JP7109009B2

JP7109009B2 - 遺伝子ノックアウト方法

Info

Publication number: JP7109009B2
Application number: JP2020529784A
Authority: JP
Inventors: 魏文▲勝▼; ▲陳▼一欧; 周悦欣; ▲張▼▲鴻▼▲敏▼; 袁▲鵬▼▲飛▼; ▲劉▼源
Original assignee: Peking University; Edigene Biotechnology Inc
Current assignee: Peking University; Edigene Biotechnology Inc
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2017-08-08
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2037-08-08
Also published as: US11624077B2; US20200255866A1; CN111278983A; EP3666898A4; JP2020533017A; EP3666898A1; WO2019028686A1

Description

本発明は、遺伝子編集技術に関し、特に遺伝子ノックアウト方法に関する。

遺伝子編集技術は、遺伝子機能についての実験的研究を徹底的に変革した。ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）［１］、ＴＡＬＥＮｓ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）［２～４］、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム［５～７］の３つの主要な技術は、異なるメカニズムを利用して配列特異的な二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢｓ）を生成し、そして自然修復システムを誘発して配列特異性修復を完成する［８、９］。これらの技術は、機能的遺伝子研究［１０］、染色体部位の動的およびリアルタイムイメージング［１１、１２］、疾患突然変異の修正［１３］、遺伝子治療［１４］などにおいて広く使用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、その効率と操作の容易さのため特に人気がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、もともと細菌免疫システムが外来ウイルスまたはプラスミドを防御するために使用されており、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがｓｇＲＮＡに導かれて二本鎖ＤＮＡを切断し、ゲノムの二本鎖の切断を引き起こし、細胞のゲノム修復の不安定性を利用して修復エラー（塩基の欠失または挿入）を生成し、これによって遺伝子編集の効果を生じる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、設計に基づいた、配列特異的なゲノム研究において未曾有の優勢を持っているが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって引き起こされた遺伝子編集は、細胞集団ではまだまれなイベントであり、真に遺伝子が編集されたモノクローンを得るには煩瑣な労力が必要である。そのため、哺乳動物細胞で遺伝子ノックアウトを生成するなどの簡単な作業であっても、このシステムは依然として技術上では困難である［１５］。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを組み込んでＣａｓ９とｓｇＲＮＡを恒久的に発現させたり［１６］、Ｃａｓ９を安定的に発現する細胞株を予め生成したり［１７］、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を増強したり［１８］、特異的な薬剤によるスクリーニングが可能な単独の遺伝子を同時に破壊することによって遺伝子‐標的イベントを濃縮したり［１９］、サロゲートレポーター（ｓｕｒｒｏｇａｔｅｒｅｐｏｒｔｅｒ）を使用して遺伝子ノックアウトを濃縮したり［２０、２１］して、さまざまな努力で遺伝子ノックアウトを生成するスキームの効率を高めている。しかしながら、さまざまな欠点により、これらの技術の広範な使用は制限されている。特に、哺乳動物細胞で複数遺伝子ノックアウトを生成することは困難な作業のままである。従来の方法を使用する時、単一の遺伝子をノックアウトする場合でも、標的遺伝子修復を含む希少なクローンに対する効率的な濃縮が欠けているため、長時間、多くて重く、かつリスクの高い作業である［２２］。

標的遺伝子の破壊が、濃縮に使用可能な表現型変化を引き起こせる場合、遺伝子ノックアウトクローンを簡単に取得できる。例えば、ＨｅｌａＣＳＰＧ４^－／－細胞は、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂに対する耐性が付与された［２３］。しかしながら、このストラテジーは一般化できない。従来の方法は、抗生物質耐性または蛍光タンパク質を発現するプラスミドをコトランスフェクションすることであるが［２３、２４］、この方法は、標的修飾を含む少数の細胞を濃縮することはない。

外来のｄｓＤＮＡフラグメントは、異なる修復メカニズムを通してＤＳＢｓを有する染色体部位に組み込まれる可能性があることは報告されている。相同組み換え（ＨＲ）による修復には、長いフランキング配列の構築が必要であり、組み込む効率は低いが、非相同末端結合（Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）によるＤＮＡ修復の組み込む効率［２７、２８］は、通常、相同組み換えによる修復の組み込む効率より高い［２９］。遺伝子ノックインの目的を達成するように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により誘発されたＮＨＥＪを使用して外来線形ドナーＤＮＡの挿入を媒介することは研究されている［３０～３４］。

Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．，Ｃｈａ，Ｊ．＆Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ，Ｓ．Ｈｙｂｒｉｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓ：ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｆｕｓｉｏｎｓｔｏＦｏｋＩｃｌｅａｖａｇｅｄｏｍａｉｎ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３，１１５６－１１６０（１９９６）．Ｂｏｃｈ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＢｒｅａｋｉｎｇｔｈｅｃｏｄｅｏｆＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆＴＡＬ－ｔｙｐｅＩＩＩｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６，１５０９－１５１２（２００９）．Ｍｏｓｃｏｕ，Ｍ．Ｊ．＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．ＡｓｉｍｐｌｅｃｉｐｈｅｒｇｏｖｅｒｎｓＤＮＡｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂｙＴＡＬｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６，１５０１（２００９）．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔａｌ．ＡＴＡＬＥｎｕｃｌｅａｓｅａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９，１４３－１４８（２０１１）．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔａｌ．Ａｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄＤＮＡｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｄａｐｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７，８１６－８２１（２０１２）．Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔａｌ．ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｖｉａＣａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，８２３－８２６（２０１３）．Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔａｌ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＧｅｎｏｍｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＵｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，８１９－８２３（２０１３）．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．＆ＭｃＫｉｎｎｏｎ，Ｐ．Ｊ．ＤＮＡｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｒｅｐａｉｒａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２６，７７９９－７８０８（２００７）．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｒ．＆Ｂｏｕｌｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｐｌａｙｉｎｇｔｈｅｅｎｄｇａｍｅ：ＤＮＡｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｒｅｐａｉｒｐａｔｈｗａｙｃｈｏｉｃｅ．ＭｏｌＣｅｌｌ４７，４９７－５１０（２０１２）．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．ｅｔａｌ．ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄｍｏｄｕｌａｒＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ１５４，４４２－４５１（２０１３）．Ｍａ，Ｈ．ｅｔａｌ．ＭｕｌｔｉｃｏｌｏｒＣＲＩＳＰＲｌａｂｅｌｉｎｇｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｏｃｉｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１２，３００２－３００７（２０１５）．Ｃｈｅｎ，Ｂ．ｅｔａｌ．ＤｙｎａｍｉｃｉｍａｇｉｎｇｏｆｇｅｎｏｍｉｃｌｏｃｉｉｎｌｉｖｉｎｇｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｂｙａｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ１５５，１４７９－１４９１（２０１３）．Ｌｉ，Ｈ．Ｌ．，Ｇｅｅ，Ｐ．，Ｉｓｈｉｄａ，Ｋ．＆Ｈｏｔｔａ，Ａ．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｏｍｉｃｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｉｎｈｕｍａｎｉＰＳｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１５）．Ｓａｖｉｃ，Ｎ．＆Ｓｃｈｗａｎｋ，Ｇ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅｊｏｕｒｎａｌｏｆｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ１６８，１５－２１（２０１６）．Ｍｉｙａｏｋａ，Ｙ．ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅｇｅｎｏｍｅ－ｅｄｉｔｅｄｈｕｍａｎｉＰＳｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ１１，２９１－２９３（２０１４）．Ｆｕ，Ｙ．ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｎｕｃｌｅａｓｅｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，８２２－８２６（２０１３）．Ｚｈｏｕ，Ｙ．ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆａＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｌｉｂｒａｒｙｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ５０９，４８７－４９１（２０１４）．Ｙｕ，Ｃ．ｅｔａｌ．ＳｍａｌｌＭｏｌｅｃｕｌｅｓＥｎｈａｎｃｅＣＲＩＳＰＲＧｅｎｏｍｅＥｄｉｔｉｎｇｉｎＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ１６，１４２－１４７（２０１５）．Ｌｉａｏ，Ｓ．，Ｔａｍｍａｒｏ，Ｍ．＆Ｙａｎ，Ｈ．ＥｎｒｉｃｈｉｎｇＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｔａｒｇｅｔｅｄｃｅｌｌｓｂｙｃｏ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅＨＰＲＴｇｅｎｅ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４３，ｅ１３４（２０１５）．Ｋｉｍ，Ｈ．ｅｔａｌ．Ｓｕｒｒｏｇａｔｅｒｅｐｏｒｔｅｒｓｆｏｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｃｅｌｌｓｗｉｔｈｎｕｃｌｅａｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ８，９４１－９４３（２０１１）．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ｓ．ｅｔａｌ．Ｓｕｒｒｏｇａｔｅｒｅｐｏｒｔｅｒ－ｂａｓｅｄｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｃｅｌｌｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄＣａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ５，３３７８（２０１４）．Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｗｅｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．＆Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．ＧｅｎｅｔｉｃｓｃｒｅｅｎｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｔｈｅＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３４３，８０－８４（２０１４）．Ｙｕａｎ，Ｐ．ｅｔａｌ．Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｓｕｌｆａｔｅｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ４ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅｔｏｘｉｎＢ．ＣｅｌｌＲｅｓ２５，１５７－１６８（２０１５）．Ｙａｎｇ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＵＬｔｉＭＡＴＥＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲａｐｉｄＡｓｓｅｍｂｌｙｏｆＣｕｓｔｏｍｉｚｅｄＴＡＬＥｆｆｅｃｔｏｒｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ８，ｅ７５６４９（２０１３）．Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｅ．ｅｔａｌ．ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＨＩＶ－１ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌｓｂｙｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｕｓｉｎｇｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２６，８０８－８１６（２００８）．Ｋｉｍ，Ｈ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｃｈｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｗｉｔｈｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｖｉａｍｏｄｕｌａｒａｓｓｅｍｂｌｙ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ１９，１２７９－１２８８（２００９）．Ｌａｃｋｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．ｅｔａｌ．ＡｇｅｎｅｒｉｃｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔａｇｇｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ６，１０２３７（２０１５）．Ａｕｅｒ，Ｔ．Ｏ．＆ＤｅｌＢｅｎｅ，Ｆ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ａｎｄＴＡＬＥＮ－ｍｅｄｉａｔｅｄｋｎｏｃｋ－ｉｎａｐｐｒｏａｃｈｅｓｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１４）．Ｌｉ，Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｔ．，Ｚｈｏｕ，Ｐ．＆Ｐｕ，Ｗ．Ｔ．ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＧｅｎｏｍｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｗｉｔｈｔｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｓｙｓｔｅｍ．ＰＬｏＳＯｎｅ９，ｅ１０５７７９（２０１４）．Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｓ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ－ｄｒｉｖｅｎｔａｒｇｅｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｍｍａｌｉａｎｇｅｎｏｍｅｓｕｓｉｎｇｄｏｎｏｒｓｗｉｔｈｌｉｍｉｔｅｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｈｏｍｏｌｏｇｙ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３８，ｅ１５２（２０１０）．Ｓａｋｕｍａ，Ｔ．，Ｎａｋａｄｅ，Ｓ．，Ｓａｋａｎｅ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｔ．＆Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．ＭＭＥＪ－ａｓｓｉｓｔｅｄｇｅｎｅｋｎｏｃｋ－ｉｎｕｓｉｎｇＴＡＬＥＮｓａｎｄＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｗｉｔｈｔｈｅＰＩＴＣｈｓｙｓｔｅｍｓ．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ１１，１１８－１３３（２０１６）．Ｎａｋａｄｅ，Ｓ．ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｄｏｎｏｒＤＮＡｉｎｃｅｌｌｓａｎｄａｎｉｍａｌｓｕｓｉｎｇＴＡＬＥＮｓａｎｄＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ５，５５６０（２０１４）．Ｃｒｉｓｔｅａ，Ｓ．ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏｃｌｅａｖａｇｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｄｏｎｏｒｓｐｒｏｍｏｔｅｓｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔａｒｇｅｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ１１０，８７１－８８０（２０１３）．Ｃｈｅｎ，Ｆ．ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｕｓｉｎｇｓｓＤＮＡｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｗｉｔｈｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ８，７５３－７５５（２０１１）．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｃ．Ｊ．＆Ｌｕｏ，Ｌ．ＳｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲｆｏｒｍａｐｐｉｎｇｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ．ＰＬｏＳＯｎｅ５，ｅ１０１６８（２０１０）．Ｕｒｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔａｌ．Ａｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｉｔｅｓ．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ４，７８９－７９８（２００９）．Ｙｉｎ，Ｂ．＆Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ，Ｄ．Ａ．ＰＣＲ－ｂａｓｅｄｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｔｏｉｓｏｌａｔｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｉｔｅｓｏｆＤＮＡｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４３，７９－８４（２００７）．Ｐｅｎｇ，Ｊ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｚｈｕ，Ｓ．＆Ｗｅｉ，Ｗ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｔｈｅＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ．ＦＥＢＳＪ２８２，２０８９－２０９６（２０１５）．

本発明は、ドナー構築体、遺伝子ノックアウト方法、そのシステムおよびキットを提供する。本発明の遺伝子ノックアウト方法は、前記ドナー構築体に含まれるマーカー遺伝子を使用して、遺伝子がノックアウトされた細胞を濃縮し、配列特異的なヌクレアーゼによる遺伝子ノックアウトの生成効率を向上させる。

本発明は一態様において、線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；前記配列特異的なヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端の標的配列；および両端の保護配列が含まれ、前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含む、ドナー構築体を提供する。

本発明において、前記線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。

好ましい実施形態では、前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡである。

一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。

もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。

もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。

もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである。

一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて標的配列を有する。

一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ標的配列を有する。

一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の標的配列は同じである。

一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の標的配列は異なる。更なる実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の異なる標的配列は同じ遺伝子に由来する。その他のさらなる実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の異なる標的配列は異なる遺伝子に由来する。

好ましい実施形態では、前記マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である。

好ましい実施形態では、保護配列の長さは５～３０ｂｐ、もっとも好ましくは２０ｂｐである。

本発明はもう一態様において、下記のステップを含む、細胞内で遺伝子ノックアウトを生成する方法を提供する：
（１）細胞ゲノムの特定の標的部位を切断できる配列特異的ヌクレアーゼとドナー構築体を細胞に導入するステップ；
前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであり、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；前記配列特異的ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記線形ドナーＤＮＡを、非相同末端結合を介して細胞ゲノムの特定の標的部位に挿入する；
（２）前記マーカーの発現が陽性である細胞をスクリーニングするステップ。

好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの特定の標的部位を認識するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞に導入することをさらに含み、線形ドナーＤＮＡの標的配列は、ｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む。

一部の実施形態では、前記ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。

より好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの単一の特定の標的部位を認識するｓｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含み、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む標的配列は、線形ドナーＤＮＡの５’末端および／または３’末端に位置する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む標的配列は、細胞ゲノムの単一の遺伝子に由来する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む標的配列は、細胞ゲノムの２つ以上の遺伝子のコンセンサス配列であり、その条件として、前記コンセンサス配列と、前記２つ以上の遺伝子のいずれか１つの、コンセンサス配列に対応する位置の配列とは、１つ以下の塩基の違いを有する。

もう一部のより好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの１つの遺伝子上の２つの特定の標的部位を認識する２つのｓｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含み、前記２つのｓｇＲＮＡによって認識される２つの標的部位をそれぞれ含む２つの標的配列はそれぞれ２つの線形ドナーＤＮＡに位置するか、または、それぞれ同一の線形ドナーＤＮＡの両端に位置する。

もう一部のより好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの２つ以上の特定の標的部位を認識する２つ以上のｓｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含み、前記２つ以上のｓｇＲＮＡによって認識される２つ以上の標的部位をそれぞれ含む２つ以上の標的配列はそれぞれ同一の線形ドナーＤＮＡの両端、または異なる線形ドナーＤＮＡに位置する。前記細胞ゲノムの２つ以上の特定の標的部位はそれぞれ異なる遺伝子に位置する。

好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの特定の標的部位を認識するガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を細胞に導入することをさらに含み、線形ドナーＤＮＡの標的配列は、ｇＤＮＡによって認識される標的部位を含む。

本発明では、前記遺伝子ノックアウトは、単一遺伝子ノックアウトまたは複数遺伝子ノックアウトであってもよい。前記複数遺伝子ノックアウトは、２つまたはそれ以上の遺伝子のノックアウトであり、例えば、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の遺伝子のノックアウトである。

一つの好ましい実施形態では、薬剤耐性により細胞をスクリーニングする。

もう一つの好ましい実施形態では、ＦＡＣＳ法により細胞をスクリーニングする。

好ましい実施形態では、保護配列の長さが５～３０ｂｐであり、もっとも好ましくは２０ｂｐである。

本発明はもう一態様において、細胞ゲノムの特定の標的部位を切断できる配列特異的ヌクレアーゼとドナー構築体を含む、遺伝子ノックアウトのためのシステムまたはキットを提供し、
前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであり、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；前記配列特異的ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端の標的配列；および両端の保護配列が含まれ、前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含む。

本発明では、線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。

一部の実施形態では、前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡである。もう一部の実施形態では、前記ドナー構築体は環状ドナー構築体であり、しかも細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができる。

好ましい実施形態では、前記システムまたはキットは、細胞ゲノムの特定の標的部位を認識するｓｇＲＮＡをさらに含み、線形ドナーＤＮＡの標的配列は、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。

好ましい実施形態では、前記システムまたはキットは、細胞ゲノムの特定の標的部位を認識するｇＤＮＡを含み、線形ドナーＤＮＡの標的配列は、前記ｇＤＮＡによって認識される標的部位を含む。

本発明では、前記切断は、二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を生成することである。

本発明はもう一態様において、線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しない、ユニバーサルドナー構築体を提供する。

一部の実施形態では、前記ユニバーサルドナー構築体は線形ドナーＤＮＡである。

一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。

一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて前記ユニバーサル標的配列を有する。

一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ前記ユニバーサル標的配列を有する。

好ましい実施形態では、前記ユニバーサルドナー構築体のユニバーサル標的配列は、５’－ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）または５’－ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）を含む。

本発明はもう一態様において、
（１）下記の：
（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ；
（ｂ）細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡ；
（ｃ）線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しない、ユニバーサルドナー構築体；および
（ｄ）線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡ
を細胞に導入するステップ；
（２）前記線形ドナーＤＮＡを、非相同末端結合を介して細胞ゲノムの特定の標的部位に挿入するステップ；および
（３）前記マーカーの発現が陽性である細胞をスクリーニングするステップ
を含む、細胞内で遺伝子ノックアウトを生成する方法を提供する。

一部の実施形態では、前記ドナー構築体は、線形ドナーＤＮＡである。

一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡが、一種のｇＲＮＡ、または細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する複数のｇＲＮＡであり、例えば、細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する２つ、３つ、またはそれ以上のｇＲＮＡであってもよい。前記異なる標的配列は、同一の遺伝子に位置してもよく、異なる遺伝子に位置してもよい。前記異なる標的配列はそれぞれ異なる遺伝子に位置する場合、複数の遺伝子のノックアウトが実現できる。

そのため、本発明では、前記遺伝子ノックアウトは、単一遺伝子ノックアウトまたは複数遺伝子ノックアウトであってもよい。複数遺伝子ノックアウトは、２つまたはそれ以上の遺伝子のノックアウトであり、例えば、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の遺伝子のノックアウトである。

一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである。

一部の実施形態では、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである。

一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｓｇＲＮＡと、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｓｇＲＮＡとは、同じベクターに位置する。

一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｓｇＲＮＡと、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに位置する。

好ましい実施形態では、前記マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である。

本発明はもう一態様において、
（１）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはＣａｓ９ヌクレアーゼを発現することができるベクターまたは細胞；
（２）細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡ；
（３）線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しない、ユニバーサルドナー構築体；および
（４）線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡ
を含む、遺伝子ノックアウトのためのシステムまたはキットを提供する。

一部の実施形態では、線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。

一部の実施形態では、前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡである。

もう一部の実施形態では、前記ドナー構築体は環状ドナー構築体であり、しかも細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができる。

一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡと、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｇＲＮＡとは、同じベクターに位置する。

一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡと、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｇＲＮＡとは、異なるベクターに位置する。

好ましい実施形態では、前記ユニバーサルドナー構築体のユニバーサル標的配列は、５’－ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ－３’または５’－ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ－３’を含む。

本発明は、マーカー遺伝子を、遺伝子ノックアウトされた切断標的部位に挿入することにより、マーカーを介して遺伝子ノックアウトを生成する希少クローンを効果的に濃縮することができる。本発明は、ｓｇＲＮＡｓの設計が困難な遺伝子の標的化、およびいくつかの遺伝子を同時に標的化してノックアウトする必要がある場合に特に有用である。この方法は、ＤＮＡ二本鎖切断を生成する様々な遺伝子編集システム、特にＣＲＩＳＰＲシステムの、遺伝子とその機能の生物医学分野での幅広い応用に寄与する。

ピューロマイシンによるスクリーニングを介してＨｅＬａ細胞のＡＮＴＸＲ１遺伝子上にＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的突然変異を含む細胞を濃縮するドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＡＮＴＸＲ１遺伝子上のｓｇＲＮＡ－またはｐｇＲＮＡ標的部位の、ＮＨＥＪに基づいた線形ドナーのノックインの概略図であり、ゲノム部位と線形ドナーにはｇＲＮＡの切断部位ｓｇ１およびｓｇ２ｇがあり、終止コドンは＊＊＊で標識され、矢印はリーディングフレームの方向を指す。（ｂ）は、ドナー（ｇＲＮＡ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞のピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ｓｇＲＮＡ／ｐｇＲＮＡ（それらの対応するドナーを添加（暗いバー）または非添加（明るいバー））でトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞のＡＮＴＸＲ１ノックアウト率の比較を示す図であり、ＡＮＴＸＲ１ノックアウト率は、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ耐性を有する細胞の百分比として表される。ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ耐性分析を行う前に、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で細胞をスクリーニングした。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ－ｔｅｓｔ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す。（ｄ）は、異なるｇＲＮＡｓおよびそのドナーを使用したＡＮＴＸＲ１ノックアウト細胞の濃縮のまとめを示す図である。ドナー媒介のピューロマイシン耐性スクリーニングによる、混合コロニーおよびモノクローンにおけるＡＮＴＸＲ１ノックアウト細胞の濃縮の実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ処理を使用したまたは使用しなかった、異なるＨｅＬａ細胞群の画像である。ｓｇＲＮＡまたはｐｇＲＮＡによりそれらに対応する線形ドナーの添加もしくは非添加で、トランスフェクションして混合細胞を取得し、スケールは２００μｍである。（ｂ）は、ピューロマイシン耐性（ｐｕｒо＋）を有するモノクローンの線形ドナーが組み込まれたＡＮＴＸＲ１部位のＰＣＲ検証を示す図であり、クローンは、ｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}／Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}（左）またはｐｇＲＮＡ_{ＡＮＴＸＲ１}／Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}（右）でトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞から得られた。ピューロマイシンスクリーニングによりＨｅＬａ細胞でのＨＥＢＧＦ破壊イベントを濃縮したドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とするドナー設計を示す図である。（ｂ）は、線形ドナーＤｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}（Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞におけるピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ＤＴ（４０ｎｇ／ｍｌ）処理を使用したまたは使用しなかった、異なるＨｅＬａ細胞群の画像である。ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１_{ＨＢＥＧＦ}）（その対応する線形ドナー（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}）添加または非添加）でトランスフェクションして混合細胞を取得し、スケールは２００μｍである。（ｄ）は、ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１_{ＨＢＥＧＦ}）、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、およびピューロマイシン耐性遺伝子（明るいバー）を含むレポータープラスミド、または、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、および線形ドナー（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}）（暗いバー）でトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞のＨＢＥＧＦノックアウト率を示す図であり、ＨＢＥＧＦノックアウト率は、ＤＴ耐性を有する細胞に対する百分比として表される。ＤＴ耐性分析を行う前に、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で細胞をスクリーニングした。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ－ｔｅｓｔ、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す。ＥＧＦＰによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＨＥＢＧＦ破壊イベントを濃縮したドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とするドナー設計を示す図である。（ｂ）は、ＤＴ（４０ｎｇ／ｍｌ）処理を使用したまたは使用しなかった、異なるＨＥＫ２９３Ｔ細胞群の画像である。ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ２_{ＨＢＥＧＦ}）（その対応する線形ドナー（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ２}）添加または非添加）でトランスフェクションして混合細胞を取得し、スケールは２００μｍである。（ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙを発現するｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ２_{ＨＢＥＧＦ}）プラスミド、およびＣａｓ９を発現するプラスミド（明るいバー）、または、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、および線形ドナー（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ２}、ＥＧＦＰ）（暗いバー）でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＨＢＥＧＦノックアウト率を示す図であり、ＨＢＥＧＦノックアウト率は、ＤＴ耐性を有する細胞に対する百分比として表される。ＤＴ耐性分析を行う前に、ＦＡＣＳで細胞をスクリーニングした。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ－ｔｅｓｔ、＊＊＊Ｐ＜０．０５を表す。ピューロマイシンによるスクリーニングを介してＨｅＬａ_ＯＣ細胞のＡＮＴＸＲ１破壊イベントを濃縮するドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＡＮＴＸＲ１を標的とするドナー設計である。ドナーは、５’末端に一つのｓｇＲＮＡ切断部位（Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ１}またはＤｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}）を含み、または、両端に二つのｇＲＮＡｓ（Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}）を含む。（ｂ）は、ドナー（ｇＲＮＡ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞のピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ処理を使用したまたは使用しなかった、異なるＨｅＬａ_ＯＣ細胞群の画像である。ｓｇＲＮＡまたはｐｇＲＮＡにより、それらに対応する線形ドナーの添加もしくは非添加でトランスフェクションして混合細胞を取得し、スケールは２００μｍである。（ｄ）は、ｓｇＲＮＡｓによりそれらの対応するドナーの添加または非添加でトランスフェクションしたＨｅＬａ_ＯＣ細胞のＡＮＴＸＲ１ノックアウト率を示す図であり、ＡＮＴＸＲ１ノックアウト率は、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ耐性を有する細胞の百分比として表される。ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ耐性分析を行う前に、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で細胞をスクリーニングした。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ－ｔｅｓｔ、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す。（ｅ）は、ピューロマイシン耐性モノクローンの線形ドナーが組み込まれたＡＮＴＸＲ１部位のＰＣＲ検証を示す図である。（ｆ）は、異なるｇＲＮＡｓおよびそのドナーを使用したＡＮＴＸＲ１ノックアウト細胞の濃縮のまとめを示す図である。ＨｅＬａ_ＯＣ細胞でのｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲ（ｓｐＰＣＲ）分析によるドナー挿入のオフターゲット評価を示す図である。（ａ）は、ｓｐＰＣＲ分析用のアダプター（ａｄａｐｔоｒ）とプライマーの設計を示す図である。Ｓｐｌｉｎｋ１およびＳｐｌｉｎｋ２プライマーはアダプター配列とマッチングし、プライマーＲ１およびＲ２は、線形ドナー配列とマッチングした。（ｂ）は、ｓｐＰＣＲ反応結果を示す図である。ピューロマイシンによるスクリーニングを介してＨｅＬａ_ＯＣ細胞のＨＢＥＧＦ破壊イベントを濃縮するドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＨＢＥＧＦを標的とするドナー設計である。ドナーは、５’末端に一つのｓｇＲＮＡ切断部位（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}またはＤｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ２}）を含み、または、両端に二つのｇＲＮＡｓ（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｐｇ}）を含む。（ｂ）は、ドナー（ｓｇＲＮＡ／ｐｇＲＮＡ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞のピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ピューロマイシン耐性モノクローンの線形ドナーが組み込まれたＨＢＥＧＦ部位のＰＣＲ検証を示す図である。（ｄ）は、異なるｇＲＮＡｓおよびそのドナーを使用したＨＢＥＧＦノックアウト細胞の濃縮のまとめを示す図である。ＨｅＬａ_ＯＣ細胞において、１ステップで２つ以上の遺伝子ノックアウトを生成したドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２遺伝子上のｓｇＲＮＡ－またはｐｇＲＮＡ標的部位での、ＮＨＥＪに基づいた線形ドナーのノックインの概略図である。（ｂ～ｃ）は、ゲノム内のＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２の一部のコード配列であり、ｓｇＲＮＡコード領域（下線が付いている）および突然変異対立遺伝子を含むシーケンシング分析を示す図である。クローン１（ｂ）は、ｐｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２}／Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２}でトランスフェクションしたＨｅＬａ_ＯＣ細胞に由来する。クローン２（ｃ）は、ｐｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２}／Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２}でトランスフェクションしたＨｅＬａ_ＯＣ細胞に由来する。影付きの領域のヌクレオチドは、Ｃａｓ９を導いてＤＮＡ認識及び切断を行うＰＡＭ配列を表す。破線は欠失を示し、長い文字はヌクレオチドの挿入を示し、背景の明るい灰色の矢印はドナーのＣＭＶプロモーターの方向を示す。（ｄ）は、ＨＳＰＡ遺伝子ファミリーの複数配列アライメント解析を示す図であり、そのコンセンサス配列、５つのＨＳＰＡファミリー遺伝子のコンセンサス配列を標的とするｓｇＲＮＡ、および複数の遺伝子突然変異を含む細胞を濃縮するためのユニバーサル線形ドナー（Ｄｏｎｏｒ_ＨＳＰＡ）の設計が示されている。黒い影付きのヌクレオチドは、５つのＨＳＰＡ遺伝子のコンセンサス配列を表す。暗い灰色の影付きのヌクレオチドは、３つまたは４つのＨＳＰＡ遺伝子のコンセンサス配列を表し、明るい灰色の影付きのヌクレオチドは、非コンセンサス配列を表す。（ｅ）は、Ｄｏｎｏｒ_ＨＳＰＡが欠失または存在している条件下で、ピューロマイシンによりスクリーニングした後、ｓｇＲＮＡ_ＨＳＰＡが５つの標的遺伝子上で誘発したｉｎｄｅｌｓを示す図である。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ－ｔｅｓｔ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す。（ｆ）は、ｓｇＲＮＡ標的領域（下線が付いている）を含むＨｅＬａクローン３のゲノム内のＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰＡ１Ｌ、およびＨＳＰＡ６遺伝子の一部のコード配列を示す図である。クローン３は、ｓｇＲＮＡ_ＨＳＰＡ／Ｄｏｎｏｒ_ＨＳＰＡでトランスフェクションしたＨｅＬａ_ＯＣ細胞に由来する。影付きのヌクレオチドは、ＰＡＭ配列を表し、破線は欠失していることを表す。背景の明るい灰色の矢印は、ドナーのＣＭＶプロモーターの方向を示す。ＨｅＬａ_ＯＣ細胞におけるＰＳＥＮ１及びＰＳＥＮ２ｓｇＲＮＡ効率の評価と単一クローンの認識を示す図である。（ａ）は、Ｔ７Ｅ１分析を使用して、ＰＳＥＮ１及びＰＳＥＮ２部位でｓｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ１}、ｓｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ２}、およびｐｇＲＮＡ_ＰＳＥＮによるｉｎｄｅｌｓ効率に対する評価を示す図である。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を表す。（ｂ）は、ドナー（ｐｇＲＮＡ_ＰＳＥＮ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞のピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ピューロマイシン耐性モノクローンの線形ドナーが組み込まれたＰＳＥＮ１（Ｌ３／Ｒ３）とＰＳＥＮ２（Ｌ４／Ｒ４）との二つの部位のＰＣＲ結果を示す図である。ドナーを使用して、または使用せずにトランスフェクションした混合細胞におけるＨＳＰＡファミリー遺伝子の標的領域のシーケンシングを示す図である。ｓｇＲＮＡ標的部位は影で示されており、これらのシーケンシング分析には、ドナー挿入を含む標的領域は含まれていない。ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ６、およびＨＳＰＡ２の５つのＨＳＰＡファミリー遺伝子の標的部位上でドナーが挿入されたモノクローン同定を示す図である。（ａ）は、ピューロマイシン耐性モノクローンの５つの遺伝子部位上で線形ドナーが組み込まれたことのＰＣＲ検証結果を示す図である。（ｂ）は、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ６の４つの遺伝子部位にドナー挿入の結果のまとめを示す図である。ユニバーサルｓｇＲＮＡを含むドナーを利用した遺伝子ノックアウトの実験のフローチャートである。ユニバーサルｓｇＲＮＡを含むドナーを利用した遺伝子ノックアウトの効率の検証を示す図である。

本発明は、新しいドナー構築体および遺伝子ノックアウト方法を提供し、当該方法は、線形ドナーＤＮＡを利用して配列特異的ヌクレアーゼによる遺伝子ノックアウトの生成効率を向上させる。本発明の線形ドナーＤＮＡは、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる少なくとも１つの標的部位を含む。細胞ゲノムの標的部位に基づいて線形ドナーＤＮＡに含まれる標的部位を設計し、これによって、細胞ゲノムの標的部位を切断できる配列特異的ヌクレアーゼも、線形ドナーＤＮＡに含まれる標的部位を切断できるようになる。配列特異的ヌクレアーゼとドナー構築体を細胞に導入した後、配列特異的ヌクレアーゼが細胞の特定の標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を生成する時、線形ドナーＤＮＡに含まれる少なくとも一つの標的部位を同時に切断し、これによって、線形ドナーＤＮＡは高い効率で非相同末端結合（Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）経路を通して細胞ゲノムの切断された標的部位に挿入される。そして、マーカーを介して細胞をスクリーニングし、ゲノムの特定の標的部位で切断されて遺伝子ノックアウトを生成した細胞を効果的に濃縮することができ、配列特異的ヌクレアーゼを介して遺伝子ノックアウトを生成した効率を大幅に高めることができる。

細胞ゲノムの標的部位に基づいて線形ドナーＤＮＡに含まれる標的部位を設計し、得られた線形ドナーＤＮＡは特異的線形ドナーであり、細胞ゲノムの異なる標的部位で遺伝子ノックアウトを行う必要がある時、当該標的部位の配列に基づいて、組み合わせて使用するための線形ドナーＤＮＡを構築する。したがって、本発明をさらに最適化するために、発明者は本発明においてさらにユニバーサル線形ドナーＤＮＡを提供し、このユニバーサル線形ドナーＤＮＡは、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できるユニバーサル標的配列を含み、このユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在せず、すなわち、このユニバーサル標的配列と同じの、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる配列は、遺伝子ノックアウトの必要がある細胞のゲノムには存在しない。この場合、配列特異的ヌクレアーゼとユニバーサル線形ドナーＤＮＡを細胞に導入した後、配列特異的ヌクレアーゼが細胞の特定の標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を生成する時、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列も当該標的配列のユニバーサルｇＲＮＡを認識することにより前記配列特異的ヌクレアーゼにより切断され、この時、線形ドナーＤＮＡは依然として高い効率で非相同末端結合（Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）経路を通して細胞ゲノムの切断された標的部位に挿入されることができる。そして、マーカーを介して細胞をスクリーニングし、ゲノムの特定の標的部位で切断されて遺伝子ノックアウトを生成した細胞を効果的に濃縮することができるとともに、配列特異的ヌクレアーゼを介して遺伝子ノックアウトを生成した効率を大幅に高めることができる。前記ユニバーサル線形ドナーＤＮＡの標的配列は、ノックアウトされる細胞とは関係なく、ユニバーサルドナーとして異なる細胞の異なる目標遺伝子のノックアウトに使用でき、いずれも配列特異的ヌクレアーゼによって遺伝子ノックアウトを生成する効率を高めることができる。ユニバーサル線形ドナーは特に、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用した遺伝子のノックアウトに使用することができ、このシステムはｇＲＮＡ（好ましくはｓｇＲＮＡ）を用いて目標配列を標的とし、遺伝子ノックアウトを行う場合、細胞ゲノムの特定の標的部位に対するｇＲＮＡを構築するだけで済み、組み合わせて使用するための線形ドナーＤＮＡを特別に構築する必要はなく、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡおよびこのユニバーサル線形ドナーＤＮＡを標的とするｇＲＮＡを直接に使用すればよい。これによって、操作の複雑さが低下され、効率は向上した。

相同対立遺伝子の一つが修飾されると、標的対立遺伝子の突然変異の頻度は通常高いことは報告されている［２５、２６］。したがって、理論に拘束されることを望まないが、標的対立遺伝子の一つの特定の部位にドナーを挿入して、ドナーに含まれるマーカー遺伝子を発現するクローンをスクリーニングできれば、すべての対立遺伝子が修飾される希少イベントを濃縮することができると本発明者は推測する。

本発明では、「遺伝子ノックアウト」は、遺伝子編集による遺伝子機能の喪失である。通常追求される遺伝子ノックアウトの効果は、２つの対立遺伝子が同時にノックアウトされ、その時点で対応するタンパク質が機能を喪失し、遺伝子ノックアウト細胞株が得られることである。１つの対立遺伝子のみがノックアウトされた場合、タンパク質は依然として一部の役割を果たすことができ、タンパク質機能が低下するに過ぎない。本発明の線形ドナーＤＮＡおよび本発明の方法により、２つの対立遺伝子がノックアウトされた細胞を効率的に濃縮することができる。

本発明のドナー構築体は二本鎖ＤＮＡである。本発明のドナー構築体自身は線形ドナーＤＮＡであってもよく、あるいは、本発明のドナー構築体は、線形ドナーＤＮＡを含む環状ＤＮＡ分子であってもよく、細胞に導入されると、細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成する。細胞内で環状ドナー構築体を切断して線形ドナーＤＮＡを生成する方法は、本分野で周知である。例えば、環状構築体は、線形ドナーＤＮＡの５’末端の上流および３’末端の下流において、別の配列特異的ヌクレアーゼの切断部位をさらに含んでもよい。

本発明の方法では、線形ドナーＤＮＡを生成するように、細胞内で環状構築体の線形ドナーＤＮＡの５’末端上流および３’末端下流の配列を切断する、別の配列特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することをさらに含んでもよい。

本発明の線形ドナーＤＮＡにおいて、「逆方向終止コドン」とは、コドンの方向が発現カセットのリーディングフレームの方向と反対であることを指す。「順方向終止コドン」とは、コドンの方向が発現カセットのリーディングフレームの方向と同じであることを指す。終止コドンの役割は、線形ドナーが順方向または逆方向のどちらでゲノムに挿入されていても、２つのトリプレット終止コドンが内因性および外因性遺伝子の発現を停止させることができることである。

本発明の線形ドナーＤＮＡの「保護配列」は任意の配列であってもよく、好ましくは、保護配列と、同一の線形ドナーＤＮＡの標的配列とは異なる。保護配列の長さは５～３０ｂｐであってもよく、好ましくは２０ｂｐである。保護配列の役割は、細胞内の酵素（例えば、エキソヌクレアーゼ）によって線形ドナーＤＮＡの標的配列が切断されるのを防ぐことである。

本文に記載の「マーカー遺伝子」とは、その発現がスクリーニングまたは濃縮されることができる任意のマーカー遺伝子を指し、すなわち、当該マーカー遺伝子が細胞で発現される場合、当該マーカー遺伝子を発現する細胞をある方式でスクリーニングして濃縮することができる。本発明に使用可能なマーカー遺伝子は、発現後にＦＡＣＳによりソーティングできる蛍光タンパク質遺伝子、または抗生物質でスクリーニングできる耐性遺伝子、または発現後に対応する抗体によって認識され、かつ免疫染色あるいは磁気ビーズ吸着によってスクリーニングできるタンパク質遺伝子を含むが、これらに限られていない。本発明に使用可能な耐性遺伝子は、ブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇ－４１８）、ハイグロマイシン（ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ）、ミコフェノール酸（ＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃＡｃｉｄ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン（Ｚｅｏｃｉｎ）またはネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ）に対する耐性遺伝子を含むが、これらに限定されていない。本発明に使用可能な蛍光タンパク質遺伝子は、青色蛍光タンパク質（ＣｙａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）、緑色蛍光タンパク質（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）、黄色蛍光タンパク質（ＹｅｌｌｏｗＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）、オレンジ蛍光タンパク質（ＯｒａｎｇｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光タンパク質（ＲｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）、遠赤色蛍光タンパク質（Ｆａｒ－ＲｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）、または切り替え可能な蛍光タンパク質（ＳｗｉｔｃｈａｂｌｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎｓ）の遺伝子を含むが、これらに限られていない。

配列特異的ヌクレアーゼの例として、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が含まれる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガータンパク質ドメインと非特異的エンドヌクレアーゼドメインからなる、天然に存在しない人工的に改造されたエンドヌクレアーゼである。ジンクフィンガータンパク質ドメインは、一連のＣｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質がタンデムで構成され、各ジンクフィンガータンパク質は、３’から５’への方向のＤＮＡ鎖上の一つの特異的トリプレット塩基および５’から３’への方向の一つの塩基を認識して結合する。複数のジンクフィンガータンパク質はタンデムで接続して、一段の特異的塩基配列を認識する一つのジンクフィンガープロテオームを形成することができ、強い特異性を持っている。ジンクフィンガープロテオームにリンクされた非特異的エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩカルボキシル末端の９６のアミノ酸残基からなるＤＮＡ切断ドメインに由来する。各ＦｏｋＩモノマーは一つのジンクフィンガープロテオームに接続され、特定の部位を認識する一つのＺＦＮを形成し、二つの認識部位間の距離が適切である場合（６～８ｂｐ）、二つのモノマーＺＦＮは互いに作用して酵素消化機能を果たしてＤＮＡ固定点切断の目的を達成する。標的配列に対して８～１０個のジンクフィンガードメインを設計し、これらの亜鉛ドメインをＤＮＡヌクレアーゼに接続すると、標的配列の二本鎖切断（Ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ、ＤＳＢｓ）を実現でき、さらにＤＳＢｓ修復メカニズムを誘発してゲノム内の特定の部位に対して指向性変換を行うことができる。

配列特異的ヌクレアーゼの別の例として、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼは主にＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインとＴＡＬＥタンパク質のＤＮＡ結合ドメインとから組み合わせてなる。ＴＡＬＥタンパク質は、３３～３５のアミノ酸からなる複数の反復ペプチドセグメントを含み、各ペプチドセグメントは一つの塩基を認識することができる。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮはＤＮＡ標的配列を切断してＤＳＢｓを形成し、さらにＤＮＡ損傷修復メカニズムを活性化してゲノムに対して特定の部位を変換することができる。

本発明に使用可能な配列特異的ヌクレアーゼシステムの別の例として、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート、クリスパー）システムが含まれる。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡによるＤＮＡ結合を利用して標的ＤＮＡの配列特異的切断を行い、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄｅｒｉｖｅｄＲＮＡ）が塩基対合を介してｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇＲＮＡ）に結合してｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、この複合体はヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質をガイドしてｃｒＲＮＡに対合した標的配列上の特定の位置で二本鎖ＤＮＡを切断する。ｃｒＲＮＡに対合した標的配列は通常、ゲノムＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）部位（ＮＮＧ）の上流の約２０個のヌクレオチドの配列である。

標的部位に対するＣａｓ９タンパク質の切断には、ガイドＲＮＡが必要である。用語の「ガイドＲＮＡ」は、ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅＲＮＡ）とも呼ばれ、ｇＲＮＡは通常、ｃｒＲＮＡ上の、標的配列に相補的なヌクレオチド、およびｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが塩基対合によって形成されるＲＮＡＳｃａｆｆｏｌｄを含み、ｃｒＲＮＡと対合する標的配列を認識することができる。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と一緒に複合体を形成し、Ｃａｓ９タンパク質を標的配列にガイドしてその中の標的部位を切断することができる。

通常、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ）として使用される。ｓｇＲＮＡは「一本鎖ガイドＲＮＡ」とも呼ばれ、ｃｒＲＮＡとｔｒａｎｃｒＲＮＡとが融合してなる一本のＲＮＡ鎖である。

本発明に使用可能な配列特異的ヌクレアーゼシステムの別の例として、ＮｇＡｇｏヌクレアーゼおよびそのｇＤＮＡが含まれる。ＮｇＡｇｏヌクレアーゼは、５’末端リン酸化された一本鎖ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合して、ｇＤＮＡに相補的な標的配列を切断してＤＮＡ二本鎖切断を引き起こすことができる。

本発明の線形ドナーＤＮＡは、一端にのみ標的配列を有していてもよく、両端にそれぞれ標的配列を有していてもよい。線形ドナーＤＮＡの両端の標的配列は異なってもよい。細胞ゲノムの二つの異なる標的部位で切断によって遺伝子ノックアウトを生成する必要がある場合、それぞれ一つの対応する標的配列を含む、二つの線形ドナーＤＮＡを提供してもよく、各端に一つの対応する標的配列が含まれている、一つの線形ドナーＤＮＡを提供してもよい。細胞ゲノムの複数の異なる標的部位で切断によって遺伝子ノックアウトを生成する必要がある場合、適切な数の線形ドナーＤＮＡを提供してもよく、各線形ドナーＤＮＡの一端または両端にそれぞれ複数の異なる対応する標的配列の中の一つが含まれている。例えば、標的部位の数と同じの数の線形ドナーＤＮＡを提供し、各線形ドナーＤＮＡは一つの対応する標的配列を含む。あるいは、標的部位の数より少ない線形ドナーＤＮＡを提供し、そのすべてまたはその一部の線形ドナーＤＮＡの両端はそれぞれ、複数の異なる対応する標的配列の中の一つを含み、その他の線形ドナーＤＮＡはそれぞれ、他の対応する標的配列の中の一つを含む。

ユニバーサル標的配列を含むユニバーサル線形ドナーＤＮＡの場合、そのいずれか一端または両端に前記ユニバーサル標的配列を含んでもよい。このユニバーサル線形ドナーＤＮＡの標的配列は、細胞ゲノム内の切られる標的部位には依存しないため、細胞ゲノムの任意の一つの標的部位、任意の二つの標的部位、またはそれ以上の標的部位に対して切断して遺伝子ノックアウトを生成する場合に普遍的に適用できる。

本発明に記載の「ユニバーサル標的配列」とは、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる配列を指すが、このユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在せず、すなわち、このユニバーサル標的配列と同じの、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しなく、ユニバーサル標的配列は、細胞ゲノム上に存在する、同一の配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる標的配列とは異なる。このユニバーサル標的部位を含む線形ドナーＤＮＡは、細胞ゲノム上の標的部位に対して特異性を持っていないため、ノックアウトする必要がある遺伝子およびその上の標的部位に対して特定の線形ドナーＤＮＡを構築する必要がなく、細胞内の任意の遺伝子の遺伝子ノックアウトに普遍的に適用できる。

配列特異的ヌクレアーゼは、タンパク質の形、またはそれをコードする核酸配列（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の形で細胞に導入することができる。配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターに含まれて細胞に導入することができ、例えば、トランスフェクションにより細胞に導入することができる。また、配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸は、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクションなどによって細胞に直接に送達することもできる。

ドナー構築体は、核酸を細胞に導入するのに適した任意の方法で送達することができ、例えば、トランスフェクションにより細胞に導入することができる。

Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムとＮｇＡｇｏヌクレアーゼを使用して遺伝子ノックアウトを生成する場合、ｓｇＲＮＡまたはｇＤＮＡを細胞に導入する必要がある。ＲＮＡまたはＤＮＡを細胞に導入するのに適した任意の方法でｓｇＲＮＡまたはｇＤＮＡを送達することができる。ｓｇＲＮＡは、単離されたＲＮＡの形で細胞に導入できる。単離されたｓｇＲＮＡは、本分野で既知の任意のインビトロ転写システムを使用してインビトロ転写により調製することができる。また、ｓｇＲＮＡをコードする配列とプロモーターを含むベクターを通してｓｇＲＮＡを細胞に導入することができる。前記ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドであってもよい。細胞を導入する方法は、トランスフェクションであってもよい。

Ｃａｓ９を誘導して細胞ゲノムの二つ以上の異なる標的部位で切断して遺伝子ノックアウトを生成するように、異なる標的部位に対する二つ以上のｓｇＲＮＡを細胞に導入することができる。この二つ以上のｓｇＲＮＡは、異なるベクターに含まれていてもよく、ｇＲＮＡペア（ｐａｉｒｅｄｇＲＮＡ）を含むベクター、またはそれ以上のｓｇＲＮＡを含むベクターのような同一のベクターに含まれていてもよい。

本発明の方法では、異なる標的部位に対する二つ以上のｓｇＲＮＡを細胞に導入する場合、これらのｓｇＲＮＡによって認識される標的配列を含む線形ドナーＤＮＡをも同時に導入する。線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端にのみ標的配列を含むことができ、または両端にそれぞれ標的配列を含むことができるので、ｓｇＲＮＡの数と線形ドナーＤＮＡの数とは異なってもよく、一つのｓｇＲＮＡが一つの線形ドナーＤＮＡに対応してもよく、二つのｓｇＲＮＡが二つの線形ドナーＤＮＡに対応してもよい。

Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムと本発明のユニバーサル線形ドナーＤＮＡを使用して遺伝子ノックアウトを行う場合、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼを細胞に導入する他、Ｃａｓ９を誘導して細胞ゲノムの特定の標的配列とユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列を切断するように、細胞ゲノムの特定の標的配列に対するｓｇＲＮＡ、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列に対するｓｇＲＮＡを細胞に導入する必要がある。細胞ゲノムの特定の標的配列に対するｓｇＲＮＡと、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列に対するｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに含まれていてもよく、同一のベクターに含まれていてもよい。

細胞ゲノムの特定の標的配列に対するｓｇＲＮＡは、一つまたは複数のｓｇＲＮＡ、例えば、２つ、３つ、またはそれ以上のｇＲＮＡであってもよい。これらの一つを超えるｓｇＲＮＡは、細胞ゲノム上の異なる標的部位に対して同時に切断することを実現するように、細胞ゲノムにおける異なる特定の標的配列に対することができる。これらの異なる標的部位は異なる遺伝子に位置する場合、複数の遺伝子のノックアウト、例えば、２つ、３つ、またはそれ以上の遺伝子のノックアウトを実現することができる。具体的に言えば、複数遺伝子ノックアウトを行う時、Ｃａｓ９を誘導して細胞ゲノムの複数の特定の標的配列とユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列を切断するように、細胞ゲノムにおける複数の特定の標的配列に対しての複数のｓｇＲＮＡと、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列に対してのｓｇＲＮＡとをそれぞれ細胞に導入することができる。前記複数の特定の標的配列は異なる遺伝子に位置し、それによって複数遺伝子ノックアウトを実現する。前記細胞ゲノムにおける複数の特定の標的配列に対しての複数のｓｇＲＮＡは異なるベクターに含まれていてもよく、同一のベクターに含まれていてもよい。前記細胞ゲノムにおける複数の特定の標的配列に対しての複数のｓｇＲＮＡのいずれか一つ以上のｓｇＲＮＡとユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列に対してのｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに含まれていてもよく、同一のベクターに含まれていてもよい。

本発明によれば、前記ユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列は好ましくは、５’－ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）または５’－ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）である。

好ましくは、本発明では、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ノックアウトを生成する場合、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、および線形ドナーＤＮＡを同時に細胞に導入してもよく、または、例えば、まずＣａｓ９を細胞に導入し、そしてｓｇＲＮＡと線形ドナーＤＮＡを細胞に導入してもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９を含むベクター、ｓｇＲＮＡを含むベクター、および線形ドナーＤＮＡを用いて細胞をコトランスフェクションする。もう一部の実施形態では、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡをインビトロでタンパク質とＲＮＡ複合体に組み立てて線形ドナーＤＮＡと一緒に細胞をコトランスフェクションする。もう一部の実施形態では、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡをレンチウイルスによって細胞内に安定的発現し、線形ドナーＤＮＡで細胞をトランスフェクションする。他の一部の実施形態では、まずＣａｓ９を細胞内で安定的に発現し、そしてｓｇＲＮＡを含むベクターと線形ドナーＤＮＡで細胞をコトランスフェクションする。

本発明により提供される遺伝子ノックアウトに用いられるシステムまたはキットにおいて、配列特異的ヌクレアーゼは、タンパク質の形、またはそれをコードする核酸配列（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の形、例えば、配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含むプラスミドまたはウイルスベクターの形であってもよい。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する場合、ｓｇＲＮＡは単離されたＲＮＡの形、またはｓｇＲＮＡをコードする配列とプロモーターを含むベクターの形、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターであってもよい。

本文に記載の細胞は、任意の真核細胞であってもよく、例えば、全能性細胞、多能性細胞、成体幹細胞、受精卵または体細胞などの単離された動物細胞であってもよい。一部の実施形態では、前記細胞は脊椎動物の細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、げっ歯類動物、魚、霊長類動物の細胞である。一部の実施形態では、げっ歯類動物は、マウス、ラット、ウサギを含む。

本発明の方法は、細胞内の単一の遺伝子または複数の遺伝子に対して標的遺伝子ノックアウトを行うことに使用でき、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の遺伝子を標的としてノックアウトすることに使用できる。複数の遺伝子に対しての標的遺伝子ノックアウトは、同時に行ってもよいし、前後に行ってもよい。例えば、２つ以上の標的遺伝子に対する配列特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼシステムをすべて細胞に導入してから、濃縮スクリーニングすることができる。あるいは、一つ以上の標的遺伝子に対する配列特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼシステムを細胞に導入してから濃縮スクリーニングし、そしてその他の標的遺伝子に対する配列特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼシステムを細胞に導入してから濃縮スクリーニングしてもよい。異なる標的遺伝子に対して異なるマーカー／マーカー遺伝子を使用することができる。例えば、前述のように、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ノックアウトを生成する場合、それぞれ異なる標的部位に対する二つ以上のｓｇＲＮＡを細胞に導入する時、これらｓｇＲＮＡによって認識される標的配列を含む線形ドナーＤＮＡを同時に導入することができる。これらの異なる標的部位が異なる遺伝子上に位置する時、複数の遺伝子の遺伝子ノックアウトを実現することができる。また、細胞ゲノム内の二つ以上の遺伝子のコンセンサス配列を使用してｓｇＲＮＡと線形ドナーＤＮＡ内の標的配列を設計することができ、この場合、細胞ゲノム内の単一の特定の標的部位を認識するｓｇＲＮＡを細胞に導入すると同時に、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的配列を含む線形ドナーＤＮＡを導入することができ、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的配列は、細胞ゲノム内の２つ以上の遺伝子のコンセンサス配列であり、その条件として、前記コンセンサス配列と、前記２つ以上の遺伝子のいずれか１つの、コンセンサス配列に対応する位置の配列とは、１つ以下の塩基の違いを有する。実施例７で証明されたように、二つの塩基の違いはｓｇＲＮＡによる認識を混乱させる可能性がある。

本発明の線形ドナーＤＮＡによる遺伝子編集のための標的遺伝子は、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを介して二本鎖切断を生成できる限り、特に限定されていない。標的遺伝子は、エクソン、イントロン、または調節配列、若しくはそれらの任意の組み合わせであってもよい。

本発明で使用される「含む」または「含有する」という用語は、「含むがこれらに限られていない」、「基本的に…からなる」、または「…からなる」を意味する。

以下の実施例および図面を合わせて本発明についてさらに説明するが、これらは例示な説明のために過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。特に指定のない限り、実施例はいずれも、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの分子クローニング実験マニュアル（ＳａｍｂｒｏｏｋＪ＆ＲｕｓｓｅｌｌＤＷ，Ｍоｌｅｃｕｌａｒｃｌоｎｉｎｇ：ａｌａｂоｒａｔоｒｙｍａｎｕａｌ，２００１）などの従来の実験条件、またはメーカーにより提供されたプロトコルに従って行われた。

実施例１線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮

１、ｓｇＲＮＡの設計
ＨｅＬａ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子の第一エクソンを標的とする２つのｓｇＲＮＡを設計し、それらが標的部位で欠失または挿入突然変異（Ｉｎｄｅｌｓ）を生成する効率をＴ７Ｅ１アッセイで検証し、検証の結果は表１に示される。ｓｇＲＮＡ１_{ＡＮＴＸＲ１}の標的配列は、本実施例ではｓｇ１と呼ばれ、ｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}の標的配列は、本実施例ではｓｇ２と呼ばれる。

２、線形ドナーＤＮＡの構築
２つの線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}とＤｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}）を構築した。その構造を図１ａに示す。
Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ２、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、ｓｇ２、２０ｂｐの保護配列を含む。
対照としての線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ｎо ｃｕｔ}）は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、２０ｂｐのランダム配列、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。ランダム配列はｓｇ１またはｓｇ２とは異なる。

３、トランスフェクション
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}またはｐｇＲＮＡ_{ＡＮＴＸＲ１}、およびそれらに対応するドナーでＨｅＬａ細胞をコトランスフェクションし、対照として、線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}、Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}、およびＤｏｎｏｒ_{ｎо ｃｕｔ}）のみでＨｅＬａ細胞をトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性によりスクリーニングして、混合コロニー（ｐооｌｅｄｐоｐｕｌａｔｉоｎ）と単一のクローン（ｓｉｎｇｌｅｃｌｏｎｅｓ）を得て、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）で染色した。その結果は図１ｂに示される。
ｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}とその対応するドナーＤｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}を受けたサンプル、およびｐｇＲＮＡ_{ＡＮＴＸＲ１}とその対応するドナーＤｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}を受けたサンプルから、ピューロマイシン耐性（ｐｕｒо＋）を有する多くの細胞クローンを得た。ドナーのみでトランスフェクションすると、わずかのピューロマイシン耐性クローンしか生じなかった。これは、染色体への線形ドナーの組み込むはまれでランダムであるからかもしれない。また、対照ドナーＤｏｎｏｒ_{ｎо ｃｕｔ}と、Ｃａｓ９を発現するプラスミドおよびｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}のコトランスフェクションも、有意な量のｐｕｒо＋クローンを生成できなかった（図１ｂの一番右の図参照）。これは、ｓｇＲＮＡにより媒介されたＣａｓ９がドナー上での切断は、効果的なドナーの組み込むに対して重要であることを示している。ｐｇＲＮＡ_{ＡＮＴＸＲ１}により媒介された二重切断Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}の組み込むは、ｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}とＤｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}との和よりも効率的である。しかしながら、どの線形ドナーＤＮＡを使用しても、十分なｐｕｒо＋クローンが生成され、後続の突然変異体の同定に使用できる。

４、遺伝子ノックアウトの効率の検証
また、Ｃａｓ９を発現するプラスミドとｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}またはｐｇＲＮＡ_{ＡＮＴＸＲ１}を用い、それらの対応するドナーの添加または非添加で、ＨｅＬａ細胞をコトランスフェクションし、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いて混合コロニーおよびモノクローンをスクリーニングして取得した。その中で、対応するドナーを添加しなかった場合に、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドと一緒にコトランスフェクションした。ＨｅＬａ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子のノックアウトにより、細胞がキメラ炭疽毒素（ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ）に対して耐性が生じ［１７］、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ（ＰＡ：１５０ｎｇ／ｍｌ；ＬＦｎＤＴＡ：１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、ピューロマイシンによりスクリーニングして取得した混合コロニーとモノクローンを処理して、線形ドナーＤＮＡがＡＮＴＸＲ１ノックアウト効率に対する影響を比較した。ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡで処理した異なる細胞の画像は図２ａに示される。ｐｕｒо＋混合コロニー中の、当該毒素耐性を有する細胞の百分比を計算することによってＡＮＴＸＲ１ノックアウト効率を確定し、図１ｃに示すように、ｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}またはｐｇＲＮＡ_{ＡＮＴＸＲ１}を単独に用いる場合より、線形ドナーＤＮＡの使用は、遺伝子ノックアウト効率を６～８倍にも高めた。ｐｕｒо＋モノクローンの線形ドナーが組み込まれたＡＮＴＸＲ１部位についてＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅に使用されたＬ１／Ｒ１プライマー配列は表２に示される。その結果は図２ｂに示す。これから分かるように、ｐｕｒо＋細胞混合物から単離された大部分のクローンは、ｓｇＲＮＡ標的部位にドナー挿入物を含んでいる（図１ｄも参照）。図１ｄから、ドナーフラグメントを有する細胞のほぼ９０％が真の遺伝子ノックアウトクローンであることも分かる。

実施例２線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮

単一または二重切断部位を有するドナーはいずれも、標的部位に修飾を有する細胞に対するスクリーニングを大幅に改善することができるため、便宜上、本実施例では、単一切断ドナーのみを使用した。

１、ｓｇＲＮＡの設計
ＨｅＬａ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とする２つのｓｇＲＮＡを設計し、それらが標的部位でＩｎｄｅｌｓを生成する効率をＴ７Ｅ１アッセイで検証した。検証結果を表３に示す。ｓｇＲＮＡ１_{ＨＢＥＧＦ}の標的配列は本実施例ではｓｇ１と呼ばれ、ｓｇＲＮＡ２_{ＨＢＥＧＦ}の標的配列は本実施例ではｓｇ２と呼ばれる。

２、線形ドナーＤＮＡの構築
線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}）を構築した。その構造は図３ａに示される。
Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。

３、トランスフェクション
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ１_{ＨＢＥＧＦ}、およびそれに対応するドナーＤｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}でＨｅＬａ細胞をコトランスフェクションし、対照として、ドナーＤｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}のみでＨｅＬａ細胞をトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングして、混合コロニー（ｐооｌｅｄｐоｐｕｌａｔｉоｎ）と単一のクローン（ｓｉｎｇｌｅｃｌｏｎｅｓ）を得て、ＭＴＴで染色した。その結果は図３ｂに示される。
実施例１の結果と同様に、ドナープラスｓｇＲＮＡでしか大量のｐｕｒо＋クローンを取得しなかった。この結果により再び証明されたように、ドナー挿入は、特異的なｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｓｇＲＮＡにより媒介されたＤＳＢｓによって決められる。

４、遺伝子ノックアウトの効率の検証
また、Ｃａｓ９を発現するプラスミドとｓｇＲＮＡ１_{ＨＢＥＧＦ}を用い、それに対応するドナーＤｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}の添加または非添加で、ＨｅＬａ細胞をコトランスフェクションし、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いて混合コロニーおよびモノクローンをスクリーニングして取得した。その中で、対応するドナーを添加しなかった場合に、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドと一緒にコトランスフェクションした。ＨＢＥＧＦ遺伝子はジフテリア毒素（ＤＴ）受容体をコードするので、ＨｅＬａ細胞においてそれをノックアウトすると、細胞がＤＴに対して耐性が生じ［１７］、ＤＴ（４０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、ピューロマイシンによりスクリーニングして取得した混合コロニーとモノクローンを処理して、線形ドナーＤＮＡがＨＢＥＧＦノックアウト効率に対する影響を比較した。ＤＴで処理した異なる細胞の画像は図３ｃに示される。図３ｄに示すように、ｐｕｒо＋混合コロニー中の、ＤＴ耐性を有する細胞の百分比を計算することによってＨＢＥＧＦノックアウト効率を確定した。図３ｃと図３ｄから分かるように、ｓｇＲＮＡ１_{ＨＢＥＧＦ}を単独に用いる場合より、線形ドナーＤＮＡの使用は、ＨＢＥＧＦ遺伝子ノックアウト効率を大幅に高めた。

実施例３線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮

１、ｓｇＲＮＡの設計および線形ドナーＤＮＡの構築
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ２_{ＨＢＥＧＦ}を設計し、線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ２}）を構築した。ドナーは５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ２、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＥＧＦＰ遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。図４ａを参照することができる。

２、遺伝子ノックアウトの効率の検証
Ｃａｓ９を発現するプラスミドとｓｇＲＮＡ２_{ＨＢＥＧＦ}を用い、それに対応するドナーＤｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ２}の添加または非添加で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクションし、ＦＡＣＳで細胞をスクリーニングし、ドナーが添加された群についてＦＡＣＳでＥＧＦＰ陽性細胞をスクリーニングし、ドナーが添加されなかった群についてＦＡＣＳでｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をスクリーニングした。ＤＴ（４０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、ＦＡＣＳにより選択された細胞を処理して、線形ドナーＤＮＡがＨＢＥＧＦノックアウト効率に対する影響を比較した。ＤＴで処理した異なる細胞の画像は図４ｂに示される。図４ｄに示すように、ＥＧＦＰ陽性細胞中の、ＤＴ耐性を有する細胞の百分比を計算することによってＨＢＥＧＦノックアウト効率を確定した。ｓｇＲＮＡ２_{ＨＢＥＧＦ}を単独に用いる場合より、線形ドナーＤＮＡの使用は、ＨＢＥＧＦ遺伝子ノックアウト効率を大幅に高めた。

実施例４線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮

１、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞株の確立
Ｃａｓ９を安定的に発現するＨｅＬａ_ＯＣ細胞株を既存の方法に従って確立した［１７］。

２、ｓｇＲＮＡの設計および線形ドナーＤＮＡの構築
図５ａに示すように、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子を標的とする２つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１_{ＡＮＴＸＲ１}とｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}）を設計し、三つの線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ１}、Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}、およびＤｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}）を構築した。ｓｇＲＮＡ１_{ＡＮＴＸＲ１}の標的配列は、本実施例ではｓｇ１と呼ばれ、ｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}の標的配列は、本実施例ではｓｇ２と呼ばれる。
Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ１}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ２、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、ｓｇ２、２０ｂｐの保護配列を含む。

３、トランスフェクション
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ１_{ＡＮＴＸＲ１}またはｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}またはｐｇＲＮＡ_{ＡＮＴＸＲ１}、およびそれらに対応するドナーでＨｅＬａ_ＯＣ細胞をコトランスフェクションし、対照として、線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ１}、Ｄｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ２}、およびＤｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｐｇ}）のみでＨｅＬａ_ＯＣ細胞をトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングして、ＭＴＴで染色した。その結果は図５ｂに示される。
ＨｅＬａ細胞における結果と同様に、ドナープラスｓｇＲＮＡでしか大量のｐｕｒо＋クローンを取得しなかった。

４、遺伝子ノックアウトの効率の検証
また、Ｃａｓ９を発現するプラスミドとｓｇＲＮＡ１_{ＡＮＴＸＲ１}またはｓｇＲＮＡ２_{ＡＮＴＸＲ１}またはｐｇＲＮＡ_{ＡＮＴＸＲ１}を用い、それらに対応するドナーの添加または非添加で、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞をコトランスフェクションし、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いてスクリーニングした。スクリーニングして取得した細胞をＰＡ／ＬＦｎＤＴＡで処理し、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡで処理した異なる細胞の画像は図５ｃに示される。ｐｕｒо＋混合コロニー中の、当該毒素耐性を有する細胞の百分比を計算することによってＡＮＴＸＲ１ノックアウト効率を確定し、図５ｄに示すように、ｓｇＲＮＡを単独に用いる場合より、線形ドナーＤＮＡの使用は、ＡＮＴＸＲ１遺伝子ノックアウト効率を大幅に高めた。
ｐｕｒо＋の単一クローンについて、ＡＮＴＸＲ１遺伝子上のドナーＤｏｎｏｒ_{ＡＮＴＸＲ１－ｓｇ１}の組み込む部位でＰＣＲ検証をした結果、ｐｕｒо＋の大部分のクローンはｓｇＲＮＡ標的部位にドナー挿入物を含み（図５ｅと図５ｆ）、ドナーフラグメントを有する細胞の大部分が真の遺伝子ノックアウトクローンである（図５ｆ）ことが分かった。
～５００ｂｐ（長さは、野生型ＡＮＴＸＲ１遺伝子に対応する）のＰＣＲフラグメントおよび～１．８ｋｂ（長さは、野生型ＡＮＴＸＲ１遺伝子プラスドナー挿入物に対応する）のＰＣＲフラグメントについてゲノムシーケンシングを行った。結果を表４に示す。

ＰＣＲ検証結果（図５ｅ）とシーケンシング結果（表４）から見えるように、大部分のクローンにはドナー挿入が一つしか含まれていない。ただし、ドナー陽性クローンでは、ほとんどの対立遺伝子が標的部位で編集（または突然変異が発生するという）されるが、ドナーを使用せずに濃縮する場合、単独のｓｇＲＮＡに挿入または欠失突然変異（ｉｎｄｅｌｓ）が生じる効率は低い。この発見は明らかに、ドナー挿入とｓｇＲＮＡまたはｐｇＲＮＡの役割と密接に関連していることを示している。

５、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのオフターゲット効果に対するドナーの影響
外部ドナーの使用がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのオフターゲット効果に影響を与えるかどうかを検査するために、ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲ分析によって全ゲノムの組み込む部位を見つけた［３５～３７］。
本実施例では、ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲ分析によって、ピューロマイシンによりスクリーニングした後に単一クローンおよび混合細胞クローン内のオフターゲットの挿入を検証した。ＡＮＴＸＲ１遺伝子上に正しいドナー挿入がある場合、プライマーＳｐｌｉｎｋ２／Ｒ１とＳｐｌｉｎｋ２／Ｒ２で増幅するとそれぞれ７１１－と９２７－ｂｐの産物が生じる（図６ａ参照）。
ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲ分析を行うために、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞においてＡＮＴＸＲ１を標的とした、ドナー挿入を有する１０つの単一クローンと、４つのｐｕｒо＋混合クローンとをランダムに選択した。ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲの結果（図６ｂ）によれば、ドナーでトランスフェクションされなかったクローンと同様に、ドナーによって濃縮された単一クローンまたは混合コロニーには、検測可能なオフターゲット効果はなかった。

実施例５線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮

１、ｓｇＲＮＡの設計および線形ドナーＤＮＡの構築
図７ａに示すように、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とする２つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１_{ＨＢＥＧＦ}とｓｇＲＮＡ２_{ＨＢＥＧＦ}）を設計し、三つの線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}、Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ２}、およびＤｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｐｇ}）を構築した。ｓｇＲＮＡ１_{ＨＢＥＧＦ}の標的配列は、本実施例ではｓｇ１と呼ばれ、ｓｇＲＮＡ２_{ＨＢＥＧＦ}の標的配列は、本実施例ではｓｇ２と呼ばれる。
Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ２}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ２、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｐｇ}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、ｓｇ２、２０ｂｐの保護配列を含む。

３、トランスフェクション
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ１_{ＨＢＥＧＦ}またはｓｇＲＮＡ２_{ＨＢＥＧＦ}またはｐｇＲＮＡ_{ＨＢＥＧＦ}、およびそれらに対応するドナーでＨｅＬａ_ＯＣ細胞をコトランスフェクションし、対照として、線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}、Ｄｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ２}、およびＤｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｐｇ}）のみでＨｅＬａ_ＯＣ細胞をトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングした。その結果は図７ｂに示される。
ＨｅＬａ細胞における結果と同様に、ドナープラスｓｇＲＮＡでしか大量のｐｕｒо＋クローンを取得しなかった。

４、遺伝子ノックアウトの効率の検証
ｐｕｒо＋の単一クローンについて、ＨＢＥＧＦ遺伝子上のドナーＤｏｎｏｒ_{ＨＢＥＧＦ－ｓｇ１}の組み込む部位でＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅に使用されたＬ２／Ｒ２プライマー配列は表５に示される。これから分かるように、ｐｕｒо＋の大部分のクローンは、ｓｇＲＮＡ標的部位にドナー挿入物を含んでおり（図７ｃと図７ｄ）、ドナーフラグメントを有する細胞の大部分は真の遺伝子ノックアウトクローンである（図７ｄ）。

実施例６線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞での二重遺伝子ノックアウト
１、ｓｇＲＮＡの設計

ＨｅＬａ_ＯＣ細胞におけるＰＳＥＮ１とＰＳＥＮ２との２つの標的遺伝子を選択し、この二つの標的遺伝子をそれぞれ標的とする二つのｓｇＲＮＡを設計し、それらが標的部位でＩｎｄｅｌｓを生成する効率をＴ７Ｅ１アッセイで検証し、検証の結果は表６に示される。ｓｇＲＮＡ１_{ＰＳＥＮ１}の標的配列は、本実施例ではｓｇ_{ＰＳＥＮ１}と呼ばれ、ｓｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ２}の標的配列は、本実施例ではｓｇ_{ＰＳＥＮ２}と呼ばれる。

２、線形ドナーＤＮＡの構築
２種類のドナーを構築した。図８ａに示すように、１種類は二つの単独のドナー（Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ１}＋Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ２}）を有し、各ドナーは、対応するｓｇＲＮＡの標的配列を有し、もう１種類のドナー（Ｄｏｎｏｒ_ＰＳＥＮ）は両端にそれぞれ２つのｓｇＲＮＡ標的配列を有する。Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ１}またはＤｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ２}は、その５’末端にｓｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ１}またはｓｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ２}の切断部位を有する。Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２}はその５’末端にｓｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ１}の切断部位を有し、３’末端にｓｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ２}の切断部位を有する。
Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ１}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ_{ＰＳＥＮ１}、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ２}は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ_{ＰＳＥＮ２}、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
Ｄｏｎｏｒ_ＰＳＥＮは５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ_{ＰＳＥＮ１}、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、ｓｇ_{ＰＳＥＮ２}、２０ｂｐの保護配列を含む。

３、トランスフェクションおよび遺伝子ノックアウトの効率の検証
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ１}またはｐｇＲＮＡ_{ＰＳＥＮ２}でＨｅＬａ_ＯＣ細胞をコトランスフェクションし、または、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｐｇＲＮＡ_ＰＳＥＮでＨｅＬａ_ＯＣ細胞をコトランスフェクションし、これによってＰＳＥＮ１とＰＳＥｎ２遺伝子の特定の部位にｉｎｄｅｌｓを生成した。ｉｎｄｅｌｓの生成効率をＴ７Ｅ１により分析し［２６］（使用されたプライマーについて表７参照）、その結果は図９ａに示される。それらのコトランスフェクションはいずれも一般的な活性のみを示した。
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｐｇＲＮＡ_ＰＳＥＮ、およびＤｏｎｏｒ_ＰＳＥＮでＨｅＬａ_ＯＣ細胞をコトランスフェクションし、または、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｐｇＲＮＡ_ＰＳＥＮ、およびＤｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ１}＋Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ２}でＨｅＬａ_ＯＣ細胞をコトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングして、ｐｕｒо＋クローンを得ることができた（図９ｂ参照）。前の実施例の結果と同様に、ドナープラスｐｇＲＮＡでは大量のｐｕｒо＋クローンを得た。
各トランスフェクションの結果について、ｐｕｒо＋の単一クローンを取って、ＰＳＥＮ１とＰＳＥＮ２遺伝子上の、ドナーＤｏｎｏｒ_ＰＳＥＮ、およびＤｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ１}＋Ｄｏｎｏｒ_{ＰＳＥＮ２}の組み込む部位についてＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅に使用されたプライマー配列は表７に示される。その中で、Ｌ３／Ｒ３は、ＰＳＥＮ１上の組み込む部位を増幅するためのものであり、Ｌ４／Ｒ４は、ＰＳＥＮ２上の組み込む部位を増幅するためのものであり、ＰＣＲ検証結果は図９ｃに示す。２つの遺伝子がいずれもドナー挿入を含むクローンは、枠で表示され、クローン１とクローン２を選択してさらにゲノムシーケンシング解析をした結果、２つのクローンがいずれもＰＳＥＮ１とＰＳＥＮ２の破壊を示した（図８ｂと図８ｃ）。

実施例７線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞での多遺伝子ノックアウト

１、標的遺伝子の選択およびｓｇＲＮＡの設計
ＨｅＬａ_ＯＣ細胞のＨＳＰＡ遺伝子ファミリーを選択した。この遺伝子ファミリーは、ＨＳＡＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＢＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ６、およびＨＳＰＡ２の５つの遺伝子を有し、これらは相同性を有する。図８ｄに示すように、ＨＳＡＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、およびＨＳＢＡ１Ｌを同時に標的とするｓｇＲＮＡ_ＨＳＰＡを設計し、このｓｇＲＮＡの標的配列には、ＨＳＰＡ６の対応する配列と１つのミスマッチが有、ＨＳＰＡ２と２つのミスマッチがある。

２、線形ドナーＤＮＡの構築
線形ドナーＤｏｎｏｒ_ＨＳＰＡを構築し、５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ_ＨＳＰＡ、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む（図８ｄ）。

３、トランスフェクションおよび遺伝子ノックアウトの効率の検証
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ_ＨＳＰＡを使用し、それに対応するドナーＤｏｎｏｒ_ＨＳＰＡが添加または非添加で、ＨｅＬａ_ＯＣ細胞をコトランスフェクションしてｉｎｄｅｌｓを誘発し、ピューロマイシンを介して耐性でスクリーニングした。ドナーが添加されなかった群について、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドと一緒にコトランスフェクションした。すべての５つの遺伝子のｉｎｄｅｌｓ効率をＴ７Ｅ１アッセイ（使用されたプライマーについて表８参照）により評価し、その結果は図８ｅに示される。単独のｓｇＲＮＡ_ＨＳＰＡと比べて、ドナーＨＳＰＡを使用することにより、ＨＳＰＡ１Ａ部位での突然変異率は約５．５倍増加し、ＨＳＰＡ１Ｂ部位での突然変異率は約６．１倍増加し、ＨＳＰＡ１Ｌ部位での突然変異率は約３．４倍増加し、ＨＳＰＡ６部位での突然変異率は約６．６倍増加した。興味深いことに、ドナーを使用してもしなくても、ＨＳＰＡ２遺伝子上にはｉｎｄｅｌｓは検出されなかった。これは、２つのミスマッチがｓｇＲＮＡ_ＨＳＰＡの認識を完全に混乱させてしまい、さらに重要なことに、ドナーによるスクリーニングは、オフターゲット効果のリスクを増加しなかったことを示している。
ドナーとコトランスフェクションして、およびドナーとコトランスフェクションせずに得られた混合細胞のＨＳＰＡファミリー遺伝子の標的配列についてシーケンシングし、その結果は図１０に示される。その結果、ＨＳＰＡファミリー遺伝子部位上にドナートランスフェクションがあるかないかを問わず、細胞混合シーケンシングの結果は、Ｔ７Ｅ１アッセイの結果と一致している。
なお、Ｔ７Ｅ１アッセイは、スクリーニングされたコロニーが標的突然変異を有する細胞を高度に濃縮し、ドナーを使用しない従来の方法と比べて、濃縮係数は約７５３（５．５＊６．１＊３．４＊６．６）であることを示した。この計算ではドナー挿入を有する遺伝子は考慮されてないことに鑑み、実際の効率向上はさらに大きい。
ピューロマイシン耐性を有する単一クローンについて、５つの標的部位上でＰＣＲ検証を行った。５つの遺伝子の標的部位を増幅するために使用された特異的プライマー（Ｌ５／Ｒ５、Ｌ６／Ｒ６、Ｌ７／Ｒ７、Ｌ８／Ｒ８、Ｌ９／Ｒ９）は表８に示される。その結果は図１１ａと１１ｂに示される。少なくとも２つの標的遺伝子上にドナー挿入を有する６つのクローン（図において枠で表示され、それぞれ１～６と番号付けられた）を選択してゲノム配列分析をして、その結果を図１１ｂに示される。クローン３は４つの遺伝子の対応する部位上で修飾があり、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、およびＨＳＰＡ１Ｌ上にフレームシフト突然変異を有し、完全なノックアウトを生成し、ＨＳＰＡ６上に２つのフレーム内突然変異を有する（図８ｆ）。

実施例８ユニバーサルｓｇＲＮＡを含む線形ドナーＤＮＡを利用した、ＳＣ－８細胞のＣＳＰＧ４遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮

１、ユニバーサルｓｇＲＮＡのスクリーニング
下記表に示すように、次の１０つのｓｇＲＮＡをスクリーニングの候補配列として選択した。

２、線形ドナーＤＮＡの構築
上記１０つのユニバーサルｓｇＲＮＡに基づいて１０つの線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ｓｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１～１０－ｐｕｒо}）を構築した。
これらの線形ドナーＤＮＡは５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１～１０}の標的配列、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。

３、タンデムｓｇＲＮＡプラスミドの構築
上記１０つの線形ドナーに基づいて１０つのタンデムｓｇＲＮＡプラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ_{ｐｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１～１０}）を構築し、その構造は図１２に示す。
タンデムで接続する２つのｓｇＲＮＡはそれぞれｓｇＲＮＡ_{ＣＳＰＧ４}とｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１～１０}である。ｓｇＲＮＡ_{ＣＳＰＧ４}はＴｃｄＢ毒素の受容体ＣＳＰＧ４を標的とし、ｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１～１０}は、対応するドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ｓｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１～１０－ｐｕｒо}）における標的配列を標的とする。

４、トランスフェクション
トランスフェクション実験で使用した細胞株は、Ｃａｓ９を安定的に発現する細胞株（ＳＣ－８）であり、１０つのタンデムプラスミドＰｌａｓｍｉｄ_{ｐｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１～１０}と、対応するドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ｓｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１～１０－ｐｕｒо}）とでＳＣ－８細胞をコトランスフェクションし、対照として、１０つの線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ_{ｓｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１～１０－ｐｕｒо}）のみでＳＣ－８細胞をトランスフェクションした。そして、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングして、混合コロニー（ｐооｌｅｄｐоｐｕｌａｔｉоｎ）を得た。スクリーニングの結果は下記表に示される。

上記の結果によると、ｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１}、ｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿３}、ｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿６}、およびｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿９}の４つのｓｇＲＮＡの効果が良好であったため、これら４つのｓｇＲＮＡに対応する混合コロニーを実験対象として後続実験で使用した。

４、遺伝子ノックアウト効率の検証
ＴｃｄＢ毒素を４つの混合コロニーに加えてスクリーニングし、２３時間後に細胞の生存を観察し、実験の結果を図１３に示す。ＴｃｄＢ毒素を加えて２３時間後、ｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１}とｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿９}を加えた実験群に対応する細胞生存率は、その他の２つの群よりも有意に高いことが分かり、これは、ｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１}とｓｇＲＮＡ_{Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿９}の遺伝子ノックアウト効率がより高いことを示している。

上記実施例１～７で使用された材料および方法は下記通りである。
細胞培養とトランスフェクション
ＨｅＬａ、ＨｅＬａＯＣ、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、蘭州百霊生物技術有限公司、蘭州、中国）が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ、１０－０１３－ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）に保持され、温度は３７℃で、５％ＣＯ_２が導入された。トランスフェクションのために、すべての細胞を６ウェルプレートに播種し、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰ（０６３６６５４６００１，Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でメーカーのプロトコルに従ってトランスフェクションした。簡単に説明すると、２μｇのＤＮＡと４μｌのＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰを２００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭＩＲｅｄｕｃｅｄＳｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ（３１９８５０８８，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）に加えた。混合物を室温で１５分間インキュベーションした後、細胞に加えた。

ｇＲＮＡ発現プラスミドのクローニング
ｓｇＲＮＡを発現するプラスミドについて、各ｓｇＲＮＡコード配列のオリゴヌクレオチドを個別に設計し（表９参照）、合成した（北京睿博興科生物技術有限公司）。

オリゴヌクレオチドを１×ＴＥで１０μＭの濃度に溶解し、ＴｒａｎｓＴａｑＨｉＦｉＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｋ１０２２２、北京全式金生物技術有限公司）を使用してペアになったオリゴヌクレオチドを混合し、９５℃に加熱して３分間保持してから、４℃までゆっくり冷却した。これらのアニーリングされたオリゴヌクレオチドペアを３７℃で３０分間リン酸化し、加熱して不活性化させた後、「ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ」法を使用して生成物をｓｇＲＮＡ骨格ベクターにライゲーションした。ｐｇＲＮＡを発現するプラスミドについて、２つのｇＲＮＡコード配列を含むプライマーでｇＲＮＡのｓｃａｆｆｏｌｄ配列とＵ６プロモーターを増幅し（表５）、そしてＰＣＲ産物を精製し、「ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ」法を使用してｓｇＲＮＡ骨格ベクターにライゲーションした。以前に報告されたｓｇＲＮＡ骨格ベクター［１７］と比べて、本発明のｓｇＲＮＡ骨格ベクターはｓｇＲＮＡ骨格を改変し［３８］、ＥＧＦＰ配列をｍＣｈｅｒｒｙコード配列に置き換えた。

Ｔ７Ｅ１アッセイ
ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅｋｉｔ（６９５０４、Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、ｇＲＮＡ標的配列を含むゲノム領域に対してＰＣＲ増幅をした。アッセイに使用したプライマー配列は表２、表５、表７、表８に示される。使用されたプライマー配列について、５０μｌシステムから３００～５００ｎｇのＰＣＲ産物を取り、１０×ＮＥＢＢｕｆｆｅｒ２と混合し、９５℃で３分間加熱してから、室温までゆっくり冷却した。得られた生成物に０．５μｌのＴ７Ｅ１を加え、３７℃で１５分間インキュベーションした後、アガロースゲル電気泳動にかけた。電気泳動画像について、バンド切断の効率をＩｍａｇｅＪ画像分析ソフトウェアで分析し、ｓｇＲＮＡがＩｎｄｅｌｓを生成する効率を示した。

線形ドナーの構築
ＣＭＶにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子またはＥＧＦＰ遺伝子を含むドナーおよび終止コドンの配列を予め生成し、ｐＥＡＳＹ－Ｔ５－Ｚｅｒоクローンベクター（ＣＴ５０１－０２、北京全式金生物技術有限公司）にクローニングしてユニバーサルテンプレートとした。ｓｇＲＮＡ切断標的部位と保護配列を含むプライマーを用いてテンプレートを増幅した。プライマー配列は表１０に示される。

ＮＨＥＪに基づいたドナー挿入および細胞スクリーニング
ＨｅＬａ_ＯＣ細胞では、１μｇの精製された線形ドナーＰＣＲ産物と１μｇのｓｇＲＮＡ／ｐｇＲＮＡとを用いて細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの２週間後、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで細胞を処理した。ＨｅＬａとＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、１μｇのドナー、０．５μｇのｓｇＲＮＡ／ｐｇＲＮＡ、および０．５μｇのＣａｓ９プラスミドで細胞をトランスフェクションした。そして、トランスフェクションの２週間後、使用するドナーの種類に応じて、１μｇ／ｍｌのピューロマイシで細胞を処理するか、または、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってＥＧＦＰ陽性を確定した。

ＳｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲ
ＳｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲ法は以前に報告されている（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｃ．Ｊ．＆Ｌｕｏ，Ｌ．ＳｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲｆｏｒｍａｐｐｉｎｇｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ．ＰＬｏＳＯｎｅ５，ｅ１０１６８（２０１０）；Ｕｒｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔａｌ．Ａｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｉｔｅｓ．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ４，７８９－７９８（２００９）；Ｙｉｎ，Ｂ．＆Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ，Ｄ．Ａ．ＰＣＲ－ｂａｓｅｄｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｔｏｉｓｏｌａｔｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｉｔｅｓｏｆＤＮＡｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４３，７９－８４（２００７））。使用されたプライマーとアダプター（ａｄａｐｔоｒ）の配列は表１１に示される。

Claims

線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、５’－ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ－３’または５’－ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ－３’を含む、
ユニバーサルドナー構築体。
線形ドナーＤＮＡ、または二本鎖線形ドナーＤＮＡである請求項１に記載のユニバーサルドナー構築体。
前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて前記ユニバーサル標的配列を有するか、または前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ前記ユニバーサル標的配列を有する請求項１または２に記載のユニバーサルドナー構築体。
前記マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である、請求項１～３のいずれか１項に記載のユニバーサルドナー構築体。
前記保護配列の長さが５～３０ｂｐである、請求項１～４のいずれか１項に記載のユニバーサルドナー構築体。
（１）下記の：
（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ；
（ｂ）細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡ；
（ｃ）線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、５’－ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ－３’または５’－ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ－３’を含む、ユニバーサルドナー構築体；および
（ｄ）線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡを細胞に導入するステップ；
（２）前記線形ドナーＤＮＡを、非相同末端結合を介して細胞ゲノムの特定の標的部位に挿入するステップ；および
（３）前記マーカーの発現が陽性である細胞をスクリーニングするステップ
を含む、細胞（但し、ヒト受精卵を除く）内で遺伝子ノックアウトを生成する方法（但し、ヒト生体内で遺伝子ノックアウトを生成する方法を除く）。
前記ユニバーサルドナー構築体は、線形ドナーＤＮＡ、または二本鎖線形ドナーＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて前記ユニバーサル標的配列を有するか、または前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ前記ユニバーサル標的配列を有する、請求項６または７に記載の方法。
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡが、一種のｇＲＮＡ、または細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する複数のｇＲＮＡである、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡがｓｇＲＮＡであり、および／または、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｓｇＲＮＡと、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｓｇＲＮＡとは、同じベクターに位置し、または、
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｓｇＲＮＡと、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに位置する、
請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である、請求項６～１１のいずれか１項に記載の方法。
薬剤耐性により細胞をスクリーニングするか、またはＦＡＣＳ法により細胞をスクリーニングする、請求項６～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記保護配列の長さが５～３０ｂｐである、請求項６～１３のいずれか一項に記載の方法。
（１）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはＣａｓ９ヌクレアーゼを発現することができるベクターまたは細胞；
（２）細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡ；
（３）線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、５’－ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ－３’または５’－ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ－３’を含む、ユニバーサルドナー構築体；および
（４）線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡ
を含む、遺伝子ノックアウトのためのシステムまたはキット。
前記ユニバーサルドナー構築体は、線形ドナーＤＮＡ、または二本鎖線形ドナーＤＮＡである、請求項１５に記載のシステムまたはキット。
前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて前記ユニバーサル標的配列を有するか、または前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ前記ユニバーサル標的配列を有する、請求項１５または１６に記載のシステムまたはキット。
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡが、一種のｇＲＮＡ、または細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する複数のｇＲＮＡである、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のシステムまたはキット。
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡがｓｇＲＮＡであり、および／または、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである、請求項１５～１８のいずれか１項に記載のシステムまたはキット。
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｓｇＲＮＡと、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｓｇＲＮＡとは、同じベクターに位置し、または、
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｓｇＲＮＡと、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに位置する、
請求項１５～１９のいずれか１項に記載のシステムまたはキット。
前記マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である、請求項１５～２０のいずれか１項に記載のシステムまたはキット。
前記保護配列の長さが５～３０ｂｐである、請求項１５～２１のいずれか１項に記載のシステムまたはキット。