은 DNA 중합이 sgRNA 스캐폴드쪽과 반대로 진행되도록 역전될 수 있다.
(C) 트랜스로 발현된 DNA 폴리머라제의 동원
프라임 편집의 주요 실시양태에서, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제 효소)는 napDNAbp (예를 들어, Cas9 닉카제)에 대한 융합체로서 발현된다. 대안적으로, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)는 트랜스로 발현될 수 있고, 그의 활성은 동원 시스템, 예컨대 MS2 RNA 압타머 및 MS2 코트 단백질, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 유사한 동원 시스템을 사용하여 편집 부위에 국재화될 수 있다. 이 시스템에서, PEgRNA는 sgRNA 스캐폴드 헤어핀 중 하나 내에 MS2 압타머를 포함하도록 변형되고, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)는 MS2cp에 대한 융합 단백질로서 발현된다. napDNAbp (예를 들어, Cas9 닉카제)는 또한 독립적 폴리펩티드로서 발현된다. 이러한 시스템은 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제로 입증되었고 (도 74), 다른 RT 변이체에 대해서도 적용가능할 것이다. 또한, 다른 RNA-단백질 상호작용 또는 단백질-단백질 상호작용이 RT 동원에 사용될 수 있다.
하기 서열이 실시예 19와 관련된다:
tPERT의 서열:
MS2 압타머 / RT 주형 / PBS / 링커
Figure pct00504
MS2 PEgRNA의 서열:
스페이서 / MS2 압타머 / sgRNA 스캐폴드 / RT 주형 / PBS
Figure pct00505
단백질 서열:
Figure pct00506
Figure pct00507
Figure pct00508
실시예 20. 프라임 편집제의 분할-인테인 전달
본 실시예는 프라임 편집제를 별개의 벡터를 통해 세포에 전달하기 위한 수단으로서 인테인을 사용하여 프라임 편집제가 분할될 수 있음을 입증하며, 여기서 각각의 벡터는 프라임 편집제 융합 단백질의 부분을 코딩한다. 본 실시예는 정규 SpCas9 (서열식별번호: 18)를 포함하는 PE 융합 단백질에 초점을 맞춘다. 다른 Cas9 단백질에 대한 분할 부위는 상응하는 동일한 부위일 수 있거나, 또는 각각의 상이한 Cas9 단백질에 대해 최적화될 필요가 있을 수 있다. 본 실시예에서, 프라임 편집제는 SpCas9 (서열식별번호: 18)의 잔기 1023과 1024 사이에서 분할되었다. 이는 "1023/1024" 분할 부위로 지칭된다.
프라임 편집제 (PE)는 AAV 패키징 능력을 초과한다. 따라서, 서열식별번호: 18의 에스. 피오게네스 Cas9 잔기 1024에 트랜스-스플라이싱 Npu 인테인을 삽입함으로써 PE를 분할하여, 이중-AAV 시스템 중 하나에 의해 각각 코딩되는 2개의 별개의 폴리펩티드로서 분할-SpPE의 전달을 가능하게 하는 것이 고려되었다. 분할 부위 1023/1024는 (1) 가이드 카세트(들) 및 최소 조절 요소를 위한 공간을 제공하면서 2개의 AAV 내로의 패키징을 가능하게 하고, (2) 천연 세린의 시스테인으로의 돌연변이는 비교적 보존적일 것이고, (3) 부위는 스플라이싱 발생이 가능할 것으로 입체적으로 예측되는 Cas9의 주변부 근처의 가요성 루프이고, (4) Cas9는 원형 순열에 의해 이러한 루프에서 성공적으로 변경되었기 때문에 (그러나 이전에는 이러한 특이적 분할 부위에서 그렇지 않았음) 선택되었다.
Npu-분할 프라임 편집제가 활성인지 결정하기 위해, HEK 세포를 분할-편집제를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켜, 이들이 고처리량 서열분석에 의해 분석된 바와 같이 전장 PE3의 활성을 재현한다는 것을 발견하였다. 또한, C-말단 엑스테인의 3개의 천연 Npu 아미노-말단 잔기는 가장 효율적으로 스플라이싱되는 것으로 공지되어 있지만, 이는 그의 천연 플랭킹 Cas9 잔기 1024와 상이하다. 이들 Cas9 잔기를 천연 Npu 잔기로 대체하는 것은 프라임 편집제의 활성을 변경시킬 수 있다. 따라서, Cas9-천연 "SEQ"로부터 Npu 인테인 "CFN" 서열로의 돌연변이가 프라임 편집의 효율을 변경시켰는지를 결정하였다. "SEQ" 잔기는 프라임 편집을 전장과 유사한 효율로 용이하게 하며, 이는 인테인-분할 PE 절반이 프라임 편집을 회합하고 매개할 수 있음을 시사한다. "CFN"으로의 돌연변이에 의해 어떠한 추가의 증가도 관찰되지 않았고, 이는 본 발명자들이 인테인-분할 염기 편집제를 사용하여 이전에 관찰한 바와 같이, 회합 단독이 분할-PE 활성에 충분할 수 있음을 시사한다.
회합된, 비스플라이싱된 편집제는 활성일 수 있지만, 개시 단계 동안 불완전한 스플라이싱으로부터 생성된 프라임 편집제의 입체구조의 교란은 편집 결과에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 1024-CFN은 또한 전장 PE3 활성을 재현하기 때문에 추가의 연구를 위해 선택되었다.
하기는 1023/1024 분할의 아미노산 서열이다.
1023/1024 N 말단 절반에서의 SpPE2 분할
Figure pct00509
Figure pct00510
1023/1024 C 말단 절반에서의 SpPE2 분할
Figure pct00511
Figure pct00512
이중 AAV 시스템으로의 프라임 편집제 패키지
Npu 트랜스-스플라이싱 인테인에 의한 잔기 1023과 1024 사이에서의 프라임 편집제 분할은 동일한 방식으로 생산된 유사한 게놈 크기의 염기 편집제의 것과 대등한 높은 역가로 AAV 내에 패키지된다.
생체내 프라임 편집
P0 마우스에게 뇌실내 주사에 의해 AAV9와 함께 전달된 분할 SpPE3은 뇌 조직에서 생체내 프라임 편집을 매개한다. 위치 +5 (즉, 닉 부위의 5개 뉴클레오티드 염기 하류이며 PAM 서열 내)에서 G에서 T로의 뉴클레오티드 치환은 DNMT1의 N 말단 근처에 Pro>Gln 코딩 돌연변이의 설치를 발생시킨다. 이러한 편집은 생체내 프라임 편집의 실행가능성을 입증하고, 편집된 세포에 임의의 선택 압력을 도입하는 것으로는 생각되지 않는다 ("+5"는 닉 부위의 하류의 +5 위치를 지칭함). 시험된 AAV 구조는 전장 MMLV RT, 뿐만 아니라 RNAse H 도메인이 결여된 말단절단된 변이체를 포함한다. 말단절단된 전사후 조절 요소 W3은 생체내에서 바이러스 카세트로부터의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌지만 염기 편집제 또는 프라임 편집제와 관련하여 그의 중요성이 시험되지 않았기 때문에 또한 평가되었다. 전장 RT가 말단절단된 RT를 능가하고, W3 서열의 부가가 활성을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. W3이 존재하는 경우의 편집 활성의 증가는 프라임 편집제의 발현이 생체내에서 제한적임을 나타내고, 생체내 대 세포 배양물에서의 프라임 편집의 별개의 도전과제를 입증한다.
참고문헌
Oakes, B.L., Fellmann, C. et al., CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification. Cell. 2019 Jan 10;176(1-2):254-267.e16. doi: 10.1016/j.cell.2018.11.052.
실시예 21. PE2 포맷으로의 링커 최적화
본 실시예는 모두 PE2를 기초로 하는 다수의 변이체 프라임 편집제를 구축하였다. PE2는 하기 서열 및 구조를 갖는다:
본원에 사용된 "PE2"는 하기 구조: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + 목적하는 PEgRNA를 갖는 Cas9(H840A) 및 변이체 MMLV RT를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 PE 복합체를 지칭하며, 여기서 PE 융합체는 하기와 같이 제시된 서열식별번호: 134의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00513
설명:
핵 국재화 서열 (NLS) 상단: (서열식별번호: 124), 하단: (서열식별번호: 133)
Cas9(H840A) (서열식별번호: 137)
33-아미노산 링커 (서열식별번호: 127)
M-MLV 리버스 트랜스크립타제 (서열식별번호: 139).
PE2 링커는 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (서열식별번호: 127)이다.
이 실험에서, PE2의 링커를 하기 치환 링커 중 1개로 대체하였다 (또는 한 경우에 링커 부재):
Figure pct00514
도 79는 대체 링커 구축물의 편집 효율을 보여준다. 특히, 데이터는 전이, 전환, 삽입, 및 결실 편집을 위해 대표적인 PEgRNA에 대한 HEK3, EMX1, FANCF, RNF2 유전자좌에서 표시된 바와 같은 서열로 대체된 링커를 갖는 다양한 버전과 비교하여 현재의 링커를 갖는 PE2 구축물 (PE2 - 백색 박스로 표시됨)의 편집 효율을 보여준다. 대체 링커는 "1x SGGS", "2x SGGS", "3x SGGS", "1x XTEN", "링커 부재", "1x Gly", "1x Pro", "1x EAAAK", "2x EAAAK", 및 "3x EAAAK"로 지칭된다. 편집 효율은 PE2의 "대조군" 편집 효율 대비 막대 그래프 포맷으로 측정된다. PE2의 링커는 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (서열식별번호: 127)이다. 모든 편집은 PE3 시스템, 즉 PE2 편집 구축물 플러스 최적 2차 sgRNA 닉킹 가이드의 부가를 지칭하는 것의 맥락으로 이루어졌다.
도 80은 1x XTEN 링커가 편집 효율의 증가를 제공하였음을 보여준다. PE2 대비 평균 배수 효능을 취하면 제시된 그래프가 산출되며, 이는 1x XTEN 링커 서열의 사용이 편집 효율을 평균 1.14배 개선시킨다는 것을 나타낸다 (n=15).
실시예 22. 개선된 활성을 갖는 프라임 편집제 가이드 RNA
다양한 실시양태에서, PEgRNA는 표적 DNA 부위 및 편집 의존성일 가능성이 있다. 즉, PEgRNA의 서열은 표적 DNA 서열 및 프라임 편집에 의해 그 안에 도입되는 특정한 편집 (예를 들어, 결실, 삽입, 역위, 치환)에 좌우될 것이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, PEgRNA의 프라이머 결합 부위 (PBS)의 3'에의 모티프의 부착 시, PBS와 모티프 사이의 링커는 PE 융합 단백질의 폴리머라제 도메인 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)과의 입체적 충돌을 방지하기 위해 바람직하다. 그러나, 그러한 링커의 성질은 각각의 부위에 대해 상이할 수 있다. 예를 들어, 각각의 부위에 대해 동일한 링커가 사용된 경우에, 이는 스페이서 서열에의 우연한 쌍형성에 의해 인공적으로 13 nt PBS가 16 nt PBS가 되게 할 수 있다. 유사하게, 링커는 PBS 그 자체에 대해 염기쌍을 형성하여, 그의 폐쇄를 발생시키고 잠재적으로 활성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 단백질-기반 편집제, 예컨대 PE 또는 BE4와 달리, 2개의 요소를 연결하는 단일 링커 서열 옵션은 각각의 구축물에서 효과적이지 않을 수 있지만, 부분적으로 표적 DNA 서열의 서열 및 관심 편집에 좌우될 것이다.
부분적으로, 실시예 15 (PEgRNA의 설계 및 조작)에 제시된 정보에 기초하여, 본 실시예를 구축한 다음, 다른 측면 중에서도 편집 기능에 대한 PEgRNA에 대해 이루어진 다양한 구조적 변형의 효과를 시험하였다.
비-pol III 프로모터로부터의 PEgRNA의 발현
다양한 PEgRNA 발현 시스템을, 판독으로서 FKBP로부터의 102개 뉴클레오티드 서열의 삽입을 사용하여, PEgRNA를 생성하는 그의 능력에 대해 시험하였다.
PEgRNA의 전사는 전형적인 구성적 프로모터, 예컨대 U6 프로모터에 의해 지시될 수 있다. U6 프로모터가 대부분의 경우에 PEgRNA의 전사를 지시하는데 효과적이지만, U6 프로모터는 보다 긴 PEgRNA 또는 U-풍부 RNA의 전사를 지시하는데 매우 효과적이지 않다. U-풍부 RNA 스트레치는 전사의 조기 종결을 유발한다. 본 실시예는 CMV 프로모터 또는 U1 프로모터로부터 발현된 가이드의 편집 결과를 U6 프로모터와 비교하였다. 이들 프로모터는 하기 제공된 바와 같은 상이한 종결인자 서열, 예컨대 MASC ENE 또는 PAN ENE를 필요로 한다. pCMV/MASC-ENE 시스템에 의해 편집의 증가가 관찰되었지만, 이들 가이드는 서열의 불완전한 삽입을 발생시킨 반면에, U6 프로모터에 의해서는 완전한 삽입이 보다 낮은 편집 수준에서 관찰되었다. 도 81을 참조한다. 데이터는 대안적 발현 시스템이 긴 삽입에 유용할 수 있다는 가능성을 시사한다.
pCMV/MASC-ENE 발현 시스템의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다 (5'에서 3' 방향) (모티프의 명칭은 그것이 지칭하는 영역 바로 앞에 볼드체로 표시됨):
Figure pct00515
Figure pct00516
Figure pct00517
설명:
[pCMV 프로모터] - pol II RNA 폴리머라제에 결합함
[Csy4 루프] - Csy4 단백질에 의해 결합됨, 루프의 3' 절단을 발생시킴. [CMV 프로모터]의 일부가 전사되기 때문에 요구되며, 이 서열이 gRNA의 5'에 부착되는 경우에, 이는 활성을 저하/제거할 것이다 (이전에 공지됨).
pegRNA의 [스페이서 서열]
[pegRNA 스캐폴드]
[DNA 합성 주형]
[삽입 편집 (FKBP로부터 108 nt)]
[프라이머 결합 부위]
[링커] (고도로 가변적) - PBS와 종결인자 요소를 연결함
[MASC ENE 전사 종결인자] - 이 요소의 전사는 전사의 종결을 발생시킴; 폴리A 테일이 코딩되며, 이는 이어서 ENE 요소에 의해 격리됨.
[중요하지 않은 서열]
[Ubc 프로모터] - Csy4 단백질의 발현을 위해 요구됨
[Csy4 단백질 및 NLS] - 가이드의 5' 단부의 프로세싱에 요구됨. 또한 대형 단백질의 발현을 필요로 하지 않는 다른 전략들이 사용될 수 있지만 (예컨대 스페이서의 리보자임-매개된 절단), 이들은 상이한 스페이서 서열에 대한 보다 많은 개별 조정을 필요로 할 것이고, 따라서 본 발명자들은 이것을 사용하였다.
[SV40 종결인자] - Csy4 단백질의 종결을 위함.
PEgRNA 스캐폴드의 개선
gRNA 스캐폴드에 대한 다수의 구조적 변형을 또한 시험하였으며, 이들 중 어떠한 것도 편집 활성의 유의한 증가를 나타내지 않았다 (도 82 참조, 3.30과 비교하여 X 축의 3.30.13 내지 3.30.19). 그러나, 이 데이터는 주목할 만한 2가지 주의사항을 갖는다. 첫째로, 이러한 가이드는 이미 상당히 잘 작동하였고, 덜 효과적인 가이드는 시험하기에 더 우수할 것이다. 둘째로, HEK 세포에서, 형질감염은 매우 효율적이고, 형질감염된 가이드 RNA의 양은 필요한 양과 비교하여 매우 과량임이 주목되었다 (양을 ~4-8배만큼 감소시키는 것은 편집에 어떠한 영향도 없음). 이들 개선은 다른 세포 유형에서만, 형질감염 효율이 더 낮거나 또는 덜 효과적인 가이드를 사용한 경우에 관찰될 수 있다. 이들 변화 중 많은 것은 다른 세포주에서 sgRNA 활성을 개선시키기 위해 선행된다.
도 82의 구축물의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00518
Figure pct00519
Figure pct00520
Figure pct00521
말단 모티프가 없거나 또는 일련의 U로 끝나지 않는 말단 모티프가 존재하는 경우에, 전사체는 하기 HDV 리보자임:
GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACAUGCUUCGGCAUGGCGAAUGGGAC [서열식별번호: 3923]을 사용하여 종결되었음에 주목한다.
추가의 RNA 모티프
PEgRNA의 3'의 특정 모티프, 예컨대 HDV 리보자임, 또는 그의 성능을 개선시키기 위해 PEgRNA 내로 도입될 수 있는 G-쿼드로플렉스 삽입, P1 연장부, 주형 헤어핀, 및 원형화된 테트라루프에 대한 상세한 내용은 도 82를 참조한다.
특히, 본 실시예는 프라이머 결합 부위의 3'에 tRNA 모티프를 설치한 효과를 시험하였다. 이 요소는 다수의 잠재적 기능으로 인해 선택되었다:
(1) tRNA 모티프는 매우 안정한 RNA 모티프이고, 따라서 잠재적으로 PEgRNA 분해를 감소시킬 수 있음;
(2) MMLV RT는 전사 동안 바이러스 게놈을 DNA로 전환시킬 때 프라이머로서 프롤릴-tRNA를 사용하므로, 동일한 캡이 RT에 의해 결합되어, PE에 의한 PEgRNA의 결합, RNA 안정성을 개선시키고, PBS를 게놈 부위에 보다 근접하게 되돌려, 또한 잠재적으로 활성을 개선시킬 것으로 추측된다.
이들 구축물에서, tRNA의 P1 (도 84 참조)은 연장되었다. P1은 tRNA의 제1 스템/염기-쌍형성 요소를 지칭한다 (도 84 참조). 이는 PEgRNA로부터 그의 제거를 발생시킬, P1의 5'의 tRNA의 RNAseP-매개된 절단을 방지하기 위해 필요한 것으로 여겨졌다.
이러한 설계에서 tRNA와 PBS 사이에 연장된 P1 및 짧은 3 nt 링커를 갖는 프롤릴-tRNA (코돈 CGG)가 사용되었다. 다양한 tRNA 설계를 시험하고, tRNA 캡을 갖지 않는 PEgRNA와 비교하여 편집 효율을 시험하였다 - 도 83 (HEK3 유전자의 편집을 표적화한 PE 실험을 도시함, 닉 부위 대비 위치 +1에서 10 nt 삽입의 삽입을 특이적으로 표적화하고 PE3을 사용함), 도 85 (FANCF 유전자의 편집을 표적화한 PE 실험을 도시함, 닉 부위 대비 위치 +5에서 G에서 T로의 전환을 특이적으로 표적화하고 PE3 구축물을 사용함) 및 도 86 (HEK3 유전자의 편집을 표적화한 PE 실험을 도시함, 닉 부위 대비 위치 +1에서 71 nt FLAG 태그 삽입의 삽입을 특이적으로 표적화하고 PE3 구축물을 사용함)의 비교 데이터를 참조한다. tRNA-변형된 PEgRNA를 비-변형된 PEgRNA 대조군에 대해 시험하였다.
UGG/CGG는 사용된 코돈을 지칭하고, 숫자는 부가된 P1 연장부의 길이를 지칭하고, 긴 것은 8 nt 링커를 나타내고, 3 nt 링커는 표기되지 않았다.
데이터는 tRNA의 설치가 보다 짧은 PBS의 사용을 가능하게 할 수 있음을 시사하며, 이는 아마도 추가의 활성 개선을 발생시킬 것이다. RNF2의 경우에, 사용된 링커는 가능하게는/아마도 스페이서에 대한 개선된 PBS 결합 및 결과적으로 활성의 감소를 발생시킬 것이다.
사용된 일부 서열:
HEK3 +1 FLAG-태그 삽입, 프롤릴-tRNA{UGG} P1 ext 5 nt, 링커 3 nt
Figure pct00522
FANCF +5 G에서 T 프롤릴-tRNA{CGG} P1 ext 5 nt, 링커 3 nt
Figure pct00523
HEK3 ++1 10 nt 삽입, 프롤릴-tRNA{UGG} P1 ext 5 nt, 링커 3 nt
Figure pct00524
도 85 및 86의 데이터에 보고된 서열은 하기와 같다:
Figure pct00525
Figure pct00526
Figure pct00527
Figure pct00528
실시예 23. CDKL5 및 겸상 적혈구 빈혈을 교정하기 위한 프라임 편집의 사용
1412delA 돌연변이를 갖는 CDKL5의 마우스 모델을 설계하기 위한 PE의 사용
CDKL5 결핍 장애 (CDD)는 시클린-의존성 키나제-유사 5 유전자에서 가장 종종 자연 돌연변이에 의해 유발되는 신경변성 질환이다. 증상은 유아기에 나타나며, 발작, 불규칙 수면 패턴, 위장 스트레스, 및 발달 지체를 포함한다. 1412delA를 포함한 CDD를 유발하는 일부 돌연변이는 염기 편집에 의해 교정될 수 없다. 그러나, 프라임 편집은 모든 염기-대-염기 변화, 결실, 및 삽입을 정확하게 교정하는 잠재력을 갖는다. 1412delA 돌연변이에 초점을 맞추어, 본 실시예는 돌연변이를 보유하는 마우스 뉴런 세포주 (N2A)를 확립하기 위해 돌연변이를 원하는 대로 삽입할 수 있는 pegRNA를 설계하고 시험하였다. 이는 돌연변이를 교정하는 잠재적으로 치료적인 pegRNA의 광범위한 스크리닝을 가능하게 할 것이다. 궁극적인 목표는 1412delA 돌연변이를 갖는 CDD 마우스 모델 내로 이동하여 치료 효과를 평가할 수 있도록 하는 것이다. CDD의 현재의 마우스 모델은 인간화 대립유전자를 갖지 않지만, pegRNA의 최적화가 또한 HEK293T 세포에서 진행 중이다. 도 87 및 88은 프라이머 결합 부위 (PBS) 길이 및 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 길이에 관한 세부사항, 및 pegRNA가 1412Adel을 설치한 N2A 세포에서의 파일럿 스크린으로부터의 결과이다. (indel의 존재 및 부재 하에 제시됨)
겸상 적혈구 빈혈 (SCA)을 치료하기 위한 PE의 사용
겸상 적혈구성 빈혈 (SCA)은 β-글로빈 유전자의 위치 6에서의 글루타메이트에서 발린 돌연변이에 의해 유발되는 열성 혈액 장애이다. 결과는 겸상 적혈구로, 이는 불량한 산소 수송체이며 응집되기 쉽다. 응집 증상은 생명을 위협할 수 있다. 이전에, 디. 리우(D. Liu) 실험실은 DNA 플라스미드 형질감염을 통한 프라임 편집을 사용하여 HEK293T 세포에서 SCA 유전자좌의 설치 및 교정 둘 다를 보여줄 수 있었다. 조혈 줄기 세포 (HSC)는 DNA 플라스미드 형질감염을 통해 편집하기 어렵기 때문에, 본 실시예는 단백질 및 mRNA 뉴클레오펙션으로 HSC에서 PE3 시스템을 시험하였다. 도 89는 편집제 대 pegRNA 및 닉킹 gRNA의 농도를 달리한, β-글로빈 유전자 내의 프록시 유전자좌 및 건강한 HSC의 HEK3에서의 편집의 결과이다.
mRNA 뉴클레오펙션 프로토콜:
프로토콜은 편집제 대 가이드의 비 ([편집제] 대 [가이드] 비 또는 편집제:가이드 비)를 조정함으로써 개선시켰다.
닉킹 가이드 프로토스페이서 서열은 다음과 같았다: CCTTGATACCAACCTGCCCA
pegRNA 서열은 다음과 같았다: CATGGTGCACCTGACTCCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAGACTTCTCTTCAGGAGTCAGGTGCACTTT
1. CD34+ 세포를 해동시키고, 엑스-비보15(X-Vivo15) 배지 중에서 시토카인 (SCF, Flt3 및 TPO)으로 24시간 동안 사전-자극하였다. 시딩 밀도 1백만개 세포/mL.
2. 다음날 (24시간 후), CD34+ 세포를 흡인하고 (1 x 105개), PBS로 1회 세척하고 (원심분리를 RT에서 10분 동안 300g에서 수행함), P3 용액 (론자) 중에 재현탁시켰다 (조건당 20 ul).
3. 후드에서, 얼음 상의 멸균 PCR 스트립에서 2 ug의 SpPE2 mRNA, 1ug의 합한 pegRNA 및 sgRNA를 합하였다. 부피를 20 ul (P3 용액 + mRNA &gRNA 믹스 중 세포)로 조정하였다.
4. 세포 현탁액을 20 uL 론자4D 16 웰 스트립 내로 피펫팅하고, 프로그램 DS130으로 전기천공하였다.
5. 전기천공 후 10 내지 15분 동안 기다리고, 80 uL의 엑스-비보10+시토카인 배지를 세포 현탁액에 첨가하고, 시토카인을 함유하는 미리 가온된 엑스-비보10 배지로 옮겼다.
6. 전기천공 72시간 후에 세포를 수거하고, 세포 회수를 체크하고, 벌크 집단에서 유전자형결정을 수행하고, 또한 CD34+ 및 CD34+90+ 집단을 분류하였다.
야생형 CDKL5 단백질 (수탁 번호 NP_001032420) (이소형 1 - 인간)
Figure pct00529
야생형 CDKL5 단백질 (수탁 번호 NP_001310218) (이소형 2 - 인간)
Figure pct00530
실시예 24. 비-당뇨병성 만성 신장 질환에 대한 치료로서 병원성 AOL1 대립유전자를 표적화하기 위한 프라임 편집의 사용
본 실시예는 신장 질환을 치료하거나 또는 그의 발생 가능성을 감소시키기 위해 프라임 편집에 사용하기 위한 병원성 APOL1 대립유전자를 표적화할 수 있는 PEgRNA를 설계하였다.
말기 신부전 (ESKD)은 현재 미국에서 50만 명이 넘는 개체에게 영향을 미치는 증가하는 문제이다. ESKD 환자에 대한 관리 비용은 현재 연간 400억 달러가 넘는다. 미국에서, 아프리카계 혈통의 대상체에서 ESKD가 발생할 가능성은 아프리카계 혈통이 아닌 미국인보다 4 내지 5배 더 높다. 이들 사실은 아프리카계 혈통을 갖는 미국 인구의 12-13%와 아프리카계 미국인인 미국 투석 환자의 40% 사이의 차이로 반영된다. 신질환 위험 인자, 예컨대 비만 및 대사 증후군의 유행성은 이 문제의 크기가 오직 증가하기만 할 것임을 시사한다.
대다수의 진행성 신장 질환에 대한 특정 요법은 존재하지 않는다. 일부 유형의 만성 신질환 진행은 특정 작용제를 사용한 혈압 제어에 의해 느려질 수 있지만, 신장학자는 어느 환자가 반응할 것인지를 정확하게 예측할 수 없다. 더욱이, 성공적인 치료는 전형적으로 진행을 늦추지만, 이는 질환을 예방하지도 않고 질환 진행을 중단시키지도 않는다.
최근, 아포지단백질-L1 (APOL1)의 단백질 서열을 변경시키는 특정 유전자 변이체가 진행성 신질환과 연관이 있는 것으로 결정되었다. 놀랍게도, APOL1 신장 질환 변이체는 고혈압-연관 말기 신질환 (H-ESRD), 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 및 HIV-연관 신병증 (HIVAN)을 포함한 다수의 상이한 유형의 신장 질환에 대해 주요 영향을 갖는다. 이들 변이체 APOL1 대립유전자를 갖는 개체는 신장 질환에 대해 7-30배 증가된 위험을 갖는다. 이들 APOL1 위험 대립유전자의 높은 빈도에 기초하여, 3백5십만명 초과의 아프리카계 미국인이 고위험 APOL1 유전자형을 가질 가능성이 있다. 고위험 유전자형이 없는 아프리카계 미국인은 유럽 혈통의 미국인과 비교하여 과도한 위험이 거의 없다.
APOL1 유전자에서의 변이체가 신질환을 유발한다는 증거에도 불구하고, 그의 생성물인 APOL1의 생물학 또는 신장에서의 그의 역할에 대해 거의 공지되어 있는 것이 없다. APOL1은 트리파노솜에 대한 저항성에서 규정된 역할을 갖고, G1 및 G2 변이체는 이들이 아프리카 수면병을 유발하는 트리파노솜 형태에 대해 보호를 부여하기 때문에 아프리카에서 통상적이 된 것으로 보인다.
1개 이상의 APOL1 위험 대립유전자를 갖는 이러한 대상체 집단 및 다른 대상체 집단에서 높은 경제적 영향과 함께 큰 이환율 및 사망률을 유발하는, 환자에서의 신장 질환에 대한 요법에 대한 필요는 여전히 존재한다.
본 실시예는 APOL1 결함있는 대립유전자를 교정하기 위해 프라임 편집과 함께 사용될 수 있는 특정의 예시적인 표적 서열에 기초한 3가지 예시적인 PEgRNA 설계 옵션을 제공한다.
PEgRNA 1
APOL1 대립유전자 rs73885319 (p.S342G)에 대한 PEgRNA의 설계. 이는 이환 개체에서의 G→A 교정을 나타낸다. 표적 서열은 5-GGAGTCAAGCTCACGGATGTGGCCCCTGTA(G에서 A)GCTTCTTTCTTGTG CTGGATGTAGTCTACCT-3이다.
프로토스페이서 (상기에서 볼드체)는 AAGCTCACGGATGTGGCCCC이다. 선택된 PE는 SaCas9(D10A)를 포함한다.
프라이머 결합 부위는 하기일 수 있다:
GTGGCCCC
TGTGGCCCC
ATGTGGCCCC
GATGTGGCCCC
GGATGTGGCCCC
CGGATGTGGCCCC
ACGGATGTGGCCCC
CACGGATGTGGCCCC
TCACGGATGTGGCCCC
CTCACGGATGTGGCCCC.
RT 주형은 하기일 수 있다:
AAGAAGCTTACA
AAAGAAGCTTACA
GAAAGAAGCTTACA
AGAAAGAAGCTTACA
AAGAAAGAAGCTTACA
CAAGAAAGAAGCTTACA
ACAAGAAAGAAGCTTACA
CACAAGAAAGAAGCTTACA
GCACAAGAAAGAAGCTTACA
AGCACAAGAAAGAAGCTTACA
CAGCACAAGAAAGAAGCTTACA
CCAGCACAAGAAAGAAGCTTACA
TCCAGCACAAGAAAGAAGCTTACA
ATCCAGCACAAGAAAGAAGCTTACA.
닉킹 주형은 GCTTTGATTCGTACACGAGG일 수 있다.
PEgRNA 2
APOL1 대립유전자 rs60910145에 대한 PEgRNA의 설계. 이는 이환 개체에서의 G→T 교정을 나타낸다.
프로토스페이서는 GCTGGAGGAGAAGCTAAACA이다. 선택된 PE는 SpCas9(D10A)-NG를 포함한다.
프라이머 결합 부위는 하기일 수 있다:
GAAGCTAA
AGAAGCTAA
GAGAAGCTAA
GGAGAAGCTAA
AGGAGAAGCTAA
GAGGAGAAGCTAA
GGAGGAGAAGCTAA
TGGAGGAGAAGCTAA
CTGGAGGAGAAGCTAA
GCTGGAGGAGAAGCTAA.
RT 주형은 하기일 수 있다 (C로 끝날 수 없음):
AGAATGT
GAGAATGT
TGAGAATGT
TTGAGAATGT
GTTGAGAATGT
TGTTGAGAATGT
TTGTTGAGAATGT
ATTGTTGAGAATGT
TATTGTTGAGAATGT
TTATTGTTGAGAATGT
ATTATTGTTGAGAATGT
AATTATTGTTGAGAATGT
TAATTATTGTTGAGAATGT
ATAATTATTGTTGAGAATGT.
닉킹 주형은 하기일 수 있다:
CCTGTGGTCACAGTTCTTGG
CCACAGGGCAGGGCAGCCAC.
PEgRNA 3
APOL1 대립유전자 rs71785313에 대한 PEgRNA의 설계. 이는 다음과 같은 삽입물을 나타낸다: ATTCTCAACAA[삽입물: TAATTA]TAAGATTC.
프로토스페이서는 TCTCAACAATAAGATTCTGC일 수 있다.
PE는 SaKKH-PE2를 포함한다.
프라이머 결합 부위는 하기일 수 있다:
TTCTCAAC
ATTCTCAAC
CATTCTCAAC
ACATTCTCAAC
AACATTCTCAAC
AAACATTCTCAAC
TAAACATTCTCAAC
CTAAACATTCTCAAC
GCTAAACATTCTCAAC
AGCTAAACATTCTCAAC.
RT 주형은 하기일 수 있다:
AATCTTATAATTATT
GAATCTTATAATTATT
AGAATCTTATAATTATT
CAGAATCTTATAATTATT
GCAGAATCTTATAATTATT
TGCAGAATCTTATAATTATT
CTGCAGAATCTTATAATTATT
CCTGCAGAATCTTATAATTATT
GCCTGCAGAATCTTATAATTATT
CGCCTGCAGAATCTTATAATTATT
CCGCCTGCAGAATCTTATAATTATT
TCCGCCTGCAGAATCTTATAATTATT
GTCCGCCTGCAGAATCTTATAATTATT
GGTCCGCCTGCAGAATCTTATAATTATT.
닉킹 주형은 하기일 수 있다:
CCTGTGGTCACAGTTCTTGG
CCACAGGGCAGGGCAGCCAC.
본 개시내용 전반에 걸쳐 언급된 다른 참고문헌
하기 참고문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00531
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실시양태
하기 실시양태는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 추가로, 본 개시내용은 열거된 실시양태 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항 및 서술적 용어를 본 섹션에서의 또 다른 열거된 실시양태에 도입하는 이들 실시양태의 모든 변형, 조합 및 순열을 포괄한다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에 종속하는 임의의 열거된 실시양태는 동일한 기본 실시양태에 종속하는 본 섹션에서의 임의의 다른 열거된 실시양태에서 발견된 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로서, 예를 들어 마쿠쉬 군 포맷으로 제시되는 경우에, 요소의 각각의 하위군이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)는 군으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용 또는 본 개시내용의 측면이 특정한 요소 및/또는 특색을 포함하는 것으로 언급되는 경우에, 본 발명의 특정 실시양태 또는 본 발명의 특정 측면은 이러한 요소 및/또는 특색으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적인 것으로 의도되고, 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 것이 주목된다. 범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 추가로, 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로서 표현된 값은 본 발명의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 구체적 값 또는 하위-범위를, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 그러한 범위의 하한치 단위의 1/10까지 가정할 수 있다.
군 1. 실시양태 1-212
1. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질.
2. 실시양태 1에 있어서, 연장된 가이드 RNA의 존재 하에 표적-프라이밍된 역전사에 의해 게놈 편집을 수행할 수 있는 융합 단백질.
3. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
4. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 융합 단백질.
5. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
6. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
7. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9, CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2C3 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
8. 실시양태 1에 있어서, 연장된 가이드 RNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 융합 단백질.
9. 실시양태 8에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
10. 실시양태 8에 있어서, 연장된 가이드 RNA에 복합체화된 융합 단백질의 결합이 R-루프를 형성하는 것인 융합 단백질.
11. 실시양태 10에 있어서, R-루프가 (i) 연장된 가이드 RNA 및 표적 가닥을 포함하는 RNA-DNA 하이브리드 및 (ii) 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
12. 실시양태 11에 있어서, 상보적 비-표적 가닥이 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 리버스 트랜스크립타제 프라이밍 서열을 형성하는 것인 융합 단백질.
13. 실시양태 2에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 (a) 가이드 RNA 및 (b) 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하는 것인 융합 단백질.
14. 실시양태 13에 있어서, RNA 연장부가 (i) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 역전사 주형 서열, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
15. 실시양태 14에 있어서, 역전사 주형 서열이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 융합 단백질.
16. 실시양태 13에 있어서, RNA 연장부가 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 융합 단백질.
17. 실시양태 15에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 혼성화함으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 것인 융합 단백질.
18. 실시양태 15에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접하고 유리 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열을 대체하는 것인 융합 단백질.
19. 실시양태 18에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 세포에 의해 절제되는 것인 융합 단백질.
20. 실시양태 18에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 융합 단백질.
21. 실시양태 14에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 PAM 서열의 약 -4 내지 +10 또는 PAM 서열의 약 -10 내지 +20 또는 PAM 서열의 약 -20 내지 +40 또는 PAM 서열의 약 -30 내지 +100인 편집 윈도우에 설치되거나, 또는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 닉 부위의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 뉴클레오티드 하류에 설치되는 것인 융합 단백질.
22. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
23. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
24. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 11-17의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 융합 단백질.
25. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 11-17 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
26. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
27. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 구조 NH2-[napDNAbp]-[리버스 트랜스크립타제]-COOH; 또는 NH2-[리버스 트랜스크립타제]-[napDNAbp]-COOH를 포함하며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타내는 것인 융합 단백질.
28. 실시양태 27에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 37-47의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
29. 실시양태 14에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실인 융합 단백질.
30. 실시양태 29에 있어서, 삽입 또는 결실이 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 31개, 적어도 32개, 적어도 33개, 적어도 34개, 적어도 35개, 적어도 36개, 적어도 37개, 적어도 38개, 적어도 39개, 적어도 40개, 적어도 41개, 적어도 42개, 적어도 43개, 적어도 44개, 적어도 45개, 적어도 46개, 적어도 47개, 적어도 48개, 적어도 49개 또는 적어도 50개인 융합 단백질.
31. 가이드 RNA 및 적어도 1개의 RNA 연장부를 포함하는 연장된 가이드 RNA.
32. 실시양태 1에 있어서, RNA 연장부가 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하는 것인 연장된 가이드 RNA.
33. 실시양태 31에 있어서, napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 연장된 가이드 RNA.
34. 실시양태 33에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 연장된 가이드 RNA.
35. 실시양태 31에 있어서, 적어도 1개의 RNA 연장부가 (i) 역전사 주형 서열, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함하는 것인 연장된 가이드 RNA.
36. 실시양태 35에 있어서, RNA 연장부가 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
37. 실시양태 35에 있어서, 역전사 주형 서열이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
38. 실시양태 35에 있어서, 역전사 프라이머 결합 부위 서열이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
39. 실시양태 35에 있어서, 임의적인 링커 서열이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
40. 실시양태 35에 있어서, 역전사 주형 서열이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 연장된 가이드 RNA.
41. 실시양태 40에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하며, 여기서 내인성 단일 가닥 DNA는 닉 부위의 하류에 바로 인접한 것인 연장된 가이드 RNA.
42. 실시양태 41에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 연장된 가이드 RNA.
43. 실시양태 41에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 연장된 가이드 RNA.
44. 실시양태 31에 있어서, 서열식별번호: 18-36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 18-36 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 연장된 가이드 RNA.
45. 실시양태 35에 있어서, 역전사 주형 서열이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 연장된 가이드 RNA.
46. 실시양태 35에 있어서, 역전사 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 연장된 가이드 RNA.
47. 실시양태 35에 있어서, 임의적인 링커 서열이 적어도 1개 뉴클레오티드 또는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
48. 실시양태 1-30 중 어느 하나의 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체.
49. 실시양태 48에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하는 것인 복합체.
50. 실시양태 48에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
51. 실시양태 50에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
52. 실시양태 49에 있어서, 적어도 1개의 RNA 연장부가 (i) 역전사 주형 서열, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함하는 것인 복합체.
53. 실시양태 48에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 서열식별번호: 18-36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 18-36 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
54. 실시양태 52에 있어서, 역전사 주형 서열이 내인성 DNA 표적과 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
55. 실시양태 52에 있어서, 역전사 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
56. napDNAbp 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체.
57. 실시양태 56에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제인 복합체.
58. 실시양태 56에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
59. 실시양태 57에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
60. 실시양태 57에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하는 것인 복합체.
61. 실시양태 57에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
62. 실시양태 61에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 스페이서 서열이 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
63. 실시양태 61에 있어서, RNA 연장부가 (i) 역전사 주형 서열, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함하는 것인 복합체.
64. 실시양태 57에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 서열식별번호: 18-36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 18-36 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
65. 실시양태 63에 있어서, 역전사 주형 서열이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
66. 실시양태 63에 있어서, 역전사 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
67. 실시양태 63에 있어서, 임의적인 링커 서열이 적어도 1개 뉴클레오티드 또는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 복합체.
68. 실시양태 1-30 중 어느 것의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
69. 실시양태 68의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
70. 실시양태 1-30 중 어느 것의 융합 단백질 및 융합 단백질의 napDNAbp에 결합된 연장된 가이드 RNA를 포함하는 세포.
71. 실시양태 48-67 중 어느 하나의 복합체를 포함하는 세포.
72. (i) 실시양태 1-30 중 어느 것의 융합 단백질, 실시양태 48-67의 복합체, 실시양태 68의 폴리뉴클레오티드 또는 실시양태 69의 벡터; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
73. (i) 실시양태 48-67의 복합체; (ii) 트랜스로 제공되는 리버스 트랜스크립타제; 및 (iii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
74. (i) 실시양태 1-30 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 및 (ii) (i)의 서열의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트.
75. (i) 이중 가닥 DNA 서열을 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하고, 연장된 가이드 RNA는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 역전사 주형 서열을 포함하는 것인 단계;
(ii) 이중 가닥 DNA 서열을 비-표적 가닥 상에서 닉킹함으로써, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
(iii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 역전사 주형 서열에 혼성화시킴으로써, 리버스 트랜스크립타제 도메인을 프라이밍하는 단계;
(iv) 3' 단부로부터 DNA의 가닥을 중합시킴으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 단계;
(v) 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 단계
를 포함하는, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
76. 실시양태 75에 있어서, (v) 대체하는 단계가 (i) 단일 가닥 DNA 플랩을 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥에 혼성화시켜 서열 미스매치를 생성하는 단계; (ii) 내인성 DNA 가닥을 절제하는 단계; 및 (iii) 미스매치를 복구시켜 DNA의 양쪽 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 목적하는 생성물을 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
77. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입인 방법.
78. 실시양태 77에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 방법.
79. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
80. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 방법.
81. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
82. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 방법.
83. 실시양태 82에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
84. 실시양태 82에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
85. 실시양태 76에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 기능상실 Cas9 (dCas9), Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 활성 Cas9인 방법.
86. 실시양태 76에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
87. 실시양태 76에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
88. 실시양태 76에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 11-17의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
89. 실시양태 76에 있어서, 리버스 트랜스크립타제 도메인이 서열식별번호: 11-17 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
90. 실시양태 76에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하며, 여기서 RNA 연장부는 역전사 주형 서열을 포함하는 것인 방법.
91. 실시양태 90에 있어서, RNA 연장부가 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 방법.
92. 실시양태 76에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 서열식별번호: 18-36으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
93. (i) DNA 분자를 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 napDNAbp를 표적 유전자좌로 표적화하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계이며, 여기서 가이드 RNA는 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열을 포함하는 것인 단계;
(ii) 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계;
(iii) 노출된 3' 단부를 RT 주형 서열에 혼성화시켜 역전사를 프라이밍하는 단계;
(iv) 리버스 트랜스크립타제에 의해 RT 주형 서열에 기초하여 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하는 단계;
(v) 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 상응하는 내인성 DNA 내로 혼입시킴으로써, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 단계
를 포함하는, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 적어도 1개의 변화를 도입하는 방법.
94. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전이를 포함하는 것인 방법.
95. 실시양태 94에 있어서, 전이가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
96. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전환을 포함하는 것인 방법.
97. 실시양태 96에 있어서, 전환이 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
98. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
99. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 방법.
100. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 질환-연관 유전자에 대한 교정을 포함하는 것인 방법.
101. 실시양태 100에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
102. 실시양태 100에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
103. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9 또는 그의 변이체인 방법.
104. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 그의 변이체인 방법.
105. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
106. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
107. 실시양태 93에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 트랜스로 도입되는 것인 방법.
108. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 리버스 트랜스크립타제에 대한 융합체를 포함하는 것인 방법.
109. 실시양태 93에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 11-17의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
110. 실시양태 93에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 11-17 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
111. 실시양태 93에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 뉴클레아제로 닉킹하는 것을 포함하는 것인 방법.
112. 실시양태 111에 있어서, 뉴클레아제가 napDNAbp이거나, napDNAbp의 융합 도메인으로서 제공되거나 또는 트랜스로 제공되는 것인 방법.
113. 실시양태 93에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 화학적 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
114. 실시양태 93에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 복제 오류를 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
115. 실시양태 93에 있어서, DNA 분자를 napDNAbp 및 가이드 RNA와 접촉시키는 단계가 R-루프를 형성하는 것인 방법.
116. 실시양태 115에 있어서, 노출된 3' 단부가 형성되는 DNA 가닥이 R-루프에 있는 것인 방법.
117. 실시양태 93에 있어서, 가이드 RNA가 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열을 포함하는 연장된 부분을 포함하는 것인 방법.
118. 실시양태 117에 있어서, 연장된 부분이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 있는 것인 방법.
119. 실시양태 93에 있어서, 가이드 RNA가 프라이머 결합 부위를 추가로 포함하는 것인 방법.
120. 실시양태 93에 있어서, 가이드 RNA가 스페이서 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
121. 실시양태 93에 있어서, RT 주형 서열이 상응하는 내인성 DNA에 상동인 방법.
122. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법.
123. 실시양태 122에 있어서, RT 주형이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하는 것인 방법.
124. 실시양태 122에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 전이, 전환, 삽입 또는 결실 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
125. 제122항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 전이를 포함하는 것인 방법.
126. 제122항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 전환을 포함하는 것인 방법.
127. 실시양태 122에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
128. 실시양태 31-47 중 어느 하나의 연장된 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
129. 실시양태 128의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
130. 실시양태 129의 벡터를 포함하는 세포.
131. 실시양태 1-30 중 어느 하나에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 오류-유발 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
132. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 오류-유발 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 돌연변이유발된 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 돌연변이유발된 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 돌연변이유발하는 방법.
133. 실시양태 132에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
134. 실시양태 132에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
135. 실시양태 132에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
136. 실시양태 132에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
137. 실시양태 132에 있어서, (b) 표적-프라이밍된 역전사를 수행하는 단계가 가이드 RNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링함으로써 역전사를 프라이밍할 수 있는 3' 단부 프라이머 결합 서열을 표적 유전자좌에서 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
138. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 대체 서열을 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 대체 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적 DNA 분자에서 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이를 건강한 수의 반복 트리뉴클레오티드를 포함하는 건강한 서열로 대체하는 방법.
139. 실시양태 138에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
140. 실시양태 138에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
141. 실시양태 138에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
142. 실시양태 138에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
143. 실시양태 138에 있어서, (b) 표적-프라이밍된 역전사를 수행하는 단계가 가이드 RNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링함으로써 역전사를 프라이밍할 수 있는 3' 단부 프라이머 결합 서열을 표적 유전자좌에서 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
144. 실시양태 138에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 헌팅톤병, 유약 X 증후군 또는 프리드라이히 운동실조와 연관된 것인 방법.
145. 실시양태 138에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 CAG 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
146. 실시양태 138에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 GAA 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
147. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 기능적 모이어티를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 기능적 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 기능적 모이어티를 설치하는 방법.
148. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 펩티드 태그인 방법.
149. 실시양태 148에 있어서, 펩티드 태그가 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 에피토프 태그 또는 형광 태그인 방법.
150. 실시양태 148에 있어서, 펩티드 태그가 아비태그 (서열식별번호: 245); C-태그 (서열식별번호: 246); 칼모듈린-태그 (서열식별번호: 247); 폴리글루타메이트 태그 (서열식별번호: 248); E-태그 (서열식별번호: 249); FLAG-태그 (서열식별번호: 250); HA-태그 (서열식별번호: 251); His-태그 (서열식별번호: 252-262); Myc-태그 (서열식별번호: 263); NE-태그 (서열식별번호: 264); Rho1D4-태그 (서열식별번호: 265); S-태그 (서열식별번호: 266); SBP-태그 (서열식별번호: 267); 소프태그-1 (서열식별번호: 268); 소프태그-2 (서열식별번호: 269); 스폿-태그 (서열식별번호: 270); 스트렙-태그 (서열식별번호: 271); TC 태그 (서열식별번호: 272); Ty 태그 (서열식별번호: 273); V5 태그 (서열식별번호: 274); VSV-태그 (서열식별번호: 275); 및 엑스프레스 태그 (서열식별번호: 276)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
151. 실시양태 148에 있어서, 펩티드 태그가 AU1 에피토프 (서열식별번호: 278); AU5 에피토프 (서열식별번호: 279); 박테리오파지 T7 에피토프 (T7-태그) (서열식별번호: 280); 블루텅 바이러스 태그 (B-태그) (서열식별번호: 281); E2 에피토프 (서열식별번호: 282); 히스티딘 친화성 태그 (HAT) (서열식별번호: 283); HSV 에피토프 (서열식별번호: 284); 폴리아르기닌 (Arg-태그) (서열식별번호: 285); 폴리아스파르테이트 (Asp-태그) (서열식별번호: 286); 폴리페닐알라닌 (Phe-태그) (서열식별번호: 287); S1-태그 (서열식별번호: 288); S-태그 (서열식별번호: 289); 및 VSV-G (서열식별번호: 290)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
152. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 이뮤노에피토프인 방법.
153. 실시양태 152에 있어서, 이뮤노에피토프가 파상풍 톡소이드 (서열식별번호: 396); 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197 (서열식별번호: 398); 볼거리 이뮤노에피토프 1 (서열식별번호: 400); 볼거리 이뮤노에피토프 2 (서열식별번호: 402); 볼거리 이뮤노에피토프 3 (서열식별번호: 404); 풍진 바이러스 (서열식별번호: 406); 헤마글루티닌 (서열식별번호: 408); 뉴라미니다제 (서열식별번호: 410); TAP1 (서열식별번호: 412); TAP2 (서열식별번호: 414); 부류 I HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 416); 부류 I HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 418); 부류 II HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 420); 부류 II HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 422); 헤마글루티닌 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 424); 뉴라미니다제 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 426)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
154. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 국재화를 변경시키는 것인 방법.
155. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 분해율이 변경되도록 하는 분해 태그인 방법.
156. 실시양태 155에 있어서, 분해 태그인 방법.
157. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 소분자 결합 도메인인 방법.
158. 실시양태 157에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 488의 FKBP12인 방법.
159. 실시양태 157에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 489의 FKBP12-F36V인 방법.
160. 실시양태 157에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 492-494의 시클로필린인 방법.
161. 실시양태 157에 있어서, 소분자 결합 도메인이 2종 이상의 관심 단백질에 설치되는 것인 방법.
162. 실시양태 161에 있어서, 2종 이상의 관심 단백질이 소분자와 접촉시 이량체화될 수 있는 것인 방법.
163. 실시양태 157에 있어서, 소분자가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자의 이량체인 방법:
Figure pct00547
Figure pct00548
164. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 이뮤노에피토프를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 이뮤노에피토프를 설치하는 방법.
165. 실시양태 164에 있어서, 이뮤노에피토프가 파상풍 톡소이드 (서열식별번호: 396); 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197 (서열식별번호: 398); 볼거리 이뮤노에피토프 1 (서열식별번호: 400); 볼거리 이뮤노에피토프 2 (서열식별번호: 402); 볼거리 이뮤노에피토프 3 (서열식별번호: 404); 풍진 바이러스 (서열식별번호: 406); 헤마글루티닌 (서열식별번호: 408); 뉴라미니다제 (서열식별번호: 410); TAP1 (서열식별번호: 412); TAP2 (서열식별번호: 414); 부류 I HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 416); 부류 I HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 418); 부류 II HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 420); 부류 II HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 422); 헤마글루티닌 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 424); 뉴라미니다제 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 426)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
166. 실시양태 164에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
167. 실시양태 164에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
168. 실시양태 164에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
169. 실시양태 164에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
170. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 소분자 이량체화 도메인을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 소분자 이량체화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 소분자 이량체화 도메인을 설치하는 방법.
171. 실시양태 170에 있어서, 방법을 제2 관심 단백질에 대해 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
172. 실시양태 171에 있어서, 제1 관심 단백질 및 제2 관심 단백질이 각각의 상기 단백질 상의 이량체화 도메인에 결합하는 소분자의 존재 하에 이량체화되는 것인 방법.
173. 실시양태 170에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 488의 FKBP12인 방법.
174. 실시양태 170에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 489의 FKBP12-F36V인 방법.
175. 실시양태 170에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 492-494의 시클로필린인 방법.
176. 실시양태 170에 있어서, 소분자가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자의 이량체인 방법:
Figure pct00549
Figure pct00550
Figure pct00551
177. 실시양태 170에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
178. 실시양태 170에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
179. 실시양태 170에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
180. 실시양태 170에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
181. 단백질을 코딩하는 표적 뉴클레오티드 서열을, 펩티드 태그를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열이 안에 삽입되도록 구성된 프라임 편집제 구축물과 접촉시켜 재조합 뉴클레오티드 서열을 생성함으로써, 재조합 뉴클레오티드 서열로부터 펩티드 태그 및 단백질이 융합 단백질로서 발현되도록 하는 것을 포함하는, 프라임 편집을 사용하여 단백질 상에 펩티드 태그 또는 에피토프를 설치하는 방법.
182. 실시양태 181에 있어서, 펩티드 태그가 단백질의 정제 및/또는 검출에 사용되는 것인 방법.
183. 실시양태 181에 있어서, 펩티드 태그가 폴리-히스티딘 (예를 들어, HHHHHH), FLAG (예를 들어, DYKDDDDK), V5 (예를 들어, GKPIPNPLLGLDST), GCN4, HA (예를 들어, YPYDVPDYA), Myc (예를 들어, EQKLISEED), GST....등인 방법.
184. 실시양태 181에 있어서, 펩티드 태그가 서열식별번호: 245-290으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
185. 실시양태 181에 있어서, 펩티드 태그가 링커에 의해 단백질에 융합되는 것인 방법.
186. 실시양태 181에 있어서, 융합 단백질이 하기 구조: [단백질]-[펩티드 태그] 또는 [펩티드 태그]-[단백질]을 가지며, 여기서 "]-["는 임의적인 링커를 나타내는 것인 방법.
187. 실시양태 181에 있어서, 링커가 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
188. 실시양태 181에 있어서, 프라임 편집제 구축물이 서열식별번호: 18-25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PEgRNA를 포함하는 것인 방법.
189. 실시양태 181에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
190. 실시양태 181에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
191. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 보호 돌연변이를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 보호 돌연변이를 포함하고 미스폴딩에 대해 저항성인 PRNP를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 PRNP 내로 1개 이상의 보호 돌연변이를 설치함으로써 프리온 질환의 진행을 예방하거나 정지시키는 방법.
192. 실시양태 191에 있어서, 프리온 질환이 인간 프리온 질환인 방법.
193. 실시양태 191에 있어서, 프리온 질환이 동물 프리온 질환인 방법.
194. 실시양태 192에 있어서, 프리온 질환이 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 치명적 가족성 불면증 또는 쿠루병인 방법.
195. 실시양태 193에 있어서, 프리온 질환이 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 "광우병"), 만성 소모성 질환 (CWD), 스크래피, 전염성 밍크 뇌병증, 고양이 해면상 뇌병증 및 유제류 해면상 뇌병증인 방법.
196. 실시양태 191에 있어서, 야생형 PRNP 아미노산 서열이 서열식별번호: 291-292인 방법.
197. 실시양태 191에 있어서, 서열식별번호: 293-323으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 PRNP 아미노산 서열을 생성하며, 여기서 상기 변형된 PRNP 단백질은 미스폴딩에 대해 저항성인 방법.
198. 실시양태 191에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
199. 실시양태 191에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
200. 실시양태 191에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
201. 실시양태 191에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
202. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 포함하는 변형된 관심 RNA를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 RNA에 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 설치하는 방법.
203. 실시양태 202에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 검출 모이어티인 방법.
204. 실시양태 202에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 발현 수준에 영향을 미치는 것인 방법.
205. 실시양태 202에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 수송 또는 세포하 위치에 영향을 미치는 것인 방법.
206. 실시양태 202에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 SV40 유형 1, SV40 유형 2, SV40 유형 3, hGH, BGH, rbGlob, TK, MALAT1 ENE-mascRNA, KSHV PAN ENE, Smbox/U1 snRNA 박스, U1 snRNA 3' 박스, tRNA-리신, 브로콜리 압타머, 스피니치 압타머, 망고 압타머, HDV 리보자임 및 m6A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
207. 실시양태 202에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 18-25를 포함하는 것인 방법.
208. 실시양태 202에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
209. 실시양태 202에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
210. 실시양태 202에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
211. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하고, 관심 단백질 및 기능적 모이어티 또는 그의 제거를 포함하는 변형된 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하며, 여기서 기능적 모이어티는 단백질의 변형 상태 또는 국재화 상태를 변경시키는 것인, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 기능적 모이어티를 설치하거나 결실시키는 방법.
212. 실시양태 211에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 인산화, 유비퀴틸화, 글리코실화, 지질화, 히드록실화, 메틸화, 아세틸화, 크로토닐화, SUMO화 상태를 변경시키는 것인 방법.
군 2. 실시양태 213-424
213. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 융합 단백질.
214. 실시양태 213에 있어서, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 존재 하에 프라임 편집을 수행할 수 있는 융합 단백질.
215. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
216. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 융합 단백질.
217. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
218. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
219. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
220. 실시양태 213에 있어서, PEgRNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 융합 단백질.
221. 실시양태 220에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
222. 실시양태 220에 있어서, PEgRNA에 복합체화된 융합 단백질의 결합이 R-루프를 형성하는 것인 융합 단백질.
223. 실시양태 222에 있어서, R-루프가 (i) PEgRNA 및 표적 가닥을 포함하는 RNA-DNA 하이브리드 및 (ii) 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
224. 실시양태 223에 있어서, 상보적 비-표적 가닥이 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 프라이밍 서열을 형성하는 것인 융합 단백질.
225. 실시양태 214에 있어서, PEgRNA가 (a) 가이드 RNA 및 (b) 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장 아암을 포함하는 것인 융합 단백질.
226. 실시양태 225에 있어서, 연장 아암이 (i) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형 서열 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 융합 단백질.
227. 실시양태 226에 있어서, DNA 합성 주형 서열이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 융합 단백질.
228. 실시양태 225에 있어서, 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 융합 단백질.
229. 실시양태 227에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열과 혼성화함으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 것인 융합 단백질.
230. 실시양태 227에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접하고 유리 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열을 대체하는 것인 융합 단백질.
231. 실시양태 230에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 세포에 의해 절제되는 것인 융합 단백질.
232. 실시양태 230에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 융합 단백질.
233. 실시양태 226에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 PAM 서열의 약 -4 내지 +10 또는 PAM 서열의 약 -10 내지 +20 또는 PAM 서열의 약 -20 내지 +40 또는 PAM 서열의 약 -30 내지 +100인 편집 윈도우에 설치되거나, 또는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 닉 부위의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 뉴클레오티드 하류에 설치되는 것인 융합 단백질.
234. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
235. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
236. 실시양태 213에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 11-17의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
237. 실시양태 213에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 11-17 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
238. 실시양태 213에 있어서, 폴리머라제가 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
239. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 구조 NH2-[napDNAbp]-[폴리머라제]-COOH; 또는 NH2-[폴리머라제]-[napDNAbp]-COOH를 포함하며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타내는 것인 융합 단백질.
240. 실시양태 239에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 37-47의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
241. 실시양태 226에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실인 융합 단백질.
242. 실시양태 241에 있어서, 삽입 또는 결실이 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 31개, 적어도 32개, 적어도 33개, 적어도 34개, 적어도 35개, 적어도 36개, 적어도 37개, 적어도 38개, 적어도 39개, 적어도 40개, 적어도 41개, 적어도 42개, 적어도 43개, 적어도 44개, 적어도 45개, 적어도 46개, 적어도 47개, 적어도 48개, 적어도 49개 또는 적어도 50개인 융합 단백질.
243. 가이드 RNA 및 DNA 합성 주형을 포함하는 적어도 1개의 핵산 연장 아암을 포함하는 PEgRNA.
244. 실시양태 241에 있어서, 핵산 연장 아암이 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하고, 핵산 연장 아암이 DNA 또는 RNA인 PEgRNA.
245. 실시양태 242에 있어서, napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 PEgRNA.
246. 실시양태 245에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 PEgRNA.
247. 실시양태 243에 있어서, 적어도 1개의 핵산 연장 아암이 (i) DNA 합성 주형 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 PEgRNA.
248. 실시양태 247에 있어서, 핵산 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 PEgRNA.
249. 실시양태 247에 있어서, DNA 합성 주형이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 PEgRNA.
250. 실시양태 247에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 PEgRNA.
251. 실시양태 243에 있어서, 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 PEgRNA.
252. 실시양태 247에 있어서, DNA 합성 주형이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 PEgRNA.
253. 실시양태 252에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하며, 여기서 내인성 단일 가닥 DNA는 닉 부위의 하류에 바로 인접한 것인 PEgRNA.
254. 실시양태 253에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 PEgRNA.
255. 실시양태 253에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 PEgRNA.
256. 실시양태 243에 있어서, 서열식별번호: 18-36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 18-36 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PEgRNA.
257. 실시양태 247에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 PEgRNA.
258. 실시양태 247에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 PEgRNA.
259. 실시양태 251에 있어서, 적어도 1개의 추가의 구조가 PEgRNA의 3' 또는 5' 단부에 위치하는 것인 PEgRNA.
260. 실시양태 213-242 중 어느 하나의 융합 단백질 및 PEgRNA를 포함하는 복합체.
261. 실시양태 260에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 핵산 연장 아암을 포함하는 것인 복합체.
262. 실시양태 260에 있어서, PEgRNA가 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
263. 실시양태 262에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
264. 실시양태 261에 있어서, 적어도 1개의 핵산 연장 아암이 (i) DNA 합성 주형 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 복합체.
265. 실시양태 260에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 18-36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 18-36 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
266. 실시양태 264에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
267. 실시양태 264에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
268. napDNAbp 및 PEgRNA를 포함하는 복합체.
269. 실시양태 268에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제인 복합체.
270. 실시양태 268에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
271. 실시양태 268에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
272. 실시양태 268에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 핵산 연장 아암을 포함하는 것인 복합체.
273. 실시양태 268에 있어서, PEgRNA가 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
274. 실시양태 272에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, PEgRNA의 스페이서 서열이 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
275. 실시양태 273에 있어서, 핵산 연장 아암이 (i) DNA 합성 주형 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 복합체.
276. 실시양태 269에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 18-36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 18-36 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
277. 실시양태 276에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
278. 실시양태 276에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
279. 실시양태 276에 있어서, PEgRNA가 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 것인 복합체.
280. 실시양태 213-242 중 어느 것의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
281. 실시양태 280의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
282. 실시양태 213-242 중 어느 것의 융합 단백질 및 융합 단백질의 napDNAbp에 결합된 PEgRNA를 포함하는 세포.
283. 실시양태 260-279 중 어느 하나의 복합체를 포함하는 세포.
284. (i) 실시양태 213-242 중 어느 것의 융합 단백질, 실시양태 260-279의 복합체, 실시양태 68의 폴리뉴클레오티드 또는 실시양태 69의 벡터; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
285. (i) 실시양태 260-279의 복합체; (ii) 트랜스로 제공되는 폴리머라제; 및 (iii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
286. (i) 실시양태 213-242 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 및 (ii) (i)의 서열의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트.
287. (i) 이중 가닥 DNA 서열을 융합 단백질 및 PEgRNA를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 폴리머라제를 포함하고, PEgRNA는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 단계;
(ii) 이중 가닥 DNA 서열을 닉킹함으로써, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
(iii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, 폴리머라제를 프라이밍하는 단계;
(iv) 프라이머 결합 부위에 혼성화된 3' 단부로부터 DNA 가닥을 중합시킴으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하고 DNA 합성 주형에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 단계;
(v) 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 단계
를 포함하는, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
288. 실시양태 287에 있어서, (v) 대체하는 단계가 (i) 단일 가닥 DNA 플랩을 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥에 혼성화시켜 서열 미스매치를 생성하는 단계; (ii) 내인성 DNA 가닥을 절제하는 단계; 및 (iii) 미스매치를 복구시켜 DNA의 양쪽 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 목적하는 생성물을 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
289. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입인 방법.
290. 실시양태 289에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 방법.
291. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
292. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 방법.
293. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
294. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 방법.
295. 실시양태 294에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 트리뉴클레오티드 반복 장애; 프리온 질환; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
296. 실시양태 294에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
297. 실시양태 287에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 기능상실 Cas9 (dCas9), Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 활성 Cas9인 방법.
298. 실시양태 287에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
299. 실시양태 287에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
300. 실시양태 287에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 11-17의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 방법.
301. 실시양태 287에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 11-17 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 방법.
302. 실시양태 287에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 분자내 위치에 핵산 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 DNA 합성 주형 서열 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 방법.
303. 실시양태 302에 있어서, 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 방법.
304. 실시양태 287에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 18-36으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
305. (i) DNA 분자를 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 napDNAbp를 표적 유전자좌로 표적화하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계이며, 여기서 PEgRNA는 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 단계;
(ii) 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계;
(iii) 노출된 3' 단부를 프라이머 결합 부위에 혼성화시켜 역전사를 프라이밍하는 단계;
(iv) 리버스 트랜스크립타제에 의해 RT 주형 서열에 기초하여 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하는 단계;
(v) 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 상응하는 내인성 DNA 내로 혼입시킴으로써, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 단계
를 포함하는, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 적어도 1개의 변화를 도입하는 방법.
306. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전이를 포함하는 것인 방법.
307. 실시양태 306에 있어서, 전이가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
308. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전환을 포함하는 것인 방법.
309. 실시양태 308에 있어서, 전환이 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
310. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (9) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
311. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 방법.
312. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 질환-연관 유전자에 대한 교정을 포함하는 것인 방법.
313. 실시양태 312에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 트리뉴클레오티드 반복 장애; 프리온 질환; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
314. 실시양태 312에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
315. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9 또는 그의 변이체인 방법.
316. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 그의 변이체인 방법.
317. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
318. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
319. 실시양태 305에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 트랜스로 도입되는 것인 방법.
320. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 리버스 트랜스크립타제에 대한 융합체를 포함하는 것인 방법.
321. 실시양태 305에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 11-17의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
322. 실시양태 305에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 11-17 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
323. 실시양태 305에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 뉴클레아제로 닉킹하는 것을 포함하는 것인 방법.
324. 실시양태 323에 있어서, 뉴클레아제가 트랜스로 제공되는 것인 방법.
325. 실시양태 305에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 화학적 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
326. 실시양태 305에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 복제 오류를 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
327. 실시양태 305에 있어서, DNA 분자를 napDNAbp 및 가이드 RNA와 접촉시키는 단계가 R-루프를 형성하는 것인 방법.
328. 실시양태 327에 있어서, 노출된 3' 단부가 형성되는 DNA 가닥이 R-루프에 있는 것인 방법.
329. 실시양태 315에 있어서, PEgRNA가 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 연장 아암을 포함하는 것인 방법.
330. 실시양태 329에 있어서, 연장 아암이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 있는 것인 방법.
331. 실시양태 305에 있어서, PEgRNA가 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 것인 방법.
332. 실시양태 305에 있어서, PEgRNA가 상동성 아암을 추가로 포함하는 것인 방법.
333. 실시양태 305에 있어서, RT 주형 서열이 상응하는 내인성 DNA에 상동인 방법.
334. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법.
335. 실시양태 334에 있어서, RT 주형이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하는 것인 방법.
336. 실시양태 334에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 전이, 전환, 삽입 또는 결실 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
337. 실시양태 334에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 전이를 포함하는 것인 방법.
338. 제334항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 전환을 포함하는 것인 방법.
339. 실시양태 334에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
340. 실시양태 243-259 중 어느 하나의 PEgRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
341. 실시양태 340의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
342. 실시양태 341의 벡터를 포함하는 세포.
343. 실시양태 213에 있어서, 폴리머라제가 오류-유발 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
344. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 오류-유발 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 돌연변이유발된 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 돌연변이유발된 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 돌연변이유발하는 방법.
345. 임의의 상기 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
346. 임의의 상기 실시양태에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
347. 실시양태 344에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
348. 실시양태 344에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 26-36을 포함하는 것인 방법.
349. 실시양태 344에 있어서, (b) 표적-프라이밍된 역전사를 수행하는 단계가 가이드 RNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링함으로써 역전사를 프라이밍할 수 있는 3' 단부 프라이머 결합 서열을 표적 유전자좌에서 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
350. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 대체 서열을 포함하는 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 프라임 편집을 수행하여 대체 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적 DNA 분자에서 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이를 건강한 수의 반복 트리뉴클레오티드를 포함하는 건강한 서열로 대체하는 방법.
351. 실시양태 350에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
352. 실시양태 350에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
353. 실시양태 350에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
354. 실시양태 350에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 26-36을 포함하는 것인 방법.
355. 실시양태 350에 있어서, (b) 프라임 편집을 수행하는 단계가 가이드 RNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링함으로써 폴리머라제를 프라이밍할 수 있는 3' 단부 프라이머 결합 서열을 표적 유전자좌에서 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
356. 실시양태 350에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 헌팅톤병, 유약 X 증후군 또는 프리드라이히 운동실조와 연관된 것인 방법.
357. 실시양태 350에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 CAG 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
358. 실시양태 350에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 GAA 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
359. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 DNA 합성 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 기능적 모이어티를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 기능적 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 기능적 모이어티를 설치하는 방법.
360. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 펩티드 태그인 방법.
361. 실시양태 360에 있어서, 펩티드 태그가 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 에피토프 또는 이뮤노에피토프 태그 또는 형광 태그인 방법.
362. 실시양태 360에 있어서, 펩티드 태그가 아비태그 (서열식별번호: 245); C-태그 (서열식별번호: 246); 칼모듈린-태그 (서열식별번호: 247); 폴리글루타메이트 태그 (서열식별번호: 248); E-태그 (서열식별번호: 249); FLAG-태그 (서열식별번호: 250); HA-태그 (서열식별번호: 251); His-태그 (서열식별번호: 252-262); Myc-태그 (서열식별번호: 263); NE-태그 (서열식별번호: 264); Rho1D4-태그 (서열식별번호: 265); S-태그 (서열식별번호: 266); SBP-태그 (서열식별번호: 267); 소프태그-1 (서열식별번호: 268); 소프태그-2 (서열식별번호: 269); 스폿-태그 (서열식별번호: 270); 스트렙-태그 (서열식별번호: 271); TC 태그 (서열식별번호: 272); Ty 태그 (서열식별번호: 273); V5 태그 (서열식별번호: 274); VSV-태그 (서열식별번호: 275); 및 엑스프레스 태그 (서열식별번호: 276)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
363. 실시양태 360에 있어서, 펩티드 태그가 AU1 에피토프 (서열식별번호: 278); AU5 에피토프 (서열식별번호: 279); 박테리오파지 T7 에피토프 (T7-태그) (서열식별번호: 280); 블루텅 바이러스 태그 (B-태그) (서열식별번호: 281); E2 에피토프 (서열식별번호: 282); 히스티딘 친화성 태그 (HAT) (서열식별번호: 283); HSV 에피토프 (서열식별번호: 284); 폴리아르기닌 (Arg-태그) (서열식별번호: 285); 폴리아스파르테이트 (Asp-태그) (서열식별번호: 286); 폴리페닐알라닌 (Phe-태그) (서열식별번호: 287); S1-태그 (서열식별번호: 288); S-태그 (서열식별번호: 289); 및 VSV-G (서열식별번호: 290)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
364. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 이뮤노에피토프인 방법.
365. 실시양태 364에 있어서, 이뮤노에피토프가 파상풍 톡소이드 (서열식별번호: 396); 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197 (서열식별번호: 398); 볼거리 이뮤노에피토프 1 (서열식별번호: 400); 볼거리 이뮤노에피토프 2 (서열식별번호: 402); 볼거리 이뮤노에피토프 3 (서열식별번호: 404); 풍진 바이러스 (서열식별번호: 406); 헤마글루티닌 (서열식별번호: 408); 뉴라미니다제 (서열식별번호: 410); TAP1 (서열식별번호: 412); TAP2 (서열식별번호: 414); 부류 I HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 416); 부류 I HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 418); 부류 II HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 420); 부류 II HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 422); 헤마글루티닌 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 424); 뉴라미니다제 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 426)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
366. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 국재화를 변경시키는 것인 방법.
367. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 분해율이 변경되도록 하는 분해 태그인 방법.
368. 실시양태 367에 있어서, 분해 태그가 태그부착된 단백질의 제거를 유발하는 것인 방법.
369. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 소분자 결합 도메인인 방법.
370. 실시양태 359에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 488의 FKBP12인 방법.
371. 실시양태 359에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 489의 FKBP12-F36V인 방법.
372. 실시양태 359에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 492-494의 시클로필린인 방법.
373. 실시양태 359에 있어서, 소분자 결합 도메인이 2종 이상의 관심 단백질에 설치되는 것인 방법.
374. 실시양태 373에 있어서, 2종 이상의 관심 단백질이 소분자와 접촉시 이량체화될 수 있는 것인 방법.
375. 실시양태 369에 있어서, 소분자가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자의 이량체인 방법:
Figure pct00552
Figure pct00553
Figure pct00554
376. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 이뮤노에피토프를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 이뮤노에피토프를 설치하는 방법.
377. 실시양태 376에 있어서, 이뮤노에피토프가 파상풍 톡소이드 (서열식별번호: 396); 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197 (서열식별번호: 398); 볼거리 이뮤노에피토프 1 (서열식별번호: 400); 볼거리 이뮤노에피토프 2 (서열식별번호: 402); 볼거리 이뮤노에피토프 3 (서열식별번호: 404); 풍진 바이러스 (서열식별번호: 406); 헤마글루티닌 (서열식별번호: 408); 뉴라미니다제 (서열식별번호: 410); TAP1 (서열식별번호: 412); TAP2 (서열식별번호: 414); 부류 I HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 416); 부류 I HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 418); 부류 II HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 420); 부류 II HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 422); 헤마글루티닌 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 424); 뉴라미니다제 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 426)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
378. 실시양태 376에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
379. 실시양태 376에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
380. 실시양태 376에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
381. 실시양태 376에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 26-36을 포함하는 것인 방법.
382. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 소분자 이량체화 도메인을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 소분자 이량체화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 소분자 이량체화 도메인을 설치하는 방법.
383. 실시양태 382에 있어서, 방법을 제2 관심 단백질에 대해 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
384. 실시양태 383에 있어서, 제1 관심 단백질 및 제2 관심 단백질이 각각의 상기 단백질 상의 이량체화 도메인에 결합하는 소분자의 존재 하에 이량체화되는 것인 방법.
385. 실시양태 382에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 488의 FKBP12인 방법.
386. 실시양태 382에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 489의 FKBP12-F36V인 방법.
387. 실시양태 382에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 492-494의 시클로필린인 방법.
388. 실시양태 382에 있어서, 소분자가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자의 이량체인 방법:
Figure pct00555
Figure pct00556
Figure pct00557
389. 실시양태 382에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
390. 실시양태 382에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
391. 실시양태 382에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
392. 실시양태 382에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 26-36을 포함하는 것인 방법.
393. 단백질을 코딩하는 표적 뉴클레오티드 서열을, 펩티드 태그를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열이 안에 삽입되도록 구성된 프라임 편집제 구축물과 접촉시켜 재조합 뉴클레오티드 서열을 생성함으로써, 재조합 뉴클레오티드 서열로부터 펩티드 태그 및 단백질이 융합 단백질로서 발현되도록 하는 것을 포함하는, 프라임 편집을 사용하여 단백질 상에 펩티드 태그 또는 에피토프를 설치하는 방법.
394. 실시양태 383에 있어서, 펩티드 태그가 단백질의 정제 및/또는 검출에 사용되는 것인 방법.
395. 실시양태 383에 있어서, 펩티드 태그가 폴리-히스티딘 (예를 들어, HHHHHH), FLAG (예를 들어, DYKDDDDK), V5 (예를 들어, GKPIPNPLLGLDST), GCN4, HA (예를 들어, YPYDVPDYA), Myc (예를 들어, EQKLISEED) 또는 GST인 방법.
396. 실시양태 383에 있어서, 펩티드 태그가 서열식별번호: 245-290으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
397. 실시양태 383에 있어서, 펩티드 태그가 링커에 의해 단백질에 융합되는 것인 방법.
398. 실시양태 383에 있어서, 융합 단백질이 하기 구조: [단백질]-[펩티드 태그] 또는 [펩티드 태그]-[단백질]을 가지며, 여기서 "]-["는 임의적인 링커를 나타내는 것인 방법.
399. 실시양태 383에 있어서, 링커가 서열식별번호: 37-47의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
400. 실시양태 383에 있어서, 프라임 편집제 구축물이 서열식별번호: 18-25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PEgRNA를 포함하는 것인 방법.
401. 실시양태 383에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
402. 실시양태 383에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
403. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 보호 돌연변이를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 보호 돌연변이를 포함하고 미스폴딩에 대해 저항성인 PRNP를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 PRNP 내로 1개 이상의 보호 돌연변이를 설치함으로써 프리온 질환의 진행을 예방하거나 정지시키는 방법.
404. 실시양태 403에 있어서, 프리온 질환이 인간 프리온 질환인 방법.
405. 실시양태 403에 있어서, 프리온 질환이 동물 프리온 질환인 방법.
406. 실시양태 404에 있어서, 프리온 질환이 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 치명적 가족성 불면증 또는 쿠루병인 방법.
407. 실시양태 403에 있어서, 프리온 질환이 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 "광우병"), 만성 소모성 질환 (CWD), 스크래피, 전염성 밍크 뇌병증, 고양이 해면상 뇌병증 및 유제류 해면상 뇌병증인 방법.
408. 실시양태 403에 있어서, 야생형 PRNP 아미노산 서열이 서열식별번호: 291-292인 방법.
409. 실시양태 403에 있어서, 서열식별번호: 293-323으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 PRNP 아미노산 서열을 생성하며, 여기서 상기 변형된 PRNP 단백질은 미스폴딩에 대해 저항성인 방법.
410. 실시양태 403에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
411. 실시양태 403에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
412. 실시양태 403에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
413. 실시양태 403에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 26-36을 포함하는 것인 방법.
414. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 포함하는 변형된 관심 RNA를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 RNA에 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 설치하는 방법.
415. 실시양태 414에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 검출 모이어티인 방법.
416. 실시양태 414에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 발현 수준에 영향을 미치는 것인 방법.
417. 실시양태 414에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 수송 또는 세포하 위치에 영향을 미치는 것인 방법.
418. 실시양태 414에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 SV40 유형 1, SV40 유형 2, SV40 유형 3, hGH, BGH, rbGlob, TK, MALAT1 ENE-mascRNA, KSHV PAN ENE, Smbox/U1 snRNA 박스, U1 snRNA 3' 박스, tRNA-리신, 브로콜리 압타머, 스피니치 압타머, 망고 압타머, HDV 리보자임 및 m6A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
419. 실시양태 414에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 18-25를 포함하는 것인 방법.
420. 실시양태 414에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
421. 실시양태 414에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
422. 실시양태 414에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
423. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하고, 관심 단백질 및 기능적 모이어티 또는 그의 제거를 포함하는 변형된 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하며, 여기서 기능적 모이어티는 단백질의 변형 상태 또는 국재화 상태를 변경시키는 것인, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 기능적 모이어티를 설치하거나 결실시키는 방법.
424. 실시양태 423에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 인산화, 유비퀴틸화, 글리코실화, 지질화, 히드록실화, 메틸화, 아세틸화, 크로토닐화, SUMO화 상태를 변경시키는 것인 방법.
군 A. 융합 단백질, 가이드 및 방법
실시양태 1. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 연장된 가이드 RNA의 존재 하에 표적-프라이밍된 역전사에 의해 게놈 편집을 수행할 수 있는 융합 단백질.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
실시양태 4. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 융합 단백질.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
실시양태 6. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
실시양태 7. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9, CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2C3 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, 연장된 가이드 RNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 융합 단백질.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 10. 실시양태 8에 있어서, 연장된 가이드 RNA에 복합체화된 융합 단백질의 결합이 R-루프를 형성하는 것인 융합 단백질.
실시양태 11. 실시양태 10에 있어서, R-루프가 (i) 연장된 가이드 RNA 및 표적 가닥을 포함하는 RNA-DNA 하이브리드 및 (ii) 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 상보적 비-표적 가닥이 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 리버스 트랜스크립타제 프라이밍 서열을 형성하는 것인 융합 단백질.
실시양태 13. 실시양태 2에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 (a) 가이드 RNA 및 (b) 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, RNA 연장부가 (i) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 역전사 주형 서열, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 역전사 주형 서열이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 16. 실시양태 13에 있어서, RNA 연장부가 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 융합 단백질.
실시양태 17. 실시양태 15에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 혼성화함으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 것인 융합 단백질.
실시양태 18. 실시양태 15에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접하고 유리 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열을 대체하는 것인 융합 단백질.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 세포에 의해 절제되는 것인 융합 단백질.
실시양태 20. 실시양태 18에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 융합 단백질.
실시양태 21. 실시양태 14에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 PAM 서열의 약 -4 내지 +10 또는 PAM 서열의 약 -10 내지 +20 또는 PAM 서열의 약 -20 내지 +40 또는 PAM 서열의 약 -30 내지 +100인 편집 윈도우에 설치되거나, 또는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 닉 부위의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 뉴클레오티드 하류에 설치되는 것인 융합 단백질.
실시양태 22. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 23. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 24. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 25. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 26. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
실시양태 27. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 구조 NH2-[napDNAbp]-[리버스 트랜스크립타제]-COOH; 또는 NH2-[리버스 트랜스크립타제]-[napDNAbp]-COOH를 포함하며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타내는 것인 융합 단백질.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 29. 실시양태 14에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실인 융합 단백질.
실시양태 30. 실시양태 29에 있어서, 삽입 또는 결실이 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 31개, 적어도 32개, 적어도 33개, 적어도 34개, 적어도 35개, 적어도 36개, 적어도 37개, 적어도 38개, 적어도 39개, 적어도 40개, 적어도 41개, 적어도 42개, 적어도 43개, 적어도 44개, 적어도 45개, 적어도 46개, 적어도 47개, 적어도 48개, 적어도 49개 또는 적어도 50개인 융합 단백질.
실시양태 31. 가이드 RNA 및 적어도 1개의 RNA 연장부를 포함하는 연장된 가이드 RNA.
실시양태 32. 실시양태 1에 있어서, RNA 연장부가 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하는 것인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 33. 실시양태 31에 있어서, napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 연장된 가이드 RNA.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 35. 실시양태 31에 있어서, 적어도 1개의 RNA 연장부가 (i) 역전사 주형 서열, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함하는 것인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 36. 실시양태 35에 있어서, RNA 연장부가 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 37. 실시양태 35에 있어서, 역전사 주형 서열이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 38. 실시양태 35에 있어서, 역전사 프라이머 결합 부위 서열이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 39. 실시양태 35에 있어서, 임의적인 링커 서열이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 40. 실시양태 35에 있어서, 역전사 주형 서열이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 41. 실시양태 40에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하며, 여기서 내인성 단일 가닥 DNA는 닉 부위의 하류에 바로 인접한 것인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 42. 실시양태 41에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 43. 실시양태 41에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 44. 실시양태 31에 있어서, 서열식별번호: 18-36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 394, 429-442, 641-649, 678-692, 2997-3103, 3113-3121, 3305-3455, 3479-3493, 3522-3556, 3628-3698 및 3755-3810 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 연장된 가이드 RNA.
실시양태 45. 실시양태 35에 있어서, 역전사 주형 서열이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 46. 실시양태 35에 있어서, 역전사 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 47. 실시양태 35에 있어서, 임의적인 링커 서열이 적어도 1개 뉴클레오티드 또는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 연장된 가이드 RNA.
실시양태 48. 실시양태 1-30 중 어느 하나의 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하는 것인 복합체.
실시양태 50. 실시양태 48에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
실시양태 51. 실시양태 50에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
실시양태 52. 실시양태 49에 있어서, 적어도 1개의 RNA 연장부가 (i) 역전사 주형 서열, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 53. 실시양태 48에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 서열식별번호: 394, 429-442, 641-649, 678-692, 2997-3103, 3113-3121, 3305-3455, 3479-3493, 3522-3556, 3628-3698 및 3755-3810의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 394, 429-442, 641-649, 678-692, 2997-3103, 3113-3121, 3305-3455, 3479-3493, 3522-3556, 3628-3698 및 3755-3810 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 54. 실시양태 52에 있어서, 역전사 주형 서열이 내인성 DNA 표적과 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 55. 실시양태 52에 있어서, 역전사 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
실시양태 56. napDNAbp 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체.
실시양태 57. 실시양태 56에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제인 복합체.
실시양태 58. 실시양태 56에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 59. 실시양태 57에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 60. 실시양태 57에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하는 것인 복합체.
실시양태 61. 실시양태 57에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
실시양태 62. 실시양태 61에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 스페이서 서열이 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
실시양태 63. 실시양태 61에 있어서, RNA 연장부가 (i) 역전사 주형 서열, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 64. 실시양태 57에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 서열식별번호: 394, 429-442, 641-649, 678-692, 2997-3103, 3113-3121, 3305-3455, 3479-3493, 3522-3556, 3628-3698 및 3755-3810의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 394, 429-442, 641-649, 678-692, 2997-3103, 3113-3121, 3305-3455, 3479-3493, 3522-3556, 3628-3698 및 3755-3810 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 65. 실시양태 63에 있어서, 역전사 주형 서열이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 66. 실시양태 63에 있어서, 역전사 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
실시양태 67. 실시양태 63에 있어서, 임의적인 링커 서열이 적어도 1개 뉴클레오티드 또는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 복합체.
실시양태 68. 실시양태 1-30 중 어느 것의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 69. 실시양태 68의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
실시양태 70. 실시양태 1-30 중 어느 것의 융합 단백질 및 융합 단백질의 napDNAbp에 결합된 연장된 가이드 RNA를 포함하는 세포.
실시양태 71. 실시양태 48-67 중 어느 하나의 복합체를 포함하는 세포.
실시양태 72. (i) 실시양태 1-30 중 어느 것의 융합 단백질, 실시양태 48-67의 복합체, 실시양태 68의 폴리뉴클레오티드 또는 실시양태 69의 벡터; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 73. (i) 실시양태 48-67의 복합체; (ii) 트랜스로 제공되는 리버스 트랜스크립타제; 및 (iii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 74. (i) 실시양태 1-30 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 및 (ii) (i)의 서열의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트.
실시양태 75. (i) 이중 가닥 DNA 서열을 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하고, 연장된 가이드 RNA는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 역전사 주형 서열을 포함하는 것인 단계;
(ii) 이중 가닥 DNA 서열을 비-표적 가닥 상에서 닉킹함으로써, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
(iii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 역전사 주형 서열에 혼성화시킴으로써, 리버스 트랜스크립타제 도메인을 프라이밍하는 단계;
(iv) 3' 단부로부터 DNA의 가닥을 중합시킴으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 단계;
(v) 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 단계
를 포함하는, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
실시양태 76. 실시양태 75에 있어서, (v) 대체하는 단계가 (i) 단일 가닥 DNA 플랩을 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥에 혼성화시켜 서열 미스매치를 생성하는 단계; (ii) 내인성 DNA 가닥을 절제하는 단계; 및 (iii) 미스매치를 복구시켜 DNA의 양쪽 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 목적하는 생성물을 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시양태 77. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입인 방법.
실시양태 78. 실시양태 77에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 방법.
실시양태 79. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
실시양태 80. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 방법.
실시양태 81. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
실시양태 82. 실시양태 76에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 방법.
실시양태 83. 실시양태 82에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 84. 실시양태 82에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 85. 실시양태 76에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 기능상실 Cas9 (dCas9), Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 활성 Cas9인 방법.
실시양태 86. 실시양태 76에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 87. 실시양태 76에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 88. 실시양태 76에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
실시양태 89. 실시양태 76에 있어서, 리버스 트랜스크립타제 도메인이 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 90. 실시양태 76에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하며, 여기서 RNA 연장부는 역전사 주형 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 91. 실시양태 90에 있어서, RNA 연장부가 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 방법.
실시양태 92. 실시양태 76에 있어서, 연장된 가이드 RNA가 서열식별번호: 394, 429-442, 641-649, 678-692, 2997-3103, 3113-3121, 3305-3455, 3479-3493, 3522-3556, 3628-3698 및 3755-3810으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 93. (i) DNA 분자를 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 napDNAbp를 표적 유전자좌로 표적화하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계이며, 여기서 가이드 RNA는 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열을 포함하는 것인 단계;
(ii) 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계;
(iii) 노출된 3' 단부를 RT 주형 서열에 혼성화시켜 역전사를 프라이밍하는 단계;
(iv) 리버스 트랜스크립타제에 의해 RT 주형 서열에 기초하여 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하는 단계;
(v) 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 상응하는 내인성 DNA 내로 혼입시킴으로써, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 단계
를 포함하는, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 적어도 1개의 변화를 도입하는 방법.
실시양태 94. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전이를 포함하는 것인 방법.
실시양태 95. 실시양태 94에 있어서, 전이가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 96. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전환을 포함하는 것인 방법.
실시양태 97. 실시양태 96에 있어서, 전환이 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 98. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 99. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 방법.
실시양태 100. 실시양태 93에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 질환-연관 유전자에 대한 교정을 포함하는 것인 방법.
실시양태 101. 실시양태 100에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 102. 실시양태 100에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 103. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 104. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 105. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 106. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 107. 실시양태 93에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 트랜스로 도입되는 것인 방법.
실시양태 108. 실시양태 93에 있어서, napDNAbp가 리버스 트랜스크립타제에 대한 융합체를 포함하는 것인 방법.
실시양태 109. 실시양태 93에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
실시양태 110. 실시양태 93에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 111. 실시양태 93에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 뉴클레아제로 닉킹하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 112. 실시양태 111에 있어서, 뉴클레아제가 napDNAbp이거나, napDNAbp의 융합 도메인으로서 제공되거나 또는 트랜스로 제공되는 것인 방법.
실시양태 113. 실시양태 93에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 화학적 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 114. 실시양태 93에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 복제 오류를 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 115. 실시양태 93에 있어서, DNA 분자를 napDNAbp 및 가이드 RNA와 접촉시키는 단계가 R-루프를 형성하는 것인 방법.
실시양태 116. 실시양태 115에 있어서, 노출된 3' 단부가 형성되는 DNA 가닥이 R-루프에 있는 것인 방법.
실시양태 117. 실시양태 93에 있어서, 가이드 RNA가 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열을 포함하는 연장된 부분을 포함하는 것인 방법.
실시양태 118. 실시양태 117에 있어서, 연장된 부분이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 있는 것인 방법.
실시양태 119. 실시양태 93에 있어서, 가이드 RNA가 프라이머 결합 부위를 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 120. 실시양태 93에 있어서, 가이드 RNA가 스페이서 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 121. 실시양태 93에 있어서, RT 주형 서열이 상응하는 내인성 DNA에 상동인 방법.
실시양태 122. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법.
실시양태 123. 실시양태 122에 있어서, RT 주형이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하는 것인 방법.
실시양태 124. 실시양태 122에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 전이, 전환, 삽입 또는 결실 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 125. 제122항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 전이를 포함하는 것인 방법.
실시양태 126. 제122항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 전환을 포함하는 것인 방법.
실시양태 127. 실시양태 122에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 128. 실시양태 31-47 중 어느 하나의 연장된 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 129. 실시양태 128의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
실시양태 130. 실시양태 129의 벡터를 포함하는 세포.
실시양태 131. 실시양태 1-30 중 어느 하나에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 오류-유발 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
실시양태 132. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 오류-유발 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 돌연변이유발된 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 돌연변이유발된 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 돌연변이유발하는 방법.
실시양태 133. 실시양태 132에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 134. 실시양태 132에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 135. 실시양태 132에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 136. 실시양태 132에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
실시양태 137. 실시양태 132에 있어서, (b) 표적-프라이밍된 역전사를 수행하는 단계가 가이드 RNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링함으로써 역전사를 프라이밍할 수 있는 3' 단부 프라이머 결합 서열을 표적 유전자좌에서 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 138. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 대체 서열을 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 대체 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적 DNA 분자에서 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이를 건강한 수의 반복 트리뉴클레오티드를 포함하는 건강한 서열로 대체하는 방법.
실시양태 139. 실시양태 138에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 140. 실시양태 138에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 141. 실시양태 138에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 142. 실시양태 138에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
실시양태 143. 실시양태 138에 있어서, (b) 표적-프라이밍된 역전사를 수행하는 단계가 가이드 RNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링함으로써 역전사를 프라이밍할 수 있는 3' 단부 프라이머 결합 서열을 표적 유전자좌에서 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 144. 실시양태 138에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 헌팅톤병, 유약 X 증후군 또는 프리드라이히 운동실조와 연관된 것인 방법.
실시양태 145. 실시양태 138에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 CAG 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
실시양태 146. 실시양태 138에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 GAA 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
실시양태 147. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 기능적 모이어티를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 기능적 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 기능적 모이어티를 설치하는 방법.
실시양태 148. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 펩티드 태그인 방법.
실시양태 149. 실시양태 148에 있어서, 펩티드 태그가 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 에피토프 태그 또는 형광 태그인 방법.
실시양태 150. 실시양태 148에 있어서, 펩티드 태그가 아비태그 (서열식별번호: 245); C-태그 (서열식별번호: 246); 칼모듈린-태그 (서열식별번호: 247); 폴리글루타메이트 태그 (서열식별번호: 248); E-태그 (서열식별번호: 249); FLAG-태그 (서열식별번호: 2); HA-태그 (서열식별번호: 5); His-태그 (서열식별번호: 252-262); Myc-태그 (서열식별번호: 6); NE-태그 (서열식별번호: 264); Rho1D4-태그 (서열식별번호: 265); S-태그 (서열식별번호: 266); SBP-태그 (서열식별번호: 267); 소프태그-1 (서열식별번호: 268); 소프태그-2 (서열식별번호: 269); 스폿-태그 (서열식별번호: 270); 스트렙-태그 (서열식별번호: 271); TC 태그 (서열식별번호: 272); Ty 태그 (서열식별번호: 273); V5 태그 (서열식별번호: 3); VSV-태그 (서열식별번호: 275); 및 엑스프레스 태그 (서열식별번호: 276)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 151. 실시양태 148에 있어서, 펩티드 태그가 AU1 에피토프 (서열식별번호: 278); AU5 에피토프 (서열식별번호: 279); 박테리오파지 T7 에피토프 (T7-태그) (서열식별번호: 280); 블루텅 바이러스 태그 (B-태그) (서열식별번호: 281); E2 에피토프 (서열식별번호: 282); 히스티딘 친화성 태그 (HAT) (서열식별번호: 283); HSV 에피토프 (서열식별번호: 284); 폴리아르기닌 (Arg-태그) (서열식별번호: 285); 폴리아스파르테이트 (Asp-태그) (서열식별번호: 286); 폴리페닐알라닌 (Phe-태그) (서열식별번호: 287); S1-태그 (서열식별번호: 288); S-태그 (서열식별번호: 266); 및 VSV-G (서열식별번호: 275)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 152. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 이뮤노에피토프인 방법.
실시양태 153. 실시양태 152에 있어서, 이뮤노에피토프가 파상풍 톡소이드 (서열식별번호: 396); 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197 (서열식별번호: 398); 볼거리 이뮤노에피토프 1 (서열식별번호: 400); 볼거리 이뮤노에피토프 2 (서열식별번호: 402); 볼거리 이뮤노에피토프 3 (서열식별번호: 404); 풍진 바이러스 (서열식별번호: 406); 헤마글루티닌 (서열식별번호: 408); 뉴라미니다제 (서열식별번호: 410); TAP1 (서열식별번호: 412); TAP2 (서열식별번호: 414); 부류 I HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 416); 부류 I HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 418); 부류 II HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 420); 부류 II HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 422); 헤마글루티닌 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 424); 뉴라미니다제 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 426)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 154. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 국재화를 변경시키는 것인 방법.
실시양태 155. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 분해율이 변경되도록 하는 분해 태그인 방법.
실시양태 156. 실시양태 155에 있어서, 분해 태그가 본원에 개시된 바와 같은 분해 태그를 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 157. 실시양태 147에 있어서, 기능적 모이어티가 소분자 결합 도메인인 방법.
실시양태 158. 실시양태 157에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 488의 FKBP12인 방법.
실시양태 159. 실시양태 157에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 489의 FKBP12-F36V인 방법.
실시양태 160. 실시양태 157에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 492-494의 시클로필린인 방법.
실시양태 161. 실시양태 157에 있어서, 소분자 결합 도메인이 2종 이상의 관심 단백질에 설치되는 것인 방법.
실시양태 162. 실시양태 161에 있어서, 2종 이상의 관심 단백질이 소분자와 접촉시 이량체화될 수 있는 것인 방법.
실시양태 163. 실시양태 157에 있어서, 소분자가 군 1의 실시양태 163에 개시된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자의 이량체인 방법.
실시양태 164. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 이뮤노에피토프를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 이뮤노에피토프를 설치하는 방법.
실시양태 165. 실시양태 164에 있어서, 이뮤노에피토프가 파상풍 톡소이드 (서열식별번호: 396); 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197 (서열식별번호: 630); 볼거리 이뮤노에피토프 1 (서열식별번호: 400); 볼거리 이뮤노에피토프 2 (서열식별번호: 402); 볼거리 이뮤노에피토프 3 (서열식별번호: 404); 풍진 바이러스 (서열식별번호: 406); 헤마글루티닌 (서열식별번호: 408); 뉴라미니다제 (서열식별번호: 410); TAP1 (서열식별번호: 412); TAP2 (서열식별번호: 414); 부류 I HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 416); 부류 I HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 418); 부류 II HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 420); 부류 II HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 422); 헤마글루티닌 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 424); 뉴라미니다제 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 426)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 166. 실시양태 164에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 167. 실시양태 164에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 168. 실시양태 164에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 169. 실시양태 164에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
실시양태 170. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 소분자 이량체화 도메인을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 소분자 이량체화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 소분자 이량체화 도메인을 설치하는 방법.
실시양태 171. 실시양태 170에 있어서, 방법을 제2 관심 단백질에 대해 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 172. 실시양태 171에 있어서, 제1 관심 단백질 및 제2 관심 단백질이 각각의 상기 단백질 상의 이량체화 도메인에 결합하는 소분자의 존재 하에 이량체화되는 것인 방법.
실시양태 173. 실시양태 170에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 488의 FKBP12인 방법.
실시양태 174. 실시양태 170에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 489의 FKBP12-F36V인 방법.
실시양태 175. 실시양태 170에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 490 및 493-494의 시클로필린인 방법.
실시양태 176. 실시양태 170에 있어서, 소분자가 군 1의 실시양태 163에 개시된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자의 이량체인 방법.
실시양태 177. 실시양태 170에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 178. 실시양태 170에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 179. 실시양태 170에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 180. 실시양태 170에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
실시양태 181. 단백질을 코딩하는 표적 뉴클레오티드 서열을, 펩티드 태그를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열이 안에 삽입되도록 구성된 프라임 편집제 구축물과 접촉시켜 재조합 뉴클레오티드 서열을 생성함으로써, 재조합 뉴클레오티드 서열로부터 펩티드 태그 및 단백질이 융합 단백질로서 발현되도록 하는 것을 포함하는, 프라임 편집을 사용하여 단백질 상에 펩티드 태그 또는 에피토프를 설치하는 방법.
실시양태 182. 실시양태 181에 있어서, 펩티드 태그가 단백질의 정제 및/또는 검출에 사용되는 것인 방법.
실시양태 183. 실시양태 181에 있어서, 펩티드 태그가 폴리-히스티딘 (예를 들어, HHHHHH) (서열식별번호: 252-262), FLAG (예를 들어, DYKDDDDK) (서열식별번호: 2), V5 (예를 들어, GKPIPNPLLGLDST) (서열식별번호: 3), GCN4, HA (예를 들어, YPYDVPDYA) (서열식별번호: 5), Myc (예를 들어, EQKLISEED) (서열식별번호: 6), GST....등인 방법.
실시양태 184. 실시양태 181에 있어서, 펩티드 태그가 서열식별번호: 1-6, 245-249, 252-262, 264-273, 275-276, 281, 278-288 및 622로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 185. 실시양태 181에 있어서, 펩티드 태그가 링커에 의해 단백질에 융합되는 것인 방법.
실시양태 186. 실시양태 181에 있어서, 융합 단백질이 하기 구조: [단백질]-[펩티드 태그] 또는 [펩티드 태그]-[단백질]을 가지며, 여기서 "]-["는 임의적인 링커를 나타내는 것인 방법.
실시양태 187. 실시양태 181에 있어서, 링커가 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 188. 실시양태 181에 있어서, 프라임 편집제 구축물이 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PEgRNA를 포함하는 것인 방법.
실시양태 189. 실시양태 181에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
실시양태 190. 실시양태 181에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
실시양태 191. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 보호 돌연변이를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 보호 돌연변이를 포함하고 미스폴딩에 대해 저항성인 PRNP를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 PRNP 내로 1개 이상의 보호 돌연변이를 설치함으로써 프리온 질환의 진행을 예방하거나 정지시키는 방법.
실시양태 192. 실시양태 191에 있어서, 프리온 질환이 인간 프리온 질환인 방법.
실시양태 193. 실시양태 191에 있어서, 프리온 질환이 동물 프리온 질환인 방법.
실시양태 194. 실시양태 192에 있어서, 프리온 질환이 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 치명적 가족성 불면증 또는 쿠루병인 방법.
실시양태 195. 실시양태 193에 있어서, 프리온 질환이 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 "광우병"), 만성 소모성 질환 (CWD), 스크래피, 전염성 밍크 뇌병증, 고양이 해면상 뇌병증 및 유제류 해면상 뇌병증인 방법.
실시양태 196. 실시양태 191에 있어서, 야생형 PRNP 아미노산 서열이 서열식별번호: 291-292인 방법.
실시양태 197. 실시양태 191에 있어서, 서열식별번호: 293-309 및 311-323으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 PRNP 아미노산 서열을 생성하며, 여기서 상기 변형된 PRNP 단백질은 미스폴딩에 대해 저항성인 방법.
실시양태 198. 실시양태 191에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 199. 실시양태 191에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 200. 실시양태 191에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 201. 실시양태 191에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
실시양태 202. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 포함하는 변형된 관심 RNA를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 RNA에 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 설치하는 방법.
실시양태 203. 실시양태 202에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 검출 모이어티인 방법.
실시양태 204. 실시양태 202에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 발현 수준에 영향을 미치는 것인 방법.
실시양태 205. 실시양태 202에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 수송 또는 세포하 위치에 영향을 미치는 것인 방법.
실시양태 206. 실시양태 202에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 SV40 유형 1, SV40 유형 2, SV40 유형 3, hGH, BGH, rbGlob, TK, MALAT1 ENE-mascRNA, KSHV PAN ENE, Smbox/U1 snRNA 박스, U1 snRNA 3' 박스, tRNA-리신, 브로콜리 압타머, 스피니치 압타머, 망고 압타머, HDV 리보자임 및 m6A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 207. 실시양태 202에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777을 포함하는 것인 방법.
실시양태 208. 실시양태 202에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 209. 실시양태 202에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 210. 실시양태 202에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 211. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하고, 관심 단백질 및 기능적 모이어티 또는 그의 제거를 포함하는 변형된 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하며, 여기서 기능적 모이어티는 단백질의 변형 상태 또는 국재화 상태를 변경시키는 것인, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 기능적 모이어티를 설치하거나 결실시키는 방법.
실시양태 212. 실시양태 211에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 인산화, 유비퀴틸화, 글리코실화, 지질화, 히드록실화, 메틸화, 아세틸화, 크로토닐화, SUMO화 상태를 변경시키는 것인 방법.
실시양태 213. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 융합 단백질.
실시양태 214. 실시양태 213에 있어서, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 존재 하에 프라임 편집을 수행할 수 있는 융합 단백질.
실시양태 215. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
실시양태 216. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 융합 단백질.
실시양태 217. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
실시양태 218. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
실시양태 219. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
실시양태 220. 실시양태 213에 있어서, PEgRNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 융합 단백질.
실시양태 221. 실시양태 220에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 222. 실시양태 220에 있어서, PEgRNA에 복합체화된 융합 단백질의 결합이 R-루프를 형성하는 것인 융합 단백질.
실시양태 223. 실시양태 222에 있어서, R-루프가 (i) PEgRNA 및 표적 가닥을 포함하는 RNA-DNA 하이브리드 및 (ii) 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 224. 실시양태 223에 있어서, 상보적 비-표적 가닥이 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 프라이밍 서열을 형성하는 것인 융합 단백질.
실시양태 225. 실시양태 214에 있어서, PEgRNA가 (a) 가이드 RNA 및 (b) 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장 아암을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 226. 실시양태 225에 있어서, 연장 아암이 (i) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형 서열 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 227. 실시양태 226에 있어서, DNA 합성 주형 서열이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 228. 실시양태 225에 있어서, 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 융합 단백질.
실시양태 229. 실시양태 227에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열과 혼성화함으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 것인 융합 단백질.
실시양태 230. 실시양태 227에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접하고 유리 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열을 대체하는 것인 융합 단백질.
실시양태 231. 실시양태 230에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 세포에 의해 절제되는 것인 융합 단백질.
실시양태 232. 실시양태 230에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 융합 단백질.
실시양태 233. 실시양태 226에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 PAM 서열의 약 -4 내지 +10 또는 PAM 서열의 약 -10 내지 +20 또는 PAM 서열의 약 -20 내지 +40 또는 PAM 서열의 약 -30 내지 +100인 편집 윈도우에 설치되거나, 또는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 닉 부위의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 뉴클레오티드 하류에 설치되는 것인 융합 단백질.
실시양태 234. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 235. 실시양태 213에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 236. 실시양태 213에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
실시양태 237. 실시양태 213에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
실시양태 238. 실시양태 213에 있어서, 폴리머라제가 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
실시양태 239. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 구조 NH2-[napDNAbp]-[폴리머라제]-COOH; 또는 NH2-[폴리머라제]-[napDNAbp]-COOH를 포함하며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타내는 것인 융합 단백질.
실시양태 240. 실시양태 239에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 241. 실시양태 226에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실인 융합 단백질.
실시양태 242. 실시양태 241에 있어서, 삽입 또는 결실이 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 31개, 적어도 32개, 적어도 33개, 적어도 34개, 적어도 35개, 적어도 36개, 적어도 37개, 적어도 38개, 적어도 39개, 적어도 40개, 적어도 41개, 적어도 42개, 적어도 43개, 적어도 44개, 적어도 45개, 적어도 46개, 적어도 47개, 적어도 48개, 적어도 49개 또는 적어도 50개인 융합 단백질.
실시양태 243. 가이드 RNA 및 DNA 합성 주형을 포함하는 적어도 1개의 핵산 연장 아암을 포함하는 PEgRNA.
실시양태 244. 실시양태 241에 있어서, 핵산 연장 아암이 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하고, 핵산 연장 아암이 DNA 또는 RNA인 PEgRNA.
실시양태 245. 실시양태 242에 있어서, napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 PEgRNA.
실시양태 246. 실시양태 245에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 PEgRNA.
실시양태 247. 실시양태 243에 있어서, 적어도 1개의 핵산 연장 아암이 (i) DNA 합성 주형 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 248. 실시양태 247에 있어서, 핵산 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 PEgRNA.
실시양태 249. 실시양태 247에 있어서, DNA 합성 주형이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 PEgRNA.
실시양태 250. 실시양태 247에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 PEgRNA.
실시양태 251. 실시양태 243에 있어서, 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 PEgRNA.
실시양태 252. 실시양태 247에 있어서, DNA 합성 주형이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 253. 실시양태 252에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하며, 여기서 내인성 단일 가닥 DNA는 닉 부위의 하류에 바로 인접한 것인 PEgRNA.
실시양태 254. 실시양태 253에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 PEgRNA.
실시양태 255. 실시양태 253에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 PEgRNA.
실시양태 256. 실시양태 243에 있어서, 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PEgRNA.
실시양태 257. 실시양태 247에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 258. 실시양태 247에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 PEgRNA.
실시양태 259. 실시양태 251에 있어서, 적어도 1개의 추가의 구조가 PEgRNA의 3' 또는 5' 단부에 위치하는 것인 PEgRNA.
실시양태 260. 실시양태 213-242 중 어느 하나의 융합 단백질 및 PEgRNA를 포함하는 복합체.
실시양태 261. 실시양태 260에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 핵산 연장 아암을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 262. 실시양태 260에 있어서, PEgRNA가 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
실시양태 263. 실시양태 262에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
실시양태 264. 실시양태 261에 있어서, 적어도 1개의 핵산 연장 아암이 (i) DNA 합성 주형 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 복합체.
실시양태 265. 실시양태 260에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 266. 실시양태 264에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 267. 실시양태 264에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
실시양태 268. napDNAbp 및 PEgRNA를 포함하는 복합체.
실시양태 269. 실시양태 268에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제인 복합체.
실시양태 270. 실시양태 268에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 271. 실시양태 268에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 272. 실시양태 268에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 핵산 연장 아암을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 273. 실시양태 268에 있어서, PEgRNA가 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
실시양태 274. 실시양태 272에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, PEgRNA의 스페이서 서열이 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
실시양태 275. 실시양태 273에 있어서, 핵산 연장 아암이 (i) DNA 합성 주형 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 복합체.
실시양태 276. 실시양태 269에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 277. 실시양태 276에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 278. 실시양태 276에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
실시양태 279. 실시양태 276에 있어서, PEgRNA가 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 것인 복합체.
실시양태 280. 실시양태 213-242 중 어느 것의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 281. 실시양태 280의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
실시양태 282. 실시양태 213-242 중 어느 것의 융합 단백질 및 융합 단백질의 napDNAbp에 결합된 PEgRNA를 포함하는 세포.
실시양태 283. 실시양태 260-279 중 어느 하나의 복합체를 포함하는 세포.
실시양태 284. (i) 실시양태 213-242 중 어느 것의 융합 단백질, 실시양태 260-279의 복합체, 실시양태 68의 폴리뉴클레오티드 또는 실시양태 69의 벡터; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 285. (i) 실시양태 260-279의 복합체; (ii) 트랜스로 제공되는 폴리머라제; 및 (iii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 286. (i) 실시양태 213-242 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 및 (ii) (i)의 서열의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트.
실시양태 287. (i) 이중 가닥 DNA 서열을 융합 단백질 및 PEgRNA를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 폴리머라제를 포함하고, PEgRNA는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 단계;
(ii) 이중 가닥 DNA 서열을 닉킹함으로써, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
(iii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, 폴리머라제를 프라이밍하는 단계;
(iv) 프라이머 결합 부위에 혼성화된 3' 단부로부터 DNA 가닥을 중합시킴으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하고 DNA 합성 주형에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 단계;
(v) 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 단계
를 포함하는, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
실시양태 288. 실시양태 287에 있어서, (v) 대체하는 단계가 (i) 단일 가닥 DNA 플랩을 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥에 혼성화시켜 서열 미스매치를 생성하는 단계; (ii) 내인성 DNA 가닥을 절제하는 단계; 및 (iii) 미스매치를 복구시켜 DNA의 양쪽 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 목적하는 생성물을 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시양태 289. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입인 방법.
실시양태 290. 실시양태 289에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 방법.
실시양태 291. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
실시양태 292. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 방법.
실시양태 293. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
실시양태 294. 실시양태 288에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 방법.
실시양태 295. 실시양태 294에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 트리뉴클레오티드 반복 장애; 프리온 질환; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 296. 실시양태 294에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 297. 실시양태 287에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 기능상실 Cas9 (dCas9), Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 활성 Cas9인 방법.
실시양태 298. 실시양태 287에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 299. 실시양태 287에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 300. 실시양태 287에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 301. 실시양태 287에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 302. 실시양태 287에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 분자내 위치에 핵산 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 DNA 합성 주형 서열 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 방법.
실시양태 303. 실시양태 302에 있어서, 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 방법.
실시양태 304. 실시양태 287에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 305. (i) DNA 분자를 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 napDNAbp를 표적 유전자좌로 표적화하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계이며, 여기서 PEgRNA는 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 단계;
(ii) 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계;
(iii) 노출된 3' 단부를 프라이머 결합 부위에 혼성화시켜 역전사를 프라이밍하는 단계;
(iv) 리버스 트랜스크립타제에 의해 RT 주형 서열에 기초하여 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하는 단계;
(v) 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 상응하는 내인성 DNA 내로 혼입시킴으로써, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 단계
를 포함하는, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 적어도 1개의 변화를 도입하는 방법.
실시양태 306. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전이를 포함하는 것인 방법.
실시양태 307. 실시양태 306에 있어서, 전이가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 308. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전환을 포함하는 것인 방법.
실시양태 309. 실시양태 308에 있어서, 전환이 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 310. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (9) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 311. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 방법.
실시양태 312. 실시양태 305에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 질환-연관 유전자에 대한 교정을 포함하는 것인 방법.
실시양태 313. 실시양태 312에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 트리뉴클레오티드 반복 장애; 프리온 질환; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 314. 실시양태 312에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 315. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 316. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 317. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 318. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 319. 실시양태 305에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 트랜스로 도입되는 것인 방법.
실시양태 320. 실시양태 305에 있어서, napDNAbp가 리버스 트랜스크립타제에 대한 융합체를 포함하는 것인 방법.
실시양태 321. 실시양태 305에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
실시양태 322. 실시양태 305에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 323. 실시양태 305에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 뉴클레아제로 닉킹하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 324. 실시양태 323에 있어서, 뉴클레아제가 트랜스로 제공되는 것인 방법.
실시양태 325. 실시양태 305에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 화학적 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 326. 실시양태 305에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 복제 오류를 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 327. 실시양태 305에 있어서, DNA 분자를 napDNAbp 및 가이드 RNA와 접촉시키는 단계가 R-루프를 형성하는 것인 방법.
실시양태 328. 실시양태 327에 있어서, 노출된 3' 단부가 형성되는 DNA 가닥이 R-루프에 있는 것인 방법.
실시양태 329. 실시양태 315에 있어서, PEgRNA가 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 연장 아암을 포함하는 것인 방법.
실시양태 330. 실시양태 329에 있어서, 연장 아암이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 있는 것인 방법.
실시양태 331. 실시양태 305에 있어서, PEgRNA가 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 332. 실시양태 305에 있어서, PEgRNA가 상동성 아암을 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 333. 실시양태 305에 있어서, RT 주형 서열이 상응하는 내인성 DNA에 상동인 방법.
실시양태 334. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법.
실시양태 335. 실시양태 334에 있어서, RT 주형이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하는 것인 방법.
실시양태 336. 실시양태 334에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 전이, 전환, 삽입 또는 결실 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 337. 실시양태 334에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 전이를 포함하는 것인 방법.
실시양태 338. 제334항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 전환을 포함하는 것인 방법.
실시양태 339. 실시양태 334에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 340. 실시양태 243-259 중 어느 하나의 PEgRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 341. 실시양태 340의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
실시양태 342. 실시양태 341의 벡터를 포함하는 세포.
실시양태 343. 실시양태 213에 있어서, 폴리머라제가 오류-유발 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
실시양태 344. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 오류-유발 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; (b) RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 돌연변이유발된 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 돌연변이유발된 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 돌연변이유발하는 방법.
실시양태 345. 임의의 상기 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 346. 임의의 상기 실시양태에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 347. 실시양태 344에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 348. 실시양태 344에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
실시양태 349. 실시양태 344에 있어서, (b) 표적-프라이밍된 역전사를 수행하는 단계가 가이드 RNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링함으로써 역전사를 프라이밍할 수 있는 3' 단부 프라이머 결합 서열을 표적 유전자좌에서 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 350. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 대체 서열을 포함하는 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 프라임 편집을 수행하여 대체 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적 DNA 분자에서 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이를 건강한 수의 반복 트리뉴클레오티드를 포함하는 건강한 서열로 대체하는 방법.
실시양태 351. 실시양태 350에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 352. 실시양태 350에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 353. 실시양태 350에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 354. 실시양태 350에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
실시양태 355. 실시양태 350에 있어서, (b) 프라임 편집을 수행하는 단계가 가이드 RNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링함으로써 폴리머라제를 프라이밍할 수 있는 3' 단부 프라이머 결합 서열을 표적 유전자좌에서 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 356. 실시양태 350에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 헌팅톤병, 유약 X 증후군 또는 프리드라이히 운동실조와 연관된 것인 방법.
실시양태 357. 실시양태 350에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 CAG 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
실시양태 358. 실시양태 350에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 GAA 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
실시양태 359. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 DNA 합성 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 기능적 모이어티를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 기능적 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 기능적 모이어티를 설치하는 방법.
실시양태 360. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 펩티드 태그인 방법.
실시양태 361. 실시양태 360에 있어서, 펩티드 태그가 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 에피토프 또는 이뮤노에피토프 태그 또는 형광 태그인 방법.
실시양태 362. 실시양태 360에 있어서, 펩티드 태그가 아비태그 (서열식별번호: 245); C-태그 (서열식별번호: 246); 칼모듈린-태그 (서열식별번호: 247); 폴리글루타메이트 태그 (서열식별번호: 248); E-태그 (서열식별번호: 249); FLAG-태그 (서열식별번호: 2); HA-태그 (서열식별번호: 5); His-태그 (서열식별번호: 252-262); Myc-태그 (서열식별번호: 6); NE-태그 (서열식별번호: 264); Rho1D4-태그 (서열식별번호: 265); S-태그 (서열식별번호: 266); SBP-태그 (서열식별번호: 267); 소프태그-1 (서열식별번호: 268); 소프태그-2 (서열식별번호: 269); 스폿-태그 (서열식별번호: 270); 스트렙-태그 (서열식별번호: 271); TC 태그 (서열식별번호: 272); Ty 태그 (서열식별번호: 273); V5 태그 (서열식별번호: 3); VSV-태그 (서열식별번호: 275); 및 엑스프레스 태그 (서열식별번호: 276)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 363. 실시양태 360에 있어서, 펩티드 태그가 AU1 에피토프 (서열식별번호: 278); AU5 에피토프 (서열식별번호: 279); 박테리오파지 T7 에피토프 (T7-태그) (서열식별번호: 280); 블루텅 바이러스 태그 (B-태그) (서열식별번호: 281); E2 에피토프 (서열식별번호: 282); 히스티딘 친화성 태그 (HAT) (서열식별번호: 283); HSV 에피토프 (서열식별번호: 284); 폴리아르기닌 (Arg-태그) (서열식별번호: 285); 폴리아스파르테이트 (Asp-태그) (서열식별번호: 286); 폴리페닐알라닌 (Phe-태그) (서열식별번호: 287); S1-태그 (서열식별번호: 288); S-태그 (서열식별번호: 266); 및 VSV-G (서열식별번호: 275)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 364. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 이뮤노에피토프인 방법.
실시양태 365. 실시양태 364에 있어서, 이뮤노에피토프가 파상풍 톡소이드 (서열식별번호: 396); 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197 (서열식별번호: 630); 볼거리 이뮤노에피토프 1 (서열식별번호: 400); 볼거리 이뮤노에피토프 2 (서열식별번호: 402); 볼거리 이뮤노에피토프 3 (서열식별번호: 404); 풍진 바이러스 (서열식별번호: 406); 헤마글루티닌 (서열식별번호: 408); 뉴라미니다제 (서열식별번호: 410); TAP1 (서열식별번호: 412); TAP2 (서열식별번호: 414); 부류 I HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 416); 부류 I HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 418); 부류 II HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 420); 부류 II HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 422); 헤마글루티닌 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 424); 뉴라미니다제 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 426)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 366. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 국재화를 변경시키는 것인 방법.
실시양태 367. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 분해율이 변경되도록 하는 분해 태그인 방법.
실시양태 368. 실시양태 367에 있어서, 분해 태그가 태그부착된 단백질의 제거를 유발하는 것인 방법.
실시양태 369. 실시양태 359에 있어서, 기능적 모이어티가 소분자 결합 도메인인 방법.
실시양태 370. 실시양태 359에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 488의 FKBP12인 방법.
실시양태 371. 실시양태 359에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 489의 FKBP12-F36V인 방법.
실시양태 372. 실시양태 359에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 490 및 493-494의 시클로필린인 방법.
실시양태 373. 실시양태 359에 있어서, 소분자 결합 도메인이 2종 이상의 관심 단백질에 설치되는 것인 방법.
실시양태 374. 실시양태 373에 있어서, 2종 이상의 관심 단백질이 소분자와 접촉시 이량체화될 수 있는 것인 방법.
실시양태 375. 실시양태 369에 있어서, 소분자가 군 1의 실시양태 163에 개시된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자의 이량체인 방법.
실시양태 376. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 이뮤노에피토프를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 이뮤노에피토프를 설치하는 방법.
실시양태 377. 실시양태 376에 있어서, 이뮤노에피토프가 파상풍 톡소이드 (서열식별번호: 396); 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197 (서열식별번호: 630); 볼거리 이뮤노에피토프 1 (서열식별번호: 400); 볼거리 이뮤노에피토프 2 (서열식별번호: 402); 볼거리 이뮤노에피토프 3 (서열식별번호: 404); 풍진 바이러스 (서열식별번호: 406); 헤마글루티닌 (서열식별번호: 408); 뉴라미니다제 (서열식별번호: 410); TAP1 (서열식별번호: 412); TAP2 (서열식별번호: 414); 부류 I HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 416); 부류 I HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 418); 부류 II HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 420); 부류 II HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 422); 헤마글루티닌 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 424); 뉴라미니다제 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 426)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 378. 실시양태 376에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 379. 실시양태 376에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 380. 실시양태 376에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 381. 실시양태 376에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777을 포함하는 것인 방법.
실시양태 382. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 소분자 이량체화 도메인을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 관심 단백질 및 소분자 이량체화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 소분자 이량체화 도메인을 설치하는 방법.
실시양태 383. 실시양태 382에 있어서, 방법을 제2 관심 단백질에 대해 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 384. 실시양태 383에 있어서, 제1 관심 단백질 및 제2 관심 단백질이 각각의 상기 단백질 상의 이량체화 도메인에 결합하는 소분자의 존재 하에 이량체화되는 것인 방법.
실시양태 385. 실시양태 382에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 488의 FKBP12인 방법.
실시양태 386. 실시양태 382에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 489의 FKBP12-F36V인 방법.
실시양태 387. 실시양태 382에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 490 및 493-494의 시클로필린인 방법.
실시양태 388. 실시양태 382에 있어서, 소분자가 군 1의 실시양태 163에 개시된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자의 이량체인 방법.
실시양태 389. 실시양태 382에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 390. 실시양태 382에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 391. 실시양태 382에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 392. 실시양태 382에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777을 포함하는 것인 방법.
실시양태 393. 단백질을 코딩하는 표적 뉴클레오티드 서열을, 펩티드 태그를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열이 안에 삽입되도록 구성된 프라임 편집제 구축물과 접촉시켜 재조합 뉴클레오티드 서열을 생성함으로써, 재조합 뉴클레오티드 서열로부터 펩티드 태그 및 단백질이 융합 단백질로서 발현되도록 하는 것을 포함하는, 프라임 편집을 사용하여 단백질 상에 펩티드 태그 또는 에피토프를 설치하는 방법.
실시양태 394. 실시양태 383에 있어서, 펩티드 태그가 단백질의 정제 및/또는 검출에 사용되는 것인 방법.
실시양태 395. 실시양태 383에 있어서, 펩티드 태그가 폴리-히스티딘 (예를 들어, HHHHHH) (서열식별번호: 252-262), FLAG (예를 들어, DYKDDDDK) (서열식별번호: 2), V5 (예를 들어, GKPIPNPLLGLDST) (서열식별번호: 3), GCN4, HA (예를 들어, YPYDVPDYA) (서열식별번호: 5), Myc (예를 들어, EQKLISEED) (서열식별번호: 6) 또는 GST인 방법.
실시양태 396. 실시양태 383에 있어서, 펩티드 태그가 서열식별번호: 1-6, 245-249, 252-262, 264-273, 275-276, 281, 278-288 및 622로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 397. 실시양태 383에 있어서, 펩티드 태그가 링커에 의해 단백질에 융합되는 것인 방법.
실시양태 398. 실시양태 383에 있어서, 융합 단백질이 하기 구조: [단백질]-[펩티드 태그] 또는 [펩티드 태그]-[단백질]을 가지며, 여기서 "]-["는 임의적인 링커를 나타내는 것인 방법.
실시양태 399. 실시양태 383에 있어서, 링커가 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 400. 실시양태 383에 있어서, 프라임 편집제 구축물이 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PEgRNA를 포함하는 것인 방법.
실시양태 401. 실시양태 383에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
실시양태 402. 실시양태 383에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
실시양태 403. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 보호 돌연변이를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 보호 돌연변이를 포함하고 미스폴딩에 대해 저항성인 PRNP를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 PRNP 내로 1개 이상의 보호 돌연변이를 설치함으로써 프리온 질환의 진행을 예방하거나 정지시키는 방법.
실시양태 404. 실시양태 403에 있어서, 프리온 질환이 인간 프리온 질환인 방법.
실시양태 405. 실시양태 403에 있어서, 프리온 질환이 동물 프리온 질환인 방법.
실시양태 406. 실시양태 404에 있어서, 프리온 질환이 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 치명적 가족성 불면증 또는 쿠루병인 방법.
실시양태 407. 실시양태 403에 있어서, 프리온 질환이 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 "광우병"), 만성 소모성 질환 (CWD), 스크래피, 전염성 밍크 뇌병증, 고양이 해면상 뇌병증 및 유제류 해면상 뇌병증인 방법.
실시양태 408. 실시양태 403에 있어서, 야생형 PRNP 아미노산 서열이 서열식별번호: 291-292인 방법.
실시양태 409. 실시양태 403에 있어서, 서열식별번호: 293-309, 311-323으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 PRNP 아미노산 서열을 생성하며, 여기서 상기 변형된 PRNP 단백질은 미스폴딩에 대해 저항성인 방법.
실시양태 410. 실시양태 403에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 411. 실시양태 403에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 412. 실시양태 403에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 413. 실시양태 403에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777을 포함하는 것인 방법.
실시양태 414. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 포함하는 변형된 관심 RNA를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 RNA에 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 설치하는 방법.
실시양태 415. 실시양태 414에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 검출 모이어티인 방법.
실시양태 416. 실시양태 414에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 발현 수준에 영향을 미치는 것인 방법.
실시양태 417. 실시양태 414에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 수송 또는 세포하 위치에 영향을 미치는 것인 방법.
실시양태 418. 실시양태 414에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 SV40 유형 1, SV40 유형 2, SV40 유형 3, hGH, BGH, rbGlob, TK, MALAT1 ENE-mascRNA, KSHV PAN ENE, Smbox/U1 snRNA 박스, U1 snRNA 3' 박스, tRNA-리신, 브로콜리 압타머, 스피니치 압타머, 망고 압타머, HDV 리보자임 및 m6A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 419. 실시양태 414에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777을 포함하는 것인 방법.
실시양태 420. 실시양태 414에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 421. 실시양태 414에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 422. 실시양태 414에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 423. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하고, 관심 단백질 및 기능적 모이어티 또는 그의 제거를 포함하는 변형된 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하며, 여기서 기능적 모이어티는 단백질의 변형 상태 또는 국재화 상태를 변경시키는 것인, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 기능적 모이어티를 설치하거나 결실시키는 방법.
실시양태 424. 실시양태 423에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 인산화, 유비퀴틸화, 글리코실화, 지질화, 히드록실화, 메틸화, 아세틸화, 크로토닐화, SUMO화 상태를 변경시키는 것인 방법.
실시양태 425. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 도메인 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인을 포함하는 융합 단백질.
실시양태 426. 실시양태 425에 있어서, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 존재 하에 프라임 편집을 수행하여 표적 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치할 수 있는 융합 단백질.
실시양태 427. 실시양태 425에 있어서, napDNAbp 도메인이 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
실시양태 428. 실시양태 425에 있어서, napDNAbp 도메인이 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 융합 단백질.
실시양태 429. 실시양태 425에 있어서, napDNAbp 도메인이 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
실시양태 430. 실시양태 425에 있어서, napDNAbp 도메인이 Cas9 닉카제 (nCas9)인 융합 단백질.
실시양태 431. 실시양태 425에 있어서, napDNAbp 도메인이 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
실시양태 432. 실시양태 425에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
실시양태 433. 실시양태 425에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 리버스 트랜스크립타제이고, 임의로 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 포함하는 도메인이 오류-유발성인 융합 단백질.
실시양태 434. 실시양태 425에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제인 융합 단백질.
실시양태 435. 실시양태 425에 있어서, PEgRNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 융합 단백질.
실시양태 436. 실시양태 435에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 437. 실시양태 435에 있어서, PEgRNA에 복합체화된 융합 단백질의 결합이 R-루프를 형성하는 것인 융합 단백질.
실시양태 438. 실시양태 437에 있어서, R-루프가 (i) PEgRNA 및 표적 가닥을 포함하는 RNA-DNA 하이브리드 및 (ii) 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 439. 실시양태 437에 있어서, 표적 또는 상보적 비-표적 가닥이 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 프라이밍 서열을 형성하는 것인 융합 단백질.
실시양태 440. 실시양태 439에 있어서, 닉 부위가 표적 가닥 상의 PAM 서열의 상류인 융합 단백질.
실시양태 441. 실시양태 439에 있어서, 닉 부위가 비-표적 가닥 상의 PAM 서열의 상류인 융합 단백질.
실시양태 442. 실시양태 439에 있어서, 닉 부위가 PAM 서열의 5' 단부에 대해 -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 또는 -9인 융합 단백질.
실시양태 443. 실시양태 426에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA 및 적어도 1개의 핵산 연장 아암을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 444. 실시양태 443에 있어서, 연장 아암이 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 있는 것인 융합 단백질.
실시양태 445. 실시양태 443에 있어서, 연장 아암이 (i) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형 서열 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 446. 실시양태 445에 있어서, DNA 합성 주형 서열이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 447. 실시양태 443에 있어서, 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 41개 뉴클레오티드, 적어도 42개 뉴클레오티드, 적어도 43개 뉴클레오티드, 적어도 44개 뉴클레오티드, 적어도 45개 뉴클레오티드, 적어도 46개 뉴클레오티드, 적어도 47개 뉴클레오티드, 적어도 48개 뉴클레오티드, 적어도 49개 뉴클레오티드 또는 적어도 50개 뉴클레오티드인 융합 단백질.
실시양태 448. 실시양태 443에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 혼성화함으로써, 표적 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 것인 융합 단백질.
실시양태 449. 실시양태 443에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접하고 유리 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열을 대체하는 것인 융합 단백질.
실시양태 450. 실시양태 446에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 세포에 의해 절제되는 것인 융합 단백질.
실시양태 451. 실시양태 446에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 절제되는 것인 융합 단백질.
실시양태 452. 실시양태 448에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 비-표적 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 혼입시킴으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 융합 단백질.
실시양태 453. 실시양태 449에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 PAM 서열의 약 -4 내지 +10 또는 PAM 서열의 약 -10 내지 +20 또는 PAM 서열의 약 -20 내지 +40 또는 PAM 서열의 약 -30 내지 +100인 편집 윈도우에 설치되는 것인 융합 단백질.
실시양태 454. 실시양태 449에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 닉 부위의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 뉴클레오티드 하류에 설치되는 것인 융합 단백질.
실시양태 455. 실시양태 425에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 456. 실시양태 425에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 457. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 구조 NH2-[napDNAbp]-[RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인]-COOH; 또는 NH2-[RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인]-[napDNAbp]-COOH를 포함하며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타내는 것인 융합 단백질.
실시양태 458. 실시양태 457에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
실시양태 459. 실시양태 425에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실인 융합 단백질.
실시양태 460. 실시양태 459에 있어서, 삽입 또는 결실이 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 31개, 적어도 32개, 적어도 33개, 적어도 34개, 적어도 35개, 적어도 36개, 적어도 37개, 적어도 38개, 적어도 39개, 적어도 40개, 적어도 41개, 적어도 42개, 적어도 43개, 적어도 44개, 적어도 45개, 적어도 46개, 적어도 47개, 적어도 48개, 적어도 49개 또는 적어도 50개인 융합 단백질.
실시양태 461. 실시양태 425-460 중 어느 것의 융합 단백질 및 PEgRNA를 포함하며, 여기서 PEgRNA는 융합 단백질을 프라임 편집을 위한 표적 DNA 서열로 지시하는 것인 복합체.
실시양태 462. 실시양태 461에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 핵산 연장 아암을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 463. 실시양태 462에 있어서, PEgRNA가 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
실시양태 464. 실시양태 463에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하며, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
실시양태 465. 실시양태 464에 있어서, 적어도 1개의 핵산 연장 아암이 (i) DNA 합성 주형 및 (ii) 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 복합체.
실시양태 466. 실시양태 464에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 467. 실시양태 465에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 468. 실시양태 465에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
실시양태 469. 실시양태 461에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제인 복합체.
실시양태 470. 실시양태 461에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 471. 실시양태 461에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 472. 실시양태 461에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 핵산 연장 아암을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 473. 실시양태 465에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 474. 실시양태 465에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
실시양태 475. 실시양태 462에 있어서, PEgRNA가 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 것인 복합체.
실시양태 476. 실시양태 425-461 중 어느 것의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 477. 상기 실시양태 중 어느 것의 PEgRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 478. 실시양태 476의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이며, 여기서 융합 단백질의 발현은 프로모터의 제어 하에 있는 것인 벡터.
실시양태 479. 실시양태 477의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이며, 여기서 PEgRNA의 발현은 프로모터의 제어 하에 있는 것인 벡터.
실시양태 480. 실시양태 479에 있어서, 프로모터가 U6 프로모터인 벡터.
실시양태 481. 실시양태 479에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터인 벡터.
실시양태 482. 실시양태 480에 있어서, PEgRNA가 연장 아암 내 T의 1개 이상의 반복 클러스터를 제거하여 U6 프로모터에 의한 전사 효율을 개선시키도록 조작되는 것인 벡터.
실시양태 483. 실시양태 482에 있어서, 제거되는 T의 1개 이상의 반복 클러스터가 적어도 3개의 T, 적어도 4개의 T, 적어도 5개의 T, 적어도 6개의 T, 적어도 7개의 T, 적어도 8개의 T, 적어도 9개의 T, 적어도 10개의 T, 적어도 11개의 T, 적어도 12개의 T, 적어도 13개의 T, 적어도 14개의 T, 적어도 15개의 T, 적어도 16개의 T, 적어도 17개의 T, 적어도 18개의 T, 적어도 19개의 T 또는 적어도 20개의 T를 포함하는 것인 벡터.
실시양태 484. 실시양태 425-460 중 어느 것의 융합 단백질 및 융합 단백질의 napDNAbp에 결합된 PEgRNA를 포함하는 세포.
실시양태 485. 실시양태 461-475 중 어느 하나의 복합체를 포함하는 세포.
실시양태 486. (i) 실시양태 425-460 중 어느 것의 융합 단백질, 실시양태 461-475의 복합체, 실시양태 476-477의 폴리뉴클레오티드 또는 실시양태 478-483의 벡터; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 487. (i) 실시양태 461-475의 복합체; (ii) 트랜스로 제공되는 폴리머라제; 및 (iii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 488. (i) 실시양태 425-460 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (ii) 융합 단백질을 표적 DNA 부위로 지시할 수 있는 PEgRNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 (i) 및 (ii)의 핵산 분자는 단일 DNA 구축물 또는 개별 DNA 구축물 내에 함유될 수 있는 것인, 프라임 편집을 위한 키트.
실시양태 489. 실시양태 488에 있어서, (i)의 핵산 분자가 융합 단백질의 발현을 구동하는 프로모터를 추가로 포함하는 것인 키트.
실시양태 490. 실시양태 488에 있어서, (ii)의 핵산 분자가 PEgRNA의 발현을 구동하는 프로모터를 추가로 포함하는 것인 키트.
실시양태 491. 실시양태 490에 있어서, 프로모터가 U6 프로모터인 키트.
실시양태 492. 실시양태 490에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터인 키트.
실시양태 493. 실시양태 457에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 174 (1x SGGS), 3888 (2x SGGS), 3889 (3x SGGS), 3890 (1x XTEN), 3891 (1x EAAAK), 3892 (2x EAAAK) 및 3893 (3x EAAAK)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
군 B. PE 가이드 및 설계 방법
실시양태 1. 가이드 RNA 및 DNA 합성 주형을 포함하는 적어도 1개의 핵산 연장 아암을 포함하는 PEgRNA.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 핵산 연장 아암이 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하고, 핵산 연장 아암이 DNA 또는 RNA인 PEgRNA.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 PEgRNA.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 5. 실시양태 3에 있어서, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 PEgRNA.
실시양태 6. 실시양태 1에 있어서, 적어도 1개의 핵산 연장 아암이 프라이머 결합 부위를 추가로 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 7. 실시양태 1에 있어서, 핵산 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 41개 뉴클레오티드, 적어도 42개 뉴클레오티드, 적어도 43개 뉴클레오티드, 적어도 44개 뉴클레오티드, 적어도 45개 뉴클레오티드, 적어도 46개 뉴클레오티드, 적어도 47개 뉴클레오티드, 적어도 48개 뉴클레오티드, 적어도 49개 뉴클레오티드 또는 적어도 50개 뉴클레오티드인 PEgRNA.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, DNA 합성 주형이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 PEgRNA.
실시양태 9. 실시양태 6에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 PEgRNA.
실시양태 10. 실시양태 1에 있어서, tRNA, 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 PEgRNA.
실시양태 11. 실시양태 1에 있어서, DNA 합성 주형이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하며, 여기서 내인성 단일 가닥 DNA는 닉 부위의 하류에 바로 인접한 것인 PEgRNA.
실시양태 13. 실시양태 11에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 PEgRNA.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 PEgRNA.
실시양태 15. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PEgRNA.
실시양태 16. 실시양태 1에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 17. 실시양태 6에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 PEgRNA.
실시양태 18. 실시양태 10에 있어서, 적어도 1개의 추가의 구조가 PEgRNA의 3' 또는 5' 단부에 위치하는 것인 PEgRNA.
실시양태 19. 실시양태 10에 있어서, 링커가 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 20. 실시양태 10에 있어서, 스템 루프가 본원에 기재된 스템 루프로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 21. 실시양태 10에 있어서, 헤어핀이 본원에 기재된 헤어핀으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 22. 실시양태 10에 있어서, 토루프가 본원에 기재된 토루프로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 23. 실시양태 10에 있어서, 압타머가 본원에 기재된 압타머로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 24. 실시양태 10에 있어서, RNA-단백질 동원 도메인이 본원에 기재된 RNA-단백질 동원 도메인으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 PEgRNA.
실시양태 25. 표적 뉴클레오티드 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 프라임 편집에 사용하기 위한 PEgRNA를 설계하는 방법이며, 여기서 상기 PEgRNA는 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하고, 여기서 상기 연장 아암은 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하고, 상기 방법은
(i) 표적 뉴클레오티드 서열에서 목적하는 표적 편집 부위를 선택하는 단계;
(ii) 표적 편집 부위로부터 상류 및 하류의 콘텍스트 뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계;
(iii) 목적하는 표적 편집 부위에 근접한 콘텍스트 뉴클레오티드 서열에서 추정 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 부위의 위치를 찾아내는 단계;
(iv) 각각의 추정 PAM 부위에 대한 상응하는 닉 부위를 확인하는 단계;
(v) 스페이서를 설계하는 단계;
(vi) gRNA 코어를 설계하는 단계;
(vii) 연장 아암을 설계하는 단계; 및
(viii) 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 연결함으로써 전체 PEgRNA를 구축하는 단계
를 포함하는 것인, 표적 뉴클레오티드 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 프라임 편집에 사용하기 위한 PEgRNA를 설계하는 방법.
실시양태 26. 실시양태 25에 있어서, 목적하는 표적 편집 부위를 선택하는 단계 (i)이 질환-유발 돌연변이를 선택하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 27. 실시양태 26에 있어서, 질환-유발 돌연변이가 암, 자가면역 장애, 신경계 장애, 피부 장애, 호흡기 질환 및 심장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환과 연관된 것인 방법.
실시양태 28. 실시양태 25에 있어서, 표적 편집 부위로부터 상류 및 하류의 콘텍스트 뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계 (ii)가 목적하는 표적 편집 부위를 포함하는 영역의 약 50-55개 염기 쌍 (bp), 약 55-60 bp, 약 60-65 bp, 약 65-70 bp, 약 70-75 bp, 약 75-80 bp, 약 80-85 bp, 약 85-90 bp, 약 90-95 bp, 약 95-100 bp, 약 100-105 bp, 약 105-110 bp, 약 110-125 bp, 약 125-130 bp, 약 130-135 bp, 약 135-140 bp, 약 140-145 bp, 약 145-150 bp, 약 150-155 bp, 약 155-160 bp, 약 160-165 bp, 약 165-170 bp, 약 170-175 bp, 약 175-180 bp, 약 180-185 bp, 약 185-190 bp, 약 190-195 bp, 약 195-200 bp, 약 200-205 bp, 약 205-210 bp, 약 210-215 bp, 약 215-220 bp, 약 220-225 bp, 약 225-230 bp, 약 230-235 bp, 약 235-240 bp, 약 240-245 bp 또는 약 245-250 bp를 수득하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, 목적하는 표적 편집 부위가 콘텍스트 뉴클레오티드 서열의 각각의 단부로부터 대략 등거리에 위치하는 것인 방법.
실시양태 30. 실시양태 25에 있어서, 단계 (iii)에서, 추정 PAM 부위가 목적하는 표적 편집 부위에 근접한 것인 방법.
실시양태 31. 실시양태 25에 있어서, 단계 (iii)에서, 추정 PAM 부위가 표적 편집 부위로부터 30개 미만의 뉴클레오티드 또는 표적 편집 부위로부터 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 뉴클레오티드의 위치에 위치한 연관된 닉 부위를 갖는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 32. 실시양태 25에 있어서, 단계 (iii)에서, 추정 PAM 부위가 표적 편집 부위로부터 30개 초과의 뉴클레오티드 또는 표적 편집 부위로부터 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 초과의 뉴클레오티드의 위치에 위치한 연관된 닉 부위를 갖는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 33. 실시양태 25에 있어서, 단계 (iii)에서, 추정 PAM 부위가 상기 PAM 부위에 결합하는 하나 또는 상응하는 napDNAbp와 연관된 것인 방법.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서, 추정 PAM 부위 및 그의 상응하는 napDNAbp가 하기 군: (a) 서열식별번호: 18-25 및 87-88의 SpCas9 및 NGG; (b) Sp VQR nCas9; 및 (c) NGAN 중 어느 것으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 35. 실시양태 25에 있어서, 스페이서를 설계하는 단계 (v)가 각각의 추정 PAM과 연관된 프로토스페이서 서열의 상보체 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 36. 실시양태 25에 있어서, gRNA 코어를 설계하는 단계 (vi)이 각각의 추정 PAM의 맥락에서, 각각의 상기 추정 PAM과 연관된 napDNAbp에 결합할 수 있는 gRNA 코어 서열을 선택하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 37. 실시양태 25에 있어서, 연장 아암을 설계하는 단계 (vii)이 (a) 관심 편집을 포함하는 DNA 합성 주형 및 (b) 프라이머 결합 부위를 설계하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 프라이머 결합 부위를 설계하는 단계가 (a) 표적 뉴클레오티드 서열의 PAM-함유 가닥 상의 DNA 프라이머를 확인하고, 여기서 DNA 프라이머의 3' 단부는 PAM 부위와 연관된 닉 부위의 제1 뉴클레오티드 상류인 단계 및 (b) DNA 프라이머의 상보체를 설계하고, 여기서 상기 상보체는 프라이머 결합 부위를 형성하는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
실시양태 39. 실시양태 38에 있어서, 프라이머 결합 부위가 8 내지 15개 뉴클레오티드 길이인 방법.
실시양태 40. 실시양태 38에 있어서, DNA 프라이머가 약 40-60% GC 함량을 함유하는 경우에 프라이머 결합 부위가 12-13개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 41. 실시양태 38에 있어서, DNA 프라이머가 약 40% 미만의 GC 함량을 함유하는 경우에 프라이머 결합 부위가 14-15개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 42. 실시양태 38에 있어서, DNA 프라이머가 약 60% 초과의 GC 함량을 함유하는 경우에 프라이머 결합 부위가 8-11개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 43. 표적 DNA 서열을 실시양태 1-24 중 어느 것의 PEgRNA 및 napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 도메인을 포함하는 프라임 편집제 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는, 프라임 편집 방법.
실시양태 44. 실시양태 43에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 것인 방법.
실시양태 45. 실시양태 43에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 46. 실시양태 43에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 47. 실시양태 43에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 48. 실시양태 43에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 방법.
실시양태 49. 실시양태 43에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 50. 실시양태 43에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 51. 실시양태 43에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제인 방법.
군 C. PE 복합체
실시양태 1. (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및
(ii) 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)
를 포함하는, 프라임 편집을 위한 복합체.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 융합 단백질이 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 존재 하에 프라임 편집을 수행하여 표적 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치할 수 있는 것인 복합체.
실시양태 3. 실시양태 11에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 것인 복합체.
실시양태 4. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 복합체.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 복합체.
실시양태 6. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 복합체.
실시양태 7. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 복합체.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 복합체.
실시양태 9. 실시양태 1에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 복합체.
실시양태 10. 실시양태 1에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제인 복합체.
실시양태 11. 실시양태 1에 있어서, 융합 단백질이 PEgRNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 것인 복합체.
실시양태 12. 실시양태 1에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA 및 DNA 합성 주형을 포함하는 적어도 1개의 핵산 연장 아암을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 13. 실시양태 12에 있어서, 핵산 연장 아암이 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하고, 핵산 연장 아암이 DNA 또는 RNA인 복합체.
실시양태 14. 실시양태 12에 있어서, PEgRNA가 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 16. 실시양태 12에 있어서, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
실시양태 17. 실시양태 12에 있어서, 적어도 1개의 핵산 연장 아암이 프라이머 결합 부위를 추가로 포함하는 것인 복합체.
실시양태 18. 실시양태 12에 있어서, 핵산 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 41개 뉴클레오티드, 적어도 42개 뉴클레오티드, 적어도 43개 뉴클레오티드, 적어도 44개 뉴클레오티드, 적어도 45개 뉴클레오티드, 적어도 46개 뉴클레오티드, 적어도 47개 뉴클레오티드, 적어도 48개 뉴클레오티드, 적어도 49개 뉴클레오티드 또는 적어도 50개 뉴클레오티드인 복합체.
실시양태 19. 실시양태 12에 있어서, DNA 합성 주형이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 복합체.
실시양태 20. 실시양태 17에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 복합체.
실시양태 21. 실시양태 12에 있어서, PEgRNA가 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 것인 복합체.
실시양태 22. 실시양태 12에 있어서, DNA 합성 주형이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 복합체.
실시양태 23. 실시양태 22에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하며, 여기서 내인성 단일 가닥 DNA는 닉 부위의 하류에 바로 인접한 것인 복합체.
실시양태 24. 실시양태 23에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 복합체.
실시양태 25. 실시양태 23에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 복합체.
실시양태 26. 실시양태 12에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 18-36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 27. 실시양태 12에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 28. 실시양태 17에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
실시양태 29. 실시양태 21에 있어서, 적어도 1개의 추가의 구조가 PEgRNA의 3' 또는 5' 단부에 위치하는 것인 복합체.
실시양태 30. 실시양태 29에 있어서, 링커가 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 31. 실시양태 29에 있어서, 스템 루프가 본원에 기재된 스템 루프로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 32. 실시양태 29에 있어서, 헤어핀이 본원에 기재된 헤어핀으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 33. 실시양태 29에 있어서, 토루프가 본원에 기재된 토루프로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 34. 실시양태 29에 있어서, 압타머가 본원에 기재된 압타머로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 35. 실시양태 29에 있어서, RNA-단백질 동원 도메인이 본원에 기재된 RNA-단백질 동원 도메인으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 36. 실시양태 1에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 37. 실시양태 36에 있어서, R-루프가 (i) PEgRNA 및 표적 가닥을 포함하는 RNA-DNA 하이브리드 및 (ii) 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 표적 또는 상보적 비-표적 가닥이 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 프라이밍 서열을 형성하는 것인 복합체.
실시양태 39. 실시양태 38에 있어서, 닉 부위가 표적 가닥 상의 PAM 서열의 상류인 복합체.
실시양태 40. 실시양태 38에 있어서, 닉 부위가 비-표적 가닥 상의 PAM 서열의 상류인 복합체.
실시양태 41. 실시양태 38에 있어서, 닉 부위가 PAM 서열의 5' 단부에 대해 -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 또는 -9인 복합체.
실시양태 42. 실시양태 22에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 혼성화함으로써, 표적 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 것인 복합체.
실시양태 43. 실시양태 22에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접하고 유리 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열을 대체하는 것인 복합체.
실시양태 44. 실시양태 22에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 세포에 의해 절제되는 것인 복합체.
실시양태 45. 실시양태 44에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 절제되는 것인 복합체.
실시양태 46. 실시양태 43에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 비-표적 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 혼입시킴으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 복합체.
실시양태 47. 실시양태 46에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 PAM 서열의 약 -4 내지 +10 또는 PAM 서열의 약 -10 내지 +20 또는 PAM 서열의 약 -20 내지 +40 또는 PAM 서열의 약 -30 내지 +100인 편집 윈도우에 설치되는 것인 복합체.
실시양태 48. 실시양태 47에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 닉 부위의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 뉴클레오티드 하류에 설치되는 것인 복합체.
실시양태 49. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 구조 NH2-[napDNAbp]-[RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인]-COOH; 또는 NH2-[RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인]-[napDNAbp]-COOH를 포함하며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타내는 것인 복합체.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
실시양태 51. 실시양태 1에 있어서, 융합 단백질이 napDNAbp와 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인을 연결하는 링커를 추가로 포함하는 것인 복합체.
실시양태 52. 실시양태 51에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 3887 (1x SGGS), 3888 (2x SGGS), 3889 (3x SGGS), 3890 (1x XTEN), 3891 (1x EAAAK), 3892 (2x EAAAK) 및 3893 (3x EAAAK)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
군 D. 돌연변이를 교정하기 위한 PE 방법
실시양태 1. 이중 가닥 DNA 서열을 융합 단백질 및 PEgRNA를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 폴리머라제를 포함하고, PEgRNA는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 단계;
이로써 이중 가닥 DNA 서열을 닉킹함으로써, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
이로써 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, 폴리머라제를 프라이밍하는 단계;
이로써 프라이머 결합 부위에 혼성화된 3' 단부로부터 DNA 가닥을 중합시킴으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하고 DNA 합성 주형에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 단계;
이로써 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 단계
를 포함하는, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 내인성 DNA 가닥을 대체하는 단계가 (i) 단일 가닥 DNA 플랩을 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥에 혼성화시켜 서열 미스매치를 생성시키는 단계; (ii) 내인성 DNA 가닥을 절제하는 단계; 및 (iii) 미스매치를 복구시켜 DNA의 양쪽 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 목적하는 생성물을 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입인 방법.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
실시양태 6. 실시양태 1에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 방법.
실시양태 7. 실시양태 1에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 방법.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 트리뉴클레오티드 반복 장애; 프리온 질환; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 10. 실시양태 8에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 11. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 기능상실 Cas9 (dCas9), Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 활성 Cas9인 방법.
실시양태 12. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 13. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 14. 실시양태 1에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 15. 실시양태 1에 있어서, 폴리머라제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 16. 실시양태 1에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 분자내 위치에 핵산 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 DNA 합성 주형 서열 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 방법.
실시양태 17. 실시양태 16에 있어서, 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이인 방법.
실시양태 18. 실시양태 1에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 19. DNA 분자를 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 napDNAbp를 표적 유전자좌로 표적화하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계이며, 여기서 PEgRNA는 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 단계;
이로써 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계;
이로써 노출된 3' 단부를 프라이머 결합 부위에 혼성화시켜 역전사를 프라이밍하는 단계;
이로써 리버스 트랜스크립타제에 의해 RT 주형 서열에 기초하여 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하는 단계;
이로써 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 상응하는 내인성 DNA 내로 혼입시킴으로써, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 단계
를 포함하는, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법.
실시양태 20. 실시양태 19에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전이를 포함하는 것인 방법.
실시양태 21. 실시양태 19에 있어서, 전이가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 22. 실시양태 19에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 전환을 포함하는 것인 방법.
실시양태 23. 실시양태 22에 있어서, 전환이 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 24. 실시양태 19에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (9) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 25. 실시양태 19에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 방법.
실시양태 26. 실시양태 19에 있어서, 뉴클레오티드 서열 내의 1개 이상의 변화가 질환-연관 유전자에 대한 교정을 포함하는 것인 방법.
실시양태 27. 실시양태 26에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 트리뉴클레오티드 반복 장애; 프리온 질환; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 28. 실시양태 26에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 29. 실시양태 19에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 30. 실시양태 19에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 31. 실시양태 19에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 32. 실시양태 19에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 33. 실시양태 19에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 트랜스로 도입되는 것인 방법.
실시양태 34. 실시양태 19에 있어서, napDNAbp가 리버스 트랜스크립타제에 대한 융합체를 포함하는 것인 방법.
실시양태 35. 실시양태 19에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
실시양태 36. 실시양태 19에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 37. 실시양태 19에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 뉴클레아제로 닉킹하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 뉴클레아제가 napDNAbp이거나, napDNAbp의 융합 도메인으로서 제공되거나 또는 트랜스로 제공되는 것인 방법.
실시양태 39. 실시양태 19에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 DNA 가닥을 화학적 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 40. 실시양태 19에 있어서, 표적 유전자좌에서 DNA 가닥에 노출된 3' 단부를 형성하는 단계가 복제 오류를 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 41. 실시양태 19에 있어서, DNA 분자를 napDNAbp 및 가이드 RNA와 접촉시키는 단계가 R-루프를 형성하는 것인 방법.
실시양태 42. 실시양태 41에 있어서, 노출된 3' 단부가 형성되는 DNA 가닥이 R-루프에 있는 것인 방법.
실시양태 43. 실시양태 19에 있어서, PEgRNA가 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 연장 아암을 포함하는 것인 방법.
실시양태 44. 실시양태 43에 있어서, 연장 아암이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 있는 것인 방법.
실시양태 45. 실시양태 19에 있어서, PEgRNA가 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 46. 실시양태 19에 있어서, PEgRNA가 상동성 아암을 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 47. 실시양태 19에 있어서, RT 주형 서열이 상응하는 내인성 DNA에 상동인 방법.
실시양태 48. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계;
이로써 RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
이로써 목적하는 뉴클레오티드 변화를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계
를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, RT 주형이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하는 것인 방법.
실시양태 50. 실시양태 48에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 전이, 전환, 삽입 또는 결실 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 51. 실시양태 48에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 전이를 포함하는 것인 방법.
실시양태 52. 실시양태 48에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 전환을 포함하는 것인 방법.
실시양태 53. 실시양태 48에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 54. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 대체 서열을 포함하는 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 프라임 편집을 수행하여 대체 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 표적 DNA 분자에서 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이를 건강한 수의 반복 트리뉴클레오티드를 포함하는 건강한 서열로 대체하는 방법.
실시양태 55. 실시양태 54에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 56. 실시양태 54에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 57. 실시양태 54에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 58. 실시양태 54에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
실시양태 59. 실시양태 54에 있어서, (b) 프라임 편집을 수행하는 단계가 가이드 RNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링함으로써 폴리머라제를 프라이밍할 수 있는 3' 단부 프라이머 결합 서열을 표적 유전자좌에서 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 60. 실시양태 54에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 헌팅톤병, 유약 X 증후군 또는 프리드라이히 운동실조와 연관된 것인 방법.
실시양태 61. 실시양태 54에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 CAG 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
실시양태 62. 실시양태 54에 있어서, 트리뉴클레오티드 반복부 확장 돌연변이가 GAA 트리플렛의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
실시양태 63. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계;
이로써 RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 수행하여 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
이로써 목적하는 뉴클레오티드 변화를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계
를 포함하는, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법.
실시양태 64. 실시양태 63에 있어서, RT 주형이 가이드 RNA의 3' 단부, 가이드 RNA의 5' 단부 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하는 것인 방법.
실시양태 65. 실시양태 63에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 전이, 전환, 삽입 또는 결실 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 66. 실시양태 63에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 C로; (b) A에서 G로; (c) C에서 T로; 및 (d) G에서 A로 이루어진 군으로부터 선택된 전이를 포함하는 것인 방법.
실시양태 67. 실시양태 63에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (a) T에서 A로; (b) T에서 G로; (c) C에서 G로; (d) C에서 A로; (e) A에서 T로; (f) A에서 C로; (g) G에서 C로; 및 (h) G에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된 전환을 포함하는 것인 방법.
실시양태 68. 실시양태 63에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 69. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계;
이로써 보호 돌연변이를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계;
이로써 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계
를 포함하며, 보호 돌연변이를 포함하고 미스폴딩에 대해 저항성인 PRNP를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 PRNP 내로 1개 이상의 보호 돌연변이를 설치함으로써 프리온 질환의 진행을 예방하거나 정지시키는 방법.
실시양태 70. 실시양태 69에 있어서, 프리온 질환이 인간 프리온 질환인 방법.
실시양태 71. 실시양태 69에 있어서, 프리온 질환이 동물 프리온 질환인 방법.
실시양태 72. 실시양태 69에 있어서, 프리온 질환이 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 치명적 가족성 불면증 또는 쿠루병인 방법.
실시양태 73. 실시양태 69에 있어서, 프리온 질환이 소 해면상 뇌병증 (BSE 또는 "광우병"), 만성 소모성 질환 (CWD), 스크래피, 전염성 밍크 뇌병증, 고양이 해면상 뇌병증 및 유제류 해면상 뇌병증인 방법.
실시양태 74. 실시양태 69에 있어서, 야생형 PRNP 아미노산 서열이 서열식별번호: 291-292인 방법.
실시양태 75. 실시양태 69에 있어서, 서열식별번호: 293-309, 311-323으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 PRNP 아미노산 서열을 생성하며, 여기서 상기 변형된 PRNP 단백질은 미스폴딩에 대해 저항성인 방법.
실시양태 76. 실시양태 69에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 77. 실시양태 69에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 78. 실시양태 69에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 79. 실시양태 69에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777을 포함하는 것인 방법.
실시양태 80. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 시클린-의존성 키나제-유사 5 유전자 (CDKL5) 내의 돌연변이를 교정하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계;
이로써 편집을 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계;
이로써 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계
를 포함하며, 복구된 CDKL5 유전자를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에서 시클린-의존성 키나제-유사 5 유전자 (CDKL5) 내의 돌연변이를 교정함으로써 CDKL5 결핍 장애를 치료하는 방법.
실시양태 81. 실시양태 D80에 있어서, CDKL5 내의 돌연변이가 1412delA인 방법.
군 E. 단백질 구조/기능 및/또는 돌연변이유발을 변형시키기 위한 PE 방법
실시양태 1. (a) 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 오류-유발 중합체 (예를 들어, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제)를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 편집 주형을 포함하는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; 이로써 편집 주형으로부터 주형화된 단일 가닥 DNA를 중합시키는 단계; 및 단일 가닥 DNA를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 단계를 포함하는, 프라임 편집에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 돌연변이유발시키는 방법.
실시양태 2. 임의의 상기 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 3. 임의의 상기 실시양태에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 4. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 222를 포함하는 것인 방법.
실시양태 6. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계;
이로써 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계;
이로써 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계
를 포함하며, 관심 단백질 및 이뮤노에피토프를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 이뮤노에피토프를 설치하는 방법.
실시양태 7. 실시양태 6에 있어서, 이뮤노에피토프가 파상풍 톡소이드 (서열식별번호: 396); 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197 (서열식별번호: 630); 볼거리 이뮤노에피토프 1 (서열식별번호: 400); 볼거리 이뮤노에피토프 2 (서열식별번호: 402); 볼거리 이뮤노에피토프 3 (서열식별번호: 404); 풍진 바이러스 (서열식별번호: 406); 헤마글루티닌 (서열식별번호: 408); 뉴라미니다제 (서열식별번호: 410); TAP1 (서열식별번호: 412); TAP2 (서열식별번호: 414); 부류 I HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 416); 부류 I HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 418); 부류 II HLA에 대한 헤마글루티닌 에피토프 (서열식별번호: 420); 부류 II HLA에 대한 뉴라미니다제 에피토프 (서열식별번호: 422); 헤마글루티닌 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 424); 및 뉴라미니다제 에피토프 H5N1-결합된 부류 I 및 부류 II HLA (서열식별번호: 426)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 8. 실시양태 6에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 9. 실시양태 6에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 10. 실시양태 6에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 11. 실시양태 6에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777을 포함하는 것인 방법.
실시양태 12. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 소분자 이량체화 도메인을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계;
이로써 이뮤노에피토프를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계;
이로써 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계
를 포함하며, 관심 단백질 및 소분자 이량체화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 변형된 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 소분자 이량체화 도메인을 설치하는 방법.
실시양태 13. 실시양태 12에 있어서, 방법을 제2 관심 단백질에 대해 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, 제1 관심 단백질 및 제2 관심 단백질이 각각의 상기 단백질 상의 이량체화 도메인에 결합하는 소분자의 존재 하에 이량체화되는 것인 방법.
실시양태 15. 실시양태 12에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 488의 FKBP12인 방법.
실시양태 16. 실시양태 12에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 489의 FKBP12-F36V인 방법.
실시양태 17. 실시양태 12에 있어서, 소분자 결합 도메인이 서열식별번호: 490 및 493-494의 시클로필린인 방법.
실시양태 18. 실시양태 12에 있어서, 소분자가 본원에 기재된 바와 같은 소분자의 이량체인 방법.
실시양태 19. 실시양태 12에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 20. 실시양태 12에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 21. 실시양태 12에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 22. 실시양태 12에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777을 포함하는 것인 방법.
실시양태 23. 단백질을 코딩하는 표적 뉴클레오티드 서열을, 펩티드 태그를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열이 안에 삽입되도록 구성된 프라임 편집제 구축물과 접촉시켜 재조합 뉴클레오티드 서열을 생성함으로써, 재조합 뉴클레오티드 서열로부터 펩티드 태그 및 단백질이 융합 단백질로서 발현되도록 하는 것을 포함하는, 프라임 편집을 사용하여 단백질 상에 펩티드 태그 또는 에피토프를 설치하는 방법.
실시양태 24. 실시양태 23에 있어서, 펩티드 태그가 단백질의 정제 및/또는 검출에 사용되는 것인 방법.
실시양태 25. 실시양태 23에 있어서, 펩티드 태그가 폴리-히스티딘 (예를 들어, HHHHHH) (서열식별번호: 252-262), FLAG (예를 들어, DYKDDDDK) (서열식별번호: 2), V5 (예를 들어, GKPIPNPLLGLDST) (서열식별번호: 3), GCN4, HA (예를 들어, YPYDVPDYA) (서열식별번호: 5), Myc (예를 들어, EQKLISEED) (서열식별번호: 6) 또는 GST인 방법.
실시양태 26. 실시양태 23에 있어서, 펩티드 태그가 서열식별번호: 1-6, 245-249, 252-262, 264-273, 275-276, 281, 278-288 및 622로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 27. 실시양태 23에 있어서, 펩티드 태그가 링커에 의해 단백질에 융합되는 것인 방법.
실시양태 28. 실시양태 23에 있어서, 융합 단백질이 하기 구조: [단백질]-[펩티드 태그] 또는 [펩티드 태그]-[단백질]을 가지며, 여기서 "]-["는 임의적인 링커를 나타내는 것인 방법.
실시양태 29. 실시양태 23에 있어서, 링커가 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 30. 실시양태 23에 있어서, 프라임 편집제 구축물이 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PEgRNA를 포함하는 것인 방법.
실시양태 31. 실시양태 23에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
실시양태 32. 실시양태 23에 있어서, PEgRNA가 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 연장 아암은 펩티드 태그를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 주형을 포함하는 것인 방법.
실시양태 33. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; (b) 기능적 모이어티 또는 그의 결실을 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 (c) 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하고, 관심 단백질 및 기능적 모이어티 또는 그의 제거를 포함하는 변형된 단백질을 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하며, 여기서 기능적 모이어티는 단백질의 변형 상태 또는 국재화 상태를 변경시키는 것인, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 단백질에 기능적 모이어티를 설치하거나 결실시키는 방법.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서, 기능적 모이어티가 관심 단백질의 인산화, 유비퀴틸화, 글리코실화, 지질화, 히드록실화, 메틸화, 아세틸화, 크로토닐화 또는 SUMO화 상태를 변경시키는 것인 방법.
군 F. PE 전달 방법 및 조성물
실시양태 1. 프라임 편집제 융합 단백질의 N-말단 절반 또는 C-말단 절반을 포함하는 폴리펩티드.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질이 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 도메인 및 폴리머라제 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질이 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 존재 하에 프라임 편집을 수행할 수 있는 것인 폴리펩티드.
실시양태 4. 실시양태 2에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 폴리펩티드.
실시양태 5. 실시양태 2에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 뉴클레아제인 폴리펩티드.
실시양태 6. 실시양태 2에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 폴리펩티드.
실시양태 7. 실시양태 2에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 폴리펩티드.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질을 분할 부위에서 분할함으로써 형성되는 폴리펩티드.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서, 분할 부위가 napDNAbp 도메인 내의 펩티드 결합인 폴리펩티드.
실시양태 10. 실시양태 8에 있어서, 분할 부위가 폴리머라제 도메인 내의 펩티드 결합인 폴리펩티드.
실시양태 11. 실시양태 8에 있어서, 분할 부위가 napDNAbp 도메인과 폴리머라제 도메인 사이의 링커 내의 펩티드 결합인 폴리펩티드.
실시양태 12. 실시양태 9에 있어서, 분할 부위가 서열식별번호: 18 (정규 SpCas9)의 잔기 1과 2, 2와 3, 3과 4, 4와 5, 5와 6, 6과 7, 7과 8, 8과 9, 9와 10, 10과 11, 11과 12, 12와 13, 13과 14, 14와 15, 16과 17, 17과 18, 18과 19, 19와 20, 20과 21, 21과 22, 22와 23, 23과 24, 24와 25, 25와 26, 26과 27, 27과 28, 28과 29, 29와 30, 30과 31, 31과 32, 32와 33, 33과 34, 34와 35, 35와 36, 36과 37, 37과 38, 38과 39, 39와 40, 40과 41, 41과 42, 42와 43, 43과 44, 44와 45, 45와 46, 46과 47, 47과 48, 48과 49, 49와 50 사이, 또는 잔기 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300 또는 1300-1368의 임의의 2개의 잔기 사이, 또는 SpCas9 상동체 또는 서열식별번호: 18의 등가물의 임의의 2개의 등가 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합 내에 있는 것인 폴리펩티드.
실시양태 13. 실시양태 9에 있어서, 분할 부위가 서열식별번호: 89 (정규 리버스 트랜스크립타제 M-MLV RT)의 잔기 1과 2, 2와 3, 3과 4, 4와 5, 5와 6, 6과 7, 7과 8, 8과 9, 9와 10, 10과 11, 11과 12, 12와 13, 13과 14, 14와 15, 16과 17, 17과 18, 18과 19, 19와 20, 20과 21, 21과 22, 22와 23, 23과 24, 24와 25, 25와 26, 26과 27, 27과 28, 28과 29, 29와 30, 30과 31, 31과 32, 32와 33, 33과 34, 34와 35, 35와 36, 36과 37, 37과 38, 38과 39, 39와 40, 40과 41, 41과 42, 42와 43, 43과 44, 44와 45, 45와 46, 46과 47, 47과 48, 48과 49, 49와 50 사이, 또는 잔기 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-600 또는 600-667의 임의의 2개의 잔기 사이, 또는 리버스 트랜스크립타제 상동체 또는 서열식별번호: 89의 등가물의 임의의 2개의 등가 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합 내에 있는 것인 폴리펩티드.
실시양태 14. 실시양태 1에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질의 N-말단 절반인 폴리펩티드.
실시양태 15. 실시양태 1에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질의 C-말단 절반인 폴리펩티드.
실시양태 16. 실시양태 1-15 중 어느 것의 폴리펩티드 및 임의로 PEgRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
실시양태 17. 실시양태 1-15 중 어느 것의 폴리펩티드 및 임의로 PEgRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 게놈.
실시양태 18. 실시양태 17에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 실시양태 1-15 중 어느 것의 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 프로모터 서열을 추가로 포함하는 것인 바이러스 게놈.
실시양태 19. 실시양태 17에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 PEgRNA를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 것인 바이러스 게놈.
실시양태 20. 실시양태 1-15 중 어느 것의 폴리펩티드 및 임의로 PEgRNA를 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈을 포함하는 바이러스 입자.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, 바이러스 입자가 아데노바이러스 입자, 아데노-연관 바이러스 입자 또는 렌티바이러스 입자인 바이러스 입자.
실시양태 22. 실시양태 20에 있어서, 게놈에 의해 코딩된 폴리펩티드가 프라임 편집제 융합 단백질의 N 말단 절반인 바이러스 입자.
실시양태 23. 실시양태 20에 있어서, 게놈에 의해 코딩된 폴리펩티드가 프라임 편집제 융합 단백질의 C 말단 절반인 바이러스 입자.
실시양태 24. 실시양태 20-23 중 어느 것의 바이러스 입자 및 제약 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 25. 실시양태 22의 바이러스 입자 (N 말단 절반을 코딩함) 및 제약 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 26. 실시양태 23의 바이러스 입자 (C 말단 절반을 코딩함) 및 제약 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 27. 실시양태 1-15 중 어느 것의 폴리펩티드 및 임의로 PEgRNA를 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, 게놈에 의해 코딩된 폴리펩티드가 프라임 편집제 융합 단백질의 N-말단 절반인 리보핵단백질 (RNP) 복합체.
실시양태 29. 실시양태 27에 있어서, 게놈에 의해 코딩된 폴리펩티드가 프라임 편집제 융합 단백질의 C-말단 절반인 리보핵단백질 (RNP) 복합체.
실시양태 30. 실시양태 27-29 중 어느 것의 리보핵단백질 (RNP) 복합체 및 제약 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 31. 실시양태 28의 리보핵단백질 (RNP) 복합체 (N-말단 절반을 코딩함) 및 제약 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 32. 실시양태 29의 리보핵단백질 (RNP) 복합체 (C-말단 절반을 코딩함) 및 제약 부형제를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 33. 제1 AAV 입자 및 제2 AAV 입자를 포함하며, 여기서 제1 AAV 벡터는 프라임 편집제 융합 단백질의 N-말단 절반을 발현하고, 제2 AAV 벡터는 프라임 편집제 융합 단백질의 C-말단 절반을 발현하고, 여기서 N-말단 절반 및 C-말단 절반은 세포 내에서 조합되어 프라임 편집제를 재구성하는 것인 제약 조성물.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서, 제1 또는 제2 AAV 입자가 재구성된 프라임 편집제를 표적 DNA 부위로 표적화하는 PEgRNA를 또한 발현하는 것인 제약 조성물.
실시양태 35. 실시양태 33에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질이 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 도메인 및 폴리머라제 도메인을 포함하는 것인 제약 조성물.
실시양태 36. 실시양태 33에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질이 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 존재 하에 프라임 편집을 수행할 수 있는 것인 제약 조성물.
실시양태 37. 실시양태 35에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 제약 조성물.
실시양태 38. 실시양태 35에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 뉴클레아제인 제약 조성물.
실시양태 39. 실시양태 35에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 제약 조성물.
실시양태 40. 실시양태 35에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 제약 조성물.
실시양태 41. 실시양태 33에 있어서, N-말단 및 C-말단 절반이 프라임 편집제 융합 단백질을 분할 부위에서 분할함으로써 형성되는 것인 제약 조성물.
실시양태 42. 실시양태 41에 있어서, 분할 부위가 napDNAbp 도메인 내의 펩티드 결합인 제약 조성물.
실시양태 43. 실시양태 41에 있어서, 분할 부위가 폴리머라제 도메인 내의 펩티드 결합인 제약 조성물.
실시양태 44. 실시양태 41에 있어서, 분할 부위가 링커 내의 펩티드 결합인 제약 조성물.
실시양태 45. 실시양태 41에 있어서, 분할 부위가 서열식별번호: 18 (정규 SpCas9)의 잔기 1과 2, 2와 3, 3과 4, 4와 5, 5와 6, 6과 7, 7과 8, 8과 9, 9와 10, 10과 11, 11과 12, 12와 13, 13과 14, 14와 15, 16과 17, 17과 18, 18과 19, 19와 20, 20과 21, 21과 22, 22와 23, 23과 24, 24와 25, 25와 26, 26과 27, 27과 28, 28과 29, 29와 30, 30과 31, 31과 32, 32와 33, 33과 34, 34와 35, 35와 36, 36과 37, 37과 38, 38과 39, 39와 40, 40과 41, 41과 42, 42와 43, 43과 44, 44와 45, 45와 46, 46과 47, 47과 48, 48과 49, 49와 50 사이, 또는 잔기 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300 또는 1300-1368의 임의의 2개의 잔기 사이, 또는 SpCas9 상동체 또는 서열식별번호: 18의 등가물의 임의의 2개의 등가 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합 내에 있는 것인 제약 조성물.
실시양태 46. 실시양태 41에 있어서, 분할 부위가 서열식별번호: 89 (정규 리버스 트랜스크립타제 M-MLV RT)의 잔기 1과 2, 2와 3, 3과 4, 4와 5, 5와 6, 6과 7, 7과 8, 8과 9, 9와 10, 10과 11, 11과 12, 12와 13, 13과 14, 14와 15, 16과 17, 17과 18, 18과 19, 19와 20, 20과 21, 21과 22, 22와 23, 23과 24, 24와 25, 25와 26, 26과 27, 27과 28, 28과 29, 29와 30, 30과 31, 31과 32, 32와 33, 33과 34, 34와 35, 35와 36, 36과 37, 37과 38, 38과 39, 39와 40, 40과 41, 41과 42, 42와 43, 43과 44, 44와 45, 45와 46, 46과 47, 47과 48, 48과 49, 49와 50 사이, 또는 잔기 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-600 또는 600-667의 임의의 2개의 잔기 사이, 또는 리버스 트랜스크립타제 상동체 또는 서열식별번호: 89의 등가물의 임의의 2개의 등가 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합 내에 있는 것인 제약 조성물.
실시양태 47. 실시양태 33에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질의 N-말단 절반이 본원에 기재된 바와 같은 N-말단 프라임 편집제 융합 단백질을 코딩하는 아미노산 서열을 갖는 것인 제약 조성물.
실시양태 48. 실시양태 33에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질의 C-말단 절반이 본원에 기재된 바와 같은 N-말단 프라임 편집제 융합 단백질을 코딩하는 아미노산 서열을 갖는 것인 제약 조성물.
실시양태 49. 세포를 제1 AAV 입자 및 제2 AAV 입자로 형질감염시키는 것을 포함하며, 여기서 제1 AAV 벡터는 프라임 편집제 융합 단백질의 N-말단 절반을 발현하고, 제2 AAV 벡터는 프라임 편집제 융합 단백질의 C-말단 절반을 발현하고, 여기서 N-말단 절반 및 C-말단 절반은 세포 내에서 조합되어 프라임 편집제 융합 단백질을 재구성하는 것인, 세포에 프라임 편집제 융합 단백질을 전달하는 방법.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, 제1 또는 제2 AAV 입자가 재구성된 프라임 편집제를 표적 DNA 부위로 표적화하는 PEgRNA를 또한 발현하는 것인 방법.
실시양태 51. 실시양태 49에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질이 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 도메인 및 폴리머라제 도메인을 포함하는 것인 방법.
실시양태 52. 실시양태 49에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질이 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 존재 하에 프라임 편집을 수행할 수 있는 것인 방법.
실시양태 53. 실시양태 51에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 54. 실시양태 53에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 뉴클레아제인 방법.
실시양태 55. 실시양태 53에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 56. 실시양태 53에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 방법.
실시양태 57. 실시양태 49에 있어서, N-말단 및 C-말단 절반이 프라임 편집제 융합 단백질을 분할 부위에서 분할함으로써 형성되는 것인 방법.
실시양태 58. 실시양태 57에 있어서, 상기 분할 부위가 napDNAbp 도메인 내의 펩티드 결합인 방법.
실시양태 59. 실시양태 57에 있어서, 분할 부위가 폴리머라제 도메인 내의 펩티드 결합인 방법.
실시양태 60. 실시양태 57에 있어서, 분할 부위가 링커 내의 펩티드 결합인 방법.
실시양태 61. 실시양태 57에 있어서, 분할 부위가 서열식별번호: 18 (정규 SpCas9)의 잔기 1과 2, 2와 3, 3과 4, 4와 5, 5와 6, 6과 7, 7과 8, 8과 9, 9와 10, 10과 11, 11과 12, 12와 13, 13과 14, 14와 15, 16과 17, 17과 18, 18과 19, 19와 20, 20과 21, 21과 22, 22와 23, 23과 24, 24와 25, 25와 26, 26과 27, 27과 28, 28과 29, 29와 30, 30과 31, 31과 32, 32와 33, 33과 34, 34와 35, 35와 36, 36과 37, 37과 38, 38과 39, 39와 40, 40과 41, 41과 42, 42와 43, 43과 44, 44와 45, 45와 46, 46과 47, 47과 48, 48과 49, 49와 50 사이, 또는 잔기 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300 또는 1300-1368의 임의의 2개의 잔기 사이, 또는 SpCas9 상동체 또는 서열식별번호: 18의 등가물의 임의의 2개의 등가 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합 내에 있는 것인 방법.
실시양태 62. 실시양태 57에 있어서, 분할 부위가 서열식별번호: 89 (정규 리버스 트랜스크립타제 M-MLV RT)의 잔기 1과 2, 2와 3, 3과 4, 4와 5, 5와 6, 6과 7, 7과 8, 8과 9, 9와 10, 10과 11, 11과 12, 12와 13, 13과 14, 14와 15, 16과 17, 17과 18, 18과 19, 19와 20, 20과 21, 21과 22, 22와 23, 23과 24, 24와 25, 25와 26, 26과 27, 27과 28, 28과 29, 29와 30, 30과 31, 31과 32, 32와 33, 33과 34, 34와 35, 35와 36, 36과 37, 37과 38, 38과 39, 39와 40, 40과 41, 41과 42, 42와 43, 43과 44, 44와 45, 45와 46, 46과 47, 47과 48, 48과 49, 49와 50 사이, 또는 잔기 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-600 또는 600-667의 임의의 2개의 잔기 사이, 또는 리버스 트랜스크립타제 상동체 또는 서열식별번호: 89의 등가물의 임의의 2개의 등가 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합 내에 있는 것인 방법.
실시양태 63. 실시양태 49에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질의 N-말단 절반이 본원에 기재된 바와 같은 N-말단 프라임 편집제 융합 단백질을 코딩하는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 64. 실시양태 49에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질의 C-말단 절반이 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 프라임 편집제 융합 단백질을 코딩하는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 65. 실시양태 49에 있어서, 제1 AAV 입자가 제1 프라임 편집제 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함하는 것인 방법.
실시양태 66. 실시양태 49에 있어서, 제2 AAV 입자가 제2 프라임 편집제 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함하는 것인 방법.
실시양태 67. 실시양태 49에 있어서, 형질감염 단계가 생체내에서 수행되는 것인 방법.
실시양태 68. 실시양태 49에 있어서, 형질감염 단계가 생체외에서 수행되는 것인 방법.
실시양태 69. 실시양태 50에 있어서, 표적 DNA 부위가 질환-연관 유전자인 방법.
실시양태 70. 실시양태 69에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 트리뉴클레오티드 반복 장애; 프리온 질환; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 71. 실시양태 69에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 72. 실시양태 51에 있어서, 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 도메인이 방법.
실시양태 73. 실시양태 51에 있어서, 폴리머라제 도메인이 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 74. 실시양태 73에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
실시양태 75. 실시양태 73에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 76. 실시양태 73에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 77. 실시양태 73에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 78. 실시양태 8에 있어서, 분할 부위가 서열식별번호: 18의 1023 내지 1024 또는 서열식별번호: 18과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에 존재하는 것인 폴리펩티드.
군 G. RNA 구조/기능을 변형시키기 위한 PE 방법
실시양태 1. (a) 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계; 이로써 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 코딩하는 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및 단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 내인성 가닥 대신에 혼입시키는 단계를 포함하며, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 포함하는 변형된 관심 RNA를 코딩하는 재조합 표적 뉴클레오티드 서열을 생산하는, 프라임 편집에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 관심 RNA에 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그를 설치하는 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 검출 모이어티인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 발현 수준에 영향을 미치는 것인 방법.
실시양태 4. 실시양태 1에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 관심 RNA의 수송 또는 세포하 위치에 영향을 미치는 것인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, 리보뉴클레오티드 모티프 또는 태그가 SV40 유형 1, SV40 유형 2, SV40 유형 3, hGH, BGH, rbGlob, TK, MALAT1 ENE-mascRNA, KSHV PAN ENE, Smbox/U1 snRNA 박스, U1 snRNA 3' 박스, tRNA-리신, 브로콜리 압타머, 스피니치 압타머, 망고 압타머, HDV 리보자임 및 m6A로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 6. 실시양태 1에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777 (표 참조)을 포함하는 것인 방법.
실시양태 7. 실시양태 1에 있어서, 융합 단백질이 PE1, PE2 또는 PE3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 9. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
군 H. 유전자 라이브러리를 제조하기 위한 PE 방법
실시양태 1. (a) 각각 1개 이상의 표적 유전자좌를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 및 (ii) 1개 이상의 표적 유전자좌에 대해 적어도 1개의 유전자 변화를 갖는 서열을 포함하는 편집 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계;
이로써 편집 주형에 의해 주형화된 단일 가닥 DNA 서열을 중합시키는 단계; 및
단일 가닥 DNA 서열을 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 1개 이상의 표적 유전자좌 대신에 혼입시킴으로써, 적어도 1개의 유전자 변화를 상기 라이브러리의 표적 뉴클레오티드 서열의 표적 유전자좌 내로 혼입시키는 단계
를 포함하는, 프라임 편집에 의해 프로그램화된 돌연변이체 유전자 라이브러리를 구축하는 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 라이브러리가 플라스미드 라이브러리인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 라이브러리가 파지 라이브러리인 방법.
실시양태 4. 실시양태 1에 있어서, 1개 이상의 표적 유전자좌가 단백질을 코딩하는 영역을 포함하는 것인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, 1개 이상의 표적 유전자좌가 단백질의 2차 구조 모티프를 코딩하는 영역을 포함하는 것인 방법.
실시양태 6. 실시양태 5에 있어서, 2차 구조 모티프가 알파 헬릭스인 방법.
실시양태 7. 실시양태 5에 있어서, 2차 구조 모티프가 베타 시트인 방법.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 9. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 뉴클레아제인 방법.
실시양태 10. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 11. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 12. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 13. 실시양태 1에 있어서, 폴리머라제 도메인이 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 16. 실시양태 1에 있어서, 편집 주형 내의 적어도 1개의 유전자 변화가 삽입인 방법.
실시양태 17. 실시양태 1에 있어서, 편집 주형 내의 적어도 1개의 유전자 변화가 결실인 방법.
실시양태 18. 실시양태 1에 있어서, 편집 주형 내의 적어도 1개의 유전자 변화가 치환인 방법.
실시양태 19. 실시양태 1에 있어서, 적어도 1개의 유전자 변화가 1개 이상의 코돈의 삽입인 방법.
실시양태 20. 실시양태 1에 있어서, 적어도 1개의 유전자 변화가 1개 이상의 코돈의 결실인 방법.
실시양태 21. 실시양태 1에 있어서, 적어도 1개의 유전자 변화가 정지 코돈의 삽입인 방법.
실시양태 22. 실시양태 1에 있어서, 적어도 1개의 유전자 변화가 비-정지 코돈에서 정지 코돈으로의 전환인 방법.
실시양태 23. 실시양태 1에 있어서, 라이브러리의 각각의 표적 뉴클레오티드 서열 내의 적어도 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10개 또는 10-100 또는 100-200 또는 200-300 또는 300-400 또는 400-500개의 표적 유전자좌에서 동시에 수행되는 방법.
실시양태 24. 실시양태 1에 있어서, 방법이 PACE 또는 PANCE 진화 동안 수행되고, 여기서 적어도 1개의 유전자 변화를 상기 라이브러리의 표적 뉴클레오티드 서열의 표적 유전자좌 내로 혼입시키는 각각의 경우가 새로운 표적 서열을 또한 설치하는 것인 방법.
군 I. 오프-타겟 검출을 위한 PE 방법
실시양태 1. (a) 편집 부위를 갖는 표적 뉴클레오티드 서열을 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 융합 단백질 및 (ii) 검출가능한 서열을 코딩하는 DNA 합성 주형을 포함하는 PEgRNA와 접촉시키는 단계이며,
여기서 PEgRNA는 융합 단백질과 복합체화되고, 상기 융합 단백질을 편집 부위로 및 존재하는 경우에 1개 이상의 오프-타겟 부위로 가이드하고;
여기서 프라임 편집제 융합 단백질은 편집 부위에 및 존재하는 경우에 1개 이상의 오프-타겟 부위에 검출가능한 서열을 설치하는 것인 단계;
(b) 편집 부위 및 1개 이상의 오프-타겟 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계
를 포함하는, 프라임 편집제에 의한 오프-타겟 편집을 평가하는 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 표적 뉴클레오티드 서열이 게놈인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 접촉시키는 단계가 시험관내에서 이루어지는 것인 방법.
실시양태 4. 실시양태 1에 있어서, 접촉시키는 단계가 생체내에서 이루어지는 것인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, 편집 부위가 질환-연관 유전자 내의 돌연변이인 방법.
실시양태 6. 실시양태 5에 있어서, 돌연변이가 단일 염기 치환, 삽입, 결실 또는 역위인 방법.
실시양태 7. 실시양태 1에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
실시양태 9. 실시양태 1에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
실시양태 10. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트, 또는 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트의 변이체인 방법.
실시양태 11. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 12. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 13. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 14. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 15. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 SpCas9 야생형 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 16. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 SpCas9 오르토로그인 방법.
실시양태 17. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열인 방법.
실시양태 18. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 19. 실시양태 1에 있어서, 폴리머라제가 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 것인 방법.
실시양태 20. 실시양태 1에 있어서, 폴리머라제가 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 21. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 89 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 자연 발생 야생형 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 22. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 23. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.
실시양태 24. 실시양태 1에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 25. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 또는 적어도 26개 또는 적어도 27개 또는 적어도 28개 또는 적어도 29개 또는 적어도 30개 또는 적어도 31개 또는 적어도 32개 또는 적어도 33개 또는 적어도 34개 또는 적어도 35개 또는 적어도 40개 또는 적어도 50개 또는 적어도 60개 또는 적어도 70개 또는 적어도 80개 또는 적어도 90개 또는 적어도 100개의 핵염기의 삽입인 방법.
실시양태 26. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 또는 적어도 26개 또는 적어도 27개 또는 적어도 28개 또는 적어도 29개 또는 적어도 30개 또는 적어도 31개 또는 적어도 32개 또는 적어도 33개 또는 적어도 34개 또는 적어도 35개 또는 적어도 40개 또는 적어도 50개 또는 적어도 60개 또는 적어도 70개 또는 적어도 80개 또는 적어도 90개 또는 적어도 100개의 핵염기의 결실인 방법.
실시양태 27. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 핵염기 치환인 방법.
실시양태 28. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 전이 돌연변이인 방법.
실시양태 29. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 전환 돌연변이인 방법.
실시양태 30. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 및 (12) A에서 C로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 뉴클레오티드 치환인 방법.
실시양태 31. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 단일 뉴클레오티드 치환인 방법.
실시양태 32. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 바코드 서열인 방법.
실시양태 33. 실시양태 1에 있어서, 온-타겟 및 오프-타겟 부위에서 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 (d)가 (i) 표적 뉴클레오티드 서열을 단편화하여 단편을 형성하는 단계, (ii) 어댑터 서열을 단편의 단부에 부착시키는 단계, (iii) 한 쌍의 프라이머를 사용하여 앰플리콘을 PCR 증폭시키는 단계이며, 여기서 하나의 프라이머는 단편의 한 단부에서 부착된 어댑터 서열에 어닐링하고, 또 다른 프라이머는 단편 내에 위치한 프라임 편집에 의해 삽입된 어댑터 서열에 어닐링하는 것인 단계, 및 (iv) 앰플리콘을 서열분석하여 편집의 위치를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
군 J. 세포 데이터 기록을 위한 PE 방법
실시양태 1. (A) (i) napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 포함하는 프라임 편집제 융합 단백질 및 (ii) PEgRNA를 코딩하는 1개 이상의 구축물을 세포 내로 도입하는 단계이며, 여기서 융합 단백질 및/또는 PEgRNA의 발현은 세포 사건의 발생에 의해 유도되고, 융합 단백질 및/또는 PEgRNA의 발현시 세포의 게놈 내 표적 편집 부위의 프라임 편집을 유발하여 검출가능한 서열을 도입하는 것인 단계, 및 (B) 검출가능한 서열을 확인함으로써, 세포 사건의 발생을 확인하는 단계를 포함하는, 프라임 편집에 의해 세포 사건을 기록하는 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 단계 (A)의 프라임 편집이 동시에 새로운 표적 편집 부위를 도입하여 세포 사건의 기록이 반복적으로 일어날 수 있도록 하는 것인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, PEgRNA가 검출가능한 서열을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 것인 방법.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, 편집 주형이 새로운 표적 편집 부위를 추가로 코딩하는 것인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 또는 적어도 26개 또는 적어도 27개 또는 적어도 28개 또는 적어도 29개 또는 적어도 30개 또는 적어도 31개 또는 적어도 32개 또는 적어도 33개 또는 적어도 34개 또는 적어도 35개 또는 적어도 40개 또는 적어도 50개 또는 적어도 60개 또는 적어도 70개 또는 적어도 80개 또는 적어도 90개 또는 적어도 100개의 핵염기의 삽입인 방법.
실시양태 6. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 또는 적어도 26개 또는 적어도 27개 또는 적어도 28개 또는 적어도 29개 또는 적어도 30개 또는 적어도 31개 또는 적어도 32개 또는 적어도 33개 또는 적어도 34개 또는 적어도 35개 또는 적어도 40개 또는 적어도 50개 또는 적어도 60개 또는 적어도 70개 또는 적어도 80개 또는 적어도 90개 또는 적어도 100개의 핵염기의 결실인 방법.
실시양태 7. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 핵염기 치환인 방법.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 전이 돌연변이인 방법.
실시양태 9. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 전환 돌연변이인 방법.
실시양태 10. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 단일 뉴클레오티드 치환이며, 여기서 단일 뉴클레오티드 치환은 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
실시양태 11. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 단일 뉴클레오티드 치환인 방법.
실시양태 12. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 바코드 서열인 방법.
실시양태 13. 실시양태 1에 있어서, 검출가능한 서열이 세포 사건의 각각의 발생에 대한 검출가능한 서열의 반복적 삽입의 결과로서 시간 경과에 따라 길이가 증가하는 것인 방법.
실시양태 14. 실시양태 1에 있어서, 검출하는 단계가 편집된 표적 부위 또는 편집된 표적 부위의 앰플리콘을 서열분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 15. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트, 또는 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트의 변이체인 방법.
실시양태 16. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 17. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 18. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 방법.
실시양태 19. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 20. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 SpCas9 야생형 또는 그의 변이체인 방법.
실시양태 21. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 SpCas9 오르토로그인 방법.
실시양태 22. 실시양태 1에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열인 방법.
실시양태 23. 실시양태 1에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제가 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 24. 실시양태 23에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 89 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 자연 발생 야생형 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 25. 실시양태 23에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 리버스 트랜스크립타제인 방법.
실시양태 26. 실시양태 1에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 123 및 134 (PE1, PE2) 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 123 및 134 (PE1, PE2) 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 27. 실시양태 1에 있어서, 프라임 편집제 융합 단백질 및/또는 PEgRNA를 코딩하는 1개 이상의 구축물이 세포 사건이 발생하는 경우에 유도성인 1개 이상의 프로모터를 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 28. 실시양태 1에 있어서, 세포 사건이 세포에 의해 받은 자극에 의해 표시되는 것인 방법.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, 자극이 소분자, 단백질, 펩티드, 아미노산, 대사물, 무기 분자, 유기금속 분자, 유기 분자, 약물 또는 약물 후보, 당, 지질, 금속, 핵산, 내인성 또는 외인성 신호전달 캐스케이드의 활성화 동안 생산된 분자, 광, 열, 소리, 압력, 기계적 응력, 전단 응력, 또는 바이러스 또는 다른 미생물, pH의 변화 또는 산화/환원 상태의 변화인 방법.
실시양태 30. i. (a) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 코딩하는 핵산 서열 및 (b) RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 포함하며, 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 융합 단백질;
ii. 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 핵산 서열 (여기서 PEgRNA는 표적 서열에 상보적임); 및
iii. 복제 기점
을 포함하며, 여기서 프로모터 중 적어도 1개는 유도성 프로모터이고, 여기서 PEgRNA는 표적 편집 부위에 검출가능한 서열을 설치하기에 충분히 PEgRNA의 발현 및 napDNAbp의 발현을 유도하는 조건 하에 napDNAbp와 회합하는 것인, 프라임 편집을 사용하여 세포 사건을 기록하기 위한 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 31. 실시양태 30에 있어서, 유도성 프로모터가 세포 사건에 의해 유도되는 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 32. 실시양태 30에 있어서, 세포 사건이 세포에 의해 받은 자극에 의해 표시되는 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 33. 실시양태 32에 있어서, 자극이 소분자, 단백질, 펩티드, 아미노산, 대사물, 무기 분자, 유기금속 분자, 유기 분자, 약물 또는 약물 후보, 당, 지질, 금속, 핵산, 내인성 또는 외인성 신호전달 캐스케이드의 활성화 동안 생산된 분자, 광, 열, 소리, 압력, 기계적 응력, 전단 응력, 또는 바이러스 또는 다른 미생물, pH의 변화 또는 산화/환원 상태의 변화인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 34. 실시양태 30에 있어서, 제1 및 제2 프로모터가 동일한 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 35. 실시양태 30에 있어서, 제1 및 제2 프로모터가 상이한 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 36. 실시양태 30에 있어서, 적어도 1개의 유도성 프로모터가 안히드로테트라시클린-유도성 프로모터, IPTG-유도성 프로모터, 람노스-유도성 프로모터 또는 아라비노스-유도성 프로모터인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 37. 실시양태 30에 있어서, 제1 또는 제2 프로모터가 구성적 프로모터인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 구성적 프로모터가 Lac 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 구성적 RNA 폴리머라제 III 프로모터 또는 UBC 프로모터인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 39. 실시양태 30에 있어서, 복제 기점이 pSC101, pMB1, pBR322, ColE1 또는 p15A 복제 기점 서열을 포함하는 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 40. 실시양태 30에 있어서, PEgRNA가 검출가능한 서열을 코딩하는 편집 주형을 포함하는 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 41. 실시양태 40에 있어서, 편집 주형이 새로운 표적 편집 부위를 추가로 코딩하는 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 42. 실시양태 30에 있어서, 검출가능한 서열이 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 또는 적어도 26개 또는 적어도 27개 또는 적어도 28개 또는 적어도 29개 또는 적어도 30개 또는 적어도 31개 또는 적어도 32개 또는 적어도 33개 또는 적어도 34개 또는 적어도 35개 또는 적어도 40개 또는 적어도 50개 또는 적어도 60개 또는 적어도 70개 또는 적어도 80개 또는 적어도 90개 또는 적어도 100개의 핵염기의 삽입인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 43. 실시양태 30에 있어서, 검출가능한 서열이 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 또는 적어도 26개 또는 적어도 27개 또는 적어도 28개 또는 적어도 29개 또는 적어도 30개 또는 적어도 31개 또는 적어도 32개 또는 적어도 33개 또는 적어도 34개 또는 적어도 35개 또는 적어도 40개 또는 적어도 50개 또는 적어도 60개 또는 적어도 70개 또는 적어도 80개 또는 적어도 90개 또는 적어도 100개의 핵염기의 결실인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 44. 실시양태 30에 있어서, 검출가능한 서열이 핵염기 치환인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 45. 실시양태 30에 있어서, 검출가능한 서열이 전이 돌연변이인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 46. 실시양태 30에 있어서, 검출가능한 서열이 전환 돌연변이인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 47. 실시양태 30에 있어서, 검출가능한 서열이 단일 뉴클레오티드 치환이며, 여기서 단일 뉴클레오티드 치환은 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 48. 실시양태 30에 있어서, 검출가능한 서열이 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 단일 뉴클레오티드 치환인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 49. 실시양태 30에 있어서, 검출가능한 서열이 바코드 서열인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 50. 실시양태 30에 있어서, 검출가능한 서열이 세포 사건의 각각의 발생에 대한 검출가능한 서열의 반복적 삽입의 결과로서 시간 경과에 따라 길이가 증가하는 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 51. 실시양태 30에 있어서, 검출하는 단계가 편집된 표적 부위 또는 편집된 표적 부위의 앰플리콘을 서열분석하는 것을 포함하는 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 52. 실시양태 30에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트, 또는 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트의 변이체인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 53. 실시양태 30에 있어서, napDNAbp가 Cas9 또는 그의 변이체인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 54. 실시양태 30에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 55. 실시양태 30에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 56. 실시양태 30에 있어서, napDNAbp가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 57. 실시양태 30에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 SpCas9 야생형 또는 그의 변이체인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 58. 실시양태 30에 있어서, napDNAbp가 SpCas9 오르토로그인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 59. 실시양태 30에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 18-88, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 및 482-487 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 60. 실시양태 30에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제가 리버스 트랜스크립타제인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 61. 실시양태 30에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 89 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 자연 발생 야생형 리버스 트랜스크립타제인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 62. 실시양태 30에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 리버스 트랜스크립타제인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 63. 실시양태 30에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 123 및 134 (PE1, PE2) 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 123 및 134 (PE1, PE2) 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포 데이터 기록 플라스미드.
실시양태 64. 실시양태 30-63 중 어느 하나의 세포 데이터 기록 플라스미드를 포함하는 세포에 사용하기 위한 키트.
실시양태 65. 실시양태 64에 있어서, 세포가 원핵 세포인 키트.
실시양태 66. 실시양태 64에 있어서, 세포가 진핵 세포인 키트.
실시양태 67. 실시양태 30-63 중 어느 하나의 세포 데이터 기록 플라스미드를 포함하는 세포.
실시양태 68. 실시양태 67에 있어서, 원핵 세포인 세포.
실시양태 69. 실시양태 67에 있어서, 진핵 세포인 세포.
실시양태 70. 실시양태 69에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 세포.
실시양태 71. 실시양태 70에 있어서, 포유동물 세포가 인간 세포인 세포.
실시양태 72. (A) 실시양태 30-63 중 어느 것의 세포 데이터 기록 플라스미드를 세포 내로 도입하는 단계이며, 여기서 융합 단백질 및/또는 PEgRNA는 세포 사건의 발생에 의해 유도되고, 융합 단백질 및/또는 PEgRNA의 발현은 세포의 게놈 내 표적 편집 부위의 프라임 편집을 유발하여 검출가능한 서열을 도입하는 것인 단계, 및 (B) 검출가능한 서열을 확인함으로써, 세포 사건의 발생을 확인하는 단계를 포함하는, 프라임 편집에 의해 세포 사건을 기록하는 방법.
실시양태 73. 실시양태 72에 있어서, (A) 도입하는 단계가 형질감염 또는 전기천공에 의한 것인 방법.
등가물 및 범주
단수형은 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 군의 1개 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 실시양태 또는 기재는 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 군 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 그에 사용되거나 또는 달리 그와 관련되는 경우에 충족된 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 그에 사용되거나 또는 달리 그와 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 군 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 그에 사용되거나 또는 달리 그와 관련되는 실시양태를 포함한다.
추가로, 본 개시내용은 열거된 청구항 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항 및 서술적 용어를 또 다른 청구항에 도입하는 모든 변형, 조합 및 순열을 포괄한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속하는 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속하는 임의의 다른 청구항에서 발견된 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로서, 예를 들어 마쿠쉬 군 포맷으로 제시되는 경우에, 요소의 각각의 하위군이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)는 군으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특정한 요소 및/또는 특색을 포함하는 것으로 언급되는 경우에, 본 개시내용의 특정 실시양태 또는 본 개시내용의 특정 측면은 이러한 요소 및/또는 특색으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 단순성의 목적을 위해, 이들 실시양태는 본원에 구체적으로 제시되지 않았다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적인 것으로 의도되고, 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 것이 주목된다. 범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 추가로, 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로서 표현된 값은 본 발명의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 구체적 값 또는 하위-범위를, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 그러한 범위의 하한치 단위의 1/10까지 가정할 수 있다.
본 출원은 다양한 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 학술지 논문 및 다른 공개물을 언급하며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 임의의 포함된 참고문헌과 본 명세서 사이에 상충이 존재하는 경우, 본 명세서가 우선할 것이다. 추가로, 선행 기술에 속하는 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 실시양태 중 어느 하나 이상으로부터 명백하게 배제될 수 있다. 이러한 실시양태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이들은 배제가 본원에 명백하게 제시되지 않더라도 배제될 수 있다. 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 선행 기술의 존재와 관련되든 관련되지 않든 임의의 이유로 임의의 실시양태로부터 배제될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 실시양태의 범주는 상기 설명에 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 첨부된 실시양태에 제시된 바와 같다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하기 실시양태에 정의된 바와 같은 본 발명의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 설명에 대한 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> The Broad Institute, Inc. President and Fellows of Harvard College Liu, David R. Anzalone, Andrew Vito Randolph, Peyton Nelson, James <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR EDITING NUCLEOTIDE SEQUENCES <130> B1195.70097WO00 <140> PCT/US2020/023713 <141> 2020-03-19 <150> US 63/100,548 <151> 2020-03-17 <150> US 62/991,069 <151> 2020-03-17 <150> US 62/974,537 <151> 2019-12-05 <150> US 62/944,231 <151> 2019-12-05 <150> US 62/931,195 <151> 2019-11-05 <150> US 62/973,558 <151> 2019-10-10 <150> US 62/913,553 <151> 2019-10-10 <150> US 62/922,654 <151> 2019-08-21 <150> US 62/889,996 <151> 2019-08-21 <150> US 62/858,958 <151> 2019-06-07 <150> US 62/820,813 <151> 2019-03-19 <160> 3872 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Phe Leu Asn Cys Cys Pro Gly Cys Cys Met Glu Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu 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180 gcgacccgcc tgaaacgcac cgcgcgccgc cgctataccc gccgcaaaaa ccgcatttgc 240 tatctgcagg aaatttttag caacgaaatg gcgaaagtgg atgatagctt ttttcatcgc 300 ctggaagaaa gctttctggt ggaagaagat aaaaaacatg aacgccatcc gatttttggc 360 aacattgtgg atgaagtggc gtatcatgaa aaatatccga ccatttatca tctgcgcaaa 420 aaactggtgg atagcaccga taaagcggat ctgcgcctga tttatctggc gctggcgcat 480 atgattaaat ttcgcggcca ttttctgatt gaaggcgatc tgaacccgga taacagcgat 540 gtggataaac tgtttattca gctggtgcag acctataacc agctgtttga agaaaacccg 600 attaacgcga gcggcgtgga tgcgaaagcg attctgagcg cgcgcctgag caaaagccgc 660 cgcctggaaa acctgattgc gcagctgccg ggcgaaaaaa aaaacggcct gtttggcaac 720 ctgattgcgc tgagcctggg cctgaccccg aactttaaaa gcaactttga tctggcggaa 780 gatgcgaaac tgcagctgag caaagatacc tatgatgatg atctggataa cctgctggcg 840 cagattggcg atcagtatgc ggatctgttt ctggcggcga aaaacctgag cgatgcgatt 900 ctgctgagcg atattctgcg cgtgaacacc gaaattacca aagcgccgct gagcgcgagc 960 atgattaaac gctatgatga acatcatcag gatctgaccc tgctgaaagc gctggtgcgc 1020 cagcagctgc 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agtctttttg agttagaaaa cggtcgtaaa cggatgctgg ctagtgccgg agaattacaa 3660 aaaggaaatg agctggctct gccaagcaaa tatgtgaatt ttttatattt agctagtcat 3720 tatgaaaagt tgaagggtag tccagaagat aacgaacaaa aacaattgtt tgtggagcag 3780 cataagcatt atttagatga gattattgag caaatcagtg aattttctaa gcgtgttatt 3840 ttagcagatg ccaatttaga taaagttctt agtgcatata acaaacatag agacaaacca 3900 atacgtgaac aagcagaaaa tattattcat ttatttacgt tgacgaatct tggagctccc 3960 gctgctttta aatattttga tacaacaatt gatcgtaaac gatatacgtc tacaaaagaa 4020 gttttagatg ccactcttat ccatcaatcc atcactggtc tttatgaaac acgcattgat 4080 ttgagtcagc taggaggtga ctga 4104 <210> 21 <211> 1367 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 21 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Gly Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg 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LEUKEMIA VIRUS <220> <221> SITE <222> (229)..(229) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 90 Ala Phe Pro Leu Glu Arg Pro Asp Trp Asp Tyr Thr Thr Gln Ala Gly 1 5 10 15 Arg Asn His Leu Val His Tyr Arg Gln Leu Leu Leu Ala Gly Leu Gln 20 25 30 Asn Ala Gly Arg Ser Pro Thr Asn Leu Ala Lys Val Lys Gly Ile Thr 35 40 45 Gln Gly Pro Asn Glu Ser Pro Ser Ala Phe Leu Glu Arg Leu Lys Glu 50 55 60 Ala Tyr Arg Arg Tyr Thr Pro Tyr Asp Pro Glu Asp Pro Gly Gln Glu 65 70 75 80 Thr Asn Val Ser Met Ser Phe Ile Trp Gln Ser Ala Pro Asp Ile Gly 85 90 95 Arg Lys Leu Gly Arg Leu Glu Asp Leu Lys Ser Lys Thr Leu Gly Asp 100 105 110 Leu Val Arg Glu Ala Glu Lys Ile Phe Asn Lys Arg Glu Thr Pro Glu 115 120 125 Glu Arg Glu Glu Arg Ile Arg Arg Glu Thr Glu Glu Lys Glu Glu Arg 130 135 140 Arg Arg Thr Val Asp Glu Gln Lys Glu Lys Glu Arg Asp Arg Arg Arg 145 150 155 160 His Arg Glu Met Ser Lys Leu Leu Ala Thr Val Val Ile Gly Gln Glu 165 170 175 Gln Asp Arg Gln Glu Gly Glu Arg Lys Arg Pro Gln Leu Asp Lys 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<223> Synthetic <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 213 Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Xaa Gly Gly Xaa 1 5 10 15 Gly <210> 214 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> SITE <222> (21)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 214 Met Met Met Met Met Met Met Met Met Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn 1 5 10 15 Asn Asn Asn Asn Xaa Gly Gly Xaa Gly 20 25 <210> 215 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 215 Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Xaa Gly Gly Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 216 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 216 nnnnnnnngt ttttgtactc tcaagattta gaaataaatc ttgcagaagc tacaaagata 60 aggcttcatg ccgaaatcaa caccctgtca ttttatggca gggtgttttc gttatttaat 120 ttttt 125 <210> 217 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 217 nnnnnnnnnn nnnnnnnngt ttttgtactc tcagaaatgc agaagctaca aagataaggc 60 ttcatgccga aatcaacacc ctgtcatttt atggcagggt gttttcgtta tttaattttt 120 t 121 <210> 218 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 218 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcagaaat gcagaagcta caaagataag 60 gcttcatgcc gaaatcaaca ccctgtcatt ttatggcagg gtgtttttt 109 <210> 219 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 219 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 102 <210> 220 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 220 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt gttttttt 88 <210> 221 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 221 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcatt tttttt 76 <210> 222 <211> 82 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 222 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag 60 uggcaccgag ucggugcuuu uu 82 <210> 223 <211> 905 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 223 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcg ttcactgccg 600 tataggcagg gcccagactg agcacgtgag ttttagagct agaaatagca agttaaaata 660 aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg ggaccgagtc ggtcctctgc catcaaagcg 720 tgctcagtct gttttagggt catgaaggtt tttcttttcc tgagaaaaca acacgtattg 780 ttttctcagg ttttgctttt tggccttttt ctagcttaaa aaaaaaaaaa gcaaaagatg 840 ctggtggttg gcactcctgg tttccaggac ggggttcaaa tccctgcggc gtctttgctt 900 tgact 905 <210> 224 <211> 942 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cccagtgtat attggaaaaa catgttatac ttttgacaat 840 ttaacgtgcc tagagctcaa attaaactaa taccataacg taatgcaact tacaacataa 900 ataaaggtca atgtttaatc cataaaaaaa aaaaaaaaaa aa 942 <210> 225 <211> 1370 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 225 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcg ttcactgccg 600 tataggcagg gcccagactg agcacgtgag ttttagagct agaaatagca agttaaaata 660 aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg ggaccgagtc ggtcctctgc catcaaagcg 720 tgctcagtct gttttgtttt ggctgggttt ttccttgttc gcaccggaca cctccagtga 780 ccagacggca aggtttttat cccagtgtat attggaaaaa catgttatac ttttgacaat 840 ttaacgtgcc tagagctcaa attaaactaa taccataacg taatgcaact tacaacataa 900 ataaaggtca atgtttaatc cataaaaaaa aaaaaaaaaa aaacacactg ttttggctgg 960 gtttttcctt gttcgcaccg gacacctcca gtgaccagac ggcaaggttt ttatcccagt 1020 gtatattgga aaaacatgtt atacttttga caatttaacg tgcctagagc tcaaattaaa 1080 ctaataccat aacgtaatgc aacttacaac ataaataaag gtcaatgttt aatccataaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaatctc tctgttttgg ctgggttttt ccttgttcgc accggacacc 1200 tccagtgacc agacggcaag gtttttatcc cagtgtatat tggaaaaaca tgttatactt 1260 ttgacaattt aacgtgccta gagctcaaat taaactaata ccataacgta atgcaactta 1320 caacataaat aaaggtcaat gtttaatcca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1370 <210> 226 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 226 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcg ttcactgccg 600 tataggcagg gcccagactg agcacgtgag ttttagagct agaaatagca agttaaaata 660 aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg ggaccgagtc ggtcctctgc catcaaagcg 720 tgctcagtct gtttgtttca aaagtagact gtacgctaag ggtcatatct ttttttgttt 780 ggtttgtgtc ttggttggcg tcttaaa 807 <210> 227 <211> 743 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 227 ctaaggacca 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gcaagttaaa 60 ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtgggaccga gtcggtcctc tgccatcaaa 120 gcgtgctcag tctgtttttt t 141 <210> 229 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 229 ggcccagact gagcacgtga gtttgagagc tagaaatagc aagtttaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt gggaccgagt cggtcctctg ccatcaaagc gtgctcagtc 120 tgttttttt 129 <210> 230 <211> 197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 230 ggcccagact gagcacgtga gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt gggaccgagt cggtcctctg ccatcaaagc gtgctcagtc 120 tgggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg ggcaacatgc ttcggcatgg 180 cgaatgggac ttttttt 197 <210> 231 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 231 ggtgggagac gtcccaccgg cccagactga gcacgtgagt tttagagcta gaaatagcaa 60 gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg gaccgagtcg gtcctctgcc 120 atcaaagctt cgaccgtgct cagtctggtg ggagacgtcc cacctttttt t 171 <210> 232 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 232 gagcagcatg gcgtcgctgc tcacggccca gactgagcac gtgagtttta gagctagaaa 60 tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtgggacc gagtcggtcc 120 tctgccatca aagcttcgac cgtgctcagt ctccatcagt tgacaccctg aggttttttt 180 <210> 233 <211> 188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 233 gcagacctaa gtggugacat atggtctggg cccagactga gcacgtgagt tttagagcta 60 uacgtagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt uacgaagtgg gaccgagtcg 120 gtcctctgcc atcaaagctt cgaccgtgct cagtctgcat gcgattagaa ataatcgcat 180 gttttttt 188 <210> 234 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 234 tctgccatca aagctgcgac cgtgctcagt ctggtgggag acgtcccacc ggccggcatg 60 gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg aatgggactt 120 ttttt 125 <210> 235 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 235 Met Gly Lys Arg His Arg Asn Leu Ile Asp Gln Ile Thr Thr Trp Glu 1 5 10 15 Asn Leu Leu Asp Ala Tyr Arg 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328 <211> 119 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 328 gcagtagtgg ggggccttgg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcatgt agacaccaag gccccccac 119 <210> 329 <211> 119 <212> DNA <213> Odocoileus virginianus <400> 329 gcagtggtag ggggccttgg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcatgt agacaccaag gccccctac 119 <210> 330 <211> 119 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mustela putorius furo <400> 330 gcggttgtgg ggggcctggg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcatgt agacgcccag gccccccac 119 <210> 331 <211> 122 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Polyomavirus simian virus <400> 331 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120 ta 122 <210> 332 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 332 atccttccag tcagggccat gtttgagagc tagaaatagc 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simian virus <400> 335 tgatcataat caagccatat cacatctgta gaggtttact tgctttaaaa aacctccaca 60 cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc 120 agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 180 ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat 240 ctgc 244 <210> 336 <211> 374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 336 atccttccag tcagggccat gtttgagagc tagaaatagc aagtttaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt gggaccgagt cggtccacct gaaccgtata tcgcagatcc 120 agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa 180 atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 240 taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg 300 gaggtttttt aaagcaagta aacctctaca gatgtgatat ggcttgatta tgatcactat 360 ggccctgact ggaa 374 <210> 337 <211> 479 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 337 acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60 cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat 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685 Ser Lys Leu Ser Gln Cys Ser Ser Lys Asp Ser Asp Ser Glu Glu Ser 690 695 700 Asp Cys Asn Ile Lys Leu Leu Asp Ser Gln Ser Asp Gln Thr Ser Lys 705 710 715 720 Leu Arg Leu Ser His Phe Ser Lys Lys Asp Thr Pro Leu Arg Asn Lys 725 730 735 Val Pro Gly Leu Tyr Lys Ser Ser Ser Ala Asp Ser Leu Ser Thr Thr 740 745 750 Lys Ile Lys Pro Leu Gly Pro Ala Arg Ala Ser Gly Leu Ser Lys Lys 755 760 765 Pro Ala Ser Ile Gln Lys Arg Lys His His Asn Ala Glu Asn Lys Pro 770 775 780 Gly Leu Gln Ile Lys Leu Asn Glu Leu Trp Lys Asn Phe Gly Phe Lys 785 790 795 800 Lys Asp Ser Glu Lys Leu Pro Pro Cys Lys Lys Pro Leu Ser Pro Val 805 810 815 Arg Asp Asn Ile Gln Leu Thr Pro Glu Ala Glu Glu Asp Ile Phe Asn 820 825 830 Lys Pro Glu Cys Gly Arg Val Gln Arg Ala Ile Phe Gln 835 840 845 <210> 3871 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3871 gccaacatga ggatcaccca tgtctgcagg gcc 33 <210> 3872 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3872 Gly Ser Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly 1 5 10 15 Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala 20 25 30 Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys 35 40 45 Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val 50 55 60 Glu Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Glu Glu Leu Pro 65 70 75 80 Val Ala Gly Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile 85 90 95 Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser 115 120 125 Gly Ile Tyr 130 "Rectified under Rule91 ISA/EP"

Claims (52)

  1. (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및
    (ii) 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)
    를 포함하는, 프라임 편집을 위한 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 융합 단백질이 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 존재 하에 프라임 편집을 수행하여 표적 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치할 수 있는 것인 복합체.
  3. 제11항에 있어서, napDNAbp가 닉카제 활성을 갖는 것인 복합체.
  4. 제1항에 있어서, napDNAbp가 Cas9 단백질 또는 그의 변이체인 복합체.
  5. 제1항에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 복합체.
  6. 제1항에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 복합체.
  7. 제1항에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는 것인 복합체.
  8. 제1항에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 복합체.
  9. 제1항에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 서열식별번호: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700, 701-716, 739-741 및 766 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 리버스 트랜스크립타제인 복합체.
  10. 제1항에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제인 복합체.
  11. 제1항에 있어서, 융합 단백질이 PEgRNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 것인 복합체.
  12. 제1항에 있어서, PEgRNA가 가이드 RNA 및 DNA 합성 주형을 포함하는 적어도 1개의 핵산 연장 아암을 포함하는 것인 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 핵산 연장 아암이 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하고, 핵산 연장 아암이 DNA 또는 RNA인 복합체.
  14. 제12항에 있어서, PEgRNA가 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 복합체.
  15. 제14항에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 복합체.
  16. 제12항에 있어서, 가이드 RNA가 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 복합체.
  17. 제12항에 있어서, 적어도 1개의 핵산 연장 아암이 프라이머 결합 부위를 추가로 포함하는 것인 복합체.
  18. 제12항에 있어서, 핵산 연장 아암이 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 41개 뉴클레오티드, 적어도 42개 뉴클레오티드, 적어도 43개 뉴클레오티드, 적어도 44개 뉴클레오티드, 적어도 45개 뉴클레오티드, 적어도 46개 뉴클레오티드, 적어도 47개 뉴클레오티드, 적어도 48개 뉴클레오티드, 적어도 49개 뉴클레오티드 또는 적어도 50개 뉴클레오티드인 복합체.
  19. 제12항에 있어서, DNA 합성 주형이 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 복합체.
  20. 제17항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 복합체.
  21. 제12항에 있어서, PEgRNA가 링커, 스템 루프, 헤어핀, 토루프, 압타머 또는 RNA-단백질 동원 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 구조를 추가로 포함하는 것인 복합체.
  22. 제12항에 있어서, DNA 합성 주형이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 복합체.
  23. 제22항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하며, 여기서 내인성 단일 가닥 DNA는 닉 부위의 하류에 바로 인접한 것인 복합체.
  24. 제23항에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 복합체.
  25. 제23항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 복합체.
  26. 제12항에 있어서, PEgRNA가 서열식별번호: 18-36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 101-104, 181-183, 223-244, 277, 325-334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 499-505, 735-761, 776-777 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
  27. 제12항에 있어서, DNA 합성 주형이 내인성 DNA 표적에 대해 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
  28. 제17항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 절단된 DNA의 유리 3' 단부와 혼성화하는 것인 복합체.
  29. 제21항에 있어서, 적어도 1개의 추가의 구조가 PEgRNA의 3' 또는 5' 단부에 위치하는 것인 복합체.
  30. 제29항에 있어서, 링커가 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
  31. 제29항에 있어서, 스템 루프가 본원에 기재된 스템 루프로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
  32. 제29항에 있어서, 헤어핀이 본원에 기재된 헤어핀으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
  33. 제29항에 있어서, 토루프가 본원에 기재된 토루프로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
  34. 제29항에 있어서, 압타머가 본원에 기재된 압타머로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
  35. 제29항에 있어서, RNA-단백질 동원 도메인이 본원에 기재된 RNA-단백질 동원 도메인으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
  36. 제1항에 있어서, 표적 DNA 서열이 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 복합체.
  37. 제36항에 있어서, R-루프가 (i) PEgRNA 및 표적 가닥을 포함하는 RNA-DNA 하이브리드 및 (ii) 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 복합체.
  38. 제37항에 있어서, 표적 또는 상보적 비-표적 가닥이 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 프라이밍 서열을 형성하는 것인 복합체.
  39. 제38항에 있어서, 닉 부위가 표적 가닥 상의 PAM 서열의 상류인 복합체.
  40. 제38항에 있어서, 닉 부위가 비-표적 가닥 상의 PAM 서열의 상류인 복합체.
  41. 제38항에 있어서, 닉 부위가 PAM 서열의 5' 단부에 대해 -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 또는 -9인 복합체.
  42. 제22항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 혼성화함으로써, 표적 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 것인 복합체.
  43. 제22항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접하고 유리 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열을 대체하는 것인 복합체.
  44. 제22항에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 세포에 의해 절제되는 것인 복합체.
  45. 제44항에 있어서, 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열이 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 절제되는 것인 복합체.
  46. 제43항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 비-표적 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 혼입시킴으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 복합체.
  47. 제46항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 PAM 서열의 약 -4 내지 +10 또는 PAM 서열의 약 -10 내지 +20 또는 PAM 서열의 약 -20 내지 +40 또는 PAM 서열의 약 -30 내지 +100인 편집 윈도우에 설치되는 것인 복합체.
  48. 제47항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 닉 부위의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 뉴클레오티드 하류에 설치되는 것인 복합체.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 구조 NH2-[napDNAbp]-[RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인]-COOH; 또는 NH2-[RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인]-[napDNAbp]-COOH를 포함하며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타내는 것인 복합체.
  50. 제49항에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 127, 165-176, 446, 453 및 767-769의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
  51. 제1항에 있어서, 융합 단백질이 napDNAbp와 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인을 연결하는 링커를 추가로 포함하는 것인 복합체.
  52. 제51항에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 3887 (1x SGGS), 3888 (2x SGGS), 3889 (3x SGGS), 3890 (1x XTEN), 3891 (1x EAAAK), 3892 (2x EAAAK) 및 3893 (3x EAAAK)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
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