JP7144618B2 - バーコード付きガイドｒｎａ構築体を使用する効率的な遺伝子スクリーニングのための組成物及び方法 - Google Patents

バーコード付きガイドｒｎａ構築体を使用する効率的な遺伝子スクリーニングのための組成物及び方法 Download PDF

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Description

本発明は、内部バーコード（「ｉＢＡＲ」）を有するガイドＲＮＡ構築体を使用する遺伝子スクリーニングのための組成物、キット、及び方法に関する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、高い効率と特異性で標的ゲノム部位での編集を可能にする（非特許文献１－２）。その幅広い用途の１つは、ハイスループットプールスクリーニングと次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）分析とを組み合わせて、コーディング遺伝子、非コーディングＲＮＡ、および調節エレメントの機能を同定することである。プールされたシングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）またはペアガイドＲＮＡ（「ｐｇＲＮＡ」）ライブラリーを、Ｃａｓ９を発現する細胞またはエフェクタードメインと融合した触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）に導入することにより、研究者は、多様な突然変異、大きなゲノム欠失、転写活性化、または転写抑制を生成することにより、様々な遺伝子スクリーニングを実行できる。
任意の所定のプールされたＣＲＩＳＰＲスクリーニングにおいて高品質のｇＲＮＡ細胞ライブラリーを生成するには、細胞ライブラリーの構築中に感染多重度（「ＭＯＩ」）を低くして、各細胞が平均して１つ未満のｓｇＲＮＡまたはｐｇＲＮＡを保持してそのスクリーニングの偽陽性率（ＦＤＲ）（非特許文献６，１０，１１）を最小限に抑える必要がある。ＦＤＲをさらに低め、データの再現性を高めるには、統計的に有意なヒット遺伝子を取得するようにｇＲＮＡ及び複数の生物学的複製を深くカバーすることが必要になることが多く、結果としてワークロードが増加する。ゲノムワイドなスクリーニングを大量に実行する場合、ライブラリー構築用の細胞材料が限られている場合、または実験的な複製を取得したり、ＭＯＩを制御したりすることが困難な場合により挑戦的なスクリーニング（例えば、インビボスクリーニング）を実施する場合、さらに困難が生じる可能性がある。真核細胞における大規模な標的同定のための信頼性が高く、非常に効率的なスクリーニングストラテジーが緊急に必要とされている。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願、及び公開された特許出願の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
Ｊｉｎｅｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７， ８１６－８２１ （２０１２）． Ｃｏｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８１９－８２３ （２０１３）． Ｍａｌｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８２３－８２６ （２０１３）． Ｓｈａｌｅｍ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３， ８４－８７ （２０１４）． Ｗａｎｇ， Ｔ．， Ｗｅｉ， Ｊ．Ｊ．， Ｓａｂａｔｉｎｉ， Ｄ．Ｍ． ＆ Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３， ８０－８４ （２０１４）． Ｋｏｉｋｅ－Ｙｕｓａ， Ｈ．， Ｌｉ， Ｙ．， Ｔａｎ， Ｅ．Ｐ．， Ｖｅｌａｓｃｏ－Ｈｅｒｒｅｒａ Ｍｄｅｌ， Ｃ． ＆ Ｙｕｓａ， Ｋ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ＣＲＩＳＰＲ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２， ２６７－２７３ （２０１４）． Ｚｈｏｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５０９， ４８７－４９１ （２０１４）． Ｚｈｕ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｉｒｅｄ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｌｉｂｒａｒｙ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４， １２７９－１２８６ （２０１６）． Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ １５９， ６４７－６６１ （２０１４）． Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｎａｔｕｒｅ ５１７， ５８３－５８８ （２０１５）． Ｐｅｎｇ， Ｊ．， Ｚｈｏｕ， Ｙ．， Ｚｈｕ， Ｓ． ＆ Ｗｅｉ， Ｗ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． ＦＥＢＳ Ｊ ２８２， ２０８９－２０９６ （２０１５）． Ｚｈｕ， Ｓ．， Ｚｈｏｕ， Ｙ． ＆ Ｗｅｉ， Ｗ． Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６５６， １７５－１８１ （２０１７）． Ｍｉｃｈｌｉｔｓ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． ＣＲＩＳＰＲ－ＵＭＩ： ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｔｒａｃｉｎｇ ｏｆ ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｃｒｅｅｎｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４， １１９１－１１９７ （２０１７）． Ｓｃｈｍｉｅｒｅｒ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ １３， ９４５ （２０１７）． Ｓｈｅｃｈｎｅｒ， Ｄ．Ｍ．， Ｈａｃｉｓｕｌｅｙｍａｎ， Ｅ．， Ｙｏｕｎｇｅｒ， Ｓ．Ｔ． ＆ Ｒｉｎｎ， Ｊ．Ｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ， ｌｏｃｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｌｏｎｇ ＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｄｉｓｐｌａｙ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２， ６６４－６７０ （２０１５）． Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｋ．Ａ．， Ｍｏｇｒｉｄｇｅ， Ｊ．， Ｍｏｕｒｅｚ， Ｍ．， Ｃｏｌｌｉｅｒ， Ｒ．Ｊ． ＆ Ｙｏｕｎｇ， Ｊ．Ａ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４１４， ２２５－２２９ （２００１）． Ｌｉ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． ＭＡＧｅＣＫ ｅｎａｂｌｅｓ ｒｏｂｕｓｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １５， ５５４ （２０１４）． Ｌｙｒａｓ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４５８， １１７６－１１７９ （２００９）． Ｙｕａｎ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ４ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ｂ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５， １５７－１６８ （２０１５）． Ｔａｏ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｃｏｌｏｎｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ５３８， ３５０－３５５ （２０１６）． Ｔａｎ， Ｙ．Ｙ．， Ｅｐｓｔｅｉｎ， Ｌ．Ｂ． ＆ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｒ．Ｄ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ６－ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ ａｎｄ ａｌｐｈａ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＬ－６０ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４９， ４４３１－４４３４ （１９８９）． Ｄｕａｎ， Ｊ．， Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｌ． ＆ Ｌａｍｂｅｒｔ， Ｂ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＨＰＲＴ１） ｌｏｃｕｓ． Ｈｕｍａｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ２３， ５９９－６１１ （２００４）． Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｓ．Ｐ． Ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒｉｎｇ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２３， ６８７－６９６ （２００２）． Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４９， １７７９－１７８４ （２０１７）． Ｈａｒｔ， Ｔ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｋ．Ｒ．， Ｓｉｒｃｏｕｌｏｍｂ， Ｆ．， Ｒｏｔｔａｐｅｌ， Ｒ． ＆ Ｍｏｆｆａｔ， Ｊ． Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｓ： ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ １０， ７３３ （２０１４）． Ｚｈｏｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｐａｉｎｔｉｎｇ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２７， ２９８－３０１ （２０１７）． Ｂｉｌｌｏｎ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ＣＲＩＳＰＲ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＯＰ Ｃｏｄｏｎｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６７， １０６８－１０７９ ｅ１０６４ （２０１７）． Ｅｎｇｌｅｒ， Ｃ．， Ｇｒｕｅｔｚｎｅｒ， Ｒ．， Ｋａｎｄｚｉａ， Ｒ． ＆ Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ， Ｓ． Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ： ａ ｏｎｅ－ｐｏｔ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｙｐｅ ＩＩｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４， ｅ５５５３ （２００９）． Ｗｅｉ， Ｗ．， Ｌｕ， Ｑ．， Ｃｈａｕｄｒｙ， Ｇ．Ｊ．， Ｌｅｐｐｌａ， Ｓ．Ｈ． ＆ Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｎ． Ｔｈｅ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＲＰ６ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ． Ｃｅｌｌ １２４， １１４１－１１５４ （２００６）． Ｑｉａｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ＤＫＫ１ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｕｐｔａｋｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｈｉｎａ． Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５７， ４６９－４８１ （２０１４）． Ａｎｄｅｒｓ， Ｓ． ＆ Ｈｕｂｅｒ， Ｗ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｕｎｔ ｄａｔａ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １１， Ｒ１０６ （２０１０）． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｍ．Ｄ． ＆ Ｓｍｙｔｈ， Ｇ．Ｋ． Ｓｍａｌｌ－ｓａｍｐｌｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｉｎｏｍｉａｌ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ， ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ＳＡＧＥ ｄａｔａ． Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ９， ３２１－３３２ （２００８）． Ｋｏｌｄｅ， Ｒ．， Ｌａｕｒ， Ｓ．， Ａｄｌｅｒ， Ｐ． ＆ Ｖｉｌｏ， Ｊ． Ｒｏｂｕｓｔ ｒａｎｋ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｌｉｓｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８， ５７３－５８０ （２０１２）．
本願は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システムを介して遺伝子スクリーニングするガイドＲＮＡ構築体、ライブラリー、組成物およびキット、ならびに遺伝子スクリーニング方法を提供する。
本願の一態様では、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットが提供され、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及び内部バーコード（「ｉＢＡＲ」）配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なる。さらに、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ蛋白質と協力可能である。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含み、例えば、約２～２０ヌクレオチドまたは約３～１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ガイド配列は約１７～２３ヌクレオチドを含む。
上記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットのいずれかによる一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列と第２のステム配列との間に位置する。上記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットのいずれかによる一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、５’から３’への方向に第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列の３’末端と第２のステム配列の５’末端との間に位置する。
上記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットのいずれかによる一部の実施形態では、Ｃａｓ蛋白質はＣａｓ９である。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第２の配列に融合したガイド配列を含み、第２の配列は、Ｃａｓ９と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列のｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に位置する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列のｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に挿入される。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列のｉＢＡＲ配列は、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３のループ領域に位置する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列のｉＢＡＲ配列は、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３のループ領域に挿入される。
上記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットのいずれかによる一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体がプラスミドである。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターである。
本願の一態様では、上記いずれかに記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーが提供され、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、少なくとも約１０００（例えば、少なくとも約２０００、５０００、１００００、１５０００、２００００またはそれ以上）セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列が同じである。一部の実施形態では、異なるセットのｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、ｉＢＡＲ配列の異なる組み合わせを有する。
本願の一態様では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを調製する方法が提供され、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的な複数のガイド配列の１つに対応し、前記方法は、ａ）各ガイド配列に対して３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を設計すること、及びｂ）各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を合成し、それによってｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを生成することを含み、ａ）において、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、対応するガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有するｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードし、ここで、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれに対応するｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、対応する標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能である。一部の実施形態では、その方法は、複数のガイド配列を提供することをさらに含む。
上記いずれかに記載の調製方法による一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は、約１～５０ヌクレオチドを含み、例えば、約２～２０ヌクレオチドまたは約３～１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ガイド配列は約１７～２３ヌクレオチドを含む。
上記いずれかに記載の調製方法による一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列と第２のステム配列との間に位置する。上記いずれかに記載の調製方法による一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、５’から３’への方向に第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列の３’末端と第２のステム配列の５’末端との間に位置する。
上記いずれかに記載の調製方法による一部の実施形態では、Ｃａｓ蛋白質はＣａｓ９である。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第２の配列に融合したガイド配列を含み、第２の配列は、Ｃａｓ９と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列のｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に位置する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列のｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に挿入される。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列のｉＢＡＲ配列は、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３のループ領域に位置する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列のｉＢＡＲ配列は、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３のループ領域に挿入される。
上記いずれかに記載の調製方法による一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体がプラスミドである。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターである。
さらに、上記いずれかに記載の調製方法による方法を使用して調製されたｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー、及び上記いずれかに記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセット、または上記いずれかに記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを含む組成物が提供される。
本願のもう一態様では、細胞の表現型を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）するゲノム遺伝子座をスクリーニングする方法が提供され、この方法には、ａ）修飾された細胞集団を提供するようにｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体および必要に応じたＣａｓ成分の細胞への導入を可能にする条件下で、初期細胞集団をｉ）上記のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーのいずれか１つのｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー、必要に応じて、ｉｉ）Ｃａｓ蛋白質、またはＣａｓ蛋白質をコードする核酸を含むＣａｓ成分と接触させること、ｂ）調節された表現型を有する細胞集団を修飾された細胞集団から選択して、選択された細胞集団を提供すること、ｃ）選択された細胞集団からｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を取得すること、ｄ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付けること（ここで、ランク付けは、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応するｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、及びｅ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対するゲノム遺伝子座を同定することを含む。一部の実施形態では、細胞が真核細胞であり、例えば、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、初期細胞集団がＣａｓ蛋白質を発現する。
上記いずれかに記載のスクリーニング方法による一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体がウイルスベクターであり、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーが約２を超える（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）感染多重度（ＭＯＩ）で初期細胞集団と接触する。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー中の約９５％を超える（例えば、約９７％、９８％、９９％を超えるまたはそれ以上）ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を初期細胞集団に導入する。一部の実施形態では、前記スクリーニングが、約１０００倍を超える（例えば、２０００倍、３０００倍、５０００倍またはそれ以上）カバー率で行われる。
上記いずれかに記載のスクリーニング方法による一部の実施形態では、前記スクリーニングが陽性スクリーニングである。一部の実施形態では、前記スクリーニングが陰性スクリーニングである。
上記のスクリーニング方法のいずれかによる一部の実施形態では、表現型は、蛋白質発現、ＲＮＡ発現、蛋白質活性、またはＲＮＡ活性である。一部の実施形態では、表現型は、細胞死、細胞増殖、細胞運動性、細胞代謝、薬剤耐性、薬剤感受性、及び刺激因子に対する応答からなる群より選択される。一部の実施形態では、表現型は、刺激因子に対する応答であり、前記刺激因子が、ホルモン、成長因子、炎症性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、薬剤、毒素、及び転写因子からなる群より選択される。
上記いずれかに記載のスクリーニング方法による一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列が、ゲノムシーケンシングまたはＲＮＡシーケンシングによって得られる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列が、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって得られる。
上記のスクリーニング方法のいずれかによる一部の実施形態では、配列カウントは、中央値比の正規化とそれに続く平均分散モデリングの対象となる。一部の実施形態では、ガイド配列に対応する前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列の分散を調整する。一部の実施形態では、選択された細胞集団から得られた配列カウントを、対照細胞集団から得られた対応する配列カウントと比較して、倍数変化を提供する。一部の実施形態では、ガイド配列に対応する前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性は、各ｉＢＡＲ配列の倍数変化の方向に基づいて決定され、ｉＢＡＲ配列の倍数変化が互いに反対方向である場合に、前記ガイド配列の分散が増加する。
上記いずれかに記載のスクリーニング方法による一部の実施形態では、前記方法は、同定されたゲノム遺伝子座を検証することをさらに含む。
上記いずれかのｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを含む、細胞の表現型を調節するゲノム遺伝子座をスクリーニングするためのキット及び製品が提供される。一部の実施形態では、キットまたは製品は、Ｃａｓ蛋白質またはＣａｓ蛋白質をコードする核酸をさらに含む。
図１Ａ～１Ｅは、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を使用した、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づいた例示的なスクリーニングを示す図である。図１Ａは、内部バーコード（ｉＢＡＲ）を有するｓｇＲＮＡｉＢＡＲを示す概略図である。６－ｎｔバーコード（ｉＢＡＲ６）は、ｓｇＲＮＡスキャフォールドのテトラループ（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ）に埋め込まれた。図１Ｂは、単一の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ構築体ライブラリー（ＡＮＴＸＲ１；本明細書では「ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１」と称する）を使用したが、４，０９６個のｉＢＡＲ６配列すべてを有する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づいたスクリーニング実験の結果を示す図である。ｓｇＲＮＡ構築体の対照（「ｓｇＲＮＡ非ターゲティング」）は、ＡＮＴＸＲ１を標的としないガイド配列を有するが、対応するｉＢＡＲ６配列を有する。参照と毒素（ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ）処理群の間の倍数変化は、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１の正規化された豊富さを使用して計算された。ここで、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１、バーコードが付いていないｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１、及び非ターゲティングｓｇＲＮＡの倍数変化を示す密度プロットが示される。Ｐｅａｒｓｏｎ相関が計算される（「Ｃｏｒｒ」）。図１Ｃは、ｓｇＲＮＡの編集効率に対するｉＢＡＲ６の各位置でのヌクレオチド同一性の影響を示す図である。図１Ｄは、スクリーニング実験においてＰＡ／ＬＦｎＤＴＡに対する最小の細胞耐性に関連する６つのバーコードを有するｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１によって生成された挿入欠失（インデル、ｉｎｄｅｌｓ）を示す図である。Ｔ７Ｅ１アッセイにおける切断効率のパーセンテージは、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用して測定され、データは平均±ｓ.ｄ．として表される（Ｎ＝３）。使用したすべてのプライマーを表１に示す。図１Ｅは、ＭＴＴ生存率アッセイの結果を示す図である。これは、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡに対する示されたｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１によって編集された細胞の感受性の低下を示している。 図２は、ｉＢＡＲ配列のＧＣ含量に応じて３つのグループに分類された４，０９６種類のｉＢＡＲ６配列すべてを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１のコレクションのＣＲＩＳＰＲスクリーニングを示す図である。３つのグループのＧＣ含量は、高（１００～６６％）、中（６６～３３％）、低（３３～０％）である。２つの生物学的複製のランキングが表示されている。 図３Ａ～３Ｄは、ｓｇＲＮＡ活性に対するｉＢＡＲ配列の影響の評価を示す図である。ｓｇＲＮＡ１ｉＢＡＲ－ＣＳＰＧ４（図３Ａ）、ｓｇＲＮＡ２ｉＢＡＲ－ＣＳＰＧ４（図３Ｂ）、ｓｇＲＮＡ２ｉＢＡＲ－ＭＬＨ１（図３Ｃ）、およびｓｇＲＮＡ３ｉＢＡＲ－ＭＳＨ２（図３Ｄ）によって生成されたインデルは、上記のスクリーニングからＰＡ／ＬＦｎＤＴＡへの細胞耐性を与えるのに最悪であると思われる６つのバーコード、およびＵ６プロモーターの終了シグナルであると思われるＧＴＴＴＴＴＴに関連する。Ｔ７Ｅ１アッセイにおける切断効率のパーセンテージは、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用して測定され、データは平均±ｓ.ｄ．として表される（ｎ＝３）。使用したすべてのプライマーを表１に示す。 図４は、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを使用したＣＲＩＳＰＲプールスクリーニングを示す概略図である。特定のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーについて、４つの異なるｉＢＡＲ６が各ｓｇＲＮＡにランダムに割り当てられた。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、高いＭＯＩ（つまり、～３）のレンチウイルス感染によって標的細胞に導入された。ライブラリースクリーニング後、濃縮細胞からのｓｇＲＮＡ及びそれに関連するｉＢＡＲをＮＧＳ（次世代シーケンシング）で測定した。データ分析では、中央値比の正規化（ｍｅｄｉａｎ ｒａｔｉｏ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）が適用され、続いて平均分散モデリング（ｍｅａｎ－ｖａｒｉａｎｃｅ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）が行われた。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲの分散は、同じｓｇＲＮＡに割り当てられたすべてのｉＢＡＲの倍数変化の一貫性に基づいて決定された。各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲのＰ値は、平均と修正された分散を使用して計算された。ヒット遺伝子を同定するために、すべての遺伝子のロバストランクアグリゲーション（Ｒｏｂｕｓｔ ｒａｎｋ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，ＲＲＡ）スコアが考慮された。より低いＲＲＡスコアは、ヒット遺伝子のより強い濃縮に対応した。 図５は、設計されたオリゴヌクレオチド（オリゴ）のＤＮＡ配列を示す図である。アレイ合成された８５－ｎｔＤＮＡオリゴヌクレオチドには、ｓｇＲＮＡとバーコードｉＢＡＲ６のコード配列が含まれている。左アームと右アームは、増幅のためのプライマーターゲティングに使用される。ＢｓｍＢＩ部位は、プールされたバーコード付きｓｇＲＮＡを最終的な発現バックボーンにクローニングするために使用される。 図６Ａ～６Ｆは、ＨｅＬａ細胞におけるＭＯＩが０．３、３および１０である場合のＴｃｄＢ毒性に関与する必須遺伝子のスクリーニング結果を示す図である。図６Ａおよび６Ｂは、ＭＯＩが０．３である場合のＭＡＧｅＣＫ（図６Ａ）およびＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲ（図６Ｂ）によって計算された同定された遺伝子（ＦＤＲ＜０．１５）のスクリーニングスコアを示す図である。図６Ｃおよび６Ｄは、ＭＯＩが３である場合のＭＡＧｅＣＫ（図６Ｃ）およびＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲ（図６Ｄ）によって計算された同定された遺伝子（ＦＤＲ＜０．１５）のスクリーニングスコアを示す図である。図６Ｅ～６Ｆは、ＭＯＩが１０である場合にＭＡＧｅＣＫ（図６Ｅ）およびＭＡＧｅＣＫＢ（図６Ｆ）によって計算された同定された遺伝子（ＦＤＲ＜０．１５）のスクリーニングスコアを示す図である。陰性対照遺伝子は、縦軸の０付近に暗い点で標記されている。ＭＡＧｅＣＫおよびＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲを介して各生物学的複製で同定された候補のランキングが表示された。 図７Ａ～７Ｈは、ＣＳＰＧ４標的構築体（図７Ａ）、ＳＰＰＬ３標的構築体（図７Ｂ）、ＵＧＰ２標的構築体（図７Ｃ）、ＫＡＴＮＡＬ２標的構築体（図７Ｄ）、ＨＰＲＴ１（図７Ｅ）、ＲＮＦ２１２Ｂ標的構築体（図７Ｆ）、ＳＢＮＯ２標的構築体（図７Ｇ）、及びＥＲＡＳ標的構築体（図７Ｈ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ読み取りカウントを示す図である。それは、ＴｃｄＢスクリーニングの前（Ｃｔｒｌ）及び後（Ｅｘｐ）で、ＭＯＩ １０で、２つの複製でＭＡＧｅＣＫによって計算された。 図８Ａ～８Ｃは、さまざまなサンプルにおけるｓｇＲＮＡの分布とカバレッジを示す図である。図８Ａは、参照群と６－ＴＧ治療群のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ分布を示す図である。横軸はｌｏｇ１０の正規化されたＲＰＭを示し、縦軸はｓｇＲＮＡの数を示す。図８Ｂは、参照サンプルのｓｇＲＮＡカバレッジを示す図である。縦軸は、ｓｇＲＮＡの比率と設計の関係を示す。図８Ｃは、ライブラリー内で異なる数の設計されたｉＢＡＲを運ぶｓｇＲＮＡの比率を示す図である。 図９は、ＭＯＩ ３での６－ＴＧスクリーニング後の、２つの生物学的複製間のすべての遺伝子のｌｏｇ１０（倍数変化）のピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関を示す図である。 図１０は、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲ分析を使用した分散調整後のすべてのｓｇＲＮＡｉＢＡＲの平均分散モデルを示す図である。 図１１Ａ～１１Ｇは、ＨｅＬａ細胞における６－ＴＧを介した細胞毒性に重要なヒト遺伝子を同定するためのＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲと従来のＣＲＩＳＰＲプールスクリーンの比較を示す図である。図１１Ａ～１１Ｂは、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲ（図１１Ａ）およびＭＡＧｅＣＫ（図１１Ｂ）によって計算された上位（トップランク）の遺伝子のスクリーニングスコアを示す図である。同定された候補（ＦＤＲ＜０．１５）にラベルが付けられ、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲスクリーニングとして、上位１０ヒットのみに標記された。陰性対照遺伝子は、縦軸の０付近に暗い点で標記された。図１１Ｃは、６－ＴＧ細胞毒性に関与する報告された遺伝子（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、およびＰＭＳ２）の検証を示す図である。図１１Ｄは、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲ（左）または従来のＭＡＧｅＣＫ分析（右）を使用した、２つの生物学的複製間の上位２０の陽性選択された遺伝子のスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）相関係数を示す図である。図１１Ｅは、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲまたはＭＡＧｅＣＫ分析によって単離された最上位の候補遺伝子の検証を示す図である。各遺伝子を標的とするミニプールされたｓｇＲＮＡは、レンチウイルス感染を介して細胞に送達された。形質導入された細胞は、６－ＴＧ処理の前にさらに１０日間培養された。データは平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ．として表される（ｎ＝５）。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を使用して計算された（*Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意ではない）。検証用のｓｇＲＮＡ配列を表３に示す。図１１Ｆ～１１Ｇは、２つの複製における６－ＴＧスクリーニングの前（Ｃｔｒｌ）および後（Ｅｘｐ）のＨＰＲＴ１標的構築体（図１１Ｆ）およびＦＧＦ１３標的構築体（図１１Ｇ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ読み取りカウントを示す図である。 図１２は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、およびＰＭＳ２を標的とする最初に設計されたｓｇＲＮＡの効率を示す図である。Ｔ７Ｅ１アッセイにおける切断効率のパーセンテージは、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用して測定され、データは平均±ｓ．ｄ．として表される（ｎ＝３）。使用したすべてのプライマーを表１に示す。 図１３は、２つの実験的複製において、示された最上位の候補遺伝子（ＨＰＲＴ１、ＩＴＧＢ１、ＳＲＧＡＰ２、およびＡＫＴＩＰ）を標的とする各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲの倍数変化を示す図である。ＣｔｒｌとＥｘｐは、それぞれ６－ＴＧ処理の前後のサンプルを表す。 図１４Ａ～１４Ｉは、２つの複製の、ＩＴＧＢ１（図１４Ａ）、ＳＲＧＡＰ２（図１４Ｂ）、ＡＫＴＩＰ（図１４Ｃ）、ＡＣＴＲ３Ｃ（図１４Ｄ）、ＰＰＰ１Ｒ１７（図１４Ｅ）、ＡＣＳＢＧ１（図１４Ｆ）、ＣＡＬＭ２（図１４Ｇ）、ＴＣＦ２１（図１４Ｈ）、及びＫＩＦＡＰ３（図１４Ｉ）を標的とするためのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ読み取りカウントを示す図である。ＣｔｒｌとＥｘｐは、それぞれ６－ＴＧ処理の前後のサンプルを表す。 図１５Ａ～１５Ｆは、２つの複製の、ＧＡＬＲ１（図１５Ａ）、ＤＵＰＤ１（図１５Ｂ）、ＴＥＣＴＡ（図１５Ｃ）、ＯＲ５１Ｄ１（図１５Ｄ）、Ｎｅｇ８９（図１５Ｅ）およびＮｅｇ６７（図１５Ｆ）を標的とするためのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ読み取りカウントを示す図である。ＣｔｒｌとＥｘｐは、それぞれ６－ＴＧ処理の前後のサンプルを表す。 図１６は、２つの実験的複製における従来の分析によるＨＰＲＴ１、ＦＧＦ１３、ＧＡＬＲ１、およびＮｅｇ６７の正規化されたｓｇＲＮＡ読み取りカウントを示す図である。ＣｔｒｌとＥｘｐは、それぞれ６－ＴＧ処理の前後のサンプルを表す。 図１７は、（ＲＯＣ曲線によって決定された）ゴールドスタンダードの必須遺伝子を使用したＭＡＧｅＣＫ及びＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲ分析によるスクリーニング性能の評価を示す図である。ＡＵＣ（曲線下面積）値が示された。破線は、ランダム分類モデルの性能を示す。 図１８は、ｓｇＲＮＡ活性に対するさまざまな長さのｉＢＡＲの影響を示す図である。Ｉｎｄｅｌは、示されているようにバーコードの長さが異なるｓｇＲＮＡ１ＣＳＰＧ４及びｓｇＲＮＡ１ｉＢＡＲ－ＣＳＰＧ４によって生成された。Ｔ７Ｅ１アッセイにおける切断効率のパーセンテージは、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用して測定され、データは平均±ｓ．ｄ．として表される（ｎ＝３）。使用したすべてのプライマーを表１に示す。
本出願は、内部バーコード（ｉＢＡＲ）を有するガイドＲＮＡセットを使用する遺伝子スクリーニングのための組成物および方法を提供する。ガイドＲＮＡは、特定のゲノム遺伝子座を標的とし、３つ以上のｉＢＡＲ配列に関連付けられている。（それぞれが異なるゲノム遺伝子座を標的とする）複数のガイドＲＮＡセットを含むガイドＲＮＡライブラリーをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのスクリーニングで使用して、プールされた細胞ライブラリーの表現型を調節するゲノム遺伝子座を同定することができる。本明細書に記載のスクリーニング方法は、ｉＢＡＲ配列が単一の実験でガイドＲＮＡ構築体の各セットに対応する遺伝子編集された複製サンプルの分析を可能にするため、低減した誤検出率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）を有する。誤検出率が低いため、感染多重度（ＭＯＩ）が高い細胞へのガイドＲＮＡライブラリーのウイルス形質導入による高効率の細胞ライブラリー生成も可能になる。
本明細書に記載の実験データは、ｉＢＡＲ法がハイスループットスクリーニングにおいて特に有利であることを示している。従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓスクリーニング法は、細胞ライブラリーを生成する際にレンチウイルス形質導入に低い感染多重度（ＭＯＩ）を必要とし、誤検出率を最小限に抑えるために複数の生物学的複製を必要とするため、多くの場合労働集約的である。対照的に、ｉＢＡＲ法は、偽陽性率と偽陰性率がはるかに低いスクリーニング結果を生成し、高いＭＯＩを使用して細胞ライブラリーを生成できる。たとえば、ＭＯＩが０．３と低い従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓスクリーニングと比較して、ｉＢＡＲ法は開始細胞数を２０倍を超える（たとえばＭＯＩが３）から７０倍を超える（たとえば、ＭＯＩが１０）倍数で減少させながら、高い効率と精度を維持できる。ｉＢＡＲシステムは、細胞の利用できる量が限られた細胞ベースのスクリーニング、または特定の細胞または組織へのウイルス感染を低ＭＯＩで制御することが困難なインビボスクリーニングに特に適用できる。
本願の一態様では、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットが提供され、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及び内部バーコード（「ｉＢＡＲ」）を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ蛋白質と協力可能である。
本願の一態様では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーが提供され、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の各セットは、それぞれｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ蛋白質と協力可能であり、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する。
さらに、細胞の表現型を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）するゲノム遺伝子座をスクリーニングする方法が提供され、この方法には、ａ）修飾された細胞集団を提供するようにｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体および必要に応じたＣａｓ成分の細胞への導入を可能にする条件下で、初期細胞集団をｉ）複数セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー（ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の各セットは、それぞれｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ蛋白質と協力可能であり、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する）、必要に応じて、ｉｉ）Ｃａｓ蛋白質、またはＣａｓ蛋白質をコードする核酸を含むＣａｓ成分と接触させること、ｂ）調節された表現型を有する細胞集団を修飾された細胞集団から選択して、選択された細胞集団を提供すること、ｃ）選択された細胞集団からｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を取得すること、ｄ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付けること（ここで、前記ランク付けは、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応するｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、及びｅ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対するゲノム遺伝子座を同定することを含む。
定義
本発明を、特定の実施形態を用いて特定の図面を参照して説明するが、本発明は、それに限定されない。特許請求の範囲におけるいずれの図面符号は、範囲を制限するものと解釈されるべきではない。図面では、説明のために、いくつかの要素のサイズは誇張されており、縮尺どおりに描かれていない場合がある。別途定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）に準ずる。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または測定に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は、例示のみであり、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「内部バーコード」または「ｉＢＡＲ」は、分子に挿入または付加されるインデックスを指し、これは、分子の特性および性能を追跡するのに使用できる。ｉＢＡＲは、例えば、本発明によって例示されるように、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡに挿入または付加される短いヌクレオチド配列であり得る。複数のｉＢＡＲを使用して、１つの実験内の単一のガイドＲＮＡ配列の性能を追跡できるため、実験を繰り返すことなく、統計分析用の複製データを提供できる。
「ｉＢＡＲ配列はループ領域に位置される」という表現は、ｉＢＡＲ配列が、ループ領域の任意の２つのヌクレオチドの間に挿入されるか、ループ領域の５’または３’末端に挿入されるか、またはループ領域の１つ以上のヌクレオチドを置き換えることを意味する。
「ＣＲＩＳＰＲシステム」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現および/またはガイドに関与する転写産物およびその他の要素の総称である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（例えば、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムにおける「直接リピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接リピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムでは「スペーサー」とも呼ばれる）、およびＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する他の配列及び転写物を含む。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の背景において、「標的配列」とは、ガイド配列と相補性を有するように設計されている配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズし、１つまたは複数のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含んでもよい。
「ガイド配列」という用語は、標的ポリヌクレオチドの標的配列に対して部分的または完全な相補性を有し、Ｃａｓタンパク質によって促進される塩基対形成によって標的配列にハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡ中のヌクレオチドの連続配列を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、標的配列はＰＡＭ部位に隣接している。ＰＡＭ配列、およびもう一方の鎖上のその相補配列は、一緒にＰＡＭ部位を構成する。
「シングルガイドＲＮＡ」、「合成ガイドＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」という用語は置き換えて使用でき、ガイド配列、およびｓｇＲＮＡの機能および／またはｓｇＲＮＡと１つ以上のＣａｓ蛋白質と相互作用してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに必要な任意の他の配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ＲＮＡに由来するｔｒａｃｒ配列およびｃｒＲＮＡに由来するｔｒａｃｒメイト配列を含む第２の配列に融合されたガイド配列を含む。ｔｒａｃｒ配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮＡからの配列の全部または一部を含んでもよい。「ガイド配列」という用語は、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内のヌクレオチド配列を指し、「ガイド」または「スペーサー」という用語と置き換えて使用できる。「ｔｒａｃｒメイト配列」という用語は、「直接リピート」という用語と置き換えて使用できる。本明細書で使用される「ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ」は、ｉＢＡＲ配列を有するシングルガイドＲＮＡを指す
「Ｃａｓタンパク質と協力可能」という用語は、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と相互作用してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成できることを意味する。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者によって理解される当技術分野の用語であり、ミュータントまたはバリアントとは区別される、自然界に存在する生物、菌株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、自然界で発生するものから逸脱するパターンを有する品質の展示を示すものを意味すると解釈されるべきである。
「相補性」は、従来のワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成または他の非従来型のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（すなわち、ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％である相補性の程度、または２つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを指す。
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、実質的に非標的配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は一般に配列に依存し、多くの要因によって異なる。一般に、配列が長いほど、その配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ，Ｙに詳細に記載されている。
「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、またはその他の配列特異的な方法で発生できる。複合体は、デュプレックス構造を形成する二本鎖、多本鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より広範なプロセスのステップを構成することができる。所定の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所定の配列の「相補配列」と呼ばれる。
本明細書で使用される「構築体」という用語は、（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）核酸分子を指す。例えば、ｓｇＲＮＡとの関連で使用される場合、構築体とは、ｓｇＲＮＡ分子を含む核酸分子またはｓｇＲＮＡをコードする核酸分子を指す。タンパク質との関連で使用される場合、構築体とは、ＲＮＡに転写されるかまたはタンパク質として発現され得るヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。構築体は、構築体が宿主細胞に存在する場合にヌクレオチド配列の転写または発現を可能にする、ヌクレオチド配列に作動可能に連結された必要な調節エレメントを含んでもよい。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に連結されている調節エレメント（例えば、プロモーター）の制御下にあることを意味する。調節エレメントは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置することができる。調節エレメント（例えば、プロモーター）と遺伝子との間の距離は、その調節エレメント（例えば、プロモーター）と、それが自然に制御し、調節エレメントが由来する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で知られているように、この距離の変動は、調節エレメント（例えば、プロモーター）の機能を失うことなく適応され得る。
「ベクター」という用語は、宿主細胞内で増殖され得るクローン化されたポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含むように操作され得る核酸分子を説明するために使用される。ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子；１つ以上の自由端を含み、自由端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および本分野で知られている他の種類のポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などによって、追加のＤＮＡセグメントを挿入できる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の本発明の核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが、発現のための、発現される核酸配列に作動可能に連結されている宿主細胞に基づいて選択され得る１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。
「宿主細胞」とは、ベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントである可能性がある、またはレシピエントであった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。一部の実施形態において、宿主細胞は、インビトロで培養され、そして本明細書に記載される方法を使用して修飾され得る真核細胞である。「細胞」という用語は、初代被検細胞及びその継代を含む。
「感染多重度」または「ＭＯＩ」は、本明細書では置き換えて使用でき、それらの感染標的（例えば、細胞または生物）に対する製剤（例えば、ファージ、ウイルス、または細菌）の比率を指す。例えば、ウイルス粒子を接種された細胞のグループに言及する場合、感染多重度またはＭＯＩは、ウイルス形質導入中の、ウイルス粒子（例えば、ｓｇＲＮＡライブラリーを含むウイルス粒子）の数と混合物中に存在する標的細胞の数との間の比率である。
本明細書で使用される細胞の「表現型」とは、その形態、発達、生化学的または生理学的特性、生物季節学（フェノロジー）、または行動などの、細胞の観察可能な特徴または特性を指す。表現型は、細胞内の遺伝子の発現、環境要因の影響、またはこれら２つの間の相互作用から生じる可能性がある。
「含む」という用語が本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、それは他の要素またはステップを除外しない。
本明細書に記載の本発明の実施形態は、「からなる」および／または「実質的にからなる」実施形態を含むことを理解されたい。
本明細書における「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体の変動を含む（および説明する）。たとえば、「約Ｘ」についての説明は、「Ｘ」の説明を含む。
本明細書で使用される場合、ある値またはパラメータ「ではない」との言及は、一般に、ある値またはパラメータ「以外」のものを意味し、説明する。例えば、この方法が、Ｘ型の癌を治療するために使用されないことは、この方法が、Ｘ以外の他の種類の癌を治療するために使用されることを意味する。
本明細書で使用される「約Ｘ～Ｙ」という用語は、「約Ｘから約Ｙ」と同じ意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「一」、「１つ」、および「この」は、文脈で明らかに他のことが説明されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書におけるヌクレオチドの数値範囲を詳しく説明するために、それらの間に介在する各数が明示的に考慮されている。例えば、１９～２１ｎｔの範囲では、１９ｎｔおよび２１ｎｔに加えて２０ｎｔの数値が考慮され、ＭＯＩの範囲では、整数か小数かに関係なく、それらの間にある各数値が明示的に考慮されている。
シングルガイドＲＮＡｉＢＡＲライブラリー
本出願は、内部バーコード（ｉＢＡＲ）を有するガイドＲＮＡ（例えば、シングルガイドＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ構築体およびガイドＲＮＡライブラリーの１つまたは複数のセットを提供する。
一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする構築体に関する。各ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼとの間の相互作用を著しく妨害しないガイドＲＮＡの領域に配置されたｉＢＡＲ配列を含む。複数（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上）のセットのガイドＲＮＡ構築物（ガイドＲＮＡ分子およびガイドＲＮＡ分子をコードする核酸を含む）が提供され、セット内の各ガイドＲＮＡは、ガイド配列は同じであるが、ｉＢＡＲ配列は異なる。異なるｉＢＡＲ配列を有するセットの異なるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を単一の遺伝子編集およびスクリーニング実験で使用して、複製データを提供することができる。
本願の一態様では、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットが提供され、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ蛋白質と協力可能である。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列と第２のステム配列との間に位置する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、５’から３’への方向に第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列の３’末端と第２のステム配列の５’末端との間に位置する。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（レンチウイルスベクターなど）である。
一部の実施形態において、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットが提供され、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能である。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第２の配列に融合したガイド配列を含み、第２の配列は、Ｃａｓ９と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムのループ領域、及び／またはステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３のループ領域に位置する。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域、及び／またはステムループ１のループ領域、ステムループ２のループ領域、またはステムループ３のループ領域に挿入される。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）である。
一部の実施形態において、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットが提供され、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列、第２の配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、ガイド配列は第２の配列に融合し、第２の配列は、Ｃａｓ９蛋白質と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含み、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に位置付け（例えば、挿入）される。各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能である。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）である。
一部の実施形態では、ゲノム遺伝子座を標的とするガイド配列と、リピート：アンチリピートデュプレックス（Ｒｅｐｅａｔ：Ａｎｔｉ－Ｒｅｐｅａｔ Ｄｕｐｌｅｘ）およびテトラループ（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ）をコードするガイドヘアピン（ｇｕｉｄｅ ｈａｉｒｐａｉｎ）とを含むＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ構築体が提供され、内部バーコード（ｉＢＡＲ）が内部複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）としてテトラループ（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ）に埋め込まれる。一部の実施形態において、内部バーコード（ｉＢＡＲ）は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドからなる、３ヌクレオチド（「ｎｔ」）～２０ｎｔ（例えば、３ｎｔ～１８ｎｔ、３ｎｔ～１６ｎｔ、３ｎｔ～１４ｎｔ、３ｎｔ～１２ｎｔ、３ｎｔ～１０ｎｔ、３ｎｔ～９ｎｔ、４ｎｔ～８ｎｔ、５ｎｔ～７ｎｔ；好ましくは、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ）配列を含む。一部の実施形態において、ガイド配列は、長さが１７～２３、１８～２２、１９～２１ヌクレオチドであり、ヘアピン配列は、転写されると、Ｃａｓヌクレアーゼに結合することができる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ構築体は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、ガイド配列は、真核細胞のゲノム遺伝子を標的とし、好ましくは、真核細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ構築体は、ウイルスベクターまたはプラスミドである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーが提供され、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、少なくとも約１０００セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列が同じである。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のすべてのセットのｉＢＡＲ配列は同じである。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーが提供され、各セットは、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、前記３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ蛋白質と協力可能であり、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列と第２のステム配列との間に位置する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、５’から３’への方向に第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列の３’末端と第２のステム配列の５’末端との間に位置する。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、少なくとも約１０００セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列が同じである。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーが提供され、各セットは、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットが提供され、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、前記３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能であり、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第２の配列に融合したガイド配列を含み、第２の配列は、Ｃａｓ９と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムのループ領域、及び／またはステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３のループ領域に位置する。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域、及び／またはステムループ１のループ領域、ステムループ２のループ領域、またはステムループ３のループ領域に挿入される。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、少なくとも約１０００セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列が同じである。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーが提供され、各セットは、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットが提供され、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列、第２の配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、ガイド配列は第２の配列に融合し、第２の配列は、Ｃａｓ９蛋白質と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含み、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に位置付け（例えば、挿入）される。各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能であり、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（レンチウイルスベクターなど）である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、少なくとも約１０００セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列が同じである。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。
さらに、本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットまたはライブラリーのいずれか１つによってコードされるｓｇＲＮＡ分子も提供される。また、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ分子、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲセットまたはライブラリーのいずれか１つを含む組成物及びキットが提供される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ分子、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲセットまたはライブラリーのいずれか１つを含む単離された宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、各宿主細胞が、本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーからの１つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む、宿主細胞ライブラリーは提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体と協力可能なＣａｓ蛋白質などの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１つ以上の成分を含むまたは発現する。一部の実施形態では、Ｃａｓ蛋白質はＣａｓ９ヌクレアーゼである。
ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを調製する方法が本明細書にも提供され、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的な複数のガイド配列の１つに対応し、前記方法は、ａ）各ガイド配列に対して３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を設計すること、及びｂ）各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を合成し、それによってｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを生成することを含み、ａ）において、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、対応するガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有するｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードし、ここで、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれに対応するｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、対応する標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能である。一部の実施形態では、その方法は、複数のガイド配列を設計することをさらに含む。
ｉＢＡＲ配列
ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットは、それぞれが異なるｉＢＡＲ配列を持つ３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットは、それぞれが異なるｉＢＡＲ配列を有する３つのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットは、それぞれが異なるｉＢＡＲ配列を有する４つのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットは、それぞれが異なるｉＢＡＲ配列を有する５つのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットは、それぞれが異なるｉＢＡＲ配列を有する６つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。
ｉＢＡＲ配列は、任意の適切な長さを有することができる。一部の実施形態において、各ｉＢＡＲ配列は、長さが約１～２０ヌクレオチド（「ｎｔ」）、例えば、約２ｎｔ～２０ｎｔ、３ｎｔ～１８ｎｔ、３ｎｔ～１６ｎｔ、３ｎｔ～１４ｎｔ、３ｎｔ～１２ｎｔ、３ｎｔ～１０ｎｔ、３ｎｔ～９ｎｔ、４ｎｔ～８ｎｔ、５ｎｔ～７ｎｔのいずれか１つである。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列の長さは、約３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、または７ｎｔである。一部の実施形態において、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体中のｉＢＡＲ配列は、同じ長さを有する。一部の実施形態において、異なるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列は、異なる長さを有する。
ｉＢＡＲ配列は、任意の適切な配列を持つことができる。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドからなるＤＮＡ配列である。一部の実施形態において、ｉＢＡＲ配列は、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧヌクレオチドからなるＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、Ａ、Ｔ／Ｕ、ＣおよびＧ以外の非従来型または修飾されたヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドからなる６ヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、ライブラリー中のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の各セットに関連するｉＢＡＲ配列のセットは、互いに異なる。一部の実施形態において、ライブラリー中の少なくとも２セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列は同じである。一部の実施形態において、同じセットのｉＢＡＲ配列が、ライブラリー内のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の各セットに使用される。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットごとに異なるｉＢＡＲセットを設計する必要はない。ｉＢＡＲの固定セットは、ライブラリー内のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のすべてのセットに使用できる。または、複数のｉＢＡＲ配列を、ライブラリー内のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の異なるセットにランダムに割り当てることができる。能率化された分析ツール（ｉＢＡＲ）を使用したｉＢＡＲストラテジーにより、さまざまな環境での生物医学的発見のための大規模なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓスクリーニングが促進される。
ｉＢＡＲ配列は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をその標的部位に誘導する際のｇＲＮＡの効率に影響を及ぼさないガイドＲＮＡ内の任意の適切な領域に配置（挿入を含む）することができる。ｉＢＡＲ配列は、ｓｇＲＮＡの３’末端または内部に位置できる。例えば、ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体におけるＣａｓヌクレアーゼと相互作用する様々なステムループを含み得、ｉＢＡＲ配列は、いずれかのステムループのループ領域内に埋め込まれ得る。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列と第２のステム配列との間に位置する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、５’から３’への方向に第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列の３’末端と第２のステム配列の５’末端との間に位置する。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡは、ゲノム遺伝子座を標的とするガイド配列、およびリピート：アンチリピートデュプレックス（Ｒｅｐｅａｔ：Ａｎｔｉ－Ｒｅｐｅａｔ Ｄｕｐｌｅｘ）およびテトラループ（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ）をコードするガイドヘアピン配列を含み得る。一部の実施形態では、内部バーコード（ｉＢＡＲ）は、内部複製としてテトラループに配置される（挿入されることを含む）。内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのコンテキストでは、ｃｒＲＮＡはトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズして、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を形成する。これは、Ｃａｓ９にロードされ、適切なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を持つ相同ＤＮＡ配列の切断を指示する。内因性ｃｒＲＮＡ配列はガイド（２０ｎｔ）領域とリピート（１２ｎｔ）領域に分けられるが、内因性ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はアンチリピート（１４ｎｔ）と３つのｔｒａｃｒＲＮＡステムループに分けられる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡに結合して、ガイド：標的ヘテロ二本鎖、リピート：アンチリピートデュプレックス、およびステムループ１～３を含むＴ字型構造を形成する。一部の実施形態では、リピートおよびアンチリピート部分はテトラループによって接続され、リピートおよびアンチリピートはリピート：アンチリピートデュプレックスを形成し、単一ヌクレオチド（Ａ５１）によってステムループ１と接続され、ステムループ１および２は、５ｎｔの一本鎖リンカー（ヌクレオチド６３～６７）によって接続される。一部の実施形態では、ガイド配列（ヌクレオチド１～２０）および標的ＤＮＡ（ヌクレオチド１０～２００）は、２０個のワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対を介してガイド：標的ヘテロデュプレックスを形成し、リピート（ヌクレオチド２１～３２）およびアンチリピート（ヌクレオチド３７～５０）は、９つのワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対を介してリピート：アンチリピートデュプレックス（Ｕ２２：Ａ４９～Ａ２６：Ｕ４５及びＧ２９：Ｃ４０～Ａ３２：Ｕ３７）を形成する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡテール（ヌクレオチド６８～８１および８２～９６）は、４つおよび６つのワトソン－クリック塩基対を介してステムループ２および３（Ａ６９：Ｕ８０～Ｕ７２：Ａ７７およびＧ８２：Ｃ９６～Ｇ８７：Ｃ９１）を形成する。本明細書は、例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの結晶構造を説明し（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ、ｅｔ ａｌ．、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと複合体を形成したｃａｓ９の結晶構造、Ｃｅｌｌ.２０１４；１５６：９３５－９４９）、参考としてその全体が本出願に取り込まれる。
一部の実施形態において、該ｉＢＡＲ配列は、ｓｇＲＮＡのリピート：アンチリピートステームループのテトラループまたはループ領域に位置する。一部の実施形態において、ｉＢＡＲ配列は、ｓｇＲＮＡのリピート：アンチリピートステームループのテトラループまたはループ領域に挿入される。Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡスキャフォールドのテトラループは、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の外側にあり、上流のガイド配列の活性に影響を与えることなく、さまざまな目的で変更されている（非特許文献９，１２）。本出願の発明者は、ｓｇＲＮＡの遺伝子編集効率に影響を与えたり、オフターゲット効果を増加させたりすることなく、６－ｎｔ長のｉＢＡＲ（ｉＢＡＲ６）を典型的なＣａｓ９ ｓｇＲＮＡスキャフォールドのテトラループに埋め込むことができることを証明した。
例示的なｉＢＡＲ６は４，０９６のバーコードの組み合わせを生み出し、これはハイスループットスクリーニングに十分な変化を提供する（図１Ａ）。これらの余分なｉＢＡＲ配列の挿入がｇＲＮＡ活性に影響を与えるかどうかを確認するために、４，０９６個のｉＢＡＲ６配列のそれぞれと組み合わせて炭疽菌毒素受容体遺伝子ＡＮＴＸＲ１１３を標的とする所定のｓｇＲＮＡのライブラリーを構築した。このｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１ライブラリーは、低いＭＯＩ（０．３）でレンチウイルスによる形質導入を介してＣａｓ９を絶えずに発現するＨｅＬａ細胞に導入された（非特許文献６，７）。ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ毒素の処理と濃縮を３回行った後、以前に報告されたように、ｓｇＲＮＡ及び毒素耐性細胞からのｉＢＡＲ６配列をＮＧＳ分析で測定した（非特許文献６）。バーコードのないｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１およびｓｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１の大部分は有意に濃縮されたが、ほとんどすべての非ターゲティング対照ｓｇＲＮＡは耐性細胞集団に存在しなかった。重要なことに、異なるｉＢＡＲ６を有するｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１の濃縮レベルは、２つの生物学的複製間でランダムであるように見えた（図１Ｂ）。ｉＢＡＲ６の各位置でのヌクレオチド頻度を計算した後、どちらの複製からも配列偏差は観察されなかった（図１Ｃ）。さらに、ｉＢＡＲ６のＧＣ含量はｓｇＲＮＡの切断効率に影響を与えていないようであった（図２）。
ガイド配列
ガイド配列は標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合をガイドする。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされた場合、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズムが含まれる。特定の実施形態において、ガイド配列の長さは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれ以上のヌクレオチドである。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合をガイドするガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの成分（シーケンシングされるガイド配列を含む）は、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターでのトランスフェクション、続いて標的配列内の優先的切断の評価などによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得る。同様に、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の成分（シーケンシングされるガイド配列を含む）、及び試験されるガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、結合または切断率（試験と対照ガイド配列反応の間の標的配列で）を比較することによって、標的ポリヌクレオチド配列の切断をチューブ内で評価することができる。
一部の実施形態では、ガイド配列は、最短で約１０ヌクレオチド、最長で約３０ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、ガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長のいずれか１つである。合成ガイド配列は約２０ヌクレオチド長であってもよいが、より長くまたはより短くなってもよい。例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのガイド配列は、標的配列に相補的な２０ヌクレオチドからなってもよい。すなわち、ガイド配列は、（ＤＮＡとＲＮＡのＡ／Ｕの違いを除いて）ＰＡＭ配列の上流の２０ヌクレオチドと同一であってもよい。
ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は、当技術分野で知られている任意の方法に従って設計することができる。ガイド配列は、エキソンまたはスプライシング部位、目的の遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）などのコード領域を標的とすることができる。例えば、遺伝子のリーディングフレームは、ガイドＲＮＡの標的部位での二本鎖切断（ＤＳＢ）によって媒介される欠失によって破壊される可能性がある。あるいは、コード配列の５’末端を標的とするガイドＲＮＡを使用して、高効率で遺伝子ノックアウトを生成することもできる。ガイド配列は、高いオンターゲット遺伝子編集活性および低いオフターゲット効果のための特定の配列特徴に従って設計および最適化することができる。例えば、ガイド配列のＧＣ含有量は、２０％～７０％の範囲にあり得、ホモポリマーセグメント（例えば、ＴＴＴＴ、ＧＧＧＧ）を含む配列は回避され得る。
ガイド配列は、目的のゲノム遺伝子座を標的とするように設計することができる。一部の実施形態において、ガイド配列は、哺乳動物細胞などの真核細胞のゲノム遺伝子座を標的とする。一部の実施形態において、ガイド配列は、植物細胞のゲノム遺伝子座を標的とする。一部の実施形態において、ガイド配列は、細菌細胞または古細菌細胞のゲノム遺伝子座を標的とする。一部の実施形態において、ガイド配列は、タンパク質をコードする遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ガイド配列は、スモールＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、または長鎖非コーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）などのＲＮＡをコードする遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ガイド配列は、ゲノムの非コード領域を標的とする。一部の実施形態では、ガイド配列は染色体遺伝子座を標的とする。一部の実施形態において、ガイド配列は、染色体外遺伝子座を標的とする。一部の実施形態において、ガイド配列は、ミトコンドリアまたは葉緑体遺伝子を標的とする。
一部の実施形態において、ガイド配列は、目的の任意の標的遺伝子の発現を抑制または活性化するように設計されている。標的遺伝子は、内因性遺伝子または導入遺伝子であってもよい。一部の実施形態において、標的遺伝子は、特定の表現型に関連すると考えられてもよい。一部の実施形態において、標的遺伝子は、特定の表現型に関連するとは思わない既知の遺伝子または特徴付けられていない未知の遺伝子など、特定の表現型に関与していない遺伝子である。一部の実施形態において、標的領域は、標的遺伝子として異なる染色体上に位置する。
その他のｓｇＲＮＡコンポーネント
ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、Ｃａｓタンパク質とのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する追加の配列エレメントを含む。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、リピート‐アンチ‐リピートステムループを含む第２の配列を含む。リピート‐アンチ‐リピートステムループは、ループ領域を介してｔｒａｃｒメイト配列に相補的であるｔｒａｃｒ配列に融合されたｔｒａｃｒメイト配列を含む。
通常、内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの背景では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、１つまたは複数のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）の形成により、標的配列にまたはその近く（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対内）の１つまたは２つの鎖が切断される。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部を含むか、またはそれらからなることができる（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれ以上のヌクレオチド）ｔｒａｃｒ配列は、（ガイド配列に作動可能に連結されている）ｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部のハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成することもできる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するように、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性を有する。標的配列と同様に、機能するのに十分であれば、完全な相補性は必要ないと考えられている。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインメントされた場合、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。最適なアラインメントを決定することは、当業者の能力範囲内である。たとえば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ ｉｎ Ｍａｔｌａｂ、Ｂｏｗｔｉｅ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｂｉｏｐｙｔｈｏｎ、ＳｅｑＭａｎなど（これらに限定されない）、公的および市販のアラインメントアルゴリズムとプログラムがある。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの長さである。ＵＳ８６９７３５９に記載されているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムからのｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列および本明細書に記載されているものなど、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムに由来する既知のｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列のいずれか1つを使用することができる。
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列は、単一の転写物内に含まれ、その結果、両者の間のハイブリダイゼーションは、「リピート‐アンチ‐リピートステムループ（ｒｅｐｅａｔ－ａｎｔｉ－ｒｅｐｅａｔ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ）」と呼ばれるステムループ（ヘアピンとも呼ばれる）などの二次構造を有する転写物を生成する。
一部の実施形態において、ｉＢＡＲ配列を有さないｓｇＲＮＡ構築体におけるステムループのループ領域は、長さが４ヌクレオチドであり、そのようなループ領域は、「テトラループ（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ）」とも呼ばれる。一部の実施形態では、ループ領域は、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、より長いまたはより短いループ配列を使用することができ、また、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）および別のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む配列などの代替配列を使用することもできる。一部の実施形態では、ループ領域の配列は、ＣＡＡＡまたはＡＡＡＧである。一部の実施例では、ｉＢＡＲは、テトラループなどのループ領域に配置されている。一部の実施形態では、ｉＢＡＲは、テトラループなどのループ領域に挿入される。例えば、ｉＢＡＲ配列は、第１のヌクレオチドの前、第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドの間、第２のヌクレオチドと第３のヌクレオチドの間、第３のヌクレオチドと第４のヌクレオチドの間、またはテトラループにおいて第４のヌクレオチドの後に挿入されてもよい。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、ループ領域内の１つまたは複数のヌクレオチドを置き換える。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、少なくとも２つ以上のステムループを含む。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、２つ、３つ、４つ、または５つのステムループを有する。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、多くとも５つのヘアピンを有する。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、ポリＴ配列、例えば、６つのＴヌクレオチドなどの転写終止配列をさらに含む。
Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である一部の実施形態において、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、Ｃａｓ９と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含む第２の配列に融合されたガイド配列を含む。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に配置される。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列はリピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に挿入される。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域内の１つまたは複数のヌクレオチドを置き換える。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲの第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２、および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、ステムループ１のループ領域に配置される。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列はステムループ１のループ領域に挿入される。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、ステムループ１のループ領域内の１つまたは複数のヌクレオチドを置き換える。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、ステムループ２のループ領域に配置される。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列はステムループ２のループ領域に挿入される。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、ステムループ２のループ領域内の１つまたは複数のヌクレオチドを置き換える。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、ステムループ３のループ領域に配置される。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列はステムループ３のループ領域に挿入される。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、ステムループ３のループ領域内の１つまたは複数のヌクレオチドを置き換える。
一部の実施形態において、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列および第２のステム配列を含み、第１のステム配列は、第２のステム配列とハイブリダイズして、Ｃａｓタンパク質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ここで、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列と第２のステム配列との間に配置される。一部の実施形態において、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、５'から３'方向に第１のステム配列および第２のステム配列を含み、第１のステム配列は第２のステム配列とハイブリダイズして、Ｃａｓタンパク質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ここで、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列の３'末端と第２のステム配列の５'末端との間に配置されている。
ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９システムでは、ガイドＲＮＡを使用して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断をガイドできる。例えば、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムヌクレアーゼを配列特異的な方法でゲノム位置に標的化する可変配列のヌクレオチドスペーサー（ガイド配列）から構成でき、しかもヘアピン配列（異なるガイドＲＮＡにおいて恒常不変である）は、ＣａｓヌクレアーゼへのガイドＲＮＡの結合を可能にする。一部の実施形態において、宿主細胞における標的ゲノム配列に相同または相補的であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ可変ガイド配列および転写されたときにＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）に結合可能な不変のヘアピン配列を含むＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡが提供される。ここで、ヘアピン配列は、リピート：アンチリピートデュプレックスおよびテトラループをコードし、内部バーコード（ｉＢＡＲ）がテトラループ領域に埋め込まれている。
ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのガイド配列は、長さが約１７～２３、１８～２２、１９～２１ヌクレオチドであってもよい。ガイド配列は、Ｃａｓヌクレアーゼを配列特異的な方法でゲノム遺伝子座に標的化することができ、当技術分野で知られている一般的な原理に従って設計することができる。不変ガイドＲＮＡヘアピン配列は、例えば、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕらによって開示されているように（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｃａｌｃｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ． Ｃｅｌｌ． ２００９；１５６：９３５－９４９）、当技術分野の一般的な知識に従って提供することができる。本出願はまた、不変ガイドＲＮＡヘアピン配列の例を提供するが、本発明はそれに限定されず、転写されるとＣａｓヌクレアーゼに結合することができる限り、他の不変ヘアピン配列を使用できることを理解されたい。
以前の研究では、４８－ｎｔ ｔｒａｃｒＲＮＡテールを持つｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ（＋４８）と呼ばれる）が最小領域であるにもかかわらず、Ｃａｓ９が触媒するインビトロでのＤＮＡ切断では（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、延長したｔｒａｃｒＲＮＡテール、ｓｇＲＮＡ（＋６７）及びｓｇＲＮＡ（＋８５）は、インビボでのＣａｓ９切断活性を改善することができる（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３を含む。ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３領域は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおける編集効率を高めることができる。
Ｃａｓ蛋白質
本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、当技術分野で知られている天然に存在するまたは操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのいずれか1つと協力するように設計することができる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと協力可能である。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと協力可能である。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと協力可能である。 例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、国際公開第２０１３／１７６７７２、国際公開第２０１４／０６５５９６、国際公開第２０１４／０１８４２３、国際公開第２０１６／０１１０８０、米国特許第８６９７３５９号明細書、米国特許第８９３２８１４号明細書、米国特許第１０１１３１６７号明細書Ｂ２に見出すことができ、それらの開示内容は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、ＲＮＡによってガイドされるポリヌクレオチド結合および／またはヌクレアーゼ活性を有する、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓタイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩシステムに由来するＣａｓタンパク質と協力可能である。そのようなＣａｓタンパク質の例は、例えば、国際公開第２０１４／１４４７６１、国際公開第２０１４／１４４５９２、国際公開第２０１３／１７６７７２、米国特許出願公開第２０１４／０２７３２２６号明細書、および米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３３号明細書に記載されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはＣａｓ９タンパク質に由来する。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、国際公開第２０１４／１４４７６１で同定されたものを含む、Ｃａｓ９タンパク質であるか、または細菌のＣａｓ９タンパク質に由来する。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２とも呼ばれる）は、そのホモログ、またはその修飾バージョンと協力可能である。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、２つ以上のＣａｓタンパク質と協力可能である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、化膿レンサ球菌または肺炎連鎖球菌由来のＣａｓ９タンパク質と協力可能である。Ｃａｓ酵素は当技術分野で既知のものである。たとえば、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて登録番号Ｑ９９ＺＷ２で見つけることができる。
Ｃａｓタンパク質（本明細書では「Ｃａｓヌクレアーゼ」とも呼ばれる）は、標的結合、標的ニッキングまたは切断活性などの所望の活性を提供する。特定の実施形態において、所望の活性は、標的結合である。特定の実施形態では、所望の活性は、標的のニッキングまたは標的の切断である。特定の実施形態において、所望の活性はまた、Ｃａｓタンパク質またはヌクレアーゼ欠損Ｃａｓタンパク質に共有結合的に融合されるポリペプチドによって提供される機能を含む。そのような所望の活性の例には、転写調節活性（活性化または抑制）、後成的（エピジェネティック）修飾活性、または標的の視覚化／同定活性が含まれる。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、二本鎖切断および一本鎖切断を含む標的配列を切断するＣａｓヌクレアーゼと協力可能である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、触媒的に不活性なＣａｓ（「ｄＣａｓ」）と協力可能である。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、ＣＲＩＳＰＲ活性化（「ＣＲＩＳＰＲａ」）システムのｄＣａｓと協力可能であり、ここで、ｄＣａｓは、転写活性化因子に融合されている。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）システムのｄＣａｓと協力可能である。一部の実施形態では、ｄＣａｓは、ＫＲＡＢドメインなどのリプレッサードメインに融合されている。
特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９など）またはそのフラグメントの変異体である。Ｃａｓ９タンパク質は一般に少なくとも２つのヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）ドメインを持っている。たとえば、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインとＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを持つことができる。ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインは共同作用して、標的部位における２つの鎖を切断し、標的ポリヌクレオチドに二本鎖切断を生じさせる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－２１）。特定の実施形態において、変異体Ｃａｓ９タンパク質は、１つの機能的ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン）のみを含むように修飾される。例えば、特定の実施形態において、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つが機能しないように（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しないように）欠失または変異されるように修飾される。ヌクレアーゼドメインの１つが不活性である一部の実施形態において、変異体は、二本鎖ポリヌクレオチド（そのようなタンパク質は「ニッカーゼ」と呼ばれる）にニックを導入することができるが、二本鎖ポリヌクレオチドを切断することはできない。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性および／または特異性を増加させ、酵素活性を変化させ、および／またはタンパク質の別の特性を変化させるように修飾される。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、エフェクタードメインの活性を最適化するために切り詰められるかまたは修飾される。特定の実施形態において、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインは、変異体Ｃａｓ９タンパク質が標的ポリヌクレオチドをニックまたは切断することができないように修飾または排除される。特定の実施形態において、野生型対応物と比較していくつかまたはすべてのヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓ９タンパク質は、それにもかかわらず、多少標的認識活性を維持する。
特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、別のポリペプチドまたはエフェクタードメインに融合された天然に存在するＣａｓまたはその変異体を含む融合タンパク質である。別のポリペプチドまたはエフェクタードメインは、例えば、切断ドメイン、転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、または後成的修飾ドメインであってもよい。特定の実施形態において、融合タンパク質は、修飾または変異されたＣａｓタンパク質を含み、ここで、すべてのヌクレアーゼドメインが不活性化または欠失されている。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質のＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨドメインは、それらがもはやヌクレアーゼ活性を有さないように修飾または変異されている。
特定の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインは、所望の特性を有する任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られる切断ドメインである。
特定の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写活性化ドメインである。一般に、転写活性化ドメインは、転写制御エレメントおよび／または転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用して、遺伝子の転写を増加および／または活性化する。特定の実施形態において、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体である）、ＮＦｘＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、またはＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）活性化ドメインである。特定の実施形態において、転写活性化ドメインは、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、ＭＬＬ、Ｒｔｇ３、Ｇｌｎ３、Ｏａｆ１、Ｐｉｐ２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｐｈｏ４、またはＬｅｕ３である。転写活性化ドメインは、元の転写活性化ドメインの野生型、もしくは修飾または短縮バージョンであってもよい。
特定の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインは、例えば、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、クルッペル（Ｋｒｕｐｐｅｌ）関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンに富んだリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐＩ）リプレッサー、Ｉ．ｋａｐｐａ．Ｂリプレッサー、またはＭｅＣＰ２などの転写リプレッサードメインである。
特定の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデメチラーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、またはＤＮＡデメチラーゼドメインなどの、ヒストン構造および／または染色体構造を修飾することによって遺伝子発現を変化させるエピジェネティック修飾ドメインである。
特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、細胞透過性または転座ドメイン、およびマーカードメイン（例えば、蛍光タンパク質マーカー）などの少なくとも１つの別のドメインをさらに含む。
ベクター
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、ガイドＲＮＡ配列およびｉＢＡＲ配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む。例示的な調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列などの転写終止シグナル）が含まれるが、これらに限定されない。そのような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ（１９９０）に記載されている。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。
ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はベクターに存在することができる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、ウイルスベクターまたはプラスミドなどの発現ベクターである。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどのような要因によられることを当業者が理解するであろう。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである。一部の実施形態において、ベクターは、選択マーカーをさらに含む。一部の実施形態において、ベクターは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするヌクレオチド配列などの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１つ以上のエレメントをコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１つ以上のエレメントをコードするヌクレオチド配列をコードする１つ以上のベクターと、本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のいずれか１つを含むベクターとを含むベクターシステムが提供される。ベクターは、複製起点、目的のポリペプチドの発現を調節する１つ以上の調節配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）、および／または１つ以上のより選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子など）からなる群より選ばれる１つ以上のエレメントを含んでもよい。
ライブラリー
本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、遺伝子スクリーニングの必要性に従って、複数のゲノム遺伝子座を標的とするように設計することができる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の単一のセットは、各目的の遺伝子を標的とするように設計されている。一部の実施形態において、目的の単一の遺伝子を標的とする異なるガイド配列を有する複数の（例えば、少なくとも２、４、６、１０、２０またはそれ以上、例えば４～６）セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を設計することができる。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００、またはそれ以上のセットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、細胞または生物中の少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００、１５０００、またはそれ以上の遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、タンパク質をコードする遺伝子および／または非コードＲＮＡのゲノムワイドなライブラリーである。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、シグナル伝達経路において選択された遺伝子または細胞プロセスに関連する遺伝子を標的とする標的化ライブラリーである。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、特定の調節された表現型に関連するゲノムワイドなスクリーニングのために使用される。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、特定の調節された表現型に関連する少なくとも１つの標的遺伝子を同定するためのゲノムワイドなスクリーニングのために使用される。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、哺乳動物ゲノムなどの真核生物ゲノムを標的とするように設計されている。対象となる例示的なゲノムには、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、飼いならされた動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、またはウサギ）、非ヒト霊長類（例えば、サル）のゲノム、魚類（例、ゼブラフィッシュ）、無脊椎動物（例、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ））、およびヒトが含まれる。
ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリのガイド配列は、ユーザー定義リスト内で高度な標的特異性を持つＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的部位を同定する既知のアルゴリズムを使用して設計できる（ゲノムターゲットスキャン（ＧＴ－スキャン）；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４）３０：２６７３－２６７５を参照）。一部の実施形態では、１００，０００個のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を単一のアレイ上で生成することができ、ヒトゲノム中のすべての遺伝子を包括的にスクリーニングするのに十分な範囲を提供する。このアプローチは、複数のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを並行して合成することにより、ゲノムワイドなスクリーニングを可能にするためにスケールアップすることもできる。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー内のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の正確な数は、スクリーニングが１）遺伝子または調節エレメントを標的にするか、２）完全なゲノムをまたはゲノム遺伝子のサブグループを標的とするかによって決められ得る。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、ゲノム内の遺伝子と重複するすべてのＰＡＭ配列を標的とするように設計されており、ここで、ＰＡＭ配列は、Ｃａｓタンパク質に対応する。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、ゲノムに見出されるＰＡＭ配列のサブセットを標的とするように設計されており、ここで、ＰＡＭ配列は、Ｃａｓタンパク質に対応する。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、ゲノム内のいかなるゲノム遺伝子座も標的としない１つ以上の対照ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態において、推定されたゲノム遺伝子を標的としないｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、陰性対照としてｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーに含まれ得る。
本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体およびライブラリーは、当技術分野における任意の既知の核酸合成法および／または分子クローニング法を使用して調製することができる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、アレイ上の電気化学的手段（例えば、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ、Ｔｗｉｓｔ、Ｇｅｎ９）、ＤＮＡ印刷（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ）、または個々のオリゴの固相合成（例えば、ＩＤＴによる）によって合成される。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はＰＣＲによって増幅され、発現ベクター（レンチウイルスベクターなど）にクローニングされる。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターは、Ｃａｓタンパク質、（例えば、Ｃａｓ９）のような、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムの１つ以上の成分をさらにコードする。
宿主細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体、分子、セット、またはライブラリーのいずれか１つを含む宿主細胞を含む組成物が提供される。
一部の実施形態において、宿主細胞内のゲノム遺伝子座を編集する方法が提供され、これは、ゲノム遺伝子を標的とするガイド配列およびリピート：アンチリピーデュプレックス及びテトラループをコードするガイドヘアピン配列を含むガイドＲＮＡ構築体を宿主細胞に導入することを含む。ここで、内部バーコード（ｉＢＡＲ）が内部複製としてテトラループに埋め込まれ、宿主細胞内のゲノム遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを発現し、それによってＣａｓヌクレアーゼの存在下で標的ゲノム遺伝子を編集する。
一部の実施形態において、本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーのいずれか１つを複数の宿主細胞にトランスフェクトすることによって調製される細胞ライブラリーが提供され、ここで、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）に存在する。一部の実施形態において、トランスフェクション中のウイルスベクターと宿主細胞との間の感染多重度（ＭＯＩ）は、少なくとも約１である。一部の実施形態において、ＭＯＩは、少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、またはそれ以上のもののうちのいずれか１つである。一部の実施形態では、ＭＯＩは、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０である。一部の実施形態では、ＭＯＩは、１～１０、１～３、３～５、５～１０、２～９、３～８、４～６、または２～５のうちのいずれか１つである。一部の実施形態において、トランスフェクション中のウイルスベクターと宿主細胞との間のＭＯＩは、１未満、例えば、０．８未満、０．５未満、０．３未満、またはそれ以下である。一部の実施形態では、ＭＯＩは約０．３から約１である。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターは宿主細胞に導入され、これによって、ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントの発現が、（１つまたは複数の標的部位で）ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ分子とのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示する。一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｃａｓヌクレアーゼが導入されているか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを安定して発現するように操作されている。
一部の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、例えば、予め確立された細胞株などの細胞株である。宿主細胞および細胞株は、ヒト細胞または細胞株であり得るか、あるいはそれらは、非ヒト、哺乳動物細胞または細胞株であり得る。宿主細胞は、任意の組織または器官に由来し得る。一部の実施形態において、宿主細胞は腫瘍細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、幹細胞またはｉＰＳ細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は神経細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、低いＭＯＩ（例えば、１、０．５、または０．３未満）のウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）でトランスフェクトすることが困難である。一部の実施形態において、宿主細胞は、低いＭＯＩ（例えば、１、０．５、または０．３未満）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して編集することが困難である。一部の実施形態において、宿主細胞は、限られた量で獲得できる。一部の実施形態において、宿主細胞は、腫瘍生検など、個体の生検から得られる。
スクリーニングの方法
本出願はまた、本明細書に記載のガイドＲＮＡ構築体、ガイドＲＮＡライブラリー、および細胞ライブラリーのいずれか１つを使用する、ハイスループットスクリーニングおよびフルゲノムスクリーニングを含む遺伝子スクリーニングの方法を提供する。
一部の実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞などの真核細胞）の表現型を調節するゲノム遺伝子座をスクリーニングする方法が提供され、この方法には、ａ）修飾された細胞集団を提供するようにｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の細胞への導入を可能にする条件下で、Ｃａｓ蛋白質を発現する初期細胞集団を本明細書に記載のいずれか１つのｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーと接触させること、ｂ）調節された表現型を有する細胞集団を修飾された細胞集団から選択して、選択された細胞集団を提供すること、ｃ）選択された細胞集団からｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を取得すること、ｄ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付けること（ここで、ランク付けは、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応するｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、及びｅ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対するゲノム遺伝子座を同定することを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）であり、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを約２を超える（例えば、少なくとも約３、５、または１０）感染多重度（ＭＯＩ）で初期細胞集団と接触させる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー中の約９５％を超えるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を初期細胞集団に導入する。一部の実施形態では、スクリーニングが、約１０００倍を超えるカバー率で行われる。一部の実施形態では、スクリーニングが陽性スクリーニングである。一部の実施形態では、スクリーニングが陰性スクリーニングである。
一部の実施形態では、細胞（例えば、哺乳動物細胞などの真核細胞）の表現型を調節するゲノム遺伝子座をスクリーニングする方法が提供され、この方法には、ａ）修飾された細胞集団を提供するようにｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体およびＣａｓ成分の細胞への導入を可能にする条件下で、初期細胞集団をｉ）本明細書に記載のいずれか１つのｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー、ｉｉ）Ｃａｓ蛋白質、またはＣａｓ蛋白質をコードする核酸を含むＣａｓ成分と接触させること、ｂ）調節された表現型を有する細胞集団を修飾された細胞集団から選択して、選択された細胞集団を提供すること、ｃ）選択された細胞集団からｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を取得すること、ｄ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付けること（ここで、ランク付けは、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応するｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、及びｅ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対するゲノム遺伝子座を同定することを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）であり、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを約２を超える（例えば、少なくとも約３、５、または１０）感染多重度（ＭＯＩ）で初期細胞集団と接触させる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー中の約９５％を超えるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を初期細胞集団に導入する。一部の実施形態では、スクリーニングが、約１０００倍を超えるカバー率で行われる。一部の実施形態では、スクリーニングが陽性スクリーニングである。一部の実施形態では、スクリーニングが陰性スクリーニングである。
一部の実施形態では、細胞（例えば、哺乳動物細胞などの真核細胞）の表現型を調節するゲノム遺伝子座をスクリーニングする方法が提供され、この方法には、ａ）修飾された細胞集団を提供するようにｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の細胞への導入を可能にする条件下で、Ｃａｓ蛋白質を発現する初期細胞集団をｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーと接触させること（ここで、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、複数のセットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各セットは、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、前記３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能であり、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する）、ｂ）調節された表現型を有する細胞集団を修飾された細胞集団から選択して、選択された細胞集団を提供すること、ｃ）選択された細胞集団からｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を取得すること、ｄ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付けること（ここで、前記ランク付けは、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応するｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、及びｅ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対するゲノム遺伝子座を同定することを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列と第２のステム配列との間に位置する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、５’から３’への方向に第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列の３’末端と第２のステム配列の５’末端との間に位置する。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ蛋白質はＣａｓ９である。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第２の配列に融合したガイド配列を含み、第２の配列は、Ｃａｓ９と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムのループ領域、及び／またはステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３のループ領域に位置する。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域、及び／またはステムループ１のループ領域、ステムループ２のループ領域、またはステムループ３のループ領域に挿入される。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを約２を超える（例えば、少なくとも約３、５、または１０）感染多重度（ＭＯＩ）で初期細胞集団と接触させる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは少なくとも約１０００セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのセットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列は同じである。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー中の約９５％を超えるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を初期細胞集団に導入する。一部の実施形態では、スクリーニングが、約１０００倍を超えるカバー率で行われる。一部の実施形態では、スクリーニングが陽性スクリーニングである。一部の実施形態では、スクリーニングが陰性スクリーニングである。
一部の実施形態では、細胞（例えば、哺乳動物細胞などの真核細胞）の表現型を調節するゲノム遺伝子座をスクリーニングする方法が提供され、この方法には、ａ）修飾された細胞集団を提供するようにｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の細胞への導入を可能にする条件下で、初期細胞集団をｉ）ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー、及びｉｉ）Ｃａｓ蛋白質、またはＣａｓ蛋白質をコードする核酸を含むＣａｓ成分と接触させること（ここで、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、複数のセットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各セットは、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、前記３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能であり、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する）、ｂ）調節された表現型を有する細胞集団を修飾された細胞集団から選択して、選択された細胞集団を提供すること、ｃ）選択された細胞集団からｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を取得すること、ｄ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付けること（ここで、前記ランク付けは、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応するｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、及びｅ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対するゲノム遺伝子座を同定することを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列と第２のステム配列との間に位置する。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、５’から３’への方向に第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列の３’末端と第２のステム配列の５’末端との間に位置する。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ蛋白質はＣａｓ９である。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第２の配列に融合したガイド配列を含み、第２の配列は、Ｃａｓ９と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムのループ領域、及び／またはステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３のループ領域に位置する。一部の実施形態では、ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域、及び／またはステムループ１のループ領域、ステムループ２のループ領域、またはステムループ３のループ領域に挿入される。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを約２を超える（例えば、少なくとも約３、５、または１０）感染多重度（ＭＯＩ）で初期細胞集団と接触させる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは少なくとも約１０００セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのセットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列は同じである。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー中の約９５％を超えるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を初期細胞集団に導入する。一部の実施形態では、スクリーニングが、約１０００倍を超えるカバー率で行われる。一部の実施形態では、スクリーニングが陽性スクリーニングである。一部の実施形態では、スクリーニングが陰性スクリーニングである。
一部の実施形態では、細胞（例えば、哺乳動物細胞などの真核細胞）の表現型を調節するゲノム遺伝子座をスクリーニングする方法が提供され、この方法には、ａ）修飾された細胞集団を提供するようにｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の細胞への導入を可能にする条件下で、Ｃａｓ９蛋白質を発現する初期細胞集団をｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーと接触させること（ここで、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、複数のセットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各セットは、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列、第２の配列、及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、Ｃａｓ９蛋白質と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含む第２の配列に融合する。ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に配置（例えば、挿入）され、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の各ｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能であり、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する）、ｂ）調節された表現型を有する細胞集団を修飾された細胞集団から選択して、選択された細胞集団を提供すること、ｃ）選択された細胞集団からｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を取得すること、ｄ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付けること（ここで、前記ランク付けは、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応するｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、及びｅ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対するゲノム遺伝子座を同定することを含む。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを約２を超える（例えば、少なくとも約３、５、または１０）感染多重度（ＭＯＩ）で初期細胞集団と接触させる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは少なくとも約１０００セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのセットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列は同じである。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー中の約９５％を超えるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を初期細胞集団に導入する。一部の実施形態では、スクリーニングが、約１０００倍を超えるカバー率で行われる。一部の実施形態では、スクリーニングが陽性スクリーニングである。一部の実施形態では、スクリーニングが陰性スクリーニングである。
一部の実施形態では、細胞（例えば、哺乳動物細胞などの真核細胞）の表現型を調節するゲノム遺伝子座をスクリーニングする方法が提供され、この方法には、ａ）修飾された細胞集団を提供するようにｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体およびＣａｓ成分の細胞への導入を可能にする条件下で、初期細胞集団をｉ）本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー、及びｉｉ）Ｃａｓ９蛋白質、またはＣａｓ９蛋白質をコードする核酸を含むＣａｓ成分と接触させること（ここで、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、複数のセットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各セットは、それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上（例えば、４つ）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含み、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列、第２の配列、及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、Ｃａｓ９蛋白質と相互作用するリピート‐アンチ‐リピートステムループを含む第２の配列に融合する。ｉＢＡＲ配列は、リピート‐アンチ‐リピートステムループのループ領域に配置（例えば、挿入）され、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の各ｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能であり、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する）、ｂ）調節された表現型を有する細胞集団を修飾された細胞集団から選択して、選択された細胞集団を提供すること、ｃ）選択された細胞集団からｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を取得すること、ｄ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付けること（ここで、前記ランク付けは、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応するｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、及びｅ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対するゲノム遺伝子座を同定することを含む。一部の実施形態では、各ｉＢＡＲ配列は約１～５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む。一部の実施形態では、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体はプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを約２を超える（例えば、少なくとも約３、５、または１０）感染多重度（ＭＯＩ）で初期細胞集団と接触させる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは少なくとも約１０００セットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのセットのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のｉＢＡＲ配列は同じである。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー中の約９５％を超えるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を初期細胞集団に導入する。一部の実施形態では、スクリーニングが、約１０００倍を超えるカバー率で行われる。一部の実施形態では、スクリーニングが陽性スクリーニングである。一部の実施形態では、スクリーニングが陰性スクリーニングである。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのハイスループット遺伝子スクリーニングの誤検出率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ、ＦＤＲ）を最小化するための方法が提供され、この方法には、各ガイドＲＮＡの性能を複数回追跡するために、同じ実験内の標的細胞内のガイドＲＮＡと内部バーコード（ｉＢＡＲ）ヌクレオチド配列の両方をカウントすることによって、複数のガイドＲＮＡが埋め込まれた内部バーコードを宿主細胞に導入することを含む。好ましい実施形態において、バーコードは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドからなる、２ｎｔ～２０ｎｔ（より好ましくは、３ｎｔ～１８ｎｔ、３ｎｔ～１６ｎｔ、３ｎｔ～１４ｎｔ、３ｎｔ～１２ｎｔ、３ｎｔ～１０ｎｔ、３ｎｔ～９ｎｔ、４ｎｔ～８ｎｔ、５ｎｔ～７ｎｔ；さらにより好ましくは、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ）短い配列を含む。好ましい実施形態では、バーコードはガイドＲＮＡのテトラループ領域に埋め込まれている。好ましい実施形態では、ガイドＲＮＡ構築体はウイルスベクターである。好ましい実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。好ましい実施形態において、ガイドＲＮＡ構築体は、ＭＯＩ＞１（例えば、ＭＯＩ＞１．５、ＭＯＩ＞２、ＭＯＩ＞２．５、ＭＯＩ＞３、ＭＯＩ＞３．５、ＭＯＩ＞４、ＭＯＩ＞４．５、 ＭＯＩ＞５、ＭＯＩ＞５．５、ＭＯＩ＞６、ＭＯＩ＞６．５、ＭＯＩ＞７；例えば、ＭＯＩは約１、ＭＯＩは約１．５、ＭＯＩは約２、ＭＯＩは約２．５、ＭＯＩは約３、ＭＯＩは約３．５、ＭＯＩは約４、ＭＯＩは約４．５、ＭＯＩは約５、ＭＯＩは約５．５、ＭＯＩは約６、ＭＯＩは約６．５、ＭＯＩは約７）で標的細胞に導入される。
強力なゲノム編集ツールとして、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）-クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システムは、（真核生物における）大規模な機能ベースのスクリーニングストラテジーに急速に発展した。従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓスクリーニング法と比較して、本発明は、スクリーニングの偽陽性率（ＦＤＲ）が大幅に低減され、データの再現性が大幅に向上する、新規の遺伝子スクリーニング法を提供する。
最近、２つの論文が、プールされたＣＲＩＳＰＲスクリーニングのためにｓｇＲＮＡ本体の外部にランダムなバーコードを生成する方法を報告した（非特許文献１３，１４）。各ｓｇＲＮＡが目的の機能喪失（ＬＯＦ）対立遺伝子と非ＬＯＦ対立遺伝子を作成すると仮定すると、いずれの所定のｓｇＲＮＡのすべての読み取りを計算しても、陰性スクリーニングにおけるその標的遺伝子の重要性を正確に評価することはできない。一つのＵＭＩ（ユニーク分子識別子）を各ｓｇＲＮＡの１つの編集結果と関連づけて単一細胞系統の追跡を可能にし、偽陰性率を下げるか、ＲＳＬ（ランダムシーケンスラベル）の数の減少をカウントすることで、統計結果を大幅に改善できる（スクリーニングの質を向上させるためにｓｇＲＮＡを付ける）。これらの２つの方法とは異なり、本発明は、ライブラリーサイズを縮小し、データ品質を改善するために、高いＭＯＩでウイルス感染から得られるＣＲＩＳＰＲライブラリーを用いたプールスクリーニングを可能にする、ｉＢＡＲ配列を有するｓｇＲＮＡセットを使用する新規な方法を提供する。
本明細書に記載のスクリーニング方法は、統計分析による標的同定およびデータ再現性を改善し、誤検出率（ＦＤＲ）を低減するために、それぞれが内部バーコード（ｉＢＡＲ）を有するｓｇＲＮＡ構築体のセットのライブラリーを使用する。プールされたｓｇＲＮＡライブラリーを使用する従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのスクリーニング方法では、ｇＲＮＡを発現する高品質の細胞ライブラリーが、細胞ライブラリーの構築中に低感染多重度（ＭＯＩ）を使用して生成され、各細胞が平均して１つ未満のｓｇＲＮＡまたはペアガイドＲＮＡ（「ｐｇＲＮＡ」）を含むように確保される。ライブラリー内のｓｇＲＮＡ分子はトランスフェクトされた細胞にランダムに組み込まれるため、ＭＯＩが十分に低いと、各細胞が単一のｓｇＲＮＡを発現し、スクリーニングの偽陽性率（ＦＤＲ）が最小限に抑えられる。ＦＤＲをさらに低め、データの再現性を高めるには、統計的に有意なヒット遺伝子を取得するようにｇＲＮＡ及び複数の生物学的複製を深くカバーすることが必要になることが多い。ゲノムワイドなスクリーニングを大量に実行する必要がある場合、ライブラリー構築用の細胞材料が限られている場合、または実験的な複製を手配したり、ＭＯＩを制御したりすることが困難な場合により挑戦的なスクリーニング（すなわち、インビボスクリーニング）を実施する場合、通常なスクリーニング法に困難が生じる。本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを使用する方法は、各ｓｇＲＮＡにｉＢＡＲ配列を含めることによって困難を克服し、これにより、同じガイド配列であるが異なるｉＢＡＲ配列を有する各ｓｇＲＮＡセット内の内部複製の収集が可能になる。たとえば、実施例で説明したように、各ｓｇＲＮＡに４つのヌクレオチドを持つｉＢＡＲは、同じゲノム遺伝子座を標的とする異なるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体間のデータの一貫性を評価するのに十分な内部複製を提供できる。２つの独立した実験間の高レベルの一貫性は、ｉＢＡＲ法を使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓスクリーニングには１つの実験複製で十分であることを示している（図９ｃおよび表１）。宿主細胞のウイルス形質導入中に高いＭＯＩでライブラリーカバー率が大幅に増加するため、実施例に記載された構築されたゲノムワイドなヒトライブラリーに示されているように、同じライブラリーカバー率に達するように、初期細胞集団の細胞数を２０倍と減らすことができる（表３）。同様に、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲを使用した各ゲノムワイドスクリーンのワークロードは、比例して削減できる。異なるｉＢＡＲ配列を持つｓｇＲＮＡを使用すると、ガイド配列と、それに対応する内部バーコード（ｉＢＡＲ）ヌクレオチド配列とをカウントすることにより、同じ実験内で各ガイド配列の性能を複数回追跡できるため、ＦＤＲが大幅に削減され、効率と応答が向上する。ウイルス形質導入ステップ中に高いウイルス力価を使用すると、形質導入効率とライブラリーカバー率はさらに増加でき、例えば、ＭＯＩ＞１（例えば、ＭＯＩ＞１．５、ＭＯＩ＞２、ＭＯＩ＞２．５、ＭＯＩ＞３、ＭＯＩ＞３．５、ＭＯＩ＞４、ＭＯＩ＞４．５、 ＭＯＩ＞５、ＭＯＩ＞５．５、ＭＯＩ＞６、ＭＯＩ＞６．５、ＭＯＩ＞７、ＭＯＩ＞７．５、ＭＯＩ＞８、ＭＯＩ＞８．５、ＭＯＩ＞９、ＭＯＩ＞９．５、またはＭＯＩ＞１０；例えば、ＭＯＩは約１、ＭＯＩは約１．５、ＭＯＩは約２、ＭＯＩは約２．５、ＭＯＩは約３、ＭＯＩは約３．５、ＭＯＩは約４、ＭＯＩは約４．５、ＭＯＩは約５、ＭＯＩは約５．５、ＭＯＩは約６、ＭＯＩは約６．５、ＭＯＩは約７、ＭＯＩは約７．５、ＭＯＩは約８、ＭＯＩは約８．５、ＭＯＩは約９、ＭＯＩは約９．５、ＭＯＩは約１０）である。
Ｃａｓタンパク質は、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、または（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ、または（ｉｉｉ）タンパク質をコードする線状または環状ＤＮＡとして、インビトロまたはインビボスクリーニングにおいて細胞に導入することができる。Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする構築体は、組成物中で精製されていても、または精製されていなくてもよい。タンパク質または核酸構築体を宿主細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、Ｃａｓタンパク質またはその構築体を細胞に導入することを必要とする本明細書に記載のすべての方法に適用可能である。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質として宿主細胞に送達される。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、宿主細胞においてｍＲＮＡまたはＤＮＡから構成的に発現される。特定の実施形態において、ｍＲＮＡまたはＤＮＡからのＣａｓタンパク質の発現は、宿主細胞において誘導可能または誘導的である。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、当技術分野で知られている組換え技術を使用して、Ｃａｓタンパク質：ｓｇＲＮＡ複合体として宿主細胞に導入することができる。Ｃａｓタンパク質またはその構築体を導入する例示的な方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１４４７６１、国際公開第２０１４／１４４５９２、および国際公開第２０１３／１７６７７２に記載されている。
一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する。Ｃａｓ９は、微生物のタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）システムのヌクレアーゼであり、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とペアになるとＤＮＡを切断することが示されている。ｓｇＲＮＡはＣａｓ９を標的ゲノム遺伝子の相補的領域にガイドする。これにより、細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムによってエラーが発生しやすい方法で修復できる部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じる可能性がある。野生型Ｃａｓ９は主に、ｇＲＮＡ配列の後にＰＡＭ配列（－ＮＧＧ）が続くゲノム部位を切断する。ＮＨＥＪを介したＣａｓ９誘導ＤＳＢの修復は、切断部位で開始される広範囲の変異を誘導する。これは通常、小さい（＜１０ｂｐ）挿入/削除（インデル）であるが、大きい（＞１００ｂｐ）インデルを含む場合もある。
本明細書に記載の方法は、コーディング遺伝子、非コーディングＲＮＡ、および調節エレメントの機能を同定するために使用することができる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーは、Ｃａｓ９を発現する細胞、またはエフェクタードメインと融合された触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を発現する細胞に導入される。ハイスループットスクリーニングにより、当業者は、多様な突然変異、大きなゲノム欠失、転写活性化または転写抑制を生成することにより、多種多様な遺伝子スクリーニングを実行することができる。実施例に示されているように、ｉＢＡＲ配列は、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導して標的部位を修飾する際のｓｇＲＮＡの効率に影響を与えない。
本明細書に記載のスクリーニング方法は、インビトロの細胞ベースのスクリーニングまたはインビボのスクリーニングに適用できる。一部の実施形態において、細胞は、細胞培養における細胞である。一部の実施形態では、細胞は組織または器官に存在する。一部の実施形態では、細胞は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ハエ、または他のモデル生物などの生物に存在する。
初期細胞集団には、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡライブラリー（たとえばＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡライブラリーレンチウイルスプール）で形質導入することができる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲウイルスベクターライブラリーは、高い感染多重度（ＭＯＩ）（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６のいずれか１つのＭＯＩ）で初期細胞集団に導入される。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲウイルスベクターライブラリーは、低ＭＯＩ、例えば、約０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３以下またはそれより低いもののいずれか１つのＭＯＩで、初期細胞集団に導入される。一部の実施形態において、初期細胞集団は、１０７、５×１０６、２×１０６、１０６、５×１０５、２×１０５、１０５、５×１０４、２×１０４、１０４、または１０３細胞以下のいずれか１つである。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーにおいて、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高いパーセンテージのいずれか１つのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体が初期細胞集団に導入される。一部の実施形態において、スクリーニングは、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１００００倍、またはそれ以上のいずれか１つ以上のカバー率で実施される。
ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを初期細胞集団に導入した後、細胞を適切な期間でインキュベートして、遺伝子編集を可能にしてもよい。例えば、細胞は、少なくとも１２時間、２４時間、２日、３日、４日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日以上インキュベートすることができる。インデル、ノックアウト、ノックイン、活性化または標的ゲノム遺伝子座または目的の遺伝子の抑制を有する修飾された細胞が得られる。一部の実施形態において、標的遺伝子の転写は、修飾された細胞におけるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体によって阻害または抑制される。一部の実施形態において、標的遺伝子の転写は、修飾された細胞におけるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体によって活性化される。一部の実施形態において、標的遺伝子は、修飾された細胞におけるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体によってノックアウトされる。修飾された細胞は、蛍光タンパク質マーカーや薬剤耐性マーカーなど、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲベクターによってコードされる選択可能なマーカーを使用して選択できる。
一部の実施形態では、この方法は、遺伝子のスプライシング部位または接合部を標的とするように設計されたｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを使用する。スプライシングターゲティング法を使用して、ゲノム内の複数（例えば、数千）の配列をスクリーニングすることができ、それにより、これらの配列の機能を解明することができる。一部の実施形態において、スプライシングターゲティング法は、生存、増殖、薬剤耐性、または他の目的の表現型に必要なゲノム遺伝子を同定するために、ハイスループットスクリーニングにおいて使用される。スプライシングターゲティング実験では、目的の遺伝子内の数万のスプライシング部位を標的とするｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを、たとえばレンチウイルスベクターによってプールとして標的細胞に送達することができる。目的の表現型を選択した後、細胞内で濃縮または枯渇したｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を同定することにより、この表現型に必要な遺伝子を体系的に同定できる。
一部の実施形態において、修飾された細胞は、ホルモン、成長因子、炎症性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、薬物、毒素、および転写因子などの刺激にさらにさらされる。一部の実施形態において、修飾された細胞は、薬剤に対する細胞の感受性を増加または減少させるゲノム遺伝子座を同定するために、薬剤で処理される。
一部の実施形態において、調節された表現型を有する細胞は、スクリーンから選択される。「調節する」とは、調整、ダウンレギュレーション、アップレギュレーション、減少、阻害、増加、減少、非活性化、または活性化などの活動の変化を指す。遺伝子発現または細胞表現型が調節された細胞は、既知の技術を使用して、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別によって単離することができる。調節された表現型は、細胞内または細胞表面マーカーの検出を介して認識され得る。一部の実施形態では、細胞内または細胞表面マーカーは、免疫蛍光染色によって検出することができる。一部の実施形態では、内因性標的遺伝子は、ゲノム編集などによって、蛍光レポーターで標識することができる。他の適用可能な調節された表現型スクリーニングには、刺激因子、細胞死、細胞成長、細胞増殖、細胞生存、薬剤耐性、または薬剤感受性への応答の変化に基づいて、独特な細胞集団を単離することが含まれる。
一部の実施形態において、調節された表現型は、少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子発現の変化、または細胞または生物の表現型の変化であってもよい。一部の実施形態において、表現型は、タンパク質発現、ＲＮＡ発現、タンパク質活性、またはＲＮＡ活性である。一部の実施形態において、細胞表現型は、刺激因子、細胞死、細胞増殖、薬剤耐性、薬剤感受性、またはそれらの組み合わせに対する細胞応答であってもよい。刺激因子は、物理的信号、環境信号、ホルモン、成長因子、炎症性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、転写因子、薬剤または毒素、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。
一部の実施形態において、修飾された細胞は、細胞増殖または生存のために選択される。一部の実施形態において、修飾された細胞は、選択剤の存在下で培養される。選択剤は、化学療法剤、細胞毒性剤、成長因子、転写因子、または薬剤であってもよい。一部の実施形態において、対照細胞は、選択剤の存在なしに同じ条件で培養される。一部の実施形態において、選択は、例えば、モデル生物を使用して、インビボで実施されてもよい。一部の実施形態において、細胞は、遺伝子編集のためにエクスビボでｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーと接触され、遺伝子編集された細胞は、調節された表現型を選択するために生物（例えば、異種移植物として）に導入される。
一部の実施形態において、修飾された細胞は、対照細胞における１つ以上の遺伝子の発現レベルと比較して、１つ以上の遺伝子の発現の変化のために選択される。一部の実施形態において、遺伝子発現の変化は、対照細胞と比較した遺伝子発現の増加または減少である。遺伝子発現の変化は、タンパク質発現、ＲＮＡ発現、またはタンパク質活性の変化によって決定することができる。一部の実施形態において、遺伝子発現の変化は、化学療法剤、細胞毒性剤、成長因子、転写因子、または薬剤などの刺激因子に応答して起こる。
一部の実施形態において、対照細胞は、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含まない細胞、または細胞内のいかなるゲノム遺伝子座も標的としないガイド配列を含む陰性対照ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を導入された細胞である。一部の実施形態では、対照細胞は、薬剤などの刺激因子に曝露されていない細胞である。
調節された表現型を有する選択された細胞集団は、選択された細胞集団におけるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を決定することによって解析される。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、ゲノムＤＮＡのハイスループットシーケンシング、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、または当技術分野で知られている他のシーケンシング方法によって取得することができる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、ゲノム配列決定またはＲＮＡ配列決定によって得られる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、次世代配列決定によって得られる。
配列決定データは、当技術分野で知られている任意の方法を使用して分析し、ゲノムにアラインメントさせることができる。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡの配列カウントおよび対応するｉＢＡＲ配列のカウントは、統計分析によって決定される。一部の実施形態では、配列カウントは、中央値比正規化などの正規化方法を経て得られたものである。
統計方法は、選択した細胞集団で増強または枯渇したｓｇＲＮＡｉＢＡＲ分子のアイデンティティを決定することに使用できる。例示的な統計方法には、線形回帰、一般化線形回帰、および階層回帰が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、配列カウントは、中央値比の正規化に続く平均分散モデリングが行われたものである。一部の実施形態では、ＭＡＧｅＣＫ（Ｌｉ， Ｗ ｅｔ ａｌ．，ＭＡＧｅＣＫは、ゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトスクリーニングからの必須遺伝子のロバストな同定を可能にする。Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １５，５５４（２０１４））を使用してガイドＲＮＡ配列をランク付ける。
一部の実施形態では、各ガイド配列の分散は、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性を前記ガイド配列に対応させることに基づいて調整される。本明細書で使用される「データの一貫性」は、スクリーニング実験における異なるｉＢＡＲ配列に対応する同じガイド配列（例えば、配列カウント、正規化された配列カウント、ランキング、または倍数変化）の配列決定結果の一貫性を指す。スクリーニングからの真のヒットは、理論的には、同じガイド配列を持ち、ｉＢＡＲが異なるｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体に対応する、相似の正規化された配列カウント、ランキング、および/または倍数変化を有するはずである。
一部の実施形態において、選択された細胞集団から得られた配列カウントを、対照細胞集団から得られた対応する配列カウントと比較して、倍数変化を提供する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中の各ｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性が前記ガイド配列に対応するかどうかは、各ｉＢＡＲ配列の倍数変化の方向に基づいて決定され、倍数変化が互いに反対方向である場合に、前記ガイド配列の分散が増加する。一部の実施形態では、データの一貫性を決定するために、ロバストランクアグリゲーションが配列カウントに適用される。
ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットでは、ガイド配列のランク付けは、セット内のさまざまなｉＢＡＲ配列の予め決定されたしきい値ｍの濃縮方向の一貫性に基づいて調整できる。ｍは１～ｎの整数である。たとえば、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲセットの少なくともｍ個のｉＢＡＲ配列が同じ方向の倍数変化を示す場合、つまり、すべてが対照群の方向よりも大きいか小さい場合、ランク付け（または分散）は変更されない。ただし、ｎ－ｍを超える異なるｉＢＡＲ配列が倍数変化の一貫性のない方向を示す場合、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲセットは、そのランクを下げることによって（例えば、分散を増やすことによって）、ダウングレードされる。ロバストランクアグリゲーション（ＲＲＡ）は、当技術分野で統計とランキングに利用できるツールの1つである。当業者は、他の利用可能なツールもこの統計およびランク付けに使用できることを理解することができる。本発明では、ロバストランクアグリゲーション（ＲＲＡ）を使用して各遺伝子の最終スコアを計算し、これによって、すべての遺伝子の平均および分散に基づいて遺伝子のランク付けを取得する。このように、対応するｉＢＡＲ間で倍数変化が異なる方向で示されるｓｇＲＮＡは、分散の増加によってダウングレードされ、これによって、特定の遺伝子のスコアとランキングが低下する。
一部の実施形態では、この方法は、陽性スクリーニングに使用され、すなわち、選択された細胞集団において増強されるガイド配列を同定することによって使用される。一部の実施形態において、この方法は、陰性スクリーニングに使用される（すなわち、選択された細胞集団において枯渇しているガイド配列を同定することによって使用される）。選択した細胞集団で強化されたガイド配列は、配列カウントまたは倍数変化に基づいて上位にランク付けられ、選択した細胞集団で枯渇したガイド配列は、配列カウントまたは倍数変化に基づいて下位にランク付けされる。
一部の実施形態では、この方法は、同定されたゲノム遺伝子座を検証することをさらに含む。例えば、ゲノム遺伝子座が同定された場合、対応するｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を使用した実験を繰り返すか、１つまたは複数のｓｇＲＮＡ（ｉＢＡＲ配列なしで、および／または目的の異なるガイド配列が付けられる）を、同じ目的の遺伝子を標的とするように設計することができる。個々のｓｇＲＮＡｉＢＡＲまたはｓｇＲＮＡ構築体を細胞に導入して、細胞内の同じ目的の遺伝子を編集する効果を検証することができる。
本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれか１つからの配列決定結果を分析する方法がさらに提供される。分析の例示的な方法は、実施例部分に記載されており、例えば、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲアルゴリズムを含む。
一部の実施形態では、細胞内の表現型を調節するゲノム遺伝子座を同定するためにユーザーからの要求を受信する入力ユニットと、入力ユニットに動作可能に結合された１つまたは複数のコンピュータプロセッサとを含むコンピュータシステムが提供され、ここで、１つまたは複数のコンピュータプロセッサは、ａ）本明細書に記載の方法のいずれか１つを使用して、遺伝子スクリーニングから配列決定データのセットを受信する、ｂ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付ける（ここで、ランク付けは、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応する各ｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、ｃ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対応するゲノム遺伝子座を同定する、ｄ）読み取り可能な方法でデータを提示する、および/または配列決定データの分析を生成するように、個別にまたは集合的にプログラムされる。
キットおよび製品
本願はさらに、本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを使用するスクリーニング方法の任意の実施形態で使用するためのキットおよび製品を提供する。
一部の実施形態において、本明細書に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーのいずれか１つを含む、細胞の表現型を調節するゲノム遺伝子座をスクリーニングするためのキットが提供される。一部の実施形態において、キットは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、１つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の陽性および／または陰性対照セットをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、データ分析ソフトウェアをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれか１つを実行するための説明書を含む。
一部の実施形態において、遺伝子スクリーニングに使用可能なｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを調製するためのキットが提供され、３つ以上（例えば、４つ）の構築体を含み、各構築体は、異なるｉＢＡＲ配列と、ガイド配列を挿入してｓｇＲＮＡｉＢＡＲの構築体を提供するためのクローニング部位とを含む。一部の実施形態において、構築体は、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）などのベクターである。一部の実施形態では、キットは、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを調製するための、および／または本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれか１つを実行するための説明書を含む。
キットは、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれか１つの実行を容易にするために、容器、試薬、培地、プライマー、緩衝液、酵素などのような追加の成分を含んでもよい。一部の実施形態において、キットは、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーおよびＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入するための試薬、緩衝液およびベクターを含む。一部の実施形態では、キットは、選択された細胞から抽出されたｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の配列決定ライブラリーを調製するためのプライマー、試薬、および酵素（例えば、ポリメラーゼ）を含む。
本出願のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性包装（例えば、マイラーまたはビニール袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、オプションで、バッファーや解釈情報などの追加コンポーネントを提供する場合がある。したがって、本出願はまた、バイアル（密封されたバイアルなど）、ボトル、ジャー、可撓性包装などを含む製品を提供する。
本出願はさらに、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれか１つに使用するための、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ分子、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲセット、細胞ライブラリー、またはそれらの組成物のいずれかを含むキットまたは製品を提供する。
以下の実施例は、本出願の例示的なもののみであるため、いかなる方法でも本発明を限定すると見なされるべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、限定としてではなく、例示として提供されている。
方法
細胞と試薬
ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＣｅｌｌＭａｘ ＢＬ１０２－０２）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ Ｃ１１９９５５００ＢＴ）で維持し、３７℃で５％ＣＯ２で培養した。マイコプラズマ汚染があるかどうかについて、すべての細胞をチェックした。
プラスミド構築
レンチウイルスｓｇＲＮＡｉＢＡＲ発現バックボーンは、Ｐｌｅｎｔｉ－ｓｇＲＮＡ－Ｌｉｂ（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃５３１２１）のＢｓｔＢＩ（ＮＥＢ、Ｒ０５１９）およびＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６）を使用してＢｓｍＢＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＲ０４５１）部位の位置を変更することによって構築された。ｓｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡｉＢＡＲを発現する配列は、ＢｓｍＢＩを介したＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングストラテジーを使用してバックボーンにクローニングされた（非特許文献２８）。
ゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーの設計
遺伝子注釈は、１９，２１０個の遺伝子を含むＵＣＳＣ ｈｇ３８ゲノムから取得された。遺伝子ごとに、３つの異なるｓｇＲＮＡが、新しく開発されたＤｅｅｐＲａｎｋアルゴリズムを使用して設計され、これらのｓｇＲＮＡは、ゲノムの１６－ｂｐシード領域に少なくとも１つのミスマッチを有し、予測されるターゲティング効率が高い。次に、４つの６－ｂｐ ｉＢＡＲ（ｉＢＡＲ６）を各ｓｇＲＮＡにランダムに割り当てた。陰性対照として、それぞれ４つのｉＢＡＲ６を備えた追加の１，０００個の非ターゲティングｓｇＲＮＡを設計した。
ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡｉＢＡＲプラスミドライブラリーの構築
８５－ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計され、アレイ合成された。オリゴの隣接配列を標的とするプライマー（オリゴＦおよびオリゴＲ）をＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ産物は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法（非特許文献２８）を使用して上記で構築されたレンチウイルスベクターにクローン化された。ライゲーション混合物をＴｒａｎｓ１－Ｔ１コンピテント細胞（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ、ＣＤ５０１－０３）に形質転換して、ライブラリープラスミドを得た。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーのスケールで少なくとも１００倍のカバレッジを確保するために、形質転換されたクローンをカウントした。ライブラリープラスミドを標準プロトコル（ＱＩＡＧＥＮ １２３６２）に従って抽出し、２つのレンチウイルスパッケージプラスミドｐＶＳＶＧおよびｐＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ライブラリーウイルスを取得した。１つのＡＮＴＸＲ１ターゲティングｓｇＲＮＡの４，０９６個のｉＢＡＲ６をすべて含むｉＢＡＲライブラリは、同じプロトコルを使用して構築された。
４，０９６種類のｉＢＡＲ６すべてを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１ライブラリーのスクリーニング
合計２×１０７個の細胞を１５０ｍｍペトリ皿に播種し、ＭＯＩ ０．３でライブラリーレンチウイルスに感染させた。感染の７２時間後、細胞を再播種し、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｐ８２３０）で４８時間処理した。各複製について、ゲノム抽出のために５×１０６個の細胞を収集した。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１ライブラリーのスクリーニングは、ライブラリー感染細胞を１５日間培養した後、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ毒素（非特許文献２９，３０）を使用して実施した（非特許文献７）。次に、Ｐｒｉｍｅｒ－ＦおよびＰｒｉｍｅｒ－Ｒを使用してゲノムＤＮＡにおけるｉＢＡＲコード領域を持つｓｇＲＮＡ（ＴｒａｎｓＧｅｎ、ＡＰ１３１－１３）を増幅し、そしてＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ Ｅ７３７０Ｌ））を使用してハイスループットシーケンシング分析（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００）を行った。
ＴｃｄＢ細胞毒性に重要な遺伝子および細胞生存率に不可欠な遺伝子のための、ゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーのスクリーニング
合計１．６×１０８細胞（ＭＯＩ＝０．３）、１．５３×１０７細胞（ＭＯＩ＝３）、４．６×１０６細胞（ＭＯＩ＝１０）をそれぞれ１５０ｍｍペトリ皿にプレーティングし、２つの複製のｓｇＲＮＡライブラリーを構築した。細胞を異なるＭＯＩのライブラリーレンチウイルスに感染させ、感染後１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで７２時間処理した。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲが組み込まれた細胞は、遺伝子ノックアウトを最大化するためにさらに１５日間培養された。細胞を１５０ｍｍペトリ皿に再播種し、ＴｃｄＢ（１００ｐｇ／ｍｌ）で１０時間処理した後、ピペッティングを繰り返して、緩く付着した丸い細胞を除去した（非特許文献１９）。スクリーニングの各ラウンドで、細胞をＴｃｄＢを含まない新鮮な培地で培養し、約５０％～６０％のコンフルエンスに到達させた。１つの複製のすべての耐性細胞をプールし、ＴｃｄＢスクリーニングの別のラウンドにかけた。その後の３ラウンドのスクリーニングでは、ＴｃｄＢ濃度はそれぞれ１２５ｐｇ／ｍｌ、１５０ｐｇ／ｍｌ、及び１７５ｐｇ／ｍｌであった。４ラウンドの処理後、耐性細胞と未処理細胞を収集して、ゲノムＤＮＡ抽出、ｓｇＲＮＡの増幅、ＮＧＳ分析を行った。ＰＣＲ増幅には７ペアのプライマーを使用し（表１）、ＰＣＲ産物を混合してＮＧＳに使用した。０．３のＭＯＩでの陰性スクリーニングでは、合計４．６×１０７（２つの複製）のｓｇＲＮＡｉＢＡＲが組み込まれた細胞を２８日間培養した後、ＮＧＳをデコードした。
Figure 0007144618000001
Figure 0007144618000002
６－ＴＧ細胞毒性に重要な遺伝子のための、ゲノムスケールＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーのスクリーニング
合計５×１０７個の細胞を１５０ｍｍペトリ皿に播種し、２つの複製を取得した。細胞をＭＯＩ ３でライブラリーレンチウイルスに感染させ、感染の７２時間後に１μｇ／ｍｌピューロマイシンで処理した。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲを組み込んだ細胞をさらに１５日間培養し、合計数５×１０７で再播種し、２００ｎｇ／ｍｌ ６－ＴＧ（Ｓｅｌｌｅｃｋ）で処理した。次の２ラウンドのスクリーニングでは、６－ＴＧ濃度は２５０ｎｇ／ｍｌと３００ｎｇ／ｍｌであった。選択の各ラウンドについて、薬剤を７日間維持し、細胞を６－ＴＧを含まない新鮮な培地でさらに３日間培養した。次に、１つの複製内のすべての耐性細胞をグループ化し、別のラウンドの６－ＴＧスクリーニングを行った。３ラウンドの処理後、耐性細胞と未処理細胞は、ゲノムＤＮＡ抽出、ｉＢＡＲ領域を使用したｓｇＲＮＡの増幅、およびディープシーケンス分析のために収集された。
陽性スクリーニングデータ分析
ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲは、ＭＡＧｅＣＫアルゴリズム（非特許文献１７）に基づくｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを使用してスクリーニング用に開発された分析ストラテジーである。ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲは、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐａｎｄａｓ、ＮｕｍＰｙ、ＳｃｉＰｙを充分に活用している。分析アルゴリズムには、分析の準備、統計的検定、ランクの集計（ｒａｎｋ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）という３つの主要な部分が含まれている。分析準備段階では、入力されたｓｇＲＮＡｓｉＢＡＲの原始カウントが正規化され、全体平均と分散の係数がモデル化される。統計的検定段階では、検定を使用して、処理と対照の正規化された読み取りの差の有意性を判断する。ランク集計段階では、各遺伝子をターゲットとするすべてのｓｇＲＮＡｓｉＢＡＲのランクを集計して、最終的な遺伝子ランキングを取得する。
正規化と準備
最初に、配列決定データからｓｇＲＮＡｓｉＢＡＲの原始カウントを取得した。シーケンシング深度とシーケンシングエラーはｓｇＲＮＡｓｉＢＡＲの原始カウントに影響を与える可能性があるため、次の分析の前に正規化が必要であった。サイズ因子（ｓｉｚｅ ｆａｃｔｏｒ）は、異なるシーケンシング深度の原始カウントを正規化するために推定された。ただし、いくつかの高度に濃縮されたｓｇＲＮＡは、総読み取り数に強い影響を与える可能性があるため、総読み取り数に対する比率を正規化に使用してはならない。したがって、中央値比の正規化を選択した（非特許文献３１）。ライブラリーにｓｇＲＮＡがｎ個あり、ｉが１からｎの範囲であり、合計ｍ回の実験（対照群と治療群）があり、ｊが１からｍの範囲であるとする。サイズ因子は次のように表すことができる。
Figure 0007144618000003
したがって、対応するサイズ因子を計算することにより、各実験でｓｇＲＮＡｉＢＡＲの正規化されたカウントを取得した。平均分散モデリングステップでは、ＮＢ分布を使用して、生物学的複製およびさまざまな処理にわたるすべてのｓｇＲＮＡｉＢＡＲの平均と分散を推定した（非特許文献３２）：
Figure 0007144618000004
ＭＡＧｅＣＫが採用したモデルを使用して、平均と分散の係数を計算した（非特許文献１７）。平均分散モデルは、次の関係を満たす。
Figure 0007144618000005
ライブラリー内のすべてのｓｇＲＮＡｉＢＡＲからのｋ係数とｂ係数を決定するために、関数を線形関数に変換できる。
Figure 0007144618000006
治療数と対照数の平均は直接計算され、対応する分散は平均と係数から計算できた。 ＣＲＩＳＰＲ－ｉＢＡＲ分析では、さまざまなｉＢＡＲのパフォーマンスを通じてｓｇＲＮＡの濃縮を評価した。内部複製として、各ｓｇＲＮＡに対して４つのｉＢＡＲを設計した。ライブラリー構築中のＭＯＩが高いため、真陽性ヒットに関連する偽陽性ｓｇＲＮＡの「フリーライダー」が存在するに違いない。ここでの「フリーライダー」は、同じ細胞に入るために（機能的なｓｇＲＮＡと誤って関連付けられた）無関係な遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを説明するために使用された。各ｓｇＲＮＡの異なるｉＢＡＲの濃縮方向に基づいて、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲの分散を変更した。１つのｓｇＲＮＡのすべてのｉＢＡＲが同じ方向の倍数変化を示した場合、つまり、すべてが対照群の方向よりも大きいか小さい場合、分散は変化しない。ただし、異なるｉＢＡＲを持つ１つのｓｇＲＮＡが、倍数変化の方向に一貫性がないことを示した場合、この種のｓｇＲＮＡは、その分散を増やすことによってダウングレードされる。一貫性のないｓｇＲＮＡｉＢＡＲの最終的な調整済み分散は、モデル推定分散にＣｔｒｌサンプルとＥｘｐサンプルから計算された実験分散を加えたものになる。
最後に、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲのスコアは、対照群と比較した治療の平均および正規化された分散によって計算された。
Figure 0007144618000007
ここで、ｔｉはｉ番目のｓｇＲＮＡの治療カウントの平均であり、ｃｉとｖｉはｉ番目のｓｇＲＮＡの対照カウントの平均と分散である。分散はスコアを計算するための分母として使用されるため、一貫性のないｓｇＲＮＡｉＢＡＲの分散が大きくなると、スコアが低くなる。
統計的測定とランク集計
正規分布は、治療カウントのスコアのテストに使用された。標準正規分布のスコアの両側は、大きい方のテールと小さい方のテールのＰ値を別々に提供した。
遺伝子ランクを取得するために、ランキングを集計するための適切な方法であるＲＲＡ（Ｒｏｂｕｓｔ ｒａｎｋ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ、ロバストランクアグリゲーション法）を使用した（非特許文献３３）。ＭＡＧｅＣＫは、濃縮されたｓｇＲＮＡを制限することにより、改良されたＲＲＡ法を採用した（非特許文献１７）。１つの遺伝子について、Ｍ ｓｇＲＮＡｉＢＡＲのライブラリーに合計ｎ個のｓｇＲＮＡが異なるｉＢＡＲを持つとする。各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ライブラリーＲ＝（Ｒ１，Ｒ２，...，Ｒｎ）内でランクを持っている。まず、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲのランクは、ライブラリー内のｓｇＲＮＡｉＢＡＲの総数で正規化する必要がある。各ｒｉ＝Ｒｉ／Ｍについて、正規化されたランクｒ＝（ｒ１，ｒ２，...，ｒｎ）を取得した。ここで、１≦ｉ≦ｎである。次に、正規化されたランキングｓｒを計算し、ｓｒ１≦ｓｒ２≦…≦ｓｒｎにした。ソートされた正規化されたランクは、０と１の間の均一分布に従う。確率βｋ，ｎ（ｓｒ）（ここで、ｓｒｉ≦ｒｉ）がβ分布β（ｋ，ｎ＋１－ｋ）に従い、これによって、ρ＝ｍｉｎ（β１，ｎ，β２，ｎ，...，βｎ，ｎ）にする。すべての遺伝子について、ρスコアはＲＲＡによって取得でき、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）校正によってさらに調整できる（非特許文献３３）。α－ＲＲＡを開発したＭＡＧｅＣＫを採用し、ランキングリストから上位のα％ｓｇＲＮＡを選択した。閾値（例えば０．２５）より低いｓｇＲＮＡのＰ値が選択された。１つの遺伝子の上位ｓｇＲＮＡのみがＲＲＡ計算で考慮されたため、ρ＝ｍｉｎ（β１，ｎ，β２，ｎ，...，βｊ，ｎ）となり、なお、１≦ｊ≦ｎである。
陰性スクリーニングデータ分析
ｉＢＡＲストラテジーに基づく高ＭＯＩでの陽性スクリーニングの分析プロセス中に、対応するバーコード間で異なる倍数変化方向を持つｓｇＲＮＡのモデル推定分散を修正した。しかし、陰性スクリーニングの場合、非機能的なｓｇＲＮＡのほとんどは変化しない。したがって、対応するバーコードの倍数変化方向に基づく分散修正アルゴリズムは、特定のｓｇＲＮＡが偽陽性の結果であるかどうかを証明するのに十分ではなくなる。したがって、バーコードを内部複製として直接扱った。ｉＢＡＲを考慮に入れると、一貫性のないｓｇＲＮＡｉＢＡＲの分散調整ではなく、陰性スクリーニングに対して２回のロバストランクアグリゲーションを実行した。ロバストランクアグリゲーションの最初のラウンドは、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲレベルをｓｇＲＮＡレベルに集約し、２番目のラウンドはｓｇＲＮＡレベルを遺伝子レベルに集約する。
候補遺伝子の検証
各遺伝子を検証するために、ライブラリーで設計された２つのｓｇＲＮＡを選択し、ピューロマイシン選択マーカーを有するレンチウイルスベクターにクローン化した。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、２つのｓｇＲＮＡプラスミドを混合し、２つのレンチウイルスパッケージプラスミド（ｐＶＳＶＧおよびｐＲ８．７４）とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。Ｃａｓ９を安定して発現しているＨｅＬａ細胞をレンチウイルスに３日間感染させ、１μｇ／ｍｌピューロマイシンで２日間処理した。次に、５，０００個の細胞を各ウェルに加え、各群について５つの複製を取得した。２４時間後、実験群を１５０ｎｇ／ｍｌ ６－ＴＧで処理し、対照群を通常の培地で７日間処理した。次に、ＭＴＴ（Ａｍｒｅｓｃｏ）染色と検出を標準プロトコルに従って実行した。６－ＴＧで処理された実験ウェルは、６－ＴＧ処理されていないウェルに正規化された。
結果
私たちは、４，０９６のバーコードの組み合わせを生み出した６－ｎｔの長さのｉＢＡＲ（ｉＢＡＲ６）を任意に設計し、目的に十分な変化を提供した（図１Ａ）。これらの余分なｉＢＡＲ配列の挿入がｇＲＮＡ活性に影響を与えるかどうかを判断するために、４，０９６種類のｉＢＡＲ６すべてと組み合わせて炭疽菌毒素受容体遺伝子ＡＮＴＸＲ１１６を標的とする所定のｓｇＲＮＡのライブラリーを構築した。この特別なｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１ライブラリーは、０．３の低いＭＯＩでレンチウイルス形質導入を介してＣａｓ９（非特許文献７，８）を絶えず発現するＨｅＬａ細胞で構築された。３ラウンドのＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ毒素処理と濃縮の後、ｓｇＲＮＡと、毒素耐性細胞からのそのｉＢＡＲ６配列とを、以前に報告されたようにＮＧＳ分析によって検出した（非特許文献７）。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１とバーコードのないｓｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１の大部分は有意に濃縮されていたが、ほとんどすべての非ターゲティング対照ｓｇＲＮＡは耐性細胞集団に存在しなかった。重要なことに、異なるｉＢＡＲ６を有するｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１の濃縮レベルは、２つの生物学的複製間でランダムであるように見えた（図１Ｂ）。ｉＢＡＲ６の各位置でのヌクレオチド頻度を計算した後、いずれの複製からのヌクレオチドの偏差も観察できなかった（図１Ｃ）。さらに、ｉＢＡＲ６のＧＣ含量はｓｇＲＮＡの切断効率に影響を与えていないようであった（図２）。ただし、少数のｉＢＡＲ６に関連するｓｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１がどちらのスクリーニング複製でもうまく機能しなかった。これらのｉＢＡＲ６がｓｇＲＮＡ活性に悪影響を及ぼした可能性を排除するために、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１ランキングの最下位から６つの異なるｉＢＡＲを選択してさらに研究した。バーコードのない対照ｓｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１と比較して、これら６つのｓｇＲＮＡｉＢＡＲ－ＡＮＴＸＲ１はすべて、標的部位でのＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）（図１Ｄ）と毒素耐性表現型につながるＡＮＴＸＲ１遺伝子破壊の両方を生成するのに同等の効率を示した（図１Ｅ）。さらに、ＣＳＰＧ４、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２のそれぞれに対する４つの異なるｓｇＲＮＡによるｓｇＲＮＡ効率に対するｉＢＡＲの影響が無視できることを確認した（図３）。まとめると、これらの結果は、この再設計されたｓｇＲＮＡｉＢＡＲがｓｇＲＮＡの十分な活性を保持していることを示しており、ＣＲＩＳＰＲプールスクリーニングでこのストラテジーを一般的に適用することが可能である。
次に、ｉＢＡＲストラテジーに基づいて、その使用を拡大し、高いＭＯＩで新しいｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリースクリーニングを実行することに着手した。標準的な手順に従って、ライブラリー細胞を回収し、ｉＢＡＲコード領域でｓｇＲＮＡをＰＣＲ増幅するためにゲノムＤＮＡを抽出し、ＮＧＳ分析を実行した（非特許文献７，１１，１２）。ＭＡＧｅＣＫアルゴリズムは、原始カウントの正規化、負の二項分布（ＮＢ）モデルを使用した分散の推定、および均一な分布を持つヌルモデルを使用したランキングの決定を通じて、ｓｇＲＮＡスコアの統計的有意性を計算するために使用できる（非特許文献１７）。ｉＢＡＲを考慮に入れて、同じ実験複製内のすべての関連するｉＢＡＲ間のｓｇＲＮＡカウントの変化の一貫性を評価した。このプロセスは、細胞ライブラリー構築における高いＭＯＩでのレンチウイルス感染のために機能的なｓｇＲＮＡに関連していた「フリーライダー」を効果的に排除した。具体的には、ｉＢＡＲシステムの場合、複数のｉＢＡＲで倍数が反対方向に変化するｓｇＲＮＡのみのモデル推定分散を意図的に調整し、これらの外れ値のＰ値を増加させた。最後に、ｓｇＲＮＡスコアと生物学的複製間の技術的差異に基づいてヒット遺伝子を特定した（図４）。ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリースクリーニングの分析のために、オープンソースで無料でダウンロードできる、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲという名前のこの特定のＭＡＧｅＣＫベースのアルゴリズムを開発した。
次に、注釈付きのすべてのヒト遺伝子をカバーするｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリ－を構築した。１９，２１０のヒト遺伝子のそれぞれについて、ＤｅｅｐＲａｎｋ法を使用して３つの固有のｓｇＲＮＡが設計され、それぞれに４つのｉＢＡＲ６がランダムに割り当てられた。さらに、それぞれ４つのｉＢＡＲ６を持つ１，０００の非ターゲティングｓｇＲＮＡが陰性対照として含まれていた。統計的比較を容易にするために、３つの独特な非ターゲティングｓｇＲＮＡの各セットを人為的に陰性対照遺伝子と名付けた。８５－ｎｔのｓｇＲＮＡｉＢＡＲオリゴヌクレオチドは、コンピューターを用いて設計され（図５）、アレイ合成を使用して合成され、プールされたライブラリーとしてレンチウイルスバックボーンにクローニングされた。Ｃａｓ９を発現するＨｅＬａ細胞に、３つの異なるＭＯＩ（０．３、３、および１０）でｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーレンチウイルスを形質導入し、ｓｇＲＮＡを４００倍カバーして、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲが１００倍カバーされた細胞ライブラリーを生成した。さまざまなＭＯＩでのＣＲＩＳＰＲスクリーニングに対するｉＢＡＲ設計の効果を評価するために、この嫌気性菌の主要な病原性因子の１つであるクロストリジウムディフィシル毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）の細胞毒性を媒介する遺伝子を特定するための陽性スクリーニングを実施した（非特許文献１８）。ＴｃｄＢの機能的受容体であるＣＳＰＧ４（非特許文献１９）の最初の同定を以前に報告した。そのコーディング遺伝子も同定され、ゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲライブラリースクリーニングから最上位にランク付けられた（非特許文献２０）。この報告されたＣＲＩＳＰＲスクリーニングでは、ＵＧＰ２遺伝子もトップランクのヒットであり、ＦＺＤ２は、宿主細胞に対するＴｃｄＢの殺傷効果を媒介する二次受容体をコードすることが確認された。注目すべきことに、ＦＺＤ２の役割はＣＳＰＧ４によって大幅に矮小化されたため、ＦＺＤ２遺伝子は、ＣＳＰＧ４相互作用領域が削除されたトランケートされたＴｃｄＢを使用してのみ識別できた（非特許文献２０）。ＴｃｄＢのスクリーニングでは、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲとＭＡＧｅＣＫを使用して、それぞれｉＢＡＲと従来のＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのデータを分析した。その結果、両方からトップランクの遺伝子（ＦＤＲ＜０．１５）を取得した。
０．３という低いＭＯＩでのスクリーニングでは、ＣＳＰＧ４とＵＧＰ２が特定され、上位にランク付けられた（図６Ａ）。これは以前の報道と一致している（非特許文献２０）。ｉＢＡＲを考慮に入れると、ＣＳＰＧ４とＵＧＰ２に加えてＦＺＤ２を特定した（図６Ｂ）。ＦＺＤ２は、ＨｅＬａ細胞においてＣＳＰＧ４よりもはるかに弱い役割を果たすＴｃｄＢの実証済みの受容体であるため（非特許文献２０）、これらの結果は、低ＭＯＩで細胞ライブラリーを構築する場合にｉＢＡＲ法が従来のＣＲＩＳＰＲスクリーニングよりも優れた品質と感度を提供することを示した。さらに、ＣＳＰＧ４とＵＧＰ２のランキングは、２つの実験的複製間のＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲスクリーニングでより一貫しており、新しい方法の品質がはるかに高いことを再度示している（図６Ａ、６Ｂ）。高いＭＯＩ（３および１０）では、ＣＳＰＧ４とＵＧＰ２をＣＲＩＳＰＲとＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲの両方のスクリーニングから分離できたが、データ品質は後者の方が大幅に高かった（図６Ｃ－６Ｆ）。一般に、ＭＯＩが高いほど、従来の方法の信号対雑音比は悪くなる。ＭＯＩが１０の場合、誤検出ヒットの数は従来の方法では大幅に増加したが、ＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲスクリーニングでは増加しなかった（図６Ｅ、６Ｆ）。印象深いことに、ＣＳＰＧ４とＵＧＰ２は、ＭＯＩが１０の場合でも、データ品質はわずかに低下したが、ＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲスクリーニングでトップランクを維持した（図６Ｆ）。注目すべきことに、ほぼすべてのＣＳＰＧ４及びＵＧＰ２を標的とするｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ＴｃｄＢ処理後に有意に濃縮され（図７）、ＳＰＰＬ３などの従来の方法を使用してＭＯＩ １０で同定された他の遺伝子とは著しく異なり、偽陽性の結果である可能性がある（図７）。２つの生物学的複製を比較すると、ＣＳＰＧ４とＵＧＰ２は、すべてのＭＯＩ条件のＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲスクリーニングからの両方の生物学的複製ですべて上位にランク付けられたが（図６ｂ、６ｄ、６ｆ）、従来のＣＲＩＳＰＲスクリーニングからはそうではない。ここで、従来のＣＲＩＳＰＲスクリーニングでは、ＵＧＰ２は、ＭＯＩが３の場合の両方の複製で６０位未満にランク付けられ（図６Ｃ）、ＭＯＩが１０の場合は両方の複製で多くの偽陽性ヒットが発生した（図６Ｅ）。これらの結果は、ｉＢＡＲ法が、高ＭＯＩでも従来のＣＲＩＳＰＲスクリーニングの低ＭＯＩと同様に、データの品質を維持することを示した。さらに、２つの実験的複製の間の一貫性が高いため、ＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲスクリーニングを使用してヒット遺伝子を特定するには１つの生物学的複製で十分である可能性がある（図６）。結局のところ、ｉＢＡＲアプローチに基づいて、１つの実験内で複数の複製を実行できる。
ｉＢＡＲ法の効果をさらに評価するために、ＤＮＡ合成を阻害するように処理できる抗がん剤である６－ＴＧ（非特許文献２１）に対する細胞の感受性を調節する遺伝子を同定するためのスクリーニングを実施した。ＭＯＩが３のゲノムスケールのｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを構築し、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲが５００倍カバーされた各ｓｇＲＮＡのカバー率が高い（２，０００倍）細胞ライブラリーを作成することにした。両方の実験的複製の全体的な読み取り分布が示され（図８Ａ）、両方の複製の参照細胞ライブラリーは、最初に設計されたすべてのｓｇＲＮＡの９７％のカバー率に達した（図８Ｂ）。元のライブラリーのｓｇＲＮＡの９５％以上が３～４個のｉＢＡＲを保持しており、ほとんどのｓｇＲＮＡがスクリーニングとデータ分析に十分なバーコードバリアントを備えたライブラリーの品質が高いことを示している（図８Ｃ）。すべての遺伝子の倍数変化は、２つの生物学的複製の間でよく相関していた（図９）。２つのｓｇＲＮＡライブラリー複製の同じ６－ＴＧスクリーニングでは、ＭＡＧｅＣＫ及びＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲ分析も採用した。その結果、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲの場合、すべてのｓｇＲＮＡｉＢＡＲの調整された分散と平均分布が得られ、異なるｉＢＡＲリピート間で濃縮に一貫性がないｓｇＲＮＡの分散が高められた（図１０）。
陽性選択された統計的に有意なｓｇＲＮＡから、対応するｓｇＲＮＡが異なるｉＢＡＲ間で一貫して濃縮されているトップランクの遺伝子（ＦＤＲ＜０．１５）を同定し（図１１Ａ）、バーコードを使用せずにＭＡＧｅＣＫアルゴリズムを使用してこれらのトップ遺伝子も見つけた（図１１Ｂ）。以前の報告（非特許文献２２）と一致して、ＨＰＲＴ１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは両方の方法でトップランクにランクされた。４つの遺伝子（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、およびＰＭＳ２）は、６－ＴＧを介した細胞死に関与していることが以前に報告されている（非特許文献６）。これら４つの遺伝子を標的とする主要な設計ｓｇＲＮＡの１つを除くすべての切断活性を調べて確認し（図１２）、これらの遺伝子が実際に使用したＨｅＬａ細胞の６－ＴＧを介した細胞死とは無関係であることを示した（図１１Ｃ）。２つの生物学的複製を別々に分析すると、各複製の上位２０遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲスクリーニングとの高いレベルの一貫性を示した（ランキングのスピアマン相関係数＝０．７４）が、従来の方法を使用した場合、２つの複製の共通性ははるかに低くなった（スピアマン相関ランキングの係数＝－０．０９）（図１１Ｄおよび表２）。
Figure 0007144618000008
Figure 0007144618000009
スクリーニング結果を検証するために、２つのｓｇＲＮＡを新たに設計して組み合わせて、各候補遺伝子を標的とするミニプールを作成し、レンチウイルス感染によって各プールをＨｅＬａ細胞に導入した（表３）。
Figure 0007144618000010
Figure 0007144618000011
６－ＴＧ処理に対する細胞生存率に対するｓｇＲＮＡプールの影響は、３－（４，５－ジメチル-２-チアゾリル）-２，５-ジフェニル-２－Ｈ－テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって定量された。ＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲおよびＣＲＩＳＰＲスクリーンからの上位１０個の遺伝子が検証のために選択された。注目すべきことに、２つの非ターゲティング対照遺伝子（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅｓ）が同定され、従来のＣＲＩＳＰＲスクリーンのトップ１０候補リストにランク付けられた。細胞ライブラリーの生成に使用したＭＯＩが高いため、これらの明らかな偽陽性の結果は予測可能である。２つの複製のＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲからの上位１０個の候補遺伝子がすべて真陽性の結果であることを確認することに成功した。対照的に、従来の方法の上位１０の候補リストから５つの遺伝子のみが真陽性であることが判明した（図１１Ｅ）。その中で、４つの遺伝子（ＨＰＲＴ１、ＩＴＧＢ１、ＳＲＧＡＰ２、およびＡＫＴＩＰ）が両方の方法を使用して取得されたのに対し、６つの遺伝子（ＡＣＴＲ３Ｃ、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＡＣＳＢＧ１、ＣＡＬＭ２、ＴＣＦ２１、およびＫＩＦＡＰ３）はＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲのみにより同定され、上位にランク付けられた。要するに、従来の方法と比較して、ｉＢＡＲは、高ＭＯＩスクリーン精度を向上させた（偽陽性率と偽陰性率が低い）。
さらに、上位４つの候補遺伝子（ＨＰＲＴ１、ＩＴＧＢ１、ＳＲＧＡＰ２、およびＡＫＴＩＰ）を標的とする各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲの性能を評価した。濃縮されたｓｇＲＮＡのすべての異なるｉＢＡＲは、それらの関連ｓｇＲＮＡの濃縮レベルにほとんど影響を与えないようであり、特定のｓｇＲＮＡに関連付けられたｉＢＡＲの順序はランダムであるように見え（図１３）、ｉＢＡＲに関する以前の認識、すなわち、付属ｓｇＲＮＡの効率に影響を与えないことをさらに支持する。４つすべてのＨＰＲＴ１ターゲティングｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、両方の複製で６－ＴＧ処理後に有意に濃縮された（図１１Ｆ）。他のＣＲＩＳＰＲｉＢＡＲで同定された遺伝子のほとんどのｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、６－ＴＧ選択後に濃縮された（図１４）。対照的に、ＦＧＦ１３（図１１Ｇ）、ＧＡＬＲ１、および２つの陰性対照遺伝子（図１５）を含む、従来のＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのいくつかのトップランク遺伝子のｓｇＲＮＡｉＢＡＲのごく一部のみが濃縮され、ＭＡＧｅＣＫｉＢＡＲ分析ではなくＭＡＧｅＣＫ分析の偽陽性ヒットを引き起こす（図１６）。
私たちが設計したように、各ｓｇＲＮＡの４つのバーコードは、データの一貫性を評価するのに十分な内部複製を提供するように見えた。２つの生物学的複製間の高レベルの一貫性は、ｉＢＡＲ法を使用したＣＲＩＳＰＲスクリーニングには１つの実験的複製で十分であることを示している（図６、図１１Ｄおよび表２）。ライブラリー構築のための固定数の細胞を用いた形質導入における高いＭＯＩでライブラリーカバー率が有意に増加したため、ライブラリー構築の開始細胞を２０倍（ＭＯＩ＝３）および７０倍（ＭＯＩ＝１０）を超える倍数で減らして、２つの生物学的複製を使用した０．３のＭＯＩでの従来のスクリーニングの結果と一致させ、さらにはそれを上回っている（表４）。
Figure 0007144618000012
複数の切断は細胞の生存率を低下させるため、高いＭＯＩで構築されたＣＲＩＳＰＲライブラリーは、陰性スクリーニングの異常な偽発見率を示す可能性がある（非特許文献２３，２４）。したがって、必須遺伝子を呼び出す際のｉＢＡＲ法を評価するために、ＭＯＩ ０．３でゲノムスケールの陰性スクリーニングを実施した。ｉＢＡＲを使用した陽性スクリーニングでは、バーコード間の倍数変化方向が異なるｓｇＲＮＡのモデル推定分散を変更して分散を拡大し、誤って関連付けられたｓｇＲＮＡが適切なペナルティの対象となるようにした。ただし、陰性スクリーニングの場合、非機能的なｓｇＲＮＡは変化しないため、誤って関連付けられたｓｇＲＮＡの枯渇は倍数変化方向の一貫性にほとんど影響しなかった。したがって、ペナルティ手順（ｐｅｎａｌｔｙ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）なしで、バーコードを内部複製としてのみ扱った。ゴールドスタンダードの必須遺伝子（ｇｏｌｄ－ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ）（非特許文献２５）を使用する従来のアプローチよりも、低いＭＯＩでｉＢＡＲ法を使用した陰性スクリーニングの真陽性率が高く、偽陽性率が低く、統計的な結果が確実的に改善された（図１７）。
ライブラリー構築用の細胞の大幅な削減に加えて、同じ実験内でｉＢＡＲによって提供される内部複製は、個別の生物学的複製（ｓｅｐａｒａｔｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）と比較して、より均一な条件とより公平な比較につながり、結果として統計スコアが向上する。複数の細胞株での大規模なＣＲＩＳＰＲスクリーニングが必要な場合、またはスクリーニング用の細胞サンプルが不足している場合（たとえば、患者からのサンプルや初代物からのサンプル）、ｉＢＡＲ法の利点は大きくなる。特にレンチウイルスの形質導入率を予測することが難しく、さまざまな動物の可変的な条件がスクリーニングの結果に大きな影響を与える可能性があるインビボスクリーニングの場合、ｉＢＡＲ法はこれらの技術的制限を解決するための理想的なソリューションになる可能性がある。
陰性スクリーニングの場合、ｉＢＡＲ法は低ＭＯＩでのウイルス感染で作られたライブラリーの統計を改善した（図１７）。「内部複製（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」と同じの利点を提供するｉＢＡＲ法の技術的進歩にもかかわらず、細胞生存率の測定に基づいて陰性スクリーンで元の細胞ライブラリーを生成するために、ウイルス形質導入中のＭＯＩに注意する必要がある。大規模な統合は細胞の適合性に影響を与えないと報告されているが（非特許文献２６）、アクティブなＣａｓ９を含む細胞の高いＭＯＩによるＤＮＡの複数回の切断によって、細胞の生存率が低下することが示されている（非特許文献２３，２４）。切断を使用しないストラテジー（ＣＲＩＳＰＲｉ／ａ（非特許文献９）またはｉＳＴＯＰシステム（非特許文献２７）など）は、高いＭＯＩでの陰性スクリーニングのためにｉＢＡＲシステムと組み合わせるのにより適した選択肢となるかもしれない。
ｉＢＡＲ６がｓｇＲＮＡの活性にほとんど影響を与えなかったことを裏付けるデータはあるが、小さな影響を避けるために、連続したＴ（＞４）のバーコードを使用することは勧めない。最終的に、４，０９６種類のｉＢＡＲ６は、ＣＲＩＳＰＲライブラリーを作成するのに十分な種類を提供した。さらに、ｉＢＡＲの長さは６ｎｔに制限されていない。さまざまな長さのｉＢＡＲをテストしたところ、関連するｓｇＲＮＡの機能に影響を与えることなく、最大５０－ｎｔの長さになることができることがわかった（図１８）。さらに、ｓｇＲＮＡごとに異なるバーコードセットを設計する必要はない。すべてのｓｇＲＮＡに割り当てられたｉＢＡＲの固定セットは、ライブラリースクリーニングでのランダムな割り当てと同様に機能するはずである。能率化された分析ツール（ｉＢＡＲ）を使用したｉＢＡＲストラテジーにより、さまざまな環境での生物医学的発見のための大規模なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓスクリーニングが促進される。

Claims (13)

  1. それぞれがｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードする３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセットであって、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、ガイド配列及び内部バーコード（ｉＢＡＲ）配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有し、各ガイド配列は、標的ゲノム遺伝子座に相補的であり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のガイド配列は同じであり、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれのｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ蛋白質と協力可能であり、
    各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列及び第２のステム配列を含み、第１のステム配列と第２のステム配列がハイブリダイズしてＣａｓ蛋白質と相互作用する二本鎖ＲＮＡ領域を形成し、ｉＢＡＲ配列は、第１のステム配列と第２のステム配列との間に位置し、
    各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列は、第２の配列に融合したガイド配列を含み、第２の配列は、Ｃａｓ９と相互作用するリピート－アンチ－リピートステムループを含み、
    各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列のｉＢＡＲ配列は、リピート－アンチ－リピートステムループのループ領域に位置して、
    各ｉＢＡＲ配列が１～５０ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセット。
  2. 前記Ｃａｓ蛋白質がＣａｓ９である、請求項１に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセット。
  3. 各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の第２の配列は、ステムループ１、ステムループ２および／またはステムループ３をさらに含む、請求項１または２に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセット。
  4. 各ガイド配列が１７～２３ヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセット。
  5. 各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体がプラスミドである、請求項１～４のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセット。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーであって、各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的なガイド配列に対応する、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー。
  7. 請求項１～５のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の複数のセットを含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを調製する方法であって、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体の各セットは、異なる標的ゲノム遺伝子座に相補的な複数のガイド配列の１つに対応し、前記方法は、
    ａ）各ガイド配列に対して３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を設計すること、及び ｂ）各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体を合成し、それによってｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを生成することを含み、
    ａ）において、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体は、対応するガイド配列及びｉＢＡＲ配列を含むｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を有するｓｇＲＮＡｉＢＡＲを含むかまたはコードし、ここで、３つ以上のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のそれぞれに対応するｉＢＡＲ配列は互いに異なり、各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲは、対応する標的ゲノム遺伝子座を修飾するようにＣａｓ９蛋白質と協力可能である、方法。
  8. 請求項１～５のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体のセット、または請求項６に記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーを含む、組成物。
  9. 細胞の表現型を調節するゲノム遺伝子座をスクリーニングする方法であって、
    ａ）修飾された細胞集団を提供するようにｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体およびＣａｓ成分の細胞への導入を可能にする条件下で、初期細胞集団を請求項６記載のｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリー、および、Ｃａｓ蛋白質、またはＣａｓ蛋白質をコードする核酸を含むＣａｓ成分と接触させること、
    ｂ）調節された表現型を有する細胞集団を修飾された細胞集団から選択して、選択された細胞集団を提供すること、
    ｃ）選択された細胞集団からｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列を取得すること、
    ｄ）配列カウントに基づいてｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列の対応するガイド配列をランク付けること（ここで、前記ランク付けは、前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列中のガイド配列に対応するｉＢＡＲ配列間のデータ一貫性に基づいて各ガイド配列のランクを調整することを含む）、及び
    ｅ）所定の閾値レベルより上にランク付けられたガイド配列に対するゲノム遺伝子座を同定すること
    を含む、方法。
  10. 前記ｃ）において、選択された細胞集団から取得される前記ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ配列が、ゲノムシーケンシングまたはＲＮＡシーケンシングによって得られる、請求項９に記載の方法。
  11. 各ｓｇＲＮＡｉＢＡＲ構築体がウイルスベクターであり、ｓｇＲＮＡｉＢＡＲライブラリーが２を超える感染多重度（ＭＯＩ）で初期細胞集団と接触する、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記表現型が、細胞死、細胞増殖、細胞運動性、細胞代謝、薬剤耐性、薬剤感受性、及び刺激因子に対する応答からなる群より選択される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記表現型は、刺激因子に対する応答であり、前記刺激因子が、ホルモン、成長因子、炎症性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、薬剤、毒素、及び転写因子からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019024081A1 (zh) 2017-08-04 2019-02-07 北京大学 特异性识别甲基化修饰dna碱基的tale rvd及其应用
US11624077B2 (en) 2017-08-08 2023-04-11 Peking University Gene knockout method
TW202039845A (zh) * 2018-12-20 2020-11-01 北京大學 使用加標籤的嚮導rna構建體進行高效基因篩選的組合物和方法
PE20212214A1 (es) 2019-04-15 2021-11-19 Edigene Inc Metodos y composiciones para editar acidos ribonucleicos (arn)
EP3997229A1 (en) 2019-07-12 2022-05-18 Peking University Targeted rna editing by leveraging endogenous adar using engineered rnas
WO2022143783A1 (en) * 2020-12-29 2022-07-07 Edigene Therapeutics (Beijing) Inc. Methods of identifying t-cell modulating genes
TW202317523A (zh) * 2021-07-12 2023-05-01 大陸商北京輯因醫療科技有限公司 結直腸癌治療的生物標記
WO2023078347A1 (zh) * 2021-11-03 2023-05-11 南京金斯瑞生物科技有限公司 检测环境中sgRNA的残留量的引物、试剂盒及方法
WO2023109875A1 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 Edigene Therapeutics (Beijing) Inc. Biomarkers for colorectal cancer treatment
WO2023125787A1 (en) * 2021-12-31 2023-07-06 Edigene Therapeutics (Beijing) Inc. Biomarkers for colorectal cancer treatment
WO2023125788A1 (en) * 2021-12-31 2023-07-06 Edigene Therapeutics (Beijing) Inc. Biomarkers for colorectal cancer treatment
WO2024020111A1 (en) * 2022-07-20 2024-01-25 Syntax Bio, Inc. Systems for cell programming and methods thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017530695A (ja) 2014-08-19 2017-10-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸をプロービングおよびマッピングするためのｒｎａ誘導型システム
JP2017534285A (ja) 2014-10-31 2017-11-24 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｃｒｉｓｐｒについての超並列コンビナトリアル遺伝学
JP2018534114A5 (ja) 2016-11-14 2019-12-19

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3011029T3 (da) * 2013-06-17 2020-03-16 Broad Inst Inc Administration, modificering og optimering af tandem-guidesystemer, fremgangsmåder og sammensætninger til sekvensmanipulering
US9546384B2 (en) * 2013-12-11 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a mouse genome
AU2015219167A1 (en) * 2014-02-18 2016-09-08 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
WO2016094874A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
US11046952B2 (en) * 2015-03-16 2021-06-29 The Broad Institute, Inc. Encoding of DNA vector identity via iterative hybridization detection of a barcode transcript
WO2016205745A2 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
EP3374502B1 (en) * 2015-11-13 2021-10-27 Avellino Lab USA, Inc. Methods for the treatment of corneal dystrophies
US10767175B2 (en) * 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
CN107513538A (zh) * 2016-06-17 2017-12-26 北京大学 基因敲除方法
WO2018005691A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 The Regents Of The University Of California Efficient genetic screening method
EP3512943B1 (en) * 2016-09-14 2023-04-12 Yeda Research and Development Co. Ltd. Crisp-seq, an integrated method for massively parallel single cell rna-seq and crispr pooled screens
CN106637421B (zh) * 2016-10-28 2019-12-27 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 双sgRNA文库的构建及其应用于高通量功能性筛选研究的方法
GB201702847D0 (en) * 2017-02-22 2017-04-05 Cancer Res Tech Ltd Cell labelling, tracking and retrieval
CN107090466B (zh) * 2017-04-20 2020-02-28 清华大学 双sgRNA表达质粒及其文库的构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017530695A (ja) 2014-08-19 2017-10-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸をプロービングおよびマッピングするためのｒｎａ誘導型システム
JP2017534285A (ja) 2014-10-31 2017-11-24 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｃｒｉｓｐｒについての超並列コンビナトリアル遺伝学
JP2018534114A5 (ja) 2016-11-14 2019-12-19

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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