CN112608948A - 两种多功能基因编辑工具的构造及其使用方法 - Google Patents

两种多功能基因编辑工具的构造及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了两种人类基因组编辑工具的构建和使用方法。两种人类基因组编辑工具都由一种RTgRNA分子及对应的基因编辑融合蛋白结合而成。每种融合蛋白主是由一种改造过的Cas蛋白和改造过的逆转录酶连接而成。每种编辑器都可更改人类细胞基因组DNA。改变DNA的方式包括短片段删除、增加、替换DNA碱基。两种基因组编辑工具具有超高精准性，期望产物纯度高，对细胞伤害极低，拓展性强，能实现多种编辑，设计较容易，成本较低，能多位点同时编辑等特点。

Description

两种多功能基因编辑工具的构造及其使用方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域的基因组编辑技术一类，具体涉及两种基因组修改工具的构建、制备方法。每种基因组修改工具都可以在一种特殊设计的RNA的指导下，定位到人类基因组上指定靶点，进行DNA的插入，删除，多碱基突变。
背景技术
本专利的基因编辑器是能和碱基编辑器对标的人类基因组超精准编辑器。首先，这种编辑器可以做12种碱基对的转换，碱基编辑器只能做4种碱基对的改变。第二，碱基编辑器不能插入或者删除人为设计的小片段DNA(大约1～100bp)到指定的编辑位点，然而本专利的技术可以做到。
第三，专利中的基因组编辑器根据专利中所述的方法，可以实现人类细胞多位点，超精准，在打靶区域内，一个或多个碱基的转换，或者多个位点的删除和插入。为了方便理解，可以表达多位点不定量任意碱基转换(Multiplexing single-or-more arbitrarybase conversion，MSMABC for short)，简称MSMABC。以及多位点短片段DNA插入或删除(Multiplexing short insertion-or-deletion，MSI for short)，简称MSID。碱基编辑器从原理上来说可以做到多个不同位点的碱基转换，但做不到在多个打靶区任意碱基同时替换。碱基编辑器也没办法做到在打靶区做短片段DNA的插入和删除，更不用说多靶点短片段的DNA的插入和删除了。HDR介导的相关编辑，操作起来很麻烦，而且实际效率很低。
第四，本专利中的所阐述的两种基因编辑策略是可以通过本专利中的基因编辑器来实现的。其他任何基因编辑工具都不具备能够实现本专利中提到的“耦连写入”、“逻辑写入”的潜力。原因之一是：这两个基因组编辑策略是为本专利中的编辑工具特别设计的。两种编辑策略极大的拓展了基因编辑器的基因编辑效率。耦连写入和逻辑写入主要是提升基因编辑效率，并且实现基因编辑区多碱基同时替换。
发明内容
定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸和蛋白质化学、分子生物学、细胞学，相关术语和实验室操作步骤均为相应领域广泛使用的术语和常规步骤。
“电转化”或“电穿孔(electroporation)”是可以互相使用的专业术语，指的是运用电脉冲在细胞表面瞬时产生纳米尺度的孔洞，为细胞外的DNA、RNA、蛋白质，无机物大分子创造入口，使得细胞外的DNA、RNA、蛋白质、无机物大分子能够进入到细胞内的物理方法。该方法可递送本专利的基因组编辑工具到人类，小鼠，猴子，黑猩猩等真核细胞里。具体设备主要是ThermoFisher Scientific公司生产的NeonTM Transfection System和Lonza公司提供的NucleofectorTM Technology。具体操作和优化参考两公司的技术手册。就本专利而言无论电转化系统中的试剂盒、培养基怎么变，电穿孔的设备主要是Neon TransfectionSystem和Nucleofector Technology两系统里面涉及的设备。
“病毒载体递送”，主要指的是以逆转录病毒(retrovirus)，特别是慢病毒(lentivirus)，腺相关病毒(AAV)，腺病毒(Adenovirus)为首的递送方法。这些方法允许使用者，将目的基因以DNA或RNA的形式编辑到病毒载体，比较长用的说法是转移载体(viralgene transfer vector，transfer vector for short)。然后在实验室，添加其他辅助材料，将转移载体培养成生物安全的病毒颗粒(viral particle，virion)。等到用的时候，用携带目的基因的病毒颗粒感染目的细胞。病毒颗粒会在细胞内释放出编码目的基因的DNA或者RNA，使得编码在病毒DNA，或者RNA上的目的基因能够转录，或逆转录，或复制，最终表达出目的蛋白。此过程即为病毒载体递送的核心过程。特别强调的是，本专利递送两个基因组编辑工具到人类和动物细胞的方法，可以运用病毒载体递送的方法，尤其是第三代自失活慢病毒载体(the 3rd generation of self-inactivating lentivirus)。
“纳米粒子递送”包括脂质体转染(lipofection)，二乙氨乙基葡聚糖转化法(Diethylaminoethyl-dextran，DEAE for short)，磷酸钙转染法(calcium phosphate)。本专利优选使用脂质体转染的方法展示所有实施例。
“突变”，指的是单个或多个碱基突变，也包括基因编辑区域内单个连续或多个不连续的碱基插入和删除。除非本专利特指，突变指的都是在特定语境下广义的突变，包含突变的三种形式，即一个或多个碱基突变，一个或多个碱基删除，一个或多个碱基插入。
“基因组编辑”在本专利特指点突变，或者插入，或者删除基因组上的DNA序列。基因组编辑可以是同时或连续多点突变、多位点插入、多位点删除基因组上的DNA序列。
“多位点不定量任意碱基转换(Multiplexing single-or-more arbitrary baseconversion，MSMABC for short)”，简称为“MSMABC”。“多位点”指的是基因组编辑区域内(对应的RTgRNA模板区)，可以改变多个位点的碱基。“不定量”指的是可以根据具体试验目的改基因组编辑区域内的一对或者多对碱基。改变的碱基对数目根据试验目的设定。根据实验条件可筛选合适碱基对的数量。“任意碱基转换”指的是人类基因组中12种碱基对突变(C：G变为T：A；G：C变为A：T；A：T变为G：C；T：A变为C：G；C：G变为A：T；C：G变为G：C；G：C变为C：G；G：C变为T：A；A：T变为C：G；A：T变为T：A；T：A变为A：T；T：A变为G：C)。
“多位点短DNA插入或删除(Multiplexing short insertion-or-deletion，MSIDfor short)“，简称为“MSID”。“多位点”在MSID中的指的是基因组编辑区域(对应RTgRNA模板区)，可以插入或删除多处DNA短序列。插入或者删除的DNA序列的长度对于目前专利中的两个基因组编辑工具仅限于±1到±100bp。
本专利中的“逆转录酶”(RT)进过改造来源于小鼠白血病病毒(Moloney murineleukemia virus，M-MLV)基因组。当RTgRNA暴露出模板区(template)提供模板，逆转录结合区(RBS)与单链DNA碱基互补配对的时候，逆转录酶会促使细胞核中脱氧核糖核苷三磷酸从单链DNA的5’磷酸端，沿RTgRNA上的模板从5‘到3’方向进行互补延伸，最终在适当的位置停止延伸。该过程与常见的逆转录酶的逆转录过程高度相似，但是本专利用的逆转录酶没有RNase活性(不会降解RTgRNA)，高度依赖RTgRNA与单链DNA配对。
“Cas蛋白”，又叫做“CRISPR蛋白”，也可叫做“CRISPR/Cas蛋白”，属于RNA指导的，来源于细菌或古生菌的可编程核酸酶。本专利使用的Cas蛋白分别是改造过的SaCas9(来源于Staphylococcus aureus)，以及改造过的CjCas9(来源于Campylobacter jejuni)。
本专利中第一个人类基因组编辑器是由改造过的SaCas9和RT为核心元件构成的融合蛋白，称作SaCas9介导逆转录酶辅助的基因组写手(SaCas9-mediated reverse-transcriptase-assisted genome writer)，简称为“SRT”，其对应的可编程的RNA称为SRTgRNA。本专利中第二个人类基因组编辑器是由改造过的CjCas9和RT为核心元件构成的融合蛋白，称作CjCas9介导逆转录酶辅助的基因组写手(CjCas9-mediated reverse-transcriptase-assisted genome writer)，简称为“CRT”，其对应的可编程的RNA称为CRTgRNA。
针对SRT、CRT的两种RTgRNA在结构模式上有相似性、又各自的差异，同时为了使专业术语通俗易懂，SRTgRNA、CRTgRNA，统称为RTgRNA。
针对SRT、CRT的两种RTgRNA，每种都有两大类设计方式：5’延伸的RTgRNA，简称为5’RTgRNA，例如针对SRT编辑器的RTgRNA，则称为5’SRTgRNA；3’延伸的RTgRNA，简称为3’SRTgRNA。CRTgRNA的RTgRNA也是如此。
编辑器携带各自的RTgRNA后会首先在基因组上搜索PAM序列。在本专利中，“PAM”，是一段基因组编辑器结合RTgRNA，形成复合体后，首先要在基因组上识别的一小段序列。然后复合体才依赖RTgRNA进一步与靶点区域碱基互补配对结合，形成双链基因组-Cas蛋白-单链RTgRNA的瞬时拓扑结构。
在本专利中，SRT的PAM是5’-NNGRRT-3’；CRT的PAM是5’-NNNVRYAC-3’。在PAM中的Y代表C(胞嘧啶)或者T(胸腺嘧啶)；V代表A(腺嘌呤)或者C(胸腺嘧啶)或者G(鸟嘌呤)；R代表A(腺嘌呤)或者G(鸟嘌呤)。符号可简化为：R＝A or G；V＝A or C or G；Y＝C or T。N代表A、T、C、G中的任意一个。
PAM是可以通过蛋白质结构指导工程进行理性改造，也可以通过高通量筛选Cas蛋白的突变文库等方法，将PAM里面的识别碱基替换成其他不同的识别碱基。
“RTgRNA”的全称叫做逆转录模板向导RNA(reverse-transcription templateguide RNA)，由gRNA(guide RNA)，gRNA支架(gRNA scaffold)，模板区(template)，逆转录结合区(reverse-transcription bind site，RBS for short)组成。RTgRNA跟据基因编辑需求设计，由A(腺嘌呤)、U(尿嘧啶)、G(鸟嘌呤)、C(胸腺嘧啶)4种核糖核苷三磷酸组成。
gRNA是一段向导RNA，在基因组上，引导SRT、CRT与gRNA区互补配对的位点结合，并让两种基因组编辑器在靶点确定位置造成切口，以此让单链DNA在靶点位置暴露出来，能与RTgRNA上的RBS区结合。gRNA一般长18～30nt。
只要RBS区与暴露出的单链DNA结合，就有机会让逆转录酶逆转录出长链DNA。Template就是未来合成出长链DNA的RNA模板，也是可以预先设定一个或者多个碱基突变，或者一个或多个插入突变，或者一个或多个删除的突变的区域。
SRT，CRT有各自对应的gRNA scaffold，一般情况下，只要碱基效率足够，不需要改变。但是也可以做进一步的突变改造。
特别需要指出：对于两个基因组编辑器，RTgRNA中的linker是可变的，根据试验需求，可以替换成其他RNA序列，但是linker容易与RTgRNA的其他部分自互补，严重影响基因组编辑效率，所以linker的最好设计成主要含有A和C两种碱基，并且A和C均匀分布，不成簇配对，也不与RTgRNA其他片段配对。U碱基可以有，但是不能过多，因为U容易和A，G，U自己配对，影响RTgRNA的结构。多个G和C之间的配对容易让RTgRNA严重互补，不容易解开，不容易和编辑器结合。
RTgRNA的linker也是可以优化的，通过改变碱基组成、自身的长度，提升有效RTgRNA的转录量、提高RTgRNA自身与SRT、CRT的结合能力。相应的RTgRNA的template和gRNA长度也可以改变，以此来找到最适合的template长度，探索最优的编辑效率。
gRNA scaffold可以缩短和延长，也可以更改gRNA scaffold的结构，即更改碱基，来增强RTgRNA整体对基因组编辑器的结合力和灵活性，以此来提升编辑效率。还可以增加化学修饰到gRNA scaffold上。一般情况下，只要碱基效率足够，不需要改变。但是也可以做进一步的突变改造。
“CgRNA(conventional gRNA)”，只由gRNA链接对应的gRNA scaffold构成。SRT，CRT编辑器都有各自的CgRNA，只是CgRNA的长度和序列组成不同。
5’SRTgRNA从5’磷酸端到3’羟基端的结构范式为：5’-(18～30nt)gRNA-(77nt)gRNA scaffold-(10～300nt)template-(7～16nt)RBS-3’，如图1。3’SRTgRNA从5’磷酸端到3’羟基端的结构范式为：5’-(10～300nt)template-(7～16nt)RBS-(10～100nt flexiblelinker)-(18～30nt)gRNA-(77nt)gRNA scaffold-3’，如图1。
SRT的CgRNA结构范式为：5’-(18～30nt)gRNA-(77nt)gRNA scaffold-3’，如图1。
SRT编辑器搭配5’SRTgRNA或者3’SRTgRNA在基因组上进行DNA编辑的模式如图2。SRT编辑器首先在基因组上寻找PAM(5’-NNGRRT-3’)短序列，然后在PAM周围搜索与RTgRNA上gRNA配对的序列，如果gRNA和基因编辑靶点区有足够的配对，就会在靶点区造成缺口(nick)，使得3’单链DNA能和RTgRNA上的RBS区结合，以此为SRT上的逆转录酶提供引物和模板。逆转录酶已RTgRNA的模板区(template)为模板，从单链DNA的3’开始逆转录合成出互补链。进入“循环编辑”状态，则可得到期望得到DNA突变。图2只是以G：C变A：T为例，但实际上其他11种点突变转换，也是同样的原理。短片段DNA的删除和插入也是同样的原理，只需要在RTgRNA的模板区设计相应的删除和插入即可。
5’CRTgRNA从5’磷酸端到3’羟基端的结构范式为：5’-(18～30nt)gRNA-(77nt)gRNA scaffold-(10～300nt)template-(7～16nt)RBS-3’，如图3。3’CRTgRNA从5’磷酸端到3’羟基端的结构范式为：5’-(10～300nt)template-(7～16nt)RBS-(10～100nt flexiblelinker)-(18～30nt)gRNA-(73nt)gRNA scaffold-3’，如图3。
CRT的CgRNA结构范式为：5’-(18～30nt)gRNA-(73nt)gRNA scaffold-3’，如图3。
CRT编辑器搭配5’CRTgRNA或者3’CRTgRNA在基因组上进行DNA编辑的模式如图4。CRT编辑器首先在基因组上寻找PAM(5’-NNNVRYAC-3’)短序列，然后在PAM周围搜索与RTgRNA上gRNA配对的序列，如果gRNA和基因编辑靶点区有足够的配对，就会在靶点区造成缺口(nick)，使得3’单链DNA能和RTgRNA上的RBS区结合，以此为CRT上的逆转录酶提供引物和模板。逆转录酶已RTgRNA的模板区(template)为模板，从单链DNA的3’开始逆转录合成出互补链。进入“循环编辑”状态，则可得到期望得到DNA突变。图4只是以G：C变A：T为例，但实际上其他11种点突变转换，也是同样的原理。短片段DNA的删除和插入也是同样的原理，只需要在RTgRNA的模板区设计相应的删除和插入即可。
“循环编辑”是两个基因组编辑器进行基因组编辑的核心机制梗概。图5以点突变为例展示SRT编辑器的循环编辑原理，其中点突变也可以通过合理设计变为DNA的删除和插入设计。
CRT的循环编辑和SRT的循环编辑原理图只在PAM的识别序列上有差别，将图5上的PAM换成CRT编辑器的PAM既是CRT的循环编辑机制梗概。
在循环编辑中，在第一次DNA修复完成后，有接近50％的概率马上就能得到期望的编辑产物，即C：G到A：的转换。已经达到期望的编辑结果后，依然可以再次编辑，大概率事件依然是A：T到A：T保持不变。
在循环编辑中，在第一次DNA修复完成后，有接近50％的概率能得到依旧没有编辑的产物，这时候的DNA序列依然是C：G。尽管基因组编辑器确实发挥作用了，但是细胞内DNA修复机制并没有把原来的G给移除，而是把人为引入的不配对的A给移除了。如果没有破坏PAM和基因编辑识别区，那么就会进入下一轮循环编辑，只要编辑器在RTgRNA的引导下识别结合靶点区。
在循环编辑中，在第一次DNA修复的时候，有很低的概率在A：C不配对的地方发生DNA双链断裂。DNA双链断裂也会诱发细胞启动DNA修复机制，使得断裂处的DNA出现短片段的插入或者删除(indels)。如果indels破坏了PAM或基因编辑靶点识别区，那么就很难进行下一轮循环编辑。这个基因区域显示出来的测序结果就会有indels。如果没有破坏PAM和基因编辑识别区，那么就会进入下一轮循环编辑，只要编辑器在RTgRNA的引导下识别结合靶点区。
在循环编辑中如果在编辑器在造成双链DNA切口(nick)的地方，双链DNA就断开了，也可能会造成indels。这时候是否能进入循环编辑，依然取决于PAM和gRNA识别区的DNA链的完整性和配对程度。越完整，配对程度越高，越能进入循环编辑。只有当细胞DNA修复系统衰退到一定程度，或基因编辑器含量达到最小值，或者PAM和基因编辑区完整度或匹配程度下降到最小值时，循环编辑才有可能会停下。利用循环编辑的原理只需要针对每个编辑区域设计一个RTgRNA即可。
“偶连写入”、“逻辑写入”是基于循环编辑原理衍生出来的编辑策略。根据实际需要，可利用本专利中的编辑工具，设计相应的RTgRNA或者CaRNA来执行三种编辑策略。“偶连写入”指同时利用RTgRNA和CgRNA引导编辑器进行编辑的基因编辑策略。
偶连写入要在编辑位点周围找到合适的且对称的PAM序列，然后设计RTgRNA和CgRNA。RTgRNA会引导编辑器造成第一个切口(Nick No1.)，逆转录合成长ssDNA后，两种产物都瞬时同时存在。然后Flap内切酶切割5’ssDNA，连接酶及时链接。CgRNA引导的编辑器结合第二个基因编辑靶点识别区，造成第二个切口(Nick No2.)。DNA修复相关蛋白结合第二个切口处，降解切口周围的ssDNA。经过合理设计和筛选CgRNA就能移除没有编辑的DNA链上的碱基，从而促进突变位点的引入。
偶连写入可以增加期望的编辑效率。相对仅仅使用RTgRNA引导编辑器进行的编辑，偶连写入会一定程度提高indels在测序产物中的比例，在编辑区域造成一定程度的短序列插入和删除。只要造成indels的比例控制在可接受范围内，偶连写作就是可以使用的。运用偶连写入的方法不需要设计RTgRNA和CgRNA导致Nick No1.和Nick No2.切口按顺序产生。
SRT的偶连写入原理如图6。CRT的偶连写入和SRT的偶连写作原理图只在PAM的识别序列上有差别，将图6上的PAM换成CRT编辑器的PAM既是CRT的偶连写入机制梗概。
“逻辑写入”指的是在偶连写入的基础上，进一步设计RTgRNA让第二个基因编辑靶点识别区也引入突变，只有当突变正确引入后，才能让CgRNA指导的编辑器在对应的DNA链上造成切口。
在逻辑写入的原理中，第二个基因编辑靶点识别区有正确突变引入是CgRNA指导编辑器在对应DNA链上造成切口的前提。以此减少偶连写作中CgRNA先产生nick导致基因编辑区dsDNA断裂的情况。
原理上逻辑写入可以提升编辑效率，相对偶连写作可以降低indels的比例，但实际编辑效率和indels的比例要根据试验结果判断。
逻辑写入和偶连写作的区别在于逻辑写入是先让RTgRNA引导编辑器产生第一个切口(Nick No1.)，并且在第二个编辑靶点区或者PAM区引入突变，然后CgRNA才能引导编辑器结合到第二个基因编辑靶点识别区，造成第二个切口(Nick No.2)。一旦第二个切口产生，就有机会启动DNA修复机制，一定概率地把第二个切口两边的DNA移除。然而偶连写作的两个切口可能同时产生，或者第二个编辑靶点区的切口先产生，因为偶连写作中CgRNA引导的编辑器结合的基因编辑靶点识别区没有突变。
SRT的逻辑写入原理如图7，其中点突变也可以通过合理设计变为DNA的删除和插入设计。CRT的逻辑写入和SRT的偶连写入原理图只在PAM的识别序列上有差别，将图7上的PAM换成CRT编辑器的PAM既是CRT的逻辑写入机制梗概。
具体实施方式
本专利利用lipofectamine 3000(ThermoFisher)的方法，双质粒共转染编码基因组编辑器的表达质粒和编码对应RTgRNA表达质粒到HEK293T细胞中进行编辑。三个编辑器使用的质粒骨架，构建方式，转染条件，细胞处理方式，测序方式展示结果的方式都一样。不一样的是三个编辑器进行基因编辑的具体位点不一样。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
也可以选择其他方式递送编辑器，例如使用权利要求1提到的方式将编辑器和RTgRNA递送到真核细胞内。本专利优选脂质体递送双质粒系统到HEK293T的方法展示基因编辑的实验操作。
实施例1
序列设计与合成
合成SRT编辑器由改造过的逆转录酶(RT)串联改造过的SaCas9蛋白构成，本实施例中SRT编辑器优选RT在蛋白质N端的设计，即N-term-RT-SaCas9-C-term构造，但实际上RT也可以放在C端，即N-term-SaCas9-RT-C-term构造。SRT功能蛋白序列为SEQ ID NO.1。
合成3’SRTgRNA-F打靶HEK293T细胞基因组上的FANCF基因的一个位点，如图8。合成3’SRTgRNA-E打靶HEK293T细胞基因组上的EXM1基因的一个位点，如图9。
质粒组装
根据NEB BbsI使用说明，用BbsI酶切开pU6-backbone质粒。根据NEB T4连接酶的使用说明，将合成的dsDNA oligos：5’SRTgRNA-F和5’SRTgRNA-E短片段分别连接到断开的phU6-backbone质粒上，构建成phU6-s-1打靶EXM2的靶点和phU6-s-2打靶FANCF。测序确认连接成功。
用NEB HindIII和EcoRI双酶切法线性化pY010-backbone质粒。用NEB T4连接酶合成的SRT编辑器dsDNA连接到线性化的pY010-backbone质粒上，得到pY010-SRT质粒。测序确认连接成功。
HEK293T细胞培养
从公司买来HEK293T细胞，PCR检测法并未检测出支原体污染。将HEK293T细胞培养在10％(v/v)牛胎儿血清中，添加1x青霉素和链霉素，加DMEM。让HEK293T生长在48孔板，接种16到24小时后，确认细胞汇合度(confluency)达到60％左右时，即可使用脂质体转染。
转染HEK293T
根据生产厂家的说明书指示，使用1μl的lipofectamine 3000(ThermoFisher)，750ng的pY010-SRT质粒，250ng的phU6-s-1或者phU6-s-2转染48孔板上的HEK294T细胞。转染后每24小时都要观察细胞状态。转染74h后收获细胞。
基因组提取
用1xPBS冲洗细胞，直接添加150μl的裂解缓冲溶液(Tris-HCl，Ph7.5；0.05％SDS；25μg/ml蛋白酶K(ThermoFisher)到48孔板的每个孔。加有裂解液的孔板放在37℃，1.5小时的培养箱里，然后紧接着做80℃，30分钟的酶失活。
测序建库及测序
用引物P-EXM1-F和P-EXM1-R扩增出SRT编辑器在EXM1上的靶点(pY010-SRT和phU6-s-1共转染的细胞)。用引物P-FANCF-F和P-FANCF-R扩增出SRT编辑器在FANCF上的靶点(pY010-SRT和phU6-s-2共转染的细胞)。做好质量控制，建立测序文库。目标测序靶点通过PCR扩增，然后用Illumina MiSeq测序。
测序结果统计方法
测序reads通过MiSeq Reporter(Illumina)解析。用CRISPResso2将扩增子对齐到参考序列上。本专利中两个编辑器的编辑结果用编辑效率来衡量。编辑效率＝含有期望编辑结果的reads数量％/测序修剪正常的素有reads数量％。对于点突变编辑的量化，用CRIPSResso2(http：//crispresso.pinellolab.partners.org/)的“standard mode”加上“discard_indels_reads”。
基因编辑结果
图10.展示的是本专利两个基因编辑工具搭配各自的RTgRNA，在EXM2和FANCF两个基因编辑位点的效率。每组编辑效率都和phU6-backbone对照组做学生t-test。Untreated指示没有转染任何质粒的对照组。phU6-backbone组指的是共转染没有RTgRNA的空phU6-backbone与pY010-SRT、pY010-CRT基因编辑器质粒的对照组。P值小于0.05的比较组用五角星符号标注出来。对照组设置5个复制(replicates)，测试组设置6复制。
实施例2
序列设计与合成
合成CRT编辑器由改造过的逆转录酶(RT)串联改造过的CjCas9蛋白构成，本实施例中CRT编辑器优选RT在蛋白质N端的设计，即N-term-RT-CjCas9-C-term构造，但实际上RT也可以放在C端，即N-term-CjCas9-RT-C-term构造。CRT功能蛋白序列为SEQ ID NO.2。
合成3’CRTgRNA-F打靶HEK293T细胞基因组上的FANCF基因的一个位点，如图11。合成3’CRTgRNA-E打靶HEK293T细胞基因组上的EXM1基因的一个位点，如图12。
实施例2和实施例1，从HEK293T细胞培养，到转染HKE293T，到基因组提取，再到测序建库及测序操作都是一样的，因为打靶的区域非常相近，都在EXM2和FANCF上。
附图说明
图1是本专利中SRT编辑器对应的RTgRNA和CgRNA结构。
图2是SRT编辑器搭配5’SRTgRNA或者3’SRTgRNA在基因组上进行DNA编辑的原理。
图3是本专利中CRT编辑器对应的RTgRNA和CgRNA结构。
图4是SRT编辑器搭配5’CRTgRNA或者3’CRTgRNA在基因组上进行DNA编辑的原理。
图5是以点突变为例展示SRT编辑器的循环编辑原理图。
图6是SRT的偶连写入原理。
图7是SRT的逻辑写入原理。
图8是SRT编辑器搭配3’SRTgRNA-F在HEK293T基因组上FANCF基因的一个位点进行编辑的示意图。
图8A是SRT在3’SRTgRNA-F的引导下切开基因编辑位点后，逆转录酶逆转录合成出长ssDNA链的情况，图8B是组装到phU6载体上的3’SRTgRNA-F序列。
图9是SRT编辑器搭配3’SRTgRNA-E在HEK293T基因组上EXM1基因的一个位点进行编辑的示意图。
图9A是SRT在3’SRTgRNA-F的引导下切开基因编辑位点后，逆转录酶逆转录合成出长ssDNA链的情况，图9B是组装到phU6载体上的3’SRTgRNA-E序列。
图10是本专利中两个编辑器在293T上编辑位点的测序效率展示。
图11是CRT编辑器搭配3’CRTgRNA-F在HEK293T基因组上FANCF基因的一个位点进行编辑的示意图。
图11A是CRT在3’CRTgRNA-F的引导下切开基因编辑位点后，逆转录酶逆转录合成出长ssDNA链的情况，图11B是组装到phU6载体上的3’CRTgRNA-F序列。
图12是CRT编辑器搭配3’CRTgRNA-E在HEK293T基因组上EXM1基因的一个位点进行编辑的示意图。
图12A是CRT在3’CRTgRNA-F的引导下切开基因编辑位点后，逆转录酶逆转录合成出长ssDNA链的情况，图12B是组装到phU6载体上的3’CRTgRNA-E序列。
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Figure BDA0002852633200000261
Figure BDA0002852633200000271
序列表
<110> 神拓生物技术（无锡）有限公司
<120> 两种多功能基因编辑工具的构造及其使用方法
<141> 2020-12-23
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1882
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Gly Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly Thr Leu Asn
20 25 30
Ile Glu Asp Glu Tyr Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu Pro Asp Val
35 40 45
Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala Trp Ala Glu
50 55 60
Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu Ile Ile Pro
65 70 75 80
Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr Pro Met Ser
85 90 95
Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg Leu Leu Asp
100 105 110
Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr Pro Leu Leu
115 120 125
Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val Gln Asp Leu
130 135 140
Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr Val Pro Asn
145 150 155 160
Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln Trp Tyr Thr
165 170 175
Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu His Pro Thr
180 185 190
Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu Met Gly Ile
195 200 205
Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe Lys Asn Ser
210 215 220
Pro Thr Leu Phe Asn Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala Asp Phe Arg
225 230 235 240
Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp Asp Leu Leu
245 250 255
Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr Arg Ala Leu
260 265 270
Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala Lys Lys Ala
275 280 285
Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu Leu Lys Glu
290 295 300
Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val Met Gly Gln
305 310 315 320
Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Phe Leu Gly Lys Ala
325 330 335
Gly Phe Cys Arg Leu Phe Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met Ala Ala Pro
340 345 350
Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Pro Gly Thr Leu Phe Asn Trp Gly Pro Asp
355 360 365
Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu Thr Ala Pro
370 375 380
Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu Phe Val Asp
385 390 395 400
Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys Leu Gly Pro
405 410 415
Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp Pro Val Ala
420 425 430
Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile Ala Val Leu
435 440 445
Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu Val Ile Leu
450 455 460
Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro Asp Arg Trp
465 470 475 480
Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu Leu Asp Thr
485 490 495
Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro Ala Thr Leu
500 505 510
Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu Asp Ile Leu
515 520 525
Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln Pro Leu Pro
530 535 540
Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Gln Glu
545 550 555 560
Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr Glu Val Ile
565 570 575
Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg Ala Glu Leu
580 585 590
Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys Lys Leu Asn
595 600 605
Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His Ile His Gly
610 615 620
Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Trp Leu Thr Ser Glu Gly Lys Glu Ile
625 630 635 640
Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu Phe Leu Pro
645 650 655
Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys Gly His Ser
660 665 670
Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala Arg Lys Ala
675 680 685
Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu Ile Glu Asn Ser
690 695 700
Ser Pro Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
705 710 715 720
Gly Gly Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Ser Gly Gly Ser
725 730 735
Gly Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gly Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Ser
740 745 750
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
755 760 765
Pro Ser Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Pro
770 775 780
Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly
785 790 795 800
Ser Ser Gly Thr Ser Gly Gly Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp
805 810 815
Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg
820 825 830
Asp Val Ile Asp Ala Gly Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu
835 840 845
Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg
850 855 860
Arg Arg Arg His Arg Ile Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr
865 870 875 880
Asn Leu Leu Thr Asp His Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu
885 890 895
Ala Arg Val Lys Gly Leu Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser
900 905 910
Ala Ala Leu Leu His Leu Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn
915 920 925
Glu Val Glu Glu Asp Thr Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile
930 935 940
Ser Arg Asn Ser Lys Ala Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln
945 950 955 960
Leu Glu Arg Leu Lys Lys Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg
965 970 975
Phe Lys Thr Ser Asp Tyr Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val
980 985 990
Gln Lys Ala Tyr His Gln Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile
995 1000 1005
Asp Leu Leu Glu Thr Arg Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly
1010 1015 1020
Ser Pro Phe Gly Trp Lys Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met
1025 1030 1035 1040
Gly His Cys Thr Tyr Phe Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala
1045 1050 1055
Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val
1060 1065 1070
Ile Thr Arg Asp Glu Asn Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln
1075 1080 1085
Ile Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln
1090 1095 1100
Ile Ala Lys Glu Ile Leu Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg
1105 1110 1115 1120
Val Thr Ser Thr Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His
1125 1130 1135
Asp Ile Lys Asp Ile Thr Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu
1140 1145 1150
Leu Leu Asp Gln Ile Ala Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu
1155 1160 1165
Asp Ile Gln Glu Glu Leu Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu
1170 1175 1180
Glu Ile Glu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn
1185 1190 1195 1200
Leu Ser Leu Lys Ala Ile Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr
1205 1210 1215
Asn Asp Asn Gln Ile Ala Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys
1220 1225 1230
Lys Val Asp Leu Ser Gln Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp
1235 1240 1245
Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile
1250 1255 1260
Lys Val Ile Asn Ala Ile Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile
1265 1270 1275 1280
Ile Ile Glu Leu Ala Arg Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met
1285 1290 1295
Ile Asn Glu Met Gln Lys Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu
1300 1305 1310
Glu Ile Ile Arg Thr Thr Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu
1315 1320 1325
Lys Ile Lys Leu His Asp Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu
1330 1335 1340
Glu Ala Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu
1345 1350 1355 1360
Val Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn
1365 1370 1375
Asn Lys Val Leu Val Lys Gln Glu Glu Ala Ser Lys Lys Gly Asn Arg
1380 1385 1390
Thr Pro Phe Gln Tyr Leu Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu
1395 1400 1405
Thr Phe Lys Lys His Ile Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile
1410 1415 1420
Ser Lys Thr Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg
1425 1430 1435 1440
Phe Ser Val Gln Lys Asp Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg
1445 1450 1455
Tyr Ala Thr Arg Gly Leu Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val
1460 1465 1470
Asn Asn Leu Asp Val Lys Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser
1475 1480 1485
Phe Leu Arg Arg Lys Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr
1490 1495 1500
Lys His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile
1505 1510 1515 1520
Phe Lys Glu Trp Lys Lys Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn
1525 1530 1535
Gln Met Phe Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr
1540 1545 1550
Glu Gln Glu Tyr Lys Glu Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His
1555 1560 1565
Ile Lys Asp Phe Lys Asp Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys
1570 1575 1580
Pro Asn Arg Glu Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp
1585 1590 1595 1600
Asp Lys Gly Asn Thr Leu Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp
1605 1610 1615
Lys Asp Asn Asp Lys Leu Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys
1620 1625 1630
Leu Leu Met Tyr His His Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu
1635 1640 1645
Ile Met Glu Gln Tyr Gly Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr
1650 1655 1660
Glu Glu Thr Gly Asn Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly
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Pro Val Ile Lys Lys Ile Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His
1685 1690 1695
Leu Asp Ile Thr Asp Asp Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys
1700 1705 1710
Leu Ser Leu Lys Pro Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val
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Tyr Lys Phe Val Thr Val Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn
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Tyr Tyr Glu Val Asn Ser Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys
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Leu Ile Lys Ile Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn
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Asp Leu Leu Asn Arg Ile Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg
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Glu Tyr Leu Glu Asn Met Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys
1810 1815 1820
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Leu Gly Asn Leu Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile
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Lys Lys Gly Gly Ser Ser Gly Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe
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<210> 2
<211> 1813
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Gly Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly Thr Leu Asn
20 25 30
Ile Glu Asp Glu Tyr Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu Pro Asp Val
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Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala Trp Ala Glu
50 55 60
Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu Ile Ile Pro
65 70 75 80
Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr Pro Met Ser
85 90 95
Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg Leu Leu Asp
100 105 110
Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr Pro Leu Leu
115 120 125
Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val Gln Asp Leu
130 135 140
Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr Val Pro Asn
145 150 155 160
Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln Trp Tyr Thr
165 170 175
Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu His Pro Thr
180 185 190
Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu Met Gly Ile
195 200 205
Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe Lys Asn Ser
210 215 220
Pro Thr Leu Phe Asn Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala Asp Phe Arg
225 230 235 240
Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp Asp Leu Leu
245 250 255
Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr Arg Ala Leu
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Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala Lys Lys Ala
275 280 285
Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu Leu Lys Glu
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325 330 335
Gly Phe Cys Arg Leu Phe Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met Ala Ala Pro
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys Leu Gly Pro
405 410 415
Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp Pro Val Ala
420 425 430
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435 440 445
Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu Val Ile Leu
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465 470 475 480
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485 490 495
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Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr Glu Val Ile
565 570 575
Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg Ala Glu Leu
580 585 590
Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys Lys Leu Asn
595 600 605
Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His Ile His Gly
610 615 620
Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Trp Leu Thr Ser Glu Gly Lys Glu Ile
625 630 635 640
Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu Phe Leu Pro
645 650 655
Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys Gly His Ser
660 665 670
Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala Arg Lys Ala
675 680 685
Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu Ile Glu Asn Ser
690 695 700
Ser Pro Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
705 710 715 720
Gly Gly Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Ser Gly Gly Ser
725 730 735
Gly Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gly Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Ser
740 745 750
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
755 760 765
Pro Ser Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Pro
770 775 780
Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly
785 790 795 800
Ser Ser Gly Thr Ser Gly Gly Ala Arg Ile Leu Ala Phe Asp Ile Gly
805 810 815
Ile Ser Ser Ile Gly Trp Ala Phe Ser Glu Asn Asp Glu Leu Lys Asp
820 825 830
Cys Gly Val Arg Ile Phe Thr Lys Val Glu Asn Pro Lys Thr Gly Glu
835 840 845
Ser Leu Ala Leu Pro Arg Arg Leu Ala Arg Ser Ala Arg Lys Arg Leu
850 855 860
Ala Arg Arg Lys Ala Arg Leu Asn His Leu Lys His Leu Ile Ala Asn
865 870 875 880
Glu Phe Lys Leu Asn Tyr Glu Asp Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Ser Leu
885 890 895
Ala Lys Ala Tyr Lys Gly Ser Leu Ile Ser Pro Tyr Glu Leu Arg Phe
900 905 910
Arg Ala Leu Asn Glu Leu Leu Ser Lys Gln Asp Phe Ala Arg Val Ile
915 920 925
Leu His Ile Ala Lys Arg Arg Gly Tyr Asp Asp Ile Lys Asn Ser Asp
930 935 940
Asp Lys Glu Lys Gly Ala Ile Leu Lys Ala Ile Lys Gln Asn Glu Glu
945 950 955 960
Lys Leu Ala Asn Tyr Gln Ser Val Gly Glu Tyr Leu Tyr Lys Glu Tyr
965 970 975
Phe Gln Lys Phe Lys Glu Asn Ser Lys Glu Phe Thr Asn Val Arg Asn
980 985 990
Lys Lys Glu Ser Tyr Glu Arg Cys Ile Ala Gln Ser Phe Leu Lys Asp
995 1000 1005
Glu Leu Lys Leu Ile Phe Lys Lys Gln Arg Glu Phe Gly Phe Ser Phe
1010 1015 1020
Ser Lys Lys Phe Glu Glu Glu Val Leu Ser Val Ala Phe Tyr Lys Arg
1025 1030 1035 1040
Ala Leu Lys Asp Phe Ser His Leu Val Gly Asn Cys Ser Phe Phe Thr
1045 1050 1055
Asp Glu Lys Arg Ala Pro Lys Asn Ser Pro Leu Ala Phe Met Phe Val
1060 1065 1070
Ala Leu Thr Arg Ile Ile Asn Leu Leu Asn Asn Leu Lys Asn Thr Glu
1075 1080 1085
Gly Ile Leu Tyr Thr Lys Asp Asp Leu Asn Ala Leu Leu Asn Glu Val
1090 1095 1100
Leu Lys Asn Gly Thr Leu Thr Tyr Lys Gln Thr Lys Lys Leu Leu Gly
1105 1110 1115 1120
Leu Ser Asp Asp Tyr Glu Phe Lys Gly Glu Lys Gly Thr Tyr Phe Ile
1125 1130 1135
Glu Phe Lys Lys Tyr Lys Glu Phe Ile Lys Ala Leu Gly Glu His Asn
1140 1145 1150
Leu Ser Gln Asp Asp Leu Asn Glu Ile Ala Lys Asp Ile Thr Leu Ile
1155 1160 1165
Lys Asp Glu Ile Lys Leu Lys Lys Ala Leu Ala Lys Tyr Asp Leu Asn
1170 1175 1180
Gln Asn Gln Ile Asp Ser Leu Ser Lys Leu Glu Phe Lys Asp His Leu
1185 1190 1195 1200
Asn Ile Ser Phe Lys Ala Leu Lys Leu Val Thr Pro Leu Met Leu Glu
1205 1210 1215
Gly Lys Lys Tyr Asp Glu Ala Cys Asn Glu Leu Asn Leu Lys Val Ala
1220 1225 1230
Ile Asn Glu Asp Lys Lys Asp Phe Leu Pro Ala Phe Asn Glu Thr Tyr
1235 1240 1245
Tyr Lys Asp Glu Val Thr Asn Pro Val Val Leu Arg Ala Ile Lys Glu
1250 1255 1260
Tyr Arg Lys Val Leu Asn Ala Leu Leu Lys Lys Tyr Gly Lys Val His
1265 1270 1275 1280
Lys Ile Asn Ile Glu Leu Ala Arg Glu Val Gly Lys Asn His Ser Gln
1285 1290 1295
Arg Ala Lys Ile Glu Lys Glu Gln Asn Glu Asn Tyr Lys Ala Lys Lys
1300 1305 1310
Asp Ala Glu Leu Glu Cys Glu Lys Leu Gly Leu Lys Ile Asn Ser Lys
1315 1320 1325
Asn Ile Leu Lys Leu Arg Leu Phe Lys Glu Gln Lys Glu Phe Cys Ala
1330 1335 1340
Tyr Ser Gly Glu Lys Ile Lys Ile Ser Asp Leu Gln Asp Glu Lys Met
1345 1350 1355 1360
Leu Glu Ile Asp Ala Ile Tyr Pro Tyr Ser Arg Ser Phe Asp Asp Ser
1365 1370 1375
Tyr Met Asn Lys Val Leu Val Phe Thr Lys Gln Asn Gln Glu Lys Leu
1380 1385 1390
Asn Gln Thr Pro Phe Glu Ala Phe Gly Asn Asp Ser Ala Lys Trp Gln
1395 1400 1405
Lys Ile Glu Val Leu Ala Lys Asn Leu Pro Thr Lys Lys Gln Lys Arg
1410 1415 1420
Ile Leu Asp Lys Asn Tyr Lys Asp Lys Glu Gln Lys Asn Phe Lys Asp
1425 1430 1435 1440
Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr Ile Ala Arg Leu Val Leu Asn Tyr
1445 1450 1455
Thr Lys Asp Tyr Leu Asp Phe Leu Pro Leu Ser Asp Asp Glu Asn Thr
1460 1465 1470
Lys Leu Asn Asp Thr Gln Lys Gly Ser Lys Val His Val Glu Ala Lys
1475 1480 1485
Ser Gly Met Leu Thr Ser Ala Leu Arg His Thr Trp Gly Phe Ser Ala
1490 1495 1500
Lys Asp Arg Asn Asn His Leu His His Ala Ile Asp Ala Val Ile Ile
1505 1510 1515 1520
Ala Tyr Ala Asn Asn Ser Ile Val Lys Ala Phe Ser Asp Phe Lys Lys
1525 1530 1535
Glu Gln Glu Ser Asn Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Lys Lys Ile Ser Glu
1540 1545 1550
Leu Asp Tyr Lys Asn Lys Arg Lys Phe Phe Glu Pro Phe Ser Gly Phe
1555 1560 1565
Arg Gln Lys Val Leu Asp Lys Ile Asp Glu Ile Phe Val Ser Lys Pro
1570 1575 1580
Glu Arg Lys Lys Pro Ser Gly Ala Leu His Glu Glu Thr Phe Arg Lys
1585 1590 1595 1600
Glu Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Gly Val Leu Lys
1605 1610 1615
Ala Leu Glu Leu Gly Lys Ile Arg Lys Val Asn Gly Lys Ile Val Lys
1620 1625 1630
Asn Gly Asp Met Phe Arg Val Asp Ile Phe Lys His Lys Lys Thr Asn
1635 1640 1645
Lys Phe Tyr Ala Val Pro Ile Tyr Thr Met Asp Phe Ala Leu Lys Val
1650 1655 1660
Leu Pro Asn Lys Ala Val Ala Arg Ser Lys Lys Gly Glu Ile Lys Asp
1665 1670 1675 1680
Trp Ile Leu Met Asp Glu Asn Tyr Glu Phe Cys Phe Ser Leu Tyr Lys
1685 1690 1695
Asp Ser Leu Ile Leu Ile Gln Thr Lys Asp Met Gln Glu Pro Glu Phe
1700 1705 1710
Val Tyr Tyr Asn Ala Phe Thr Ser Ser Thr Val Ser Leu Ile Val Ser
1715 1720 1725
Lys His Asp Asn Lys Phe Glu Thr Leu Ser Lys Asn Gln Lys Ile Leu
1730 1735 1740
Phe Lys Asn Ala Asn Glu Lys Glu Val Ile Ala Lys Ser Ile Gly Ile
1745 1750 1755 1760
Gln Asn Leu Lys Val Phe Glu Lys Tyr Ile Val Ser Ala Leu Gly Glu
1765 1770 1775
Val Thr Lys Ala Glu Phe Arg Gln Arg Glu Asp Phe Lys Lys Gly Ser
1780 1785 1790
Ser Gly Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys
1795 1800 1805
Lys Arg Lys Val Glu
1810

Claims (6)

1.递送本专利的两种人类基因组编辑工具到人类和其他哺乳动物细胞的方式包括；电转化或电转孔(electroporation)递送法；纳米粒子递送，特别是脂质体(liposome)，脂质纳米粒子(lipid nanoparticle)，多聚合物纳米粒子(polymer nanoparticle)和脂质多聚合纳米粒子(lipid-polymer hybrid nanoparticle)；病毒载体递送，特别是第二代或第三代自失活的慢病毒载体系统(the 2ndor 3rdgeneration of self-inactivatinglentivirus)，逆转录病毒系统。
2.如权利要求1所述的递送方法，递送到细胞中的人类基因组编辑工具可以是表达SEQID NO.1，SEQ ID NO.2氨基酸链的DNA分子、mRNA分子，RNA和融合蛋白混合物。
3.如权利要求1所述，电转化或电穿孔所用的设备包括4D-NucleofectorTM(Lonza)和NeonTM nucleofection(ThermoFisher Scientific)系统。
4.如权利要求1所述，每种基因组编辑工具都由一种融合蛋白和对应的RTgRNA构成，每种融合蛋白包含以下一条或者多条特征：
i.整个融合蛋白由改造过的Cas蛋白(以下简称为Cas)和改造过的逆转录酶(以下简称为RT)两个必要蛋白构成，改造过的Cas可以是改造过的SaCas9或改造过的CjCas9；
ii.整个融合蛋白的N端(简称为N-term)或者C端(简称为C-term)，至少一端拥有一个核定位信号(以下简称为NLS)；
iii.整个融合蛋白含有一段由甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的GS linker氨基酸链，无论GS linker区怎样加入其它氨基酸或者改变氨基酸的排列方式，linker本生由甘氨酸加丝氨酸构成，其长度在20到400个氨基酸以内，G加S在整个GS linker的比例在50％～100％之间，GS linker主要放到Cas和RT之间；
iv.改造过的Cas和改造过的RT从N-term到C-term的组合顺序可以是：Cas-RT，也可以是RT-Cas。
5.如权利要求4所述，每种基因组编辑工具由一种融合蛋白和对应的RTgRNA构成，
i.与含有SaCas9的融合蛋白搭配的RTgRNA称作SRTgRNA，SRTgRNA的结构模式是：5’-template-RBS-flexible linker-gRNA-gRNA scaffold-3’或3’-gRNA-gRNA scaffold-template-RBS-5’：
ii.与含有CjCas9的融合蛋白搭配的RTgRNA称作CRTgRNA，CRTgRNA的结构模式是：5’-template-RBS-flexible linker-gRNA-gRNA scaffold-3’或3’-gRNA-gRNA scaffold-template-RBS-5’。
6.如权利要求1所述，利用基因编辑工具实现本专利中定义的基因编辑策略包括本专利中定义的：“耦连写入”、“逻辑写入”。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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