CN116286738B - Dsb-pe基因编辑系统及其应用 - Google Patents
Dsb-pe基因编辑系统及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116286738B CN116286738B CN202310083155.5A CN202310083155A CN116286738B CN 116286738 B CN116286738 B CN 116286738B CN 202310083155 A CN202310083155 A CN 202310083155A CN 116286738 B CN116286738 B CN 116286738B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- dsb
- editing
- pegrna
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 26
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 5
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 5
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 3
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Polymers C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100021601 Ephrin type-A receptor 8 Human genes 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000898676 Homo sapiens Ephrin type-A receptor 8 Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150045355 akt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 101150074154 pe gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000031877 prophase Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种DSB‑PE基因编辑系统及其应用。DSB‑PE基因编辑系统包括融合蛋白和pegRNA；pegRNA依次由spacer、scaffold尾端碱基、靶点序列以及PBS组成，靶点序列与scaffold尾端碱基及其互补配对碱基之间不包括逆转录模板；融合蛋白为野生型Cas9切刻酶与逆转录酶RT融合所形成。本发明的DSB‑PE系统保留了PE2系统编辑形式多样的优点，同时编辑效率高、应用范围更广泛，并且在不影响切割效率的情况下大大提升目标碱基准确插入比率，提高DSB‑PE系统的生物安全性。本系统更适用于不需要维持插入序列3'端无缝连接的编辑应用场景，可通过高效插入终止密码子实现靶基因敲除。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及DSB-PE基因编辑系统及其应用。
背景技术
基因编辑技术作为生命科学的新兴研究领域，可直接对遗传物质中的特定序列进行定点敲除、插入或突变，为基因的功能研究、基因检测和治疗提供了强有力的工具，极大地推动了生命科学的发展。随着对基因编辑技术的不断探索，新型核酸酶的发现使基因编辑技术发生了质的飞跃，锌指核酸酶技术(zinc finger nucleases,ZFNs)、类转录激活因子效应核酸酶技术(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)、规律成簇间隔的短回文重复相关蛋白技术(clustered regμlarly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)等基因编辑技术相继出现。其中，CRISPR/Cas9基因编辑技术以其效率高、特异性强及可扩展性等优势在基因编辑领域占据了越来越重要的地位。
然而，随着越来越多的基因变异类型被证实，单纯的CRISPR/Cas9基因编辑技术无法对产生的碱基缺失、替换及插入等进行编辑纠正，已经难以满足基因治疗的要求。为了解决这一难题，引导编辑Prime Editor(PE)基因编辑技术应运而生，这种方法可以在不引入双链断裂(DSB)和供体DNA模板的前提下，实现靶标位点的插入、缺失和所有12种类型点突变(目前ABE和CBE系统仅能实现C→T，G→A，A→G，T→C四种突变类型)，扩展了碱基编辑的范围，提高了精准编辑的效率。PE是一种基于搜索和替换(search-and-replace)的基因组编辑方式，引导编辑的搜索功能是基于改造的向导RNA(the engineered guide RNA，thepegRNA)，pegRNA中包含我们熟知的single guide RNAs(sgRNAs)，不同的是，在其3’端还有一段引物结合序列(Primer binding site，PBS)和转录模板序列(RT template，RTT)。prime editor蛋白由nCas9切口酶(Cas9nickase，仅有切割单链的功能，H840A)和逆转录酶(M-MLV RT)融合而成。这样，nCas9切口酶在pegRNA上的sgRNA序列指引下，切割DNA单链，pegRNA3’端的PBS(引物结合序列)可以与切割断点前的互补序列识别配对，逆转录酶(M-MLV RT)以pegRNA上PBS序列后的人工设计的模板序列为模板进行逆转录，将目标序列直接聚合到切口的DNA链上，可以在无需引入双链断裂和外源DNA模板的情况下，有效地产生精确的碱基转换或颠换、插入和缺失等变异。
然而，不同的PE编辑系统对同一位点进行编辑时，编辑效率不尽相同，pegRNA中PBS序列长度、RTT序列长度以及切口sgRNA的位置都会影响其基因编辑效率；进行插入或缺失编辑时，插入或缺失片段的增长也会导致其编辑效率降低。此外，目前PE编辑系统利用仅具有单链DNA切割功能的nCas9切口酶，降低了编辑副产物indel的发生率，但其切割活性较野生型Cas9大大降低。另外，nCas9切割DNA单链后，主要依靠细胞内同源重组修复途径(homology directed repair，HDR)进行修复，大量研究证实该途径修复效率较低，且主要在细胞增殖的DNA复制S期和G2期发挥作用，无法实现在神经细胞、肌细胞等永久性细胞、及非增殖期体细胞中高效的基因编辑。因此，提高PE编辑系统的编辑效率、拓展其编辑应用范围十分必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供DSB-PE基因编辑系统及其应用。该编辑系统相比PE基因编辑系统，编辑效率高、应用范围更广泛，并且在不影响切割效率的情况下大大提升目标碱基准确插入比率，提高DSB-PE系统的生物安全性。
本发明的目的通过下述技术方案实现：DSB-PE基因编辑系统，包括融合蛋白和pegRNA；所述pegRNA依次由spacer、scaffold尾端碱基、靶点序列以及PBS组成，靶点序列与scaffold尾端碱基及其互补配对碱基之间不包括逆转录模板；所述融合蛋白为野生型Cas9切刻酶与逆转录酶RT融合所形成。
所述scaffold尾端碱基为A1、A2或A3：
A1.将如SEQ ID NO.1所示的pegRNA序列第82-96位替换为ABaccgagtcggtCD得到的RNA分子，其中，CD序列为目标插入序列末尾两个碱基的反向互补序列，A序列为D序列的互补配对序列，B序列为C序列的互补配对序列；
A2.将所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
A3.与A1或A2限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。
所述野生型Cas9切刻酶为B1或B2：
B1.氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
B2.将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述野生型Cas9切刻酶的编码基因为C1、C2或C3：
C1.SEQ ID NO.3所示序列第715位-第4815位的cDNA分子或DNA分子；
C2.与C1限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述野生型Cas9切刻酶的cDNA分子或DNA分子；
C3.在严格条件下与C1或C2限定的核苷酸序列杂交，且编码所述野生型Cas9切刻酶的cDNA分子或DNA分子。
所述逆转录酶RT为D1或D2：
D1.氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的蛋白质；
D2.将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述逆转录酶RT的编码基因为E1、E2或E3：
E1.SEQ ID NO.3所示序列第4915位-第7008位的cDNA分子或DNA分子；
E2.与E1限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述逆转录酶RT的cDNA分子或DNA分子；
E3.在严格条件下与E1或E2限定的核苷酸序列杂交，且编码所述逆转录酶RT的cDNA分子或DNA分子。
上述DSB-PE基因编辑系统的应用，包括：
F1.生物体或生物细胞基因组序列的编辑；
F2.制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；
F3.提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；
F4.制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
一种基因组序列的编辑方法，包括以下步骤：使生物体或生物细胞表达所述融合蛋白和所述pegRNA。
与传统的PE2系统相比，DSB-PE同样可以实现插入、删除和替换等多种编辑，保留了其编辑形式多样的优点。同时，DSB-PE在传统PE2基础上进行了改造，本发明采用了野生型Cas9形式与M-MLV逆转录酶融合，在pegRNA的引导下产生双链DNA切割，进行靶基因的编辑。这种方式不仅改善了传统PE2由于利用nCas9产生单链切割的修复效率低下问题，还改变了后续参与编辑修复过程中的DNA主要修复途径。相较于单链DNA断裂，双链DNA断裂(DSB)修复途径已不再局限于效率较低的同源重组修复(HDR)，而是以非同源末端连接NHEJ(non-homologous end joining)途径为主，这种修复方式发生概率更高，效能更强，在细胞G1/S/G2期都可以发挥作用，而HDR仅在DNA复制的S期和G2期才有活性，且在S和G2期的DSB修复中，NHEJ约占70％，HDR约占30％。依据细胞分裂再生能力的强弱，可将人体细胞分为三类：1.不稳定细胞：又称持续分裂细胞。这类细胞增殖活跃，在复制分裂的细胞周期中往复循环，HDR修复途径在此类细胞中较活跃。2.稳定细胞：又称静止细胞。在生理情况下，这类细胞增殖现象不明显，在细胞增殖周期中处于静止期，但受到组织损伤的刺激时，则进入DNA合成前期，表现出较强的再生能力，此类细胞在进入增殖周期时HDR修复途径可发挥作用。3.永久性细胞：又称非分裂细胞。神经细胞、骨骼肌细胞及心肌细胞，这类细胞在出生后不再分裂增生，不具备细胞复制分裂周期，因而在DNA复制的S期和G2期才有活性的HDR修复途径，很难在此类细胞中发挥作用。DSB-PE拓展了NHEJ修复途径在PE系统中的应用，可以在一定程度上提高PE系统的编辑效率，解决了现有PE工具编辑效率较低，适用编辑细胞类型较局限的问题。
此外，DSB形式PE虽然编辑切割效率较高，但随之而来的indel编辑副产物也不容忽视。我们发现DSB-PE实现靶点目标编辑的同时还会增加indel及额外序列的插入。因此，本发明在原始pegRNA的基础上进行改造，发现通过对pegRNAscaffold尾端及其互补序列、RTT序列改造，可在不影响切割效率的情况下大大提升目标碱基准确插入比率，提高DSB-PE系统的生物安全性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的DSB-PE系统保留了PE2系统编辑形式多样的优点，同时编辑效率高、应用范围更广泛，并且在不影响切割效率的情况下大大提升目标碱基准确插入比率，提高DSB-PE系统的生物安全性。本发明的DSB-PE系统更适用于不需要维持插入序列3'端无缝连接的编辑应用场景，可通过高效插入终止密码子实现靶基因敲除。
附图说明
图1是PE系统与DSB-PE系统的编辑修复模式图。
图2是PE系统与DSB-PE系统的目标编辑(CTT准确插入)效率结果比较图。
图3是PE系统与DSB-PE系统目标编辑(终止密码子TGA插入)效率比较结果比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中使用的引物由苏州Genewiz生物科技有限公司合成；PCR试剂采用PCR SuperMix(北京全式金生物科技，货号AS111-02)。
为了详细说明本发明的DSB-PE系统，以下实施例采用编辑效果较为稳定的pegRNA-RTT-CTT-PBS质粒。本领域技术人员可根据以下实施例设计针对其他基因目标位点的DSB-PE碱基编辑系统。
以下实施例1将SEQ ID NO.5所示序列精准编辑为SEQ ID NO.6所示序列(目标位点插入CTT这3个碱基，大写表示)；
ttttctgcttctccagccctggcctgggtcaatccttggggcccagactgagcacgtgatggcagaggaaaggaag ccctgcttcctccagagggcgtcgcaggacagcttttcctagacaggggctagtatgtgcagctcctgcaccgggatactg gttgaca(SEQ ID NO.5)；
ttttctgcttctccagccctggcctgggtcaatccttggggcccagactgagcacgCTTtgatggcagaggaaa ggaagccctgcttcctccagagggcgtcgcaggacagcttttcctagacaggggctagtatgtgcagctcctgcaccggg atactggttgaca-3’(SEQ ID NO.6)。
实施例1
1、原始质粒pegRNA-RTT-CTT-PBS
采用的原始质粒pegRNA-RTT-CTT-PBS序列中包含：引物结合序列PBS(Primerbinding site)、目标编辑碱基CTT和转录模板序列RTT(RT template)。该质粒购于淼灵质粒平台，产品货号为P11694，pegRNA序列为：
5’-ggcccagactgagcacgtgagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttga aaaagtgggaccgagtcggtccTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTG-3’(SEQ ID NO.1所示)；
其中，spacer序列斜体，scaffold序列小写，RTT-CTT-PBS序列大写。
2、构建pegRNA-CTT-PBS质粒
以pegRNA-RTT-CTT-PBS质粒为构建模板，通过引物pegRNA-ZT-F和pegRNA-ZT-RPCR扩增获得载体，pegRNA中spacer、scaffold和3'端延伸及两端20nt同源臂寡核苷酸序列由Genewiz公司合成，然后通过Gibson组装法克隆到载体中，构建为不含RTT的pegRNA-CTT-PBS重组质粒，pegRNA1序列为：
5’-ggcccagactgagcacgtgagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttga aaaagtgggaccgagtcggtccAAGCGTGCTCAGTCTG-3’；
其中，spacer序列斜体，scaffold序列小写，CTT-PBS序列大写；所述pegRNA1序列为pegRNA发挥编辑作用的序列，并未包含质粒构建过程中3'端延伸及两端20nt做为同源臂的序列；3'端延伸序列：AAGCGTGCTCAGTCTG，5'端20nt同源臂寡核苷酸序列：5’-tgtggaaaggacgaaacacc-3’；3'端20nt同源臂寡核苷酸序列：5’-tttttttaagcttgggccgc-3’。
pegRNA-ZT-F引物序列：5’-tttttttaagcttgggccgc-3’；
pegRNA-ZT-R引物序列：5’-ggtgtttcgtcctttccaca-3’。
表1 PCR扩增体系
| 名称 | 体积 |
| 模板质粒 | 10ng |
| 上游引物(10μM) | 1μl |
| 下游引物(10μM) | 1μl |
| 2xPhanta Mix | 25μl |
| H2O | 补至50μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR反应体系：98℃for 45s；35cycles of(98℃for 15s，60℃for 30s，72℃for2min)，72℃for 5min，4℃for∞。
3、构建pegRNAm-CTT-PBS质粒
与pegRNA-RTT-CTT-PBS质粒的不同点在于，删除了其中RTT序列，并突变了pegRNAscaffold尾端碱基及其互补配对碱基(pegRNA-scaffold-mutated，pegRNAm)，构建过程以pegRNA-RTT-CTT-PBS质粒为构建模板，通过引物pegRNA-ZT-F和pegRNA-ZT-R PCR扩增获得质粒载体，pegRNA中spacer、scaffold-mutated、3'端延伸及两端20nt同源臂寡核苷酸序列由Genewiz公司合成，然后通过Gibson组装法克隆到质粒载体中，构建为pegRNAm-CTT-PBS质粒，pegRNA2序列为：
5’-ggcccagactgagcacgtgagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtta tcaacttgaaaaagtgTTaccgagtcggtAAGCGTGCTCAGTCTG-3’；
其中，spacer序列斜体，scaffold-mutated序列标下划线，CTT-PBS序列大写并正体；所述pegRNA2序列为pegRNA发挥编辑作用的序列，并未包含质粒构建过程中3'端延伸及两端20nt做为同源臂的序列；3'端延伸序列：GCGTGCTCAGTCTG；5'端20nt同源臂寡核苷酸序列：5’-tgtggaaaggacgaaacacc-3’，3'端20nt同源臂寡核苷酸序列：5’-tttttttaagcttgggccgc-3’。
表2 PCR扩增体系
| 名称 | 体积 |
| 模板质粒 | 10ng |
| 上游引物(10μM) | 1μl |
| 下游引物(10μM) | 1μl |
| 2xPhanta Mix | 25μl |
| H2O | 补至50μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR反应体系：98℃for 45s；35cycles of(98℃for 15s，60℃for 30s，72℃for2min)，72℃for 5min，4℃for∞。
构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提取质粒。
4、构建DSB-PE质粒
PE2质粒，购于淼灵质粒平台，产品货号为P11682。将该质粒中仅具有DNA单链切割活性的nCas9(H840A)序列替换为野生型具有切割DNA双链功能的Cas9序列，具体构建过程：以PE2质粒为构建模板，通过引物PE2-ZT-F和PE2-ZT-R PCR扩增获得PE2质粒载体；以SpCas9质粒(碧云天，D0511L)为模板，通过引物Cas9-PCR-F和Cas9-PCR-R PCR扩增获得野生型Cas9序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，并在Cas9序列两端分别添加20nt同源臂序列；然后通过Gibson组装法克隆到PE2质粒载体中，构建为DSB-PE质粒(核苷酸序列如SEQID NO.3所示)。DSB-PE质粒第715位-第4815位碱基为野生型Cas9序列；第4816位-第4914位碱基为flexible linker序列；第4915位-第7008位碱基为逆转录酶RT序列。逆转录酶RT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
PE2-ZT-F引物序列为：5’-tctggaggatctagcggagg-3’；
PE2-ZT-R引物序列为：5’-gactttccgcttcttctttg-3’；
Cas9-PCR-F引物序列为：5’-caaagaagaagcggaaagtcgacaagaagtacagcatcgg-3’；
Cas9-PCR-R引物序列为：5’-cctccgctagatcctccagagtcacctcccagctgagaca-3’；
质粒构建过程中：Cas9-PCR-F引物中作为组装同源臂的序列为：5’-caaagaagaagcggaaagtc-3’；Cas9-PCR-R引物中作为组装同源臂的序列为：5’-cctccgctagatcctccaga-3’。
表3 PCR扩增体系
| 名称 | 体积 |
| 模板质粒 | 10ng |
| 上游引物(10μM) | 1μl |
| 下游引物(10μM) | 1μl |
| 2xPhanta Mix | 25μl |
| H2O | 补至50μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR反应体系：98℃for 45s；35cycles of(98℃for 15s，60℃for 30s，72℃for3min)，72℃ for 5min，4℃ for∞。
构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提取质粒。
5、比较DSB-PE系统和原始PE2系统的目标编辑效果
将质粒pegRNA-RTT-CTT-PBS、pegRNA-CTT-PBS、pegRNAm-CTT-PBS分别与DSB-PE质粒共转染，并设置共转染pegRNA-RTT-CTT-PBS与PE2质粒的原始PE2系统作为对照组，分别测试目标序列准确插入效率。
具体方法步骤如下：
(1)细胞培养
人胚肾细胞系HEK-293T(丰晖生物，CL0133)用含有10％血清的DMEM完全培养基在37℃、5％ CO2培养箱里培养。待细胞融合度达到90％时用0.25％的胰酶消化后，用DMEM完全培养基终止消化，接种到12孔板中，继续培养24小时。
(2)质粒转染
24小时后，确认细胞贴壁良好，细胞融合度达到80％，即可进行转染。每孔转染0.5μg含有pegRNA的质粒(pegRNA-RTT-CTT-PBS、pegRNA-CTT-PBS或pegRNAm-CTT-PBS质粒)以及0.5μg的含有nCas9的质粒(DSB-PE质粒或PE质粒)，使用Yeasen公司的PolyethylenimineLinear(PEI)MW40000转染试剂按照说明书要求进行转染，以等量的空载体(1μg)作为阴性对照。转染后的细胞继续在37℃、5％ CO2培养箱中培养。
(3)基因组DNA的提取
转染48小时后，常规0.25％的胰酶消化，用DMEM完全培养基终止消化，收集细胞到离心管中，300g离心5分钟，弃除培养基，PBS洗涤一次，再次300g离心5分钟，弃除PBS，获得细胞渣，使用细胞基因组提取试剂盒(全式金生物技术有限公司，货号EE101-01)提取细胞基因组DNA，测量DNA浓度。
(4)扩增子建库引物的设计
分别根据HEK3的sgRNA靶向的基因序列设计引物，引物两端横跨靶点(产物长度优选150～200bp，并且靶点距离引物两段的距离应当差别不大)，以扩增出目的片段。引物序列为：
HEK3-NGS-F：
5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTttttctgcttctccagccct-3’；
HEK3-NGS-R：
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTtgtcaaccagtatcccggtg-3’。
(5)扩增子建库的PCR反应
以上述提取的基因组DNA为模版，采用上述HEK3-NGS-F和HEK3-NGS-R引物进行PCR反应。本实验使用的高保真kapa聚合酶为KAPA HiFi HotStart ReadyMix(货号KK2602)。
表4第1轮PCR反应体系
| 名称 | 体积 |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 12.5μl |
| DNA | 200ng |
| HEK3-NGS-F(10μM) | 0.5μl |
| HEK3-NGS-R(10μM) | 0.5μl |
| 补无菌去离子水 | To 25μl |
| 总共 | 25μl |
PCR反应体系：98℃for 3min；25cycles of(98℃for 20s，65℃for 15s，72℃for15s)，72℃for 1min，4℃for∞。
表5第2轮PCR反应体系
| 名称 | 体积 |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 12.5μl |
| 第一轮的PCR产物 | 1μl |
| I7 primer(10μM) | 2μl |
| I5 primer(10μM) | 2μl |
| 补无菌去离子水 | To 25μl |
| 总共 | 25μl |
I7 primer和I5 primer采用商业的illumina测序接头引物：Hieff NGS384 DualIndex Primer Kit forSet1(货号12613ES02)。
PCR反应体系：
98℃ for 3min；11cycles of(98℃ for 20s，65℃ for 15s，72℃ for 15s)，72℃for 1min，4℃ for∞。
PCR反应完成后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段大小231bp的扩增子文库进行高通量测序分析目标突变效率，结果见图2，DSB-PE组目标突变CTT准确插入效率分别为pegRNA-RTT-CTT-PBS(7.9％)、pegRNA-CTT-PBS(4.5％)、pegRNAm-CTT-PBS(31.1％)，pegRNAm-CTT-PBS组编辑效果最好，优于原始PE2系统组(11.3％)。
实施例2
对实施例1的高通量测序序列分析，发明人发现pegRNA-RTT-CTT-PBS、pegRNA-CTT-PBS、pegRNAm-CTT-PBS质粒分别与DSB-PE质粒共转染，均能在目标位点插入CTT 3个碱基，但同时还会增加indel及额外序列(如RTT序列、pegRNA scaffold序列)的插入。伴随目标编辑下游附加序列的整合是DSB-PE编辑技术的缺点，但发明人将此方法应用于不需要维持插入序列3'端无缝连接的编辑需求，例如通过插入终止密码子实现基因敲除时，其强有力的编辑效率可能比现有的方法更具有优势。为此，发明人针对AKT1基因外显子，设计构建pegRNA-TGA-PBS质粒与DSB-PE质粒共转染，同时构建pegRNA-RTT-TGA-PBS质粒与PE2质粒共转染作为对照，比较终止密码子插入效果。
pegRNA-RTT-TGA-PBS质粒中pegRNA3序列为：
5’-gccatccagactgtggctgagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtgggaccgagtcggtccGAGGCCGTCATCAAGCCACAGTCTGGA-3’；
其中，spacer序列斜体，scaffold序列小写，RTT-TGA-PBS序列大写。
pegRNA-TGA-PBS质粒序列中pegRNA4序列为：
5’-gccatccagactgtggctgagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtgggaccgagtcggtccTCAAGCCACAGTCTGGA-3’；
其中，spacer序列斜体，scaffold序列小写，TGA-PBS序列大写。
转染上述质粒，方法同实施例1，比较终止密码子插入效果，结果见图3。结果显示，DSB-PE组终止密码子TGA插入效率约为43.1％，显著优于原始PE2系统组的编辑效果(13.5％)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.DSB-PE基因编辑系统，其特征在于，包括融合蛋白和pegRNA；所述pegRNA依次由spacer、scaffold尾端碱基、靶点序列以及PBS组成，靶点序列与scaffold尾端碱基及其互补配对碱基之间不包括逆转录模板；所述融合蛋白为野生型Cas9切刻酶与逆转录酶RT融合所形成；
pegRNA的序列为5’-ggcccagactgagcacgtgagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgABaccgagtcggtCDGCGTGCTCAGTCTG-3’；
其中，CD序列为目标插入序列末尾两个碱基的反向互补序列，A序列为D序列的互补配对序列，B序列为C序列的互补配对序列；
所述野生型Cas9切刻酶为氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
所述逆转录酶RT为D1：
D1. 氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述DSB-PE基因编辑系统，其特征在于，所述野生型Cas9切刻酶的编码基因为SEQ ID NO.3所示序列第715位-第4815位的cDNA分子或DNA分子。
3.根据权利要求1所述DSB-PE基因编辑系统，其特征在于，所述逆转录酶RT的编码基因为SEQ ID NO.3所示序列第4915位-第7008位的cDNA分子或DNA分子。
4.权利要求1-3任一项所述DSB-PE基因编辑系统的应用，其特征在于，包括：
F1. 制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；
F2. 制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
5.一种基因组序列的编辑方法，包括以下步骤：使生物体或生物细胞表达权利要求1所述融合蛋白和所述pegRNA，所述编辑方法为非疾病治疗或诊断目的。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310083155.5A CN116286738B (zh) | 2023-02-03 | 2023-02-03 | Dsb-pe基因编辑系统及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310083155.5A CN116286738B (zh) | 2023-02-03 | 2023-02-03 | Dsb-pe基因编辑系统及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116286738A CN116286738A (zh) | 2023-06-23 |
| CN116286738B true CN116286738B (zh) | 2023-11-24 |
Family
ID=86836860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310083155.5A Active CN116286738B (zh) | 2023-02-03 | 2023-02-03 | Dsb-pe基因编辑系统及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116286738B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111684069A (zh) * | 2017-12-22 | 2020-09-18 | G+Flas生命科学有限公司 | 嵌合基因组工程分子和方法 |
| CN111748578A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-09 | 北大荒垦丰种业股份有限公司 | 植物导引模板原位合成基因编辑方法及应用 |
| CN113564164A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-10-29 | 中国农业大学 | 一种提高先导编辑效率的载体和方法 |
| CN114127285A (zh) * | 2019-03-19 | 2022-03-01 | 布罗德研究所股份有限公司 | 编辑核苷酸序列的方法和组合物 |
| WO2022242660A1 (en) * | 2021-05-17 | 2022-11-24 | Wuhan University | System and methods for insertion and editing of large nucleic acid fragments |
-
2023
- 2023-02-03 CN CN202310083155.5A patent/CN116286738B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111684069A (zh) * | 2017-12-22 | 2020-09-18 | G+Flas生命科学有限公司 | 嵌合基因组工程分子和方法 |
| CN114127285A (zh) * | 2019-03-19 | 2022-03-01 | 布罗德研究所股份有限公司 | 编辑核苷酸序列的方法和组合物 |
| CN111748578A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-09 | 北大荒垦丰种业股份有限公司 | 植物导引模板原位合成基因编辑方法及应用 |
| WO2022242660A1 (en) * | 2021-05-17 | 2022-11-24 | Wuhan University | System and methods for insertion and editing of large nucleic acid fragments |
| CN113564164A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-10-29 | 中国农业大学 | 一种提高先导编辑效率的载体和方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116286738A (zh) | 2023-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2019041296A1 (zh) | 一种碱基编辑系统及方法 | |
| CN112746071B (zh) | 一种造血干细胞hbb基因修复的方法及产品 | |
| WO2022007959A1 (zh) | 一种编辑核酸的系统及方法 | |
| CN112159801B (zh) | SlugCas9-HF蛋白、含有SlugCas9-HF蛋白的基因编辑系统及应用 | |
| CN112608948A (zh) | 两种多功能基因编辑工具的构造及其使用方法 | |
| WO2022146498A1 (en) | Nucleic acid-guided nickases | |
| CN110577971A (zh) | CRISPR/Sa-SauriCas9基因编辑系统及其应用 | |
| CN114075559A (zh) | 一种2型CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用 | |
| CN110551762B (zh) | CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用 | |
| CN116286738B (zh) | Dsb-pe基因编辑系统及其应用 | |
| CN114560946A (zh) | 无pam限制的腺嘌呤单碱基编辑产品、方法和应用 | |
| US20230332184A1 (en) | Template guide rna molecules | |
| WO2023016021A1 (zh) | 一种碱基编辑工具及其构建方法 | |
| US20240011055A1 (en) | Precise genome deletion and replacement method based on prime editing | |
| CN111088253A (zh) | 针对hbb-28地中海贫血基因的crispr单碱基供体修复体系 | |
| CN110551763B (zh) | CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用 | |
| WO2022159742A1 (en) | Novel engineered and chimeric nucleases | |
| JPWO2018015995A1 (ja) | 長鎖一本鎖ｄｎａを調製する方法 | |
| CN113403342A (zh) | 一种单碱基突变方法及采用的系统 | |
| CN110577970A (zh) | CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用 | |
| CN110551760A (zh) | 一种CRISPR/Sa-SeqCas9基因编辑系统和其应用 | |
| CN115141817B (zh) | 一种细胞中hbb基因修复的方法及产品 | |
| CN112391410B (zh) | 一种sgRNA及其在修复内含子异常剪接中的应用 | |
| RU2712492C1 (ru) | Средство разрезания днк на основе cas9 белка из defluviimonas sp. | |
| EP4230734A1 (en) | Type ii crispr/cas9 genome editing system and the application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |