JP7244885B2 - 機能的なＩｎｃＲＮＡをスクリーニングおよび同定するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、真核細胞のゲノム中のスプライス部位を標的とすることで長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）に対して遺伝子干渉を行い、これによって機能的なＩｎｃＲＮＡをスクリーニングおよび同定することに関する。

強力なゲノム編集ツールとして、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、大規模なスクリーニングを通す遺伝子機能の同定に使用されている（非特許文献１－４）。ゲノムスケールでさえ、遺伝子干渉はほとんどエクソン内で生成されたフレームシフト突然変異によって達成される。ヒトゲノムの約２％のタンパク質コード遺伝子を除いて、残りの大量な転写物が非コードＲＮＡであることはより多くの証拠によって示されている（非特許文献５）。その中で、＞２００ヌクレオチドのＩｎｃＲＮＡは、明らかなタンパク質コーディングの可能性のない遺伝子の大きなサブセットを表す（非特許文献６－７）。以前の研究では、ヒトＩｎｃＲＮＡの総数がタンパク質をコードする遺伝子の総数を超えており、その数が増加し続けていることは示されている（非特許文献８）。

ＩｎｃＲＮＡは、転写または転写後のレベルで、遺伝子発現をシスまたはトランスに調節することにより、様々な細胞プロセスで重要な役割を果たす（非特許文献９）。ヒトゲノムの何万もの遺伝子座は長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）をコードするものとしてラベル付けられているが、主にスケーラブルな遺伝子機能喪失法がないため、それらの機能はほとんど知られていない。一般的に、ＩｎｃＲＮＡはリーディングフレームの変化に敏感ではないため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して従来の方法でその発現を破壊することは困難であり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを大規模に適用してその発現を破壊することはさらに困難である。前には、ＩｎｃＲＮＡの機能喪失スクリーニング（非特許文献９）のためにｐｇＲＮＡライブラリーを介して欠失戦略を開発したが、そのスケールアップは面倒であった。ＲＮＡ干渉（非特許文献１０、１１）またはＣＲＩＳＰＲｉ（非特許文献１２）に基づくスクリーニングがＩｎｃＲＮＡ機能の同定に効果的であることは研究によって証明されているが、ＲＮＡｉ方法には潜在的なオフターゲット問題があり（非特許文献１３）、両方の方法も転写ノックダウンの有効性によって制限される。そのため、機能的な長鎖ノンコーディングＲＮＡをスクリーニングおよび同定する、およびノンコーディングＲＮＡの機能を大規模に干渉する効果的な方法が必要である。

Ｓｈａｌｅｍ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３， ８４－８７ （２０１４）． Ｗａｎｇ， Ｔ．， Ｗｅｉ， Ｊ． Ｊ．， Ｓａｂａｔｉｎｉ， Ｄ． Ｍ． ＆ Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ． Ｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３， ８０－８４ （２０１４）． Ｋｏｉｋｅ－Ｙｕｓａ， Ｈ．， Ｌｉ， Ｙ．， Ｔａｎ， Ｅ． Ｐ．， Ｖｅｌａｓｃｏ－Ｈｅｒｒｅｒａ Ｍｄｅｌ， Ｃ． ＆ Ｙｕｓａ， Ｋ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ＣＲＩＳＰＲ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２， ２６７－２７３ （２０１４）． Ｚｈｏｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５０９， ４８７－４９１ （２０１４）． Ｅｚｋｕｒｄｉａ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｓｔｒａｎｄｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｍａｙ ｂｅ ａｓ ｆｅｗ ａｓ １９，０００ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２３， ５８６６－５８７８ （２０１４）． Ｒｉｎｎ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｃｈａｎｇ， Ｈ． Ｙ． Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８１， １４５－１６６ （２０１２）． Ｑｕｉｎｎ， Ｊ． Ｊ． ＆ Ｃｈａｎｇ， Ｈ． Ｙ． Ｕｎｉｑｕｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １７， ４７－６２ （２０１６）． Ｋｒｅｔｚ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ＴＩＮＣＲ． Ｎａｔｕｒｅ ４９３， ２３１－２３５ （２０１３）． Ｚｈｕ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｉｒｅｄ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｌｉｂｒａｒｙ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４， １２７９－１２８６ （２０１６）． Ｇｕｔｔｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ｌｉｎｃＲＮＡｓ ａｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４７７， ２９５－３００ （２０１１）． Ｌｉｎ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ＴＵＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５３， １００５－１０１９ （２０１４）． Ｌｉｕ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ＣＲＩＳＰＲｉ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｌｏｃｉ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５ （２０１７）． Ａｄａｍｓｏｎ， Ｂ．， Ｓｍｏｇｏｒｚｅｗｓｋａ， Ａ．， Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ， Ｆ． Ｄ．， Ｋｉｎｇ， Ｒ． Ｗ． ＆ Ｅｌｌｅｄｇｅ， Ｓ． Ｊ． Ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＢＭＸ ａｓ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ－ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４， ３１８－３２８ （２０１２）． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）． Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （１９８７）． Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．， ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）： ＰＧＲ ２： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （１９９５）． Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ． ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， （１９８８）． Ｒ．Ｌ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ．， ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ （１９８７）． Ｇｏｅｄｄｅｌ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）． Ｓｅｅｄ， １９８７． Ｎａｔｕｒｅ ３２９： ８４０ （Ｓｅｅｄ， Ｂ． Ａｎ ＬＦＡ－３ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ２． Ｎａｔｕｒｅ （１９８７） ３２９： ８４０－８４２．） Ｋａｕｆｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８７． ＥＭＢＯ Ｊ． ６： １８７－ １９５ （Ｒａｎｄａｌ Ｊ， Ｋａｕｆｍａｎ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ （１９８７） ６： １８７－ １９５） Ｃｌａｎｃｙ， Ｓｕｚａｎｎｅ． ＲＮＡ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ： Ｉｎｔｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｘｏｎｓ ａｎｄ Ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ． １， ３１ （２００８）． Ｂｌａｃｋ， Ｄｏｕｇｌａｓ Ｌ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｐｒｅ－Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ７２： ２９１－３３６ （２００３）． Ｎｇ， Ｂｅｒｎａｒｄ； Ｙａｎｇ， Ｆａｎ； ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｕｎｔｏｌｅｒｉｚｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １１４： １４６３－７０（２００４）． Ｌｉｍ， ＫＨ； Ｆｅｒｒａｒｉｓ， Ｌ； ｅｔ ａｌ． Ｕｓｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １０８： １１０９３－１１０９８ （２０１１）． Ｗａｒｆ， ＭＢ； Ｂｅｒｇｌｕｎｄ， ＪＡ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ３５： １６９－１７８ （２０１０）． Ｗａｒｆ， ＭＢ； Ｂｅｒｇｌｕｎｄ， ＪＡ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ３５ （３）： １６９－１７８ （２０１０）． Ｒｅｎ， Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ａ Ｄｕａｌ－Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ５， ８８６５ （２０１５）． Ｗａｎｇ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０， １０９６－１１０１ （２０１５）． Ｌｉ， Ｂ． ＆ Ｄｅｗｅｙ， Ｃ． Ｎ． ＲＳＥＭ： ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ． ＢＭＣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １２， ３２３ （２０１１）． Ｌｅｎｇ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． ＥＢＳｅｑ： ａｎ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ Ｂａｙｅｓ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９， １０３５－１０４３ （２０１３）． Ｊｉａｏ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ＤＡＶＩＤ－ＷＳ： ａ ｓｔａｔｅｆｕｌ ｗｅｂ ｓｅｒｖｉｃｅ ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｇｅｎｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｓｔ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８， １８０５－１８０６ （２０１２）． Ｃｒｏｏｋｓ， Ｇ． Ｅ．， Ｈｏｎ， Ｇ．， Ｃｈａｎｄｏｎｉａ， Ｊ． Ｍ． ＆ Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｓ． Ｅ． ＷｅｂＬｏｇｏ： ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｏｇｏ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １４， １１８８－１１９０ （２００４）． Ｍａｔｌｉｎ， Ａ． Ｊ．， Ｃｌａｒｋ， Ｆ． ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｃ． Ｗ． Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ： ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｄｅ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６， ３８６－３９８ （２００５）． Ｔａｇｇａｒｔ， Ａ． Ｊ．， ＤｅＳｉｍｏｎｅ， Ａ． Ｍ．， Ｓｈｉｈ， Ｊ． Ｓ．， Ｆｉｌｌｏｕｘ， Ｍ． Ｅ． ＆ Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ， Ｗ． Ｇ． Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９， ７１９－７２１ （２０１２）． Ｈｓｕ， Ｐ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１， ８２７－８３２ （２０１３）． Ｘｕ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２５， １１４７－１１５７ （２０１５）． Ｈｅｉｄａｒｉ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｍａｐ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２４， １９０５－１９１７ （２０１４）． Ｍｕｌｌｅｒ， Ｒ． Ｙ．， Ｈａｍｍｏｎｄ， Ｍ． Ｃ．， Ｒｉｏ， Ｄ． Ｃ． ＆ Ｌｅｅ， Ｙ． Ｊ． Ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ ＥＮＣＯＤＥ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｉｅｒ １ ＧＭ１２８７８ ａｎｄ Ｋ５６２ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｔｅｃｈ ２６， １４２－１４９ （２０１５）． Ｊｏｕｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｌｎｃＲＮＡ ｌｏｃｕｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａ ｇｅｎｅ ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ． Ｎａｔｕｒｅ （２０１７）． Ｇｏｙａｌ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｇｅｎｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５， ｅ１２ （２０１７）．

本開示は特に、ゲノム領域の機能を研究するための方法、および調節機能を有するＩｎｃＲＮＡをスクリーニングおよび同定するための方法を提供する。これらの方法は、ここで提供される新しく開発されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをベースとしたライブラリースクリーニングに部分的に依存する。

一態様では、本発明の方法は、ＩｎｃＲＮＡスプライス部位周辺の特定のゲノム配列を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの能力を利用して、エクソンスキッピングまたはイントロン保持をＩｎｃＲＮＡに導入し、これにより、ＩｎｃＲＮＡ機能の干渉または排除を引き起こす。標的とされるゲノム部位は、具体的には、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）をコードするゲノム遺伝子のスプライス部位周辺のゲノム領域であり、この領域は、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－５０ｂｐ～＋７５ｂｐの領域にまたがり、より好ましくは、－３０ｂｐ～＋３０ｂｐの領域、もっとも好ましくは、前記長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－１０ｂｐ～＋１０ｂｐの領域にまたがる。標的とされるＩｎｃＲＮＡスプライス部位周辺の配列は切断され、宿主細胞中の細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムによって突然変異し、このような突然変異は、エクソンスキッピングおよび／またはイントロン保持を引き起こし、これによってＩｎｃＲＮＡの機能または活動を実質的に排除する。

本分野で既知のように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡを切断するためにガイドＲＮＡを必要とする。これらのガイドＲＮＡは、（１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムヌクレアーゼが配列特異的な方法でゲノム位置の異なる配列を標的とする１９～２１のヌクレオチドのスペーサー配列（ガイドＲＮＡ）と、（２）ガイドＲＮＡの間に位置し、ガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムヌクレアーゼに結合できるようにするヘアピン配列とで構成される。

本文で提供される方法は、プロモーターに操作可能に連結された、長鎖ノンコーディングＲＮＡのスプライス部位周辺のゲノム配列を標的とするガイド配列とヘアピン配列とを含むＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ構築体を宿主細胞に導入し、前記ゲノム配列を標的とする前記ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を前記宿主細胞において発現させることに係る。一つの実施形態では、前記ガイド配列は、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－５０ｂｐ～＋７５ｂｐの領域のゲノム配列を標的とし、より好ましくは、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－３０ｂｐ～＋３０ｂｐの領域、最も好ましくは、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－１０ｂｐ～＋１０ｂｐの領域のゲノム配列を標的とする。

場合によっては、前記方法は、前記長鎖ノンコーディングＲＮＡの機能プロファイルを決定することをさらに含む。ゲノム遺伝子（コーディング遺伝子またはノンコーディング遺伝子）の発現またはその遺伝子産物（コーディングタンパク質）の機能的活性は、ＩｎｃＲＮＡ調節機能の表現とすることができる。あるいは、レポーター遺伝子のコード配列をゲノムに挿入する（例えば、元のコード配列の代わりとする）ことができ、その発現またはその遺伝子産物の機能的活性の変化を、当該長鎖ノンコーディングＲＮＡの機能プロファイルの表現として使用することができる。場合によっては、レポーター遺伝子のコード配列は元のコード配列と融合し、しかも前記表現は、得られた融合タンパク質のｍＲＮＡまたはタンパク質発現または前記融合タンパク質の機能的活性である。

一態様では、本文に開示される方法は、例えば、細胞生存、細胞分裂、細胞代謝、アポトーシス、細胞サイクル、ヌクレオソームアセンブリ、シグナル伝達、多細胞生物の発達、免疫応答、細胞接着、血管新生などのＩｎｃＲＮＡを含む、転写以外の細胞プロセスにおけるＩｎｃＲＮＡをスクリーニングおよび同定することに使用することができる。一部の実施形態では、前記方法は、細胞生存、細胞分裂、細胞代謝、アポトーシス、細胞サイクル、ヌクレオソームアセンブリ、シグナル伝達、多細胞生物の発達、免疫応答、細胞接着、血管新生などからなる群より選択される細胞プロセスの変化を引き起こすＩｎｃＲＮＡを同定することに使用することができる。一部の実施形態では、前記方法は、機能の喪失または機能の獲得など、細胞の表現型の変化を引き起こすＩｎｃＲＮＡを同定することに使用することができる。一部の実施形態では、前記方法は、コード遺伝子および／または非コード遺伝子の転写の減少または増加を引き起こすＩｎｃＲＮＡを同定することに使用することができる。前記方法は、１つまたは複数のＩｎｃＲＮＡの効果を同時にまたは順次にまたは単独にまたは組み合わせて同定することに使用することができる。

例えば、細胞集団をＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡライブラリーでトランスフェクトする。前記ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、ＩｎｃＲＮＡのスプライス部位周辺のゲノム配列を標的とするガイドＲＮＡの異なる配列をそれぞれコードし、前記細胞において前記ガイドＲＮＡを発現させ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの存在下で、前記ガイドＲＮＡはＩｎｃＲＮＡのエクソンスキッピングおよび／またはイントロン保持を引き起こす。各細胞のＲＮＡプロファイルとトランスクリプトームは、例えば、単一細胞ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）テクノロジーを使用して分析できるが、これに限定されない。前記分析により、ＲＮＡ分子の種類と量を含む、ＲＮＡプロファイルに対する細胞ゲノム変異の影響が明らかになる。この方法は、エクソンスキッピングまたはイントロン保持を実現するガイドＲＮＡの特性（例えば、配列）を同定することに使用することができる。したがって、エクソンスキッピングまたはイントロン保持の効果は、単一細胞での実験を通して細胞トランスクリプトーム全体ですぐに観察できる。

よって、本文は、プロモーターに操作可能に連結された、長鎖ノンコーディングＲＮＡのスプライス部位周辺のゲノム配列を標的とするガイド配列とヘアピン配列とを含むＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ構築体を提供する。

一部の実施形態では、前記真核生物ゲノムはヒトゲノムであってもよいので、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド構築体はヒト細胞での使用を目的とすることができる。

前記ガイド配列の長さは、１９～２１ヌクレオチドであってもよい。前記ヘアピン配列の長さは、１００ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、６０ヌクレオチド未満、または約４０ヌクレオチドであってもよい。他の実施形態では、前記ヘアピン配列の長さは、約２０～６０ヌクレオチド長であってもよい。転写されると、前記ヘアピン配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに結合することができる。

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド構築体は実質的にはＤＮＡであり、転写されるとガイドＲＮＡを生成する。

本文はさらに、上記宿主細胞のいずれかを含む細胞集団を提供する。この宿主細胞集団は、同種または異種であってもよい。

一部の実施形態では、前記細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記細胞は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび／またはＣａｓ９ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む。

一部の実施形態では、レポータータンパク質またはレポータータンパク質を含む融合タンパク質のコード配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。

一部の実施形態では、前記宿主細胞が宿主細胞集団内にあり、各宿主細胞が独立してユニークなガイドＲＮＡ構築体を含む。

一部の実施形態では、各宿主細胞はユニークな機能的ガイドＲＮＡを発現し、当該ガイドＲＮＡの関与により、前記宿主細胞は前記集団内の他の宿主細胞と比較して異なるゲノム配列に変異する。

本願はさらに、ＩｎｃＲＮＡのスプライス部位周辺のゲノム配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡライブラリーを宿主細胞集団に導入することを含む、真核細胞ゲノムにおいて長鎖ノンコーディングＲＮＡをスクリーニングまたは同定するためのハイスループット方法を提供し、前記細胞集団の各宿主細胞は独立してユニークな機能的ガイドＲＮＡを含み、このユニークなガイドＲＮＡを発現し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの存在下で、標的とされるゲノム配列を切断して変異させ、これによってＩｎｃＲＮＡのエクソンスキッピングおよび／またはイントロン保持を引き起こす。

一部の実施形態では、前記ハイスループット方法は、細胞表現型の変化またはコード遺伝子または非コード遺伝子の発現の変化に対するＩｎｃＲＮＡの影響を同定することをさらに含む。一部の実施形態では、各宿主細胞はユニークなガイドＲＮＡを発現し、前記集団内の他の宿主細胞と比較して異なるゲノム配列に変異する。一部の実施形態では、前記コード遺伝子は前記細胞のゲノムに対して外因性または内因性である。一部の実施形態では、前記細胞表現型の変化は、機能の喪失または機能の獲得を含む。一部の実施形態では、前記コード遺伝子または非コード遺伝子の発現の変化は、コード遺伝子または非コード遺伝子の転写の増加または減少である。

本発明はさらに、本文に開示されたハイスループット方法によるＩｎｃＲＮＡのスクリーニングまたは同定を提供する。これらのＩｎｃＲＮＡは、ＸＸｂａｃ－Ｂ１３５Ｈ６．１５、ＲＰ１１－８４８Ｐ１．５、ＡＣ００５３３０．２、ＡＰ００１０６２．９、ＡＰ００５１３５．２、ＲＰ１１－８６７Ｇ２３．４、ＬＩＮＣ０１０４９、ＤＧＣＲ５、ＲＰ１１－５０９Ａ１７．３、ＣＴＢ－２５Ｊ１９．１、ＣＴＤ－２５１７Ｍ２２．１７、ＣＲＯＣＣＰ２、ＡＣ０１６６２９．８、ＣＴＣ－４９０Ｇ２３．４、ＲＰ１１－１１７Ｄ２２．１、ＡＣ０６７９６９．２、ＲＰ１１－２５１Ｍ１．１、ＡＣ００４４７１．９、ＡＣ００４４７１．１０、ＡＣ００２４７２．１１、ＲＰ１１－４２９Ｊ１７．７、ＲＰ１１－５６Ｎ１９．５、ＴＭＥＭ１９１Ａ、ＬＬ２２ＮＣ０３－１０２Ｄ１．１８、ＬＩＮＣ００４１０、ＬＬ２２ＮＣ０３－２３Ｃ６．１３、ＲＰ１１－８３Ｊ２１．３、ＲＰ１１－５４４Ａ１２．４、ＡＮＫＲＤ６２Ｐ１－ＰＡＲＰ４Ｐ３、ＣＴＤ－２０３１Ｐ１９．５、ＸＸｂａｃ－Ｂ４４４Ｐ２４．８、ＲＰ１１－４６４Ｆ９．２１、ＴＰＴＥＰ１、ＭＩＲ１７ＨＧ、およびＢＭＳ１Ｐ２０を含むが、これらに限定されず、細胞の成長または増殖を調節するために使用できる。

本発明はさらに、長鎖ノンコーディングＲＮＡの１つまたは複数のスプライス部位周辺の１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を標的とする１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを真核細胞に導入し、これによって前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、前記長鎖ノンコーディングＲＮＡの１つまたは複数のスプライス部位周辺の１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を標的とし、Ｃａｓタンパク質の存在下で前記１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を切断し、長鎖ノンコーディングＲＮＡのイントロン保持および／またはエクソンスキッピングをもたらし、これによって長鎖ノンコーディングＲＮＡの機能を干渉または排除することを含む、真核細胞における長鎖ノンコーディングＲＮＡの機能を干渉または排除するための方法を提供する。一部の実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－５０ｂｐ～＋７５ｂｐの領域のポリヌクレオチド配列を標的とする。一部の実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－３０ｂｐ～＋３０ｂｐの領域のポリヌクレオチド配列を標的とする。一部の実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－１０ｂｐ～＋１０ｂｐの領域のポリヌクレオチド配列を標的とする。一部の実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９またはＣｐｆｌである。一部の実施形態では、前記細胞への導入は、ウイルス粒子、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、カップリング、ナノ粒子、エクソソーム、微小胞、または遺伝子銃を含む送達システムによるものであり、好ましくは、レンチウイルス粒子を含む送達システムによるものである。

図１のａは、ヒトスプライス部位のゲノム配列特性と塩基特異性を示す図である。ｙ軸は、各遺伝子座の塩基の確率を示す。図１のｂは、スプライスドナー（ＳＤ）またはスプライスアクセプター（ＳＡ）部位周辺を標的とするｓｇＲＮＡによって引き起こされるイントロン保持またはエクソンスキッピングを示す模式図である。 この図は、必須リボソーム遺伝子のｓｇＲＮＡライブラリーのスクリーニングにおいて重複実験間の相関関係を示す。ＨｅＬａ細胞株（ａ）とＨｕｈ７．５細胞株（ｂ）の０日目のコントロールサンプル（Ｃｔｒｌ）と１５日目の実験サンプル（Ｅｘｐ）を含むスプライシングターゲティングライブラリーの正規化されたｓｇＲＮＡ読み取りカウントの散布図である。各サンプルの２つの重複実験間のＳｐｅａｒｍａｎ相関係数（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｃｏｒｒ．）も報告されている。 ＨｅＬａおよびＨｕｈ７．５細胞株のリボソーム遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡライブラリーのＣＲＩＳＰＲスクリーニングのディープシーケンス分析を示す図である。７９のリボソーム遺伝子の５’ＳＤ部位周辺の－５０ｂｐ～＋７５ｂｐの領域、および３’ＳＡ部位周辺の－７５ｂｐ～＋５０ｂｐの領域を標的とするように、ｓｇＲＮＡ飽和突然変異誘発ライブラリーを設計した。混合プラスミドライブラリーは、レンチウイルスによってＣａｓ９タンパク質を発現するＨｅＬａおよびＨｕｈ７．５細胞に形質導入された。示された各遺伝子座でのすべてのｓｇＲＮＡの損失を、正規化された読み取りカウントのｌоｇ_２（Ｅｘｐ：Ｃｔｒｌ）で計算し、黒いバーは各遺伝子座でのすべてのｓｇＲＮＡの平均倍数変化を表す。点線はスプライス部位の位置を示す。 スプライス部位の妨害を生成するｓｇＲＮＡターゲット領域の同定を示す図である。図４のａは、ＨｅＬａおよびＨｕｈ７．５細胞株中の各遺伝子座での高効率ｓｇＲＮＡの正規化を示す図である。データは、損失が４倍を超えるｓｇＲＮＡの数を示された遺伝子座で設計されたｓｇＲＮＡの総数で割ることによって計算された。図４のｂは、ＨｅＬａおよびＨｕｈ７．５細胞株におけるイントロン、５’ＳＤ部位およびエクソンを標的とする高効率ｓｇＲＮＡの比較を示す図である。各バーは、異なる領域で２倍または４倍を超える損失があるｓｇＲＮＡの割合を表す。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。図４のｃは、ＨｅＬａおよびＨｕｈ７．５細胞株におけるイントロン、３’ＳＡ部位およびエクソンを標的とする高効率ｓｇＲＮＡの比較を示す図である。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。 細胞の成長と増殖に必要なＩｎｃＲＮＡを同定するためのＣＲＩＳＰＲシステムの構築とゲノムスケールのスクリーニングを示す図である。図５のａは、ＣＲＩＳＰＲシステムの構築を示す図である。図５のｂは、ターゲットスプライシングｓｇＲＮＡライブラリーの構築、スクリーニング、およびデータ分析のフローを示す図である。図５のｃは、２つの独立した重複間のｓｇＲＮＡ倍数変化の散布図である。図５のｄは、非標的ｓｇＲＮＡ、必須遺伝子とＩｎｃＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡのｌоｇ_２（倍数変化）分布図である。各群の倍数変化を、ｔ検定によって非標的ｓｇＲＮＡと比較した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５のｅは、スプライシングターゲティングしたＣＲＩＳＰＲによってスクリーニングされたネガティブに選択されたＩｎｃＲＮＡのスクリーンスコアを示す図である。各ＩｎｃＲＮＡについて、すべてのターゲットｓｇＲＮＡの倍数変化をＷｉｌｃｏｘ検定によってネガティブコントロールｓｇＲＮＡと比較し、生成されたＰ値をネガティブコントロール遺伝子の帰無分布（ネガティブコントロールｓｇＲＮＡをランダムにサンプリングして得られた）によってさらに補正した。スクリーンスコアは、平均倍数変化と補正されたＰ値から計算された（方法部分参照）。トップ１０のＩｎｃＲＮＡとネガティブに選択された必須遺伝子はそれぞれラベル付けされた。 候補のＩｎｃＲＮＡ機能の検証を示す図である。図６のａ～ｃは、Ｋ５６２およびＧＭ１２８７８細胞の細胞増殖に対する示されたｓｇＲＮＡの影響を示し、これには、３つのコントロールｓｇＲＮＡ、非標的ｓｇＲＮＡ、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ、ＲＰＬ１８（細胞の成長に必須な遺伝子）のスプライス部位を標的とするｓｇＲＮＡ（ａ）と２つのネガティブに選択されたＩｎｃＲＮＡ（ｂ、ｃ）が含まれる。ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰマーカーを担持するｓｇＲＮＡのレンチウイルス発現ベクターをそれぞれＫ５６２とＧＭ１２８７８細胞に形質導入した。ＥＧＦＰ陽性細胞の割合を３日ごとにＦＡＣＳで測定し、ｓｇＲＮＡ感染細胞を示した。最初のＦＡＣＳ分析は、感染の３日後（０日目と表記）に開始し、続いて混合細胞を１２日間継代した。各サンプルの細胞増殖は、示された時点でのＥＧＦＰ陽性細胞の割合を０日目の割合で割ることによって決定された。データは、３つの生物学的重複実験の平均値と標準偏差として表される。アスタリスク（＊）は、ｔ検定を使用して計算されＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して補正された、アッセイの終了時（１２日目）のＡＡＶＳ１を標的とするｓｇＲＮＡと比較したＰ値を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。図６のｄは、ターゲットスプライシングの戦略を通じて、ＧＭ１２８７８細胞と比較して、Ｋ５６２細胞における最初の３５の候補ＩｎｃＲＮＡの細胞増殖を示す図である。前記最初の３５の候補ＩｎｃＲＮＡは、ＸＸｂａｃ－Ｂ１３５Ｈ６．１５、ＲＰ１１－８４８Ｐ１．５、ＡＣ００５３３０．２、ＡＰ００１０６２．９、ＡＰ００５１３５．２、ＲＰ１１－８６７Ｇ２３．４、ＬＩＮＣ０１０４９、ＤＧＣＲ５、ＲＰ１１－５０９Ａ１７．３、ＣＴＢ－２５Ｊ１９．１、ＣＴＤ－２５１７Ｍ２２．１７、ＣＲＯＣＣＰ２、ＡＣ０１６６２９．８、ＣＴＣ－４９０Ｇ２３．４、ＲＰ１１－１１７Ｄ２２．１、ＡＣ０６７９６９．２、ＲＰ１１－２５１Ｍ１．１、ＡＣ００４４７１．９、ＡＣ００４４７１．１０、ＡＣ００２４７２．１１、ＲＰ１１－４２９Ｊ１７．７、ＲＰ１１－５６Ｎ１９．５、ＴＭＥＭ１９１Ａ、ＬＬ２２ＮＣ０３－１０２Ｄ１．１８、ＬＩＮＣ００４１０、ＬＬ２２ＮＣ０３－２３Ｃ６．１３、ＲＰ１１－８３Ｊ２１．３、ＲＰ１１－５４４Ａ１２．４、ＡＮＫＲＤ６２Ｐ１－ＰＡＲＰ４Ｐ３、ＣＴＤ－２０３１Ｐ１９．５、ＸＸｂａｃ－Ｂ４４４Ｐ２４．８、ＲＰ１１－４６４Ｆ９．２１、ＴＰＴＥＰ１、ＭＩＲ１７ＨＧ、およびＢＭＳ１Ｐ２０である。しきい値は８０％に設定され、これは、１２日目のｓｇＲＮＡ感染細胞の正規化された割合である。明るい灰色の点は、Ｋ５６２細胞でのみ必要なＩｎｃＲＮＡを示し、暗い灰色の点は、Ｋ５６２とＧＭ１２８７８細胞の両方で成長表現型を示すものを示す。図６のｅは、Ｋ５６２細胞の細胞増殖に対するＩｎｃＲＮＡ ＸＸｂａｃ－Ｂ１３５Ｈ６．１５の大きな断片の欠失の影響を示す図である。プロモーターと最初のエクソンを削除するために４対のｇＲＮＡが設計された。ＥＧＦＰマーカーを含む骨格からもｐｇＲＮＡを発現させ、図３に従って細胞増殖試験を実施した（ａ～ｃ）。データは、３つの生物学的重複実験の平均値と標準偏差として表されている。アスタリスクは、ｔ検定を使用して計算されＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して補正された、１５日目のＡＡＶＳ１＿ｐ１と比較したＰ値を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。図６のｆは、スプライシングターゲティングとｐｇＲＮＡを介した欠失法の間の上位ＩｎｃＲＮＡ候補に対するノックアウト効果の相関を示す図である。 スプライシングターゲティング戦略を通して得られた最高ランキングのＩｎｃＲＮＡの検証証拠を提供する。 スプライシングターゲティング戦略を通して得られた最高ランキングのＩｎｃＲＮＡの検証証拠を提供する。 スプライシングターゲティング戦略を通して得られた最高ランキングのＩｎｃＲＮＡの検証証拠を提供する。 スプライシングターゲティング戦略を通して得られた最高ランキングのＩｎｃＲＮＡの検証証拠を提供する。 スプライシングターゲティング戦略を通して得られた最高ランキングのＩｎｃＲＮＡの検証証拠を提供する。 スプライシングターゲティング戦略を通して得られた最高ランキングのＩｎｃＲＮＡの検証証拠を提供する。 大きな断片の欠失による候補ＩｎｃＲＮＡの検証を提供する図である。図１３のａは、ＡＡＶＳ１遺伝子座と必須遺伝子ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２３Ａの大きな断片の欠失によるＫ５６２細胞の細胞増殖試験を示す図である。ＡＡＶＳ１遺伝子座について２対のｇＲＮＡが設計され、プロモーターと最初のエクソンを削除するために各必須遺伝子について１対のｇＲＮＡが設計された。ｐｇＲＮＡの設計原理と成長効果の測定方法は図３のｅで説明されたものと同じであり、残りの図もそれと同じである。データは、３つの生物学的重複実験の平均値と標準偏差として表されている。アスタリスクは、ｔ検定を使用して計算されＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して補正された、１５日目のＡＡＶＳ１＿ｐ１と比較したＰ値を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。図１３のｂは、５つの候補ＩｎｃＲＮＡの大きな断片の欠失による細胞成長への影響を、スプライシングターゲティング戦略を通して検証した図である。 この図は、大きな断片の欠失による候補ＩｎｃＲＮＡの検証を提供し、６つの候補ＩｎｃＲＮＡは、Ｋ５６２細胞でのスプライシングターゲティング戦略によって検証しなかった。 Ｋ５６２およびＧＭ１２８７８細胞株におけるＩｎｃＲＮＡｓ ＭＩＲ１７ＨＧおよびＢＭＳ１Ｐ２０の機能分析を示す図である。図１５のａでは、最初の５００遺伝子の発現パターンは、ＭＩＲ１７ＨＧ－およびＢＭＳ１Ｐ２０－ＫＯ（ノックアウト）細胞とそれらに対応するコントロールで最も高い変動性を示した。図１５のｂは、Ｋ５６２およびＧＭ１２８７８細胞における最初の１００の必須ＩｎｃＲＮＡ候補の発現レベルを示す図である。図１５のｃは、野生型Ｋ５６２細胞と比較してＭＩＲ１７ＨＧ－とＢＭＳ１Ｐ２０－ＫＯ細胞でダウンレギュレートされた必須遺伝子の発現レベルを示す図である。図１５のｄは、ＭＩＲ１７ＨＧ－とＢＭＳ１Ｐ２０－ＫＯ Ｋ５６２細胞の間の必須遺伝子のダウンレギュレーションを示すＶｅｅｎ図（Ｖｅｅｎ ｄｉａｇｒａｍ）である。図１５のｅは、ＧＭ１２８７８細胞と比較したＫ５６２細胞におけるＢＭＳ１Ｐ２０のスプライシングターゲティングｓｇＲＮＡの感染後の差次的発現の火山プロットである。黒と灰色の点は、それぞれすべての遺伝子と差次的に発現した遺伝子を表す。図１５のｆは、Ｋ５６２細胞でダウンレギュレート（上図）およびアップレギュレート（下図）された遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語およびＫＥＧＧ注釈である。 Ｋ５６２およびＧＭ１２８７８細胞におけるＭＩＲ１７ＨＧおよびＢＭＳ１Ｐ２０のＩｎｃＲＮＡノックアウトのＲＮＡ－ｓｅｑプロファイルを示す図である。図１６のａは、ＭＩＲ１７ＨＧ－ＫＯ（ノックアウト）、ＢＭＳ１Ｐ２０－ＫＯ、および野生型Ｋ５６２細胞の遺伝子発現レベルのペア散布図である。図１６のｂは、ＭＩＲ１７ＨＧノックアウト、ＢＭＳ１Ｐ２０ノックアウト、および野生型ＧＭ１２８７８細胞ｄ遺伝子発現レベルのペア散布図である。図１６のｃは、Ｋ５６２細胞でＭＩＲ１７ＨＧおよびＢＭＳ１Ｐ２０のスプライシングターゲティングｓｇＲＮＡに感染した後、ダウンレギュレーションを示す保存された必須遺伝子の遺伝子オントロジーおよびＫＥＧＧ注釈である。図１６のｄは、ＢＭＳ１Ｐ２０－ＫＯと野生型Ｋ５６２細胞間の差次的発現の火山プロットである。図１６のｅは、ＢＭＳ１Ｐ２０－ＫＯと野生型ＧＭ１２８７８細胞間の差次的発現の火山プロットである。

定義
本発明は、特定の実施形態に基づいて図面を参照して説明されるが、本発明はそれに限定されず、保護範囲は請求の範囲によって限定される。請求項の中の参照記号は、いずれも範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。図面では、説明のため、一部の要素のサイズが誇張されており、縮尺通りに描かれていない場合がある。本明細書および請求の範囲において「含む」という用語が使用される場合、その他の要素またはステップを除外しない。単数の名詞を言及する時に「１つ」、「一種」または「これ」、「この」などのような表現が使用されるが、特に明記しない限り、これらの表現には当該名詞の複数形も含まれる。

本発明はまた、本発明を理解するように以下の用語または定義を提供する。本文で特に定義しない限り、本文で使用されるすべての用語は、本発明の技術分野の当業者にとっての意味と同じ意味を有する。本分野におけるこれらの定義と用語について、具体的な実践者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照することができる。本文で提供される定義は、当業者が理解する範囲よりも狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、置き換えて使用することができる。これは、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体であってもよい。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を実行することができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子または遺伝子フラグメントのコードまたは非コード領域、遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離された任意の配列のＤＮＡ、単離された任意の配列のＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立の前または後に与えることができる。非ヌクレオチド成分をヌクレオチドの配列に挿入することができる。ポリヌクレオチドは、標識成分とのカップリングなどによって、多量体化後にさらに修飾することができる。

本発明の一態様では、「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、および「合成ガイドＲＮＡ」という用語は置き換えて使用することができ、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、およびｔｒａｃｒシャペロン配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「ガイド配列」という用語は、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指し、「ガイド」または「スペーサー」という用語と置き換えて使用することができる。

本文で使用されるように、「発現」とは、ＤＮＡテンプレートからのポリヌクレオチド転写（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物になるなど）のプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後に、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へ翻訳されるプロセスをいう。転写物およびコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子生成物」と呼ばれることができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。

特に明記しない限り、本発明の実施は、本技術分野の技術的範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉоｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）：ＰＧＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８） ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｌ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））（非特許文献１４－１８）を参照。

本発明のいくつかの態様は、１つまたは複数のベクターを含むベクターシステム、またはその中のベクターに係る。原核または真核細胞でＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）を発現するようにベクターを設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞などで発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）（非特許文献１９）にも詳しく記載されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳することができる。

一部の実施形態では、哺乳動物発現ベクターを使用し、ベクターは哺乳動物細胞における１つまたは複数の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８（非特許文献２０）とｐＭＴ２ＰＣ（非特許文献２１）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの調節機能は、主に１つまたは複数の調節要素によって提供される。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、および本文に開示され、本分野で知られている他のプロモーターに由来する。原核細胞と真核細胞の両方に使用される他の適切な発現システムについて、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（非特許文献１４）の１６と１７章を参照できる。

一般的に言えば、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の転写物、およびＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子の発現に参与する、またはその活動をガイドする他の要素をまとめて指し、これは、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性化部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－シャペロン配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの背景で「直接リピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡ－処理された部分直接リピートをカバーする）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの背景で「スペーサー」とも呼ばれる）またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する他の配列と転写物を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数の要素は、タイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。

ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する背景において、「標的配列」は、ガイド配列がそれに相補的になるように設計された配列であり、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性を持っている場合、完全な相補は必要ではない。

典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの背景において、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ガイド配列と標的配列がハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合することを含む）により、標的配列中または標的配列の近く（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０またはそれ以上の塩基対の範囲内）の１つの鎖または２つの鎖の切断が引き起こされる。理論に拘束されるつもりはなく、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０以上、２３以上、２６以上、２９以上、３２以上、３５以上、３８以上、４１以上、４４以上、４７以上、５０以上、５３以上、５６以上、５９以上、６２以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、またはそれ以上のヌクレオチド）、または上記からなるｔｒａｃｒ配列を含むことができ、さらにＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成することができ、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に操作可能に連結されたｔｒａｃｒシャペロン配列の全部または一部とハイブリダイズする。

一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒシャペロン配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に参加するのに十分な相補性を有する。標的配列と同様に、その機能を発揮するのに十分である限り、完全な相補は必要ではない。一部の実施形態では、最適なアラインメントの場合、ｔｒａｃｒ配列はｔｒａｃｒシャペロン配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の相補性を有する。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数の要素の発現を駆動する１つまたは複数のベクターを宿主細胞に導入して、ＣＲＩＳＰＲシステム要素の発現は、１つまたは複数の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成をガイドする。別の実施形態では、宿主細胞は、Ｃａｓ９および／またはＯＣＴ１を安定して発現するように操作される。

一般的に言えば、ガイド配列は、標的配列にハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合をガイドするように標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを行う場合、ガイド配列およびそれに対応する標的配列間の相補程度は約５０％以上、６０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７．５％以上、９９％以上またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定でき、その非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づいたアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｉ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅｔ．ｎｅｔで入手可能）などが挙げられる。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約５以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約７５未満、７０未満、６５未満、６０未満、５５未満、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１２未満、またはそれより少ないヌクレオチドであってもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列の配列特異的結合をガイドするガイド配列の能力は、任意の適切な測定方法により評価することができる。例えば、対応する標的配列を有する宿主細胞に、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するには十分なＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネント（テストされるガイド配列を含む）を提供してもよく、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列コンポーネントをコードするベクターを使用してトランスフェクションし、そして標的配列内の優先的な切断（例えば、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒにより測定する）を評価することで行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管内で、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体（テストされるガイド配列と、ガイド配列と異なる対照ガイド配列とを含む）のコンポーネントを提供し、標的配列へのテストと対照ガイド配列の結合または切断率を比較して評価することができる。当業者が想到できる他の試験も使用可能である。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部である（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素以外の約１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上のドメイン）。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および選択されてもよい、任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素と融合できるタンパク質ドメインの例には、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写阻害活性、転写放出因子活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性からなる群より選ばれる１つまたは複数の活性を有するタンパク質ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの局面において、本発明は、本文に記載されるベクターを含む１つまたは複数の構築体、その１つまたは複数の転写物、および／またはそれにより転写される１つまたは複数のタンパク質のような１つまたは複数のポリヌクレオチドを宿主に送達することを含む方法を提供する。本発明は、ＤＮＡベースのゲノムの標的修飾のための基本的なプラットフォームとして使用することができ、ウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびカップリングを含むが、これらに限定されない任意の送達システムと組み合わせて使用できる。いくつかの局面において、本発明はさらに、このような方法によって生成された細胞、およびこれらの細胞を含むまたはこれらの細胞によって生成された生物（動物、植物、または真菌など）を提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わされた（およびそれと複合されていてもよい）ＣＲＩＳＰＲ酵素を細胞に送達する。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子転移法を使用して、核酸を哺乳動物細胞または標的組織に導入することができる。このような方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネントをコードする核酸を培地または宿主生物の細胞に投与するために使用することができる。非ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本文に記載のベクター転写物）、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ベクターと複合した核酸を含む。ウイルスベクター送達システムは、細胞に送達するためのエピソームまたは組み込まれたゲノムを有するＤＮＡとＲＮＡウイルスを含む。

核酸の非ウイルス送達法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ウイルス粒子、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡおよび人口ウイルス粒子を含む。

ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムを使用して核酸を送達することは、生体の特定の細胞を標的とし、ウイルス負荷を核に輸送するという効率的な利点を持っている。

好ましい実施形態では、本発明の標的は、２００ヌクレオチドを超える長さのＲＮＡ分子などの、長い転写されたＲＮＡ分子のクラスを代表する長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）を含む。そのサイズにより、ＩｎｃＲＮＡは、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短い干渉（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体ＲＮＡ（ｓｎоＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびその他の短いＲＮＡのような小さい調節ＲＮＡと区別付けられる。ＩｎｃＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するか、タンパク質に結合することによって配列特異的な方法で機能を発揮することができる。ｍｉＲＮＡと相反に、ＩｎｃＲＮＡは通常の作用モードで機能しないように見えるが、様々な方法で遺伝子発現とタンパク質合成を調節することができる。

タンパク質をコードする遺伝子に対する位置に基づいて、ＩｎｃＲＮＡを以下の遺伝子座バイオタイプに分類できる。すなわち、２本の鎖から遺伝的に転写される遺伝子間ＩｎｃＲＮＡ；完全にタンパク質コード遺伝子のイントロンにより転写されるイントロンＩｎｃＲＮＡ；タンパク質コード遺伝子のセンス鎖から転写され、タンパク質コード遺伝子の一部と重複する、またはイントロンを介してタンパク質コード遺伝子の配列全体をカバーするタンパク質コード遺伝子からのエクソンを含むセンスＩｎｃＲＮＡ；および、エクソンまたはイントロン領域と重複するタンパク質コード遺伝子のアンチセンス鎖から転写される、またはイントロンを介してタンパク質コード配列全体をカバーするアンチセンスＩｎｃＲＮＡに分類できる。ヒトトランスクリプトーム分析の最近の研究は、タンパク質コード配列がゲノム転写物のごく一部しか占めていないことを示している。ほとんどのヒトゲノム転写物は非コードＲＮＡである。

「ＩｎｃＲＮＡ」という用語は、広義に本発明の標的を指し、「ＩｎｃＲＮＡ遺伝子」およびそれによって生成される「ＩｎｃＲＮＡ転写物」を含む。

本文で使用されるように、「エクソン」という用語は、最終的な成熟ＲＮＡ（ＲＮＡスプライシングによってイントロンが除去された後の遺伝子から生成される）の一部をコードする遺伝子の任意の部分を指す。エクソンという用語は、遺伝子内のＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写物内の対応する配列を指す。ＲＮＡスプライシングでは、イントロンが除去され、エクソンは、成熟したメッセンジャーＲＮＡの一部として互いに共有結合している。

「イントロン」は、最終的なＲＮＡ生成物の成熟過程中にＲＮＡスプライシングによって除去される遺伝子内の任意のヌクレオチド配列である。イントロンという用語は、遺伝子内のＤＮＡ配列とＲＮＡ転写物内の対応する配列を指す。ＲＮＡスプライシング後、配列は最終的な成熟ＲＮＡにおいて結合される。イントロンは、ほとんどの生物や複数のウイルスの遺伝子に見られ、タンパク質、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）、および転送ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を生成する遺伝子など、複数の遺伝子に存在することができる。イントロンを含む遺伝子からタンパク質を生成する場合、ＲＮＡスプライシングは転写後および翻訳前のＲＮＡ加工経路の一部である。

本文で使用される「スプライシング」という用語は、新生前駆体ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）を成熟ＲＮＡに編集すること、例えば、新生前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）転写物を成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に編集することを意味する。ほとんどの真核生物のイントロンでは、スプライシングは、スプライスソーム（核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）の複合体）によって触媒される一連の反応で実行される。スプライスソームイントロンは通常、真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の配列内にある。イントロン内では、スプライシングに必要なのは、ドナー部位（イントロンの５’末端）、分岐部位（イントロンの３’末端の近く）、およびアクセプター部位（イントロンの３’末端）である。より大きく、高度に保存されていない領域内では、スプライスドナー（ＳＤ）部位は、イントロン５’末端にほとんど変更しない配列ＧＴを含む。イントロン３’末端のスプライスアクセプター（ＳＡ）部位は、ほとんど変更しないＡＧ配列でイントロンを終止する。ＡＧの上流（５’方向）にピリミジン（ＣとＴ）またはポリピリミジントラクトが豊富な領域がある。ポリピリミジントラクトのさらなる上流には分岐点があり、ラリアート形成に関与するアデニンヌクレオチドを含む（非特許文献２２、２３）。

核ｐｒｅ－ｍＲＮＡイントロンは、イントロンとエクソンの境界に位置する特定のイントロン配列を特徴とする。スプライシング反応が始まると、これらの配列はスプライスソームＲＮＡ分子によって認識される。ほとんどのスプライスソームは、５’スプライス部位においてＧＴを含み、３’スプライス部位においてＡＧを含むイントロンをスプライシングし、このようなスプライシングは、古典的なスプライシングまたはラリアート経路と呼ばれ、９９％以上のスプライシングはこのようなものである。対照的に、イントロン隣接配列がＧＴ－ＡＧ規則に従わない場合、非古典的なスプライシングが発生し、スプライシングの１％未満を占めると言われる（非特許文献２４）。

Ｗｅｂｌｏｇｏ３ツールを使用したバイオインフォマティクス分析では、ヒトゲノムの中の約９９％のイントロン領域が５’部位でＧＴに隣接し、３’部位でＡＧに隣接していることは示されている。これらのイントロン領域は、コード遺伝子と非コードＲＮＡに適する。

エクソンスキッピングは、最終ＲＮＡが１つまたは複数のエクソンを「スキップ」することを引き起こすＲＮＡスプライシングの形式である。一方、イントロン保持は、スプライシング後にイントロンが最終ＲＮＡに残るＲＮＡスプライシングの形式である。

スプライシングは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ上のトランス作用性タンパク質（リプレッサーおよび活性化タンパク質）および対応するシス作用性調節部位（サイレンサーおよびエンハンサー）によって調節される。ただし、代替スプライシングの複雑さの一部として、スプライシング因子の影響はしばしば位置に依存することに注意されたい。つまり、エクソンの背景では、イントロンエンハンサー要素と組み合わせると、スプライシング活性化タンパク質として機能するスプライシング因子は、そのスプライシング要素と組み合わせる時にリプレッサータンパク質として機能でき、その逆も成立する（非特許文献２５）。ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の二次構造は、スプライシング要素をまとめたり、マスクされないとスプライシング因子の結合要素として機能する配列をマスクしたりすることで、スプライシングを調節する役割を果たす（非特許文献２６）。総じて、これらの要素は、異なる細胞条件下でスプライシングがどのように発生するかを制御する「スプライシングコード」を形成する。

真核細胞における遺伝子の修飾
本発明の方法は、スプライス部位を標的とするｓｇＲＮＡを効果的に送達してエクソンスキッピングおよび／またはイントロン保持を引き起こすことで、コード遺伝子または非コード遺伝子のような遺伝子を干渉することに係る。ＩｎｃＲＮＡをコードする遺伝子の場合、この方法はＩｎｃＲＮＡの機能に効果的に影響を与えることができる。

ＣＲＩＳＰＲスクリーニングにおけるスプライシングターゲティングの有効性を評価するために、７９のリボソーム遺伝子のスプライス部位を標的とする飽和ライブラリーを設計した。これらの遺伝子のほとんどは、様々な細胞株での細胞増殖に必要である。このライブラリーは５，７８８のｓｇＲＮＡを含み、その切断部位は、これら７９の遺伝子の各５’ＳＤ（スプライスドナー）部位周辺の５０ｂｐ～＋７５ｂｐ、および各３’ＳＡ（スプライスアクセプター）部位周辺の５０ｂｐ～＋７５ｂｐの範囲内にある。明らかに、スプライス部位に影響を与えるｓｇＲＮＡは、エクソン領域のみを標的とするｓｇＲＮＡより優れており、ｓｇＲＮＡ切断部位からスプライス部位までの距離が近いほど、遺伝子破壊の効果が高くなり、ＳＤとＳＡの場合、ピークポイントは少しエクソンに向かっている。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の作用メカニズムとライブラリースクリーニングの原則
本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用する。Ｃａｓ９は、微生物由来のタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）システムであり、単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とペアになった時ＤＮＡを切断することが示されている。ｇＲＮＡは１７～２１ｂｐの配列を含み、Ｃａｓ９をゲノム内の相補領域へガイドするので、二本鎖切断（ＤＳＢ）部位を特異的に生成することが可能になり、細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムによってエラーが発生しやすい方法で修復される。Ｃａｓ９は主に、ｇＲＮＡ配列の後にＰＡＭ配列（－ＮＧＧ）であるゲノム部位を切断する。ＮＨＥＪを介したＣａｓ９誘導ＤＳＢの修復は、切断部位に様々な異なる変異を誘導し、前記切断部位は通常、より小さい（＜１０ｂｐ）挿入／削除（ｉｎｄｅｌ）であるが、より大きい（＞１００ｂｐ）挿入／削除（ｉｎｄｅｌ）および単一の塩基変化を含むこともできる。

本発明のスプライシングターゲティング法は、ゲノム内の複数の（例えば、数千の）配列のスクリーニングに使用でき、それにより、これらの配列の機能を解明する。一部の実施形態では、本発明のスプライシングターゲティング法は、生存、増殖、または薬剤耐性に必要な遺伝子を同定するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して長鎖非コードＲＮＡのハイスループットスクリーニングを含む。スクリーニングでは、例えば、レンチウイルスベクターを通じて、標的遺伝子内の数万のスプライス部位を標的とするｇＲＮＡを集合としてＣａｓ９とともにターゲット細胞に送達する。予期の表現型を選択した後、細胞内で濃縮され、または枯渇しているｇＲＮＡを特定することにより、当該表現型に必要な遺伝子を体系的に特定することができる。

上記のハイスループットＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づいた方法では、ｇＲＮＡライブラリーをレンチウイルスベクターにクローンすることができる。この場合、感染多重度（ＭＯＩ）を減らすことで単一細胞内のガイドＲＮＡの数を制限する必要がある。通常、各細胞には単一のガイドＲＮＡしかない。各細胞へのｇＲＮＡの組み込むはランダムであり、各細胞が１つのｇＲＮＡのみを発現するプールされたスクリーニング（ｐｏｏｌｅｄ ｓｃｒｅｅｎ）が可能になる。なお、本発明のスプライス部位を標的とするｇＲＮＡベースのゲノムハイスループットスクリーニングは、コード遺伝子および調節遺伝子の他のＣＲＩＳＰＲベースのハイスループットスクリーニングにも使用できる。

ガイドＲＮＡ
本分野で知られているように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムヌクレアーゼは、ＲＮＡをガイドしてゲノムＤＮＡを切断する必要がある。これらのガイドＲＮＡは、（１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムヌクレアーゼを配列特異的にゲノム部位を標的とする、可変配列（ガイド配列）の１９～２１ヌクレオチドスペーサー（ガイド）と、（２）ガイドＲＮＡ間で恒常であり、ガイドＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムヌクレアーゼとの結合を可能にする不変のヘアピン配列とから構成される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの存在下で、ガイドＲＮＡは、細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのゲノム切断イベントをトリガーする。

ガイド配列は、予期の標的配列に基づいて選択または設計される。一部の実施形態では、前記標的配列は、スプライス部位周辺の配列であり、例えば、細胞ゲノム中のＩｎｃＲＮＡをコードする遺伝子のＳＤ部位周辺の－５０ｂｐ～＋７５ｂｐの領域、好ましくはＳＤ部位周辺の－３０ｂｐ～＋３０ｂｐの領域、最も好ましくはＳＤ部位周辺の－１０ｂｐ～＋１０ｂｐの領域；ＳＡ部位周辺の－５０ｂｐ～＋７５ｂｐの領域、好ましくはＳＡ部位周辺の－３０ｂｐ～＋３０ｂｐの領域、最も好ましくはＳＡ部位周辺の－１０ｂｐ～＋１０ｂｐの領域である。例示的な標的配列は、標的ゲノムに特有の配列を含む。

例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合、ゲノム内の特有の標的配列は、Ｍ８Ｎ１２ＸＧＧの形式のＣａｓ９標的部位を含むことができ、ここで、Ｎ１２ＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意の１つであってもよい）はゲノムには単一に発生する頻度（単一の発生率）を有する。ゲノム内の特有の標的配列は、Ｍ９Ｎ１１ＸＧＧの形式の化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、ここで、Ｎ１１ＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意の１つである）はゲノムには単一に発生する頻度を有する。

好熱連鎖球菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９の場合、ゲノム内の特有の標的配列は、Ｍ８Ｎ１２ＸＸＡＧＡＡＷの形式のＣａｓ標的部位を含むことができ、ここで、Ｎ１２ＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意の１つであってもよく、ＷはＡまたはＴである）はゲノムには単一に発生する頻度を有する。ゲノム内の特有の標的配列は、Ｍ９Ｎ１１ＸＸＡＧＡＡＷの形式の好熱連鎖球菌ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、ここで、Ｎ１２ＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意の１つであってもよく、ＷはＡまたはＴである）はゲノムには単一に発生する頻度を有する。

化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９の場合、ゲノム内の特有の標的配列は、Ｍ８Ｎ１２ＸＧＧＸＧの形式の標的部位を含むことができ、ここで、Ｎ１２ＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意の１つであってもよい）はゲノムには単一に発生する頻度を有する。ゲノム内の特有の標的配列は、Ｍ９Ｎ１１ＸＧＧＸＧの形式の化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、ここで、Ｎ１２ＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意の１つであってもよい）はゲノムには単一に発生する頻度を有する。これらの各配列では、「Ｍ」はＡ、Ｇ、ＴまたはＣであってもよく、配列を特有の配列として識別する時にそれを考慮する必要はない。

なお、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって認識及び結合できる限り、任意のヘアピン配列を使用できることを理解すべきである。

ガイドＲＮＡ構築体
一部の実施形態では、本発明は、ガイドＲＮＡ構築体に係る。前記ガイドＲＮＡ構築体は、（１）ガイド配列および（２）ガイドＲＮＡヘアピン配列、並びに選択されていてもよい（３）ガイドＲＮＡの転写を開始することができるプロモーター配列を含み得る。ガイドＲＮＡヘアピン配列の非限定的な例として、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｄｅｃ １９；１５５（７）：１４７９－９１に記載のＦＥヘアピン配列が挙げられる。プロモーターの例として、ヒトＵ６プロモーターが挙げられる。

一部の実施形態では、本発明は、（１）ガイド配列および（２）ガイドＲＮＡヘアピン配列、並びに選択されていてもよい（３）ガイドＲＮＡの転写を開始することができるプロモーター配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド構築体に係る。前記ガイド配列は、真核細胞ゲノムのスプライス部位周辺の配列を標的とし、例えば、前記ガイド配列は、ＩｎｃＲＮＡをコードする遺伝子のＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－５０ｂｐ～＋７５ｂｐの領域、好ましくはＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－３０ｂｐ～＋３０ｂｐの領域、最も好ましくはＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－１０ｂｐ～＋１０ｂｐの領域を標的とする。一部の実施形態では、ガイド配列は、エクソンスキッピングおよび／またはイントロン保持を誘導するように、真核細胞ゲノム内の長鎖ノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子のスプライス部位を標的とし、これによって長鎖ノンコーディングＲＮＡを破壊する。一部の実施形態では、前記真核細胞ゲノムはヒトゲノムである。一部の実施形態では、前記ガイド配列は長さが１９～２１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、前記ヘアピン配列は、長さが約４０ヌクレオチドであり、転写されると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに結合することができる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムヌクレアーゼ
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、肺炎連鎖球菌、化膿性連鎖球菌、または好熱連鎖球菌Ｃａｓ９であり、これらの生物に由来する変異Ｃａｓ９を含むことができる。前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９の機能的に同等の変異体であってもよい。一部の実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、真核細胞で発現するためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、標的配列の位置で１つまたは２つの鎖の切断を引き起こす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムヌクレアーゼは、Ｃａｓ９とＣｐｆｌを含むが、これらに限定されない。

レポーター遺伝子とタンパク質、および読み取り
一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓメカニズムを使用して細胞に組み込むことができる。例えば、プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）、ガイドＲＮＡヘアピン配列、および所望のゲノムの遺伝子座を標的とするガイド配列を含むプラスミドのような発現ベクターを使用可能であり、前記遺伝子座は、前記レポーター構築体に組み込まれる。このような発現ベクターは、ガイド配列を他の要素を含む発現構築体にクローニングすることによって調製することができる。レポータータンパク質コード配列を含むＤＮＡフラグメントを生成することができ、レポータータンパク質コード配列に隣接する相同性アームに含まれるようにその後に修飾される。ガイドＲＮＡ発現ベクター、レポータータンパク質をコードする配列を含む増幅されたＤＮＡフラグメントおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ（またはヌクレアーゼをコードする発現ベクター）を宿主細胞に（例えば、エレクトロポレーションを介して）導入する。発現ベクターは、発現ベクターに首尾よく感染した細胞を濃縮するために、抗生物質耐性マーカーなどの追加の選択マーカーをさらに含むことができる。レポータータンパク質を発現する細胞をさらに選択することができる。

レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を特定し、調節配列の機能を評価するために使用される。一般的に言えば、レポーター遺伝子は宿主細胞に対して内因性でも固有のものでもなく、それによってコードされるタンパク質は簡単に測定できる。簡単に測定できるタンパク質をコードするレポーター遺伝子は本分野で既知であり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラティッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己励起蛍光タンパク質、細胞表面マーカー、ネオ抗生物質などの耐性遺伝子などを含むが、これらに限定されない。

発現ベクター
「ベクター」という用語は、それに結合した別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターは、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖の核酸分子；１つまたは複数の自由端を含む、自由端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および本分野で知られている他の様々なポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術のように、追加のＤＮＡセグメントが挿入される環状二本鎖ＤＮＡループを指す。一部のベクターは、それらが導入された宿主細胞で自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞に導入されると、他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これによって宿主ゲノムと共複製する。また、一部のベクターは、操作可能に連結された遺伝子の発現をガイドすることができる。このようなベクターは、本文では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術における発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をとる。

組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸を発現するのに適した形態で本発明に記載の核酸を含み得る。これは、前記組換え発現ベクターが、発現される核酸配列と操作可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に従って選択可能な１つまたは複数の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「操作可能に連結」することは、ヌクレオチド発現を可能にする方法で目的ヌクレオチド配列を調節エレメントに連結することを意図する（例えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいて、または前記ベクターが宿主細胞に導入される時に宿主細胞において発現する）。

宿主細胞
実際、インビトロで培養でき、しかも本文に記載のように修飾できる限り、任意の真核細胞タイプを宿主細胞として使用することができる。好ましくは、前記宿主細胞は、予め確立された（ｐｒｅ－ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）細胞株である。前記宿主細胞と細胞株は、ヒト細胞または細胞株、若しくは非ヒト、哺乳動物細胞または細胞株であってもよい。

実施例
材料と方法
１、細胞と試薬
Ｚ．Ｊｉａｎｇ実験室（北京大学）からのＨｅＬａ細胞株は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ Ｃ１１９９５５００ＢＴ）で培養した。Ｓ．Ｃｏｈｅｎ実験室（スタンフォード大学医学部）からのＨｕｈ７．５細胞株は、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ，Ｇｉｂｃｏ １１４０－０５０）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。Ｈ．Ｗｕ実験室（北京大学）からのＫ５６２細胞とＣｏｒｉｅｌｌセルバンクからのＧＭ１２８７８細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ１１８７５－０９３）で培養した。すべての細胞に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＣｅｌｌＭａｘ ＢＬ１０２－０２）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充し、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

２、イントロン保持またはエクソンスキッピングをテストするための逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）
ｓｇＲＮＡをＣＭＶプロモーターによって駆動されるｍＣｈｅｒｒｙマーカーを持つレンチウイルス発現ベクターにクローニングし、そしてＨｅＬａ_ＯＣ細胞（非特許文献１－４）をＭＯＩ＜１でウイルス感染により形質導入し、感染して７２時間後に、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別し、ＲＮＡｐｒｅｐ精製細胞／細菌キット（ＴＩＡＮＧＥＮ ＤＰ４３０）を使用して各サンプルから総ＲＮＡを抽出した。Ｑｕａｎｔｓｃｒｉｐｔ ＲＴキット（ＴＩＡＮＧＥＮ ＫＲ１０３－０４）を使用して２μｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＴｒａｎｓＴａｑ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｒａｎｓＧｅｎ ＡＰ１３１－１３）を使用してＲＴ－ＰＣＲ反応を実施した。
ＲＰＬ１８またはＲＰＬ１１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ配列：
ｓｇＲＮＡ１_{ＲＰＬ１８}：５’－ＧＧＡＣＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡＴＣＣ（配列番号１）
ｓｇＲＮＡ２_{ＲＰＬ１８}：５’－ＡＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＴＣＴＴ（配列番号２）
ｓｇＲＮＡ３_{ＲＰＬ１１}：５’－ＴＣＣＴＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＴ（配列番号３）
ｓｇＲＮＡ４_{ＲＰＬ１１}：５’－ＡＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＴＧ（配列番号４）
ＲＴ－ＰＣＲに使用されるプライマー：
１Ｆ：５’－ＣＴＧＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＡＡ（配列番号５）；
１Ｒ：５’－ＣＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧＣＣＣＣ（配列番号６）；
２Ｆ：５’－ＧＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＣＡ（配列番号７）；
２Ｒ：５’－ＧＡＣＡＧＴＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴＡＧ（配列番号８）；
３Ｆ：５’－ＴＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＧＴＧＧＧＡＴＴ（配列番号９）；
３Ｒ：５’－ＧＡＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣ（配列番号１０）;
４Ｆ：５’－ＧＡＴＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣＣＧＧＡＧＡ（配列番号１１）；
４Ｒ：５’－ＧＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＧＣＣＣ（配列番号１２）。

３、必須リボソーム遺伝子のスプライシングターゲティングｓｇＲＮＡライブラリーの構築とスクリーニング
７９のリボソーム遺伝子の注釈をＮＣＢＩから検索した。これらの７９の遺伝子を標的とするすべての潜在的なｓｇＲＮＡを、各５’ＳＤ部位周辺の－５０ｂｐ～＋７５ｂｐ、および各３’ＳＡ部位周辺の－７５ｂｐ～＋５０ｂｐの領域でスキャンした。前記遺伝子は、
ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２２Ｌ¹、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２６Ｌ¹、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３６ＡＬ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ３９Ｌ、ＲＰＬ３Ｌ、ＲＰＬ４、ＲＰＬ４１、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ７Ｌ¹、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４Ｘ、ＲＰＳ４Ｙ１、ＲＰＳ４Ｙ２、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８を含む。すべてのｓｇＲＮＡが、ヒトゲノム内の他の遺伝子座と少なくとも２つのミスマッチを持つことを確保した。ライブラリー内のｓｇＲＮＡの自然な切断効率を示すために、ＧＣ含有量を設計で考慮しなかった。ＣｕｓｔｍｏＡｒｒａｙ １２Ｋアレイチップ（ＣｕｓｔｍｏＡｒｒａｙ，Ｉｎｃ．）を使用して、７９個のリボソーム遺伝子を標的とする合計５，７８８個のｓｇＲＮＡを合成した。ここでは、７９個のリボソーム遺伝子のうちＲＰＬ１８遺伝子を例として使用して、ｓｇＲＮＡの設計を説明する。

Ｃａｓ９を発現するＨｅＬａおよびＨｕｈ７．５細胞において、これらのｓｇＲＮＡを運ぶ細胞ライブラリーをＭＯＩ＜０．３のレンチウイルス送達によって構築し（非特許文献２８）、最小カバレッジは４００倍であった。ウイルス感染の７２時間後、ＦＡＣＳ（ＢＤ）を通じてｍＣｈｅｒｒｙ^＋に従って前記細胞を選別した。ＤＮｅａｓｙ ＢｌｏｏｄとＴｉｓｓｕｅキット（ＱＩＡＧＥＮ ６９５０６）を使用して、ゲノムＤＮＡ抽出のために各ライブラリーからコントロール細胞（２．４×１０^６）を収集し、ゲノムＤＮＡ抽出の前に試験細胞を１５日間培養した。各重複について、レンチウイルスにより組み込まれたｓｇＲＮＡコード領域をＴｒａｎｓＴａｑ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｒａｎｓＧｅｎ ＡＰ１３１－１３）でＰＣＲによって増幅し、前述のようにさらにＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－２５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｄ４０３４）を使用して精製した（非特許文献４、９）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ （ＮＥＢ Ｅ７３７０Ｌ）に使用されるＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキットを使用して調製したライブラリーを、ハイスループットシーケンス分析（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００）に使用した。

４、ゲノムスケールのヒトＩｎｃＲＮＡライブラリーの設計と構築
１４，４７０個のＩｎｃＲＮＡを含むＧＥＮＣＯＤＥデータセットＶ２０からＩｎｃＲＮＡの注釈を検索した。このデータセットにおいて、第一フィルタリングステップでは、スプライス部位のない２４７７個のＩｎｃＲＮＡを除去した。残りのＩｎｃＲＮＡについて、各５’ＳＤ部位および３’ＳＡ部位周辺の－１０ｂｐ～＋１０ｂｐの領域を標的とするすべての潜在的な２０－ｎｔ ｓｇＲＮＡを設計した。切断効率と特異性を確保するために、ゲノム内の他の遺伝子座と少なくとも２つのミスマッチがあり、ＧＣ含有量が２０％～８０％のｓｇＲＮＡのみを保持し、４ｂｐ Ｔ以上のヌクレオチドホモポリマーを含むｓｇＲＮＡを除去した。最良のカバレッジを達成するために、Ｋ５６２細胞株のいずれか必須遺伝子（非特許文献１５）を標的とせず、ミスマッチ部位の総数が２未満である限り、他の遺伝子座と１ｂｐまたは０ｂｐのミスマッチを持つ一部のｓｇＲＮＡを保持した。最後に、１０，９９６個のＩｎｃＲＮＡを標的とする合計１２６，７７３個のｓｇＲＮＡを合成した。このライブラリーには、５００個のヒトゲノム中の非標的ｓｇＲＮＡをネガティブコントロールとしてふくめ、３６の必須リボソーム遺伝子を標的とする３５０個のｓｇＲＮＡをポジティブコントロールとして含めた。ＣｕｓｔｍｏＡｒｒａｙ ９０Ｋアレイチップ（ＣｕｓｔｍｏＡｒｒａｙ，Ｉｎｃ．）を使用してオリゴヌクレオチドを合成し、ライブラリーの構築は上記の通りであった。

５、ゲノムスケールのＩｎｃＲＮＡスクリーニング
２回の重複でそれぞれ合計５×１０^８個のＫ５６２細胞を１７５ｃｍ^２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ４３１０８０）に播種した。２４時間後、細胞をＭＯＩが０．３未満（１０００倍のカバレッジ）のｓｇＲＮＡライブラリーレンチウイルスに感染させた。感染の４８時間後、ライブラリー細胞をプロマイシン（３μｇ／ｍｌ；Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｐ８２３０）で２日間処理した。各重複について、ゲノム抽出のために、０日目の対照サンプルとして合計１．３×１０^８個の細胞を収集した。ウイルス感染の３０日後、ゲノム抽出トＮＧＳ分析のために１．３×１０^８個の細胞を単離した（非特許文献４、９）。

６、スクリーニングのコンピューター分析
シーケンス読み取りをｈｇ３８参照ゲノムにマッピングし、自家製のスクリプトによってデコードした。２つの重複のｓｇＲＮＡカウントに対してクオンタイル正規化を実行してから、平均カウントおよび試験と対照群間の倍数変化を計算した。１０個のネガティブコントロールｓｇＲＮＡ（各遺伝子置換）をランダムに選択することにより、１０００個のネガティブコントロール遺伝子を生成した。そして、次の基準に基づいてノイズｓｇＲＮＡをフィルタリングした：１回の重複でのｓｇＲＮＡの倍数変化が、ポジティブコントロールｓｇＲＮＡの平均倍数変化よりも低く、別の重複でネガティブコントロールｓｇＲＮＡの平均倍数変化よりも高い場合、ｓｇＲＮＡをフィルタリングされたノイズｓｇＲＮＡと見なす。ノイズフィルタリング後、各ＩｎｃＲＮＡについて、ネガティブコントロールと比較したｓｇＲＮＡの倍数変化をＷｉｌｃｏｘテストを通じて比較し、偽陽性率を減少するように、ネガティブコントロールによって生成された経験的分布を使用してｐ値を修正した。最終的に、スクリーンスコアを次のように定義した：スクリーンスコア＝スケール（－ｌоｇ_１０（修正されたｐ値））＋｜スケール（ｌоｇ_２（ｓｇＲＮＡ倍数変化））｜。スクリーンスコアが２を超えるヒットを必須のＩｎｃＲＮＡとして識別した。

７、ＩｎｃＲＮＡヒットの検証
上位２つのｓｇＲＮＡを、スプライシング戦略の検証のためにライブラリーから選択した。前記ｓｇＲＮＡは、ゲノム内の他の遺伝子座に対して少なくとも２つのミスマッチを持つ。ｐｇＲＮＡ削除戦略について、ｐｇＲＮＡが各ＩｎｃＲＮＡのプロモーターと最初のエクソンを削除するように設計された。次の原則に基づいてｇＲＮＡペアを設計した：（１）１つのｓｇＲＮＡは転写開始部位（ＴＳＳ）の上流の２．５～３．５ｋｂ領域を標的とし、もう１つはＴＳＳの下流の０．２～１．５ｋｂ領域を標的とする；（２）コードまたは非コード遺伝子のエクソンまたはプロモーターと重複することを避ける。前記ｐｇＲＮＡペアの各ｓｇＲＮＡについて、（１）ＧＣ含有量が４５％～７０％であること、（２）ｓｇＲＮＡに４ｂｐ以上のホモポリマーが含まれていないこと、および（３）ｓｇＲＮＡには、ヒト遺伝子座の他の遺伝子座と２つを超えるミスマッチが含まれていることをさらに確保する。他の遺伝子座と２つのミスマッチを持っているが、オフターゲットサイトが２つ未満のｓｇＲＮＡをいくつか含めた。
検証対象の選択されたＩｎｃＲＮＡを標的とするすべてのｓｇＲＮＡまたはｐｇＲＮＡを、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰタグを備えたレンチウイルスベクターに単独にクローニングした。ウイルスパッケージング後、ｓｇＲＮＡまたはｐｇＲＮＡレンチウイルスを１．０未満のＭＯＩでＫ５６２またはＧＭ１２８７８細胞に形質導入した。細胞増殖試験は、前の文献に記載された通りであった（非特許文献９）。

８、ＲＮＡシーケンスとデータ分析
ＩｎｃＲＮＡ ＭＩＲ１７ＨＧおよびＢＭＳ１Ｐ２０のスプライス部位を標的とする２つのｓｇＲＮＡをそれぞれ、ＥＧＦＰタグを備えたレンチウイルスベクターにクローニングした。ｓｇＲＮＡをレンチウイルス感染（ＭＯＩ＜１）を介してＫ５６２またはＧＭ１２８７８細胞に送達した。感染の５日後、２×１０^６個のＥＧＦＰ陽性Ｋ５６２またはＧＭ１２８７８細胞をＦＡＣＳで選別した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ ７８２５４）を使用して各サンプルの総ＲＮＡを抽出し、ＮＥＢＮｅｘｔ ＰｏｌｙＡ ｍＲＮＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ Ｅ７４９０Ｓ）、ＮＥＢＮｅｘｔ ＲＮＡ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ Ｅ７５２５Ｓ）、ＮＥＢＮｅｘｔ ｍＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ Ｅ６１１１Ｓ）、およびＩｌｌｕｍｉｎａに用いられるＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット（ＮＥＢ Ｅ７３７０Ｌ）に従ってＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎプラットフォーム（Ｇｅｎｅｔｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ）を使用してすべてのサンプルについてＮＧＳ分析をした。ディープシーケンシングリードをｈｇ３８参照ゲノムにマッピングし、ＲＳＥＭ ｖ１．２．２５（非特許文献３０）によって遺伝子発現を定量化した。ＥＢＳｅｑバージョン１．１０．０（非特許文献３１）によって差次的発現分析を行い、差次的発現遺伝子について、自己修正されたＰ値が０．０５未満、しかも絶対ｌоｇ_２（倍数変化）が３を超えたものを選択した。ＤＡＶＩＤ６．８（非特許文献３２）によって遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）とＫＥＧＧ分析を実行した。

結果
公知常識と一致して、スプライス部位をマークする保存的な配列が存在する。Ｗｅｂｌｏｇｏ３ツール（非特許文献３３）を使用したバイオインフォマティクス分析では、ヒトゲノムの中の約９９％のイントロン領域が５’スプライスドナー（ＳＤ）部位でＧＴに隣接し、３’スプライスアクセプター（ＳＡ）部位でＡＧに隣接していることは示されている。なお、ＡＧ配列は主にＳＤ部位のすぐ上流のエクソンの最後の２つの塩基として存在する（図１のａ）。エクソンスキッピングおよび／またはイントロン保持の生成におけるｓｇＲＮＡの有効性を確認するために、細胞成長と増殖に不可欠な２つのリボソーム遺伝子ＲＰＬ１８とＲＰＬ１１のＳＤまたはＳＡ部位を標的とするｓｇＲＮＡを設計した。Ｃａｓ９およびＯＣＴ１遺伝子（非特許文献４）を安定して発現するＨｅＬａ細胞で、ＳＤ部位を標的とするｓｇＲＮＡ１_{ＲＰＬ１８}およびＳＡ部位を標的とするｓｇＲＮＡ２_{ＲＰＬ１８}が、ゲノム内のＲＰＬ１８遺伝子座でそれぞれイントロン３保持とエクソン４スキッピングを生成したことは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）およびＳａｎｇｅｒシーケンシング分析によって確認された。ＲＰＬ１１遺伝子に対する同様の試みから同じ結果が得られ、ｓｇＲＮＡ３_{ＲＰＬ１１}とｓｇＲＮＡ４_{ＲＰＬ１１}はＲＰＬ１１遺伝子座でそれぞれイントロン２保持とエクソン４スキッピングを生成した。図１のｂは、スプライスドナー（ＳＤ）またはスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を標的とするｓｇＲＮＡによって誘導されるイントロン保持とエクソンスキッピングを示している。

ＣＲＩＳＰＲスクリーニングにおけるターゲティングスプライシングの有効性をさらに評価するために、７９のリボソーム遺伝子のスプライス部位を標的とする飽和ライブラリーを設計した。これらの７９のリボソーム遺伝子は、多くの細胞株での細胞増殖に必要である（非特許文献２９）。このライブラリーは５，７８８のｓｇＲＮＡを含み、その切断部位は、これら７９の遺伝子の各５’ＳＤ部位周辺の５０ｂｐ～＋７５ｂｐ、および各３’ＳＡ部位周辺の－７５ｂｐ～＋５０ｂｐの範囲内にある。ｓｇＲＮＡの例について、表１を参照できる。

ＭＯＩ（感染多重度）＜０．３のレンチウイルスの送達により、これらのｓｇＲＮＡを持つ細胞ライブラリーを、Ｃａｓ９を発現するＨｅＬａ細胞及びＨｕｈ７．５細胞で構築した。１５日間のライブラリー細胞の延長した細胞培養によってスクリーニングし、ＮＧＳ分析に基づいて、細胞生存率の低下を引き起こすｓｇＲＮＡを解読した。

１５日間のテストサンプル（Ｅｘｐ）と対照サンプル（Ｃｔｒｌ）間のｓｇＲＮＡのｌоｇ_２倍数変化を計算することにより、すべてのｓｇＲＮＡを並べ替え、ｓｇＲＮＡ切断部位とそれに対応するＳＤまたはＳＡ部位間の距離（塩基対の数）によってアラインメントした。ＨｅＬａおよびＨｕｈ７．５細胞におけるＣｔｒｌとＥｘｐの生物学的重複実験間のＳｐｅａｒｍａｎ相関性は、すべての結果が高い再現性を有することはしめされた（図２）。遺伝子破壊に対するスプライシングターゲティングの有効性を反映するために、ＳＤ部位を標的とするデータおよびＳＡ部位を標的とするデータを組み合わせ、ＳＤまたはＳＡ部位に対する物理的距離に応じてそれらを並べた（図３および図１のｄ）。明らかに、ＨｅＬａおよびＨｕｈ７．５細胞では、スプライス部位に影響を与えるｓｇＲＮＡは、エクソン領域のみを標的とするｓｇＲＮＡより優れている。ｓｇＲＮＡ切断部位からスプライス部位までの距離が近いほど、遺伝子破壊の効果が高くなり、ＳＤとＳＡの場合、ピークポイントは少しエクソンに向かっている（図３、１のｄ）。対照的に、イントロンを標的とする多数のｓｇＲＮＡは、スクリーニングプロセス中に枯渇することはめったになく、遺伝子への破壊およびそれによる遺伝子機能の喪失が細胞の生存に与える影響が小さいことを示している。唯一の例外は、ＳＡ部位の近くのイントロン領域を標的とするｓｇＲＮＡ（非特許文献３４、３５）であり、これには、ＲＮＡスプライシングへの関与で知られている分岐点が含まれ、それに続くのが、ポリピリミジントラクトである。

いずれかの遺伝子座に対しても設計されたｓｇＲＮＡの数は等しくないため、公平に比較するために、各遺伝子座の高効率ｓｇＲＮＡ（損失が４倍を超えるｓｇＲＮＡ）の割合を比較した。このような標準化を通して、ＳＤおよびＳＡを標的とするｓｇＲＮＡが、エクソン領域のみを標的とするｓｇＲＮＡよりもはるかに優れていることをさらに確認した（図４のａ）。結果をよりよく定量化するために、すべてのｓｇＲＮＡを、イントロンを標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの切断部位はイントロン内にあり、ＳＤまたはＳＡ部位から少なくとも３０ｂｐ離れている）、エクソンを標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの切断部位はエクソン内にあり、ＳＤまたはＳＡ部位から少なくとも３０ｂｐ離れている）、およびターゲティングスプライシングｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの切断部位はＳＤまたはＳＡ部位に隣接する－１－ｂｐ～＋１０ｂｐの範囲にあり、－と＋は、それぞれイントロンとエクソンの方法を示す）の三種類に分けた。ＨｅＬａおよびＨｕｈ７．５細胞では、２または４倍を超えた損失を引き起こしたｓｇＲＮＡの中で、スプライシングターゲティングｓｇＲＮＡの割合は、その他の２種類よりもはるかに高かった（図４のｂ、４のｃ）。

上記の結果に基づいて、その戦略はコード遺伝子および非コード遺伝子に普遍的に適用できるはずであると推測する。これは、ＲＮＡスプライシングが両方で非常に保存的なメカニズムであるからである。スプライス部位を標的とすることは、ヒト細胞におけるＩｎｃＲＮＡの機能をエクソンスキッピングおよび／またはイントロン保持によって破壊する可能性があると想定して、ゲノムスケールのＩｎｃＲＮＡの機能的なスクリーニングを確立するために特別なターゲティングスプライシングｓｇＲＮＡライブラリーを設計して構築した。ＧＥＮＣＯＤＥデータベースＶ２０から検索した１４４７０個のＩｎｃＲＮＡのうち、まずスプライス部位を欠く２，４７７個のＩｎｃＲＮＡを除外した。また、他のいくつかのルールに従った：すべてのｓｇＲＮＡ切断部位はスプライス部位周辺の－１０ｂｐ～＋１０ｂｐの範囲内にあり、ｓｇＲＮＡが高い切断活性を有すると予測され（非特許文献２９、３６、３７）、しかも既知の必須遺伝子のオフターゲットはない（方法部分参照）。最終的に、１０，９９６の独特なＩｎｃＲＮＡを標的とする１２６，７７３のｓｇＲＮＡライブラリーを調製した。５００の非標的対照ｓｇＲＮＡおよび必須リボソーム遺伝子を標的とする３５０のｓｇＲＮＡと一緒に、Ｃａｓ９タンパク質を安定して発現するように操作されたＫ５６２細胞において細胞ライブラリーを構築した（図５のａおよび図２のａ）。０．３未満の低いＭＯＩでレンチウイルス形質導入によって細胞ライブラリーを調製した。感染後、ライブラリー細胞を３０日間継続的に培養し、細胞の成長と増殖に影響を与えるＩｎｃＲＮＡをスクリーニングした。その後、ＮＧＳ分析をｓｇＲＮＡのデコードに使用した（非特許文献４、９）（図５のｂ）。

３０日間培養した後、ＩｎｃＲＮＡおよび必須遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは、非標的ｓｇＲＮＡと比較して枯渇しており（図５のｃ、５のｄ、図２のｂ、ｃ）、細胞の生存または増殖に対する影響は示された。各ＩｎｃＲＮＡについて、非標的ｓｇＲＮＡと比較して、Ｗｉｌｃｏｘоｎ検定によってｓｇＲＮＡの倍数をテスト計算してそのＰ値を得た。非標的ｓｇＲＮＡをランダムにサンプリングして「ネガティブコントロール遺伝子」を生成し、これによってＩｎｃＲＮＡのＰ値をその分布によって補正した。各ＩｎｃＲＮＡについて、平均倍数変化と補正されたＰ値とを組み合わせてスクリーンスコアを計算した（方法部分参照）。これにより、スクリーンスコアが２であるしきい値に基づいて合計２４３の候補ＩｎｃＲＮＡを選択し、それらの枯渇は、Ｋ５６２細胞株で細胞成長阻害または細胞死を引き起こす（図５のｅ、図２のｄ）。スクリーンスコアによって、３６の必須遺伝子はすべて、ネガティブセレクション遺伝子のランキングリストで有意に濃縮されており、これは、スクリーニング法とデータ分析法の信頼性を示している。

対応するｓｇＲＮＡが２つの重複で一貫して枯渇しているネガティブに選択されたＩｎｃＲＮＡから、更なる検証のために３５のトップランクのＩｎｃＲＮＡ遺伝子を選択した。各候補について、ライブラリースクリーニングから得られた２つのトップランクのｓｇＲＮＡを、ＥＧＦＰ選択タグを有するレンチウイルス骨格にクローニングした。非標的ｓｇＲＮＡおよび非機能性アデノ関連ウイルス組み込み部位１（ＡＡＶＳ１）遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡを陰性対照として選択し、リボソーム遺伝子ＲＰＬ１８を標的とするｓｇＲＮＡをポジティブコントロールとして含めた（図６のａ、図３のａ）。各ｓｇＲＮＡをＫ５６２細胞に形質導入し、ＥＧＦＰ陽性細胞の変化の割合に基づいて細胞増殖を定量化した。癌細胞と正常細胞のＩｎｃＲＮＡ機能の違いをさらに考察するために、検証するようにリンパ系幹細胞ＧＭ１２８７８を含めた。この細胞は比較的に正常な核型を持ち、Ｋ５６２と同じくティア１のＥＮＣＯＤＥ細胞株に属す（非特許文献２４、２５）。なお、３５のトップランクのＩｎｃＲＮＡ遺伝子座を標的とするすべてのｓｇＲＮＡは、Ｋ５６２細胞の細胞増殖を効果的に引き起こした（図６のｂ、ｃ、図３のｂ、ｃ、および図７～１２）。その中で、１８のＩｎｃＲＮＡはＧＭ１２８７８の成長にも不可欠である（図６のｂ、図７～１０、図３のｂ）。一方、６個および１１個のＩｎｃＲＮＡヒットは、ＧＭ１２８７８での細胞生存率に対してそれぞれ弱い（図１０）および検出できない影響を示した（図６のｃおよび図１１～１２、図３のｃ）。これらの結果は、細胞型特異性の存在を示している。要するに、Ｋ５６２に必要なＩｎｃＲＮＡの約半分は、ＧＭ１２８７８細胞の成長に有意な影響を与えず、治療の可能性のある癌細胞のユニークなバイオマーカーを示している（図６のｄ、図３のｄ）。

検証実験とスクリーニング戦略（いずれもスプライシング干渉に依存）をさらに確認するために、ｐｇＲＮＡを介した削除方法（非特許文献９）を選択して、スクリーニングからのＩｎｃＲＮＡヒットの作用を独立に研究した。検証済みの３５のヒットから６つのＩｎｃＲＮＡを選択し、上位ランクのスプライシングターゲティングｓｇＲＮＡには特定のオフターゲットの可能性があるため、上記の検証に含まれなかった上位ヒットから別の６つの候補を選択した。これらの１２のＩｎｃＲＮＡのそれぞれについて、４ペアのｐｇＲＮＡを、そのプロモーターと最初のエクソンを削除するように設計した（方法部分参照）。ＡＡＶＳ１遺伝子座またはリボソーム遺伝子ＲＰＬ１９とＲＰＬ２３ＡをそれぞれｐｇＲＮＡターゲティングネガティブコントロールまたはポジティブコントロールとして選択した（図１３のａ）。細胞増殖実験を通して、３５の検証済みのヒットからの６つのＩｎｃＲＮＡは、ターゲティングスプライシング戦略によって検証された表現型を再現した（図６のｅおよび図１３のｂ、図３のｅ）。ターゲティングスプライシングの検証結果は、削除戦略の結果とよい相関性があり（相関係数＝０．９３、Ｐ＝０．００２）（図６のｆ、図３のｆ）、これは、ターゲティングスプライシングがＩｎｃＲＮＡ遺伝子破壊に対して信頼でき、且つ強力な方法であることを示した。同様に、他の６つの候補ＩｎｃＲＮＡもＫ５６２細胞の成長に重要であることを実証した（図１４）。これまでに、４１の選択されたＩｎｃＲＮＡはすべて、Ｋ５６２細胞の成長と増殖に極めて重要であることは確認された。

Ｋ５６２とＧＭ１２８７８細胞でこれらの異なる発現を引き起こすメカニズムをよりよく理解するために、両方の細胞株に必要なＩｎｃＲＮＡ ＭＩＲ１７ＨＧ（図６のｂ、図３のｂ）と、Ｋ５６２細胞の生存にのみ必要であるがＧＭ１２８７８で（図６のｃ、図３のｃ）必要ではないＢＭＳ１Ｐ２０の機能をさらに探索した。ＭＩＲ１７ＨＧまたはＢＭＳ１Ｐ２０のノックアウトがある、またはない場合に、Ｋ５６２とＧＭ１２８７８の２つの細胞に対してＲＮＡ－ｓｅｑ分析をした。そのスプライス部位を標的とする２つのｓｇＲＮＡで各ＩｎｃＲＮＡを破壊し、その有効性は検証実験で確認された（図６のｂ、ｃ、図３のｂ、ｃ）。対照とｓｇＲＮＡターゲティングサンプル間で最も大きい変化を示した５００個の遺伝子の発現レベルを評価し、２つのＩｎｃＲＮＡをノックアウトした後に異なる発現パターンを観察した（図１５のａ、図４のａ）。各細胞株における２つのＩｎｃＲＮＡについて、同じスプライス部位を標的とし、発現パターンが類似した２つのｓｇＲＮＡが示されている（図１６のａ、ｂ）。Ｋ５６２細胞から同定されたトップランクの１００の必須ＩｎｃＲＮＡの全体的な発現レベルは、ＧＭ１２８７８細胞よりも野生型Ｋ５６２細胞において高かった（Ｐ＝０．０３、図１５のｂ、図４のｂ）。

Ｋ５６２細胞株では、ＭＩＲ１７ＨＧのスプライシングモードの変更は、細胞の成長と増殖に影響を与える既知の１７９の必須遺伝子をダウンレギュレートし（非特許文献１５（Ｐ＝０．０１、図１５のｃ、図４のｃ）、ＢＭＳ１Ｐ２０の破壊は、１７８の既知の必須遺伝子をダウンレギュレートした（非特許文献１５）（Ｐ＝０．０５、図１５のｃ、図４のｃ）。これは、これら２つのＩｎｃＲＮＡがＫ５６２細胞の成長に影響する可能なメカニズムを示した。意外なことに、ＭＩＲ１７ＨＧとＢＭＳ１Ｐ２０は、ＧＭ１２８７８細胞では異なる役割を果たすが、Ｋ５６２細胞の１４０の一般的な必須遺伝子に影響を与える（図１５のｄ、図４のｄ）。これらの保存的な遺伝子は、翻訳開始、細胞分裂、およびＤＮＡ修復を調節する経路など、いくつかの必須な経路に富んでいる（図１６のｃ）。ＢＭＳ１Ｐ２０の場合、対照細胞と比較して、このＩｎｃＲＮＡの破壊は、Ｋ５６２とＧＭ１２８７８細胞における一連のコード遺伝子の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートした（１６のｄ～ｅ）。さらに、ＩｎｃＲＮＡをノックアウトした後、Ｋ５６２とＧＭ１２８７８で差次的に発現する遺伝子を研究した（図１５のｅ、図４のｅ）。Ｋ５６２でダウンレギュレートされたこれらの遺伝子は、ｐ５３シグナル伝達経路やＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路などのプロセスに富んでおり、細胞の成長と増殖に影響を与える可能性がある（図１５のｆ、図４のｆ、上の図）。また、アップレギュレートされた遺伝子もあり（図１５のｆ、図４のｆ、下の図）、これらの差次的に発現する遺伝子はすべて、これら２つの細胞株において、細胞の成長に影響を与える面では、ＢＭＳ１Ｐ２０ノックアウトによって引き起こされる表現型の変化に関連している。

要するに、タンパク質をコードする遺伝子とＩｎｃＲＮＡ遺伝子の干渉は、いずれもスプライス部位を標的とすることで実質的に増強することができる。タンパク質をコードする遺伝子にリーディングフレームシフト変異を生成するに加えて、ターゲティングスプライシングは遺伝子破壊に追加の機会を提供する。この特徴は、ｓｇＲＮＡを介してリーディングフレームに敏感ではない非コードＲＮＡをノックアウトするためにかけがえのないものである。さらに、スプライス部位を破壊するこの戦略は、保存されたコード配列を持つ遺伝子を標的とする適切なｓｇＲＮＡを設計することが難しい場合に特に効果的である可能性がある。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、２つの戦略（ペアｇＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）削除（非特許文献９）とＣＲＩＳＰＲｉ（非特許文献１２））を通じて、機能的なＩｎｃＲＮＡを大規模に特定するために適用されている。ｐｇＲＮＡを介したゲノム欠失よりも、ＣＲＩＳＰＲｉ戦略を使用して技術上ではスケールアップしやすいが、ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａ法は通常、標的転写開始部位（ＴＳＳ）の約１ｋｂのウィンドウ内でのみ機能し（非特許文献１２、２６）、技術者がこの方法で直面するリスクは、ほぼ６０％のＩｎｃＲＮＡ遺伝子座に隣接する遺伝子の発現に意図せずに影響を与えることである（非特許文献２７）。スプライシングターゲティングの戦略は、単一のガイドＲＮＡを使用して重複領域のほとんどを切断することを効果的に回避でき、隣接する遺伝子への影響を高い確率で回避できるため、偽陽性率を減らすことができる。総じていえば、ＣＲＩＳＰＲｉは、標的遺伝子座を完全にノックアウトするのではなく、遺伝子発現レベルを低下させるだけなので、偽陰性の結果の余地が残った。

実験データに基づいて、本発明に記載の新しい方法は、コード遺伝子の陰性ＣＲＩＳＰＲスクリーニングにおいて有意な利点を有し、従来のエクソンターゲティング法を補完するものであり、しかも本発明の方法は、単一のガイドＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲライブラリーを使用して、非コード遺伝子の大規模な機能喪失スクリーニングを可能にする。また、スプライス部位の破壊によって生成されるエクソンスキッピングおよび／またはイントロン保持は、個々の非コードＲＮＡの機能検証のために便利なアプローチを提供する。

Claims (8)

1. 長鎖ノンコーディングＲＮＡのスプライス部位周辺のゲノム配列を標的とする、プロモーターに操作可能に連結されたガイド配列とプロモーターに操作可能に連結されたガイドヘアピン配列とを含み、前記ガイド配列は、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－３０ｂｐ～＋３０ｂｐの領域のゲノム配列を標的とする、真核細胞のゲノム中で長鎖ノンコーディングＲＮＡを干渉するためのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ構築体を複数含むライブラリー。
2. 前記ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ構築体はウイルスベクターまたはプラスミドである、請求項１に記載のライブラリー。
3. 長鎖ノンコーディングＲＮＡのスプライス部位周辺のゲノム配列を標的とする、プロモーターに操作可能に連結されたガイドＲＮＡとガイドヘアピン配列とを含むＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ構築体を宿主細胞に導入することと、
   前記ゲノム配列を標的とする前記ガイドＲＮＡを前記宿主細胞において発現させ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの存在下で前記長鎖ノンコーディングＲＮＡにエクソンスキッピングおよび／またはイントロン保持を導入してから前記長鎖ノンコーディングＲＮＡの機能プロファイルを決定することと
   を含み、前記ガイドＲＮＡのガイド配列は、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－３０ｂｐ～＋３０ｂｐの領域のゲノム配列を標的とし、
   前記宿主細胞が宿主細胞集団内にあり、各宿主細胞が独立してユニークなガイドＲＮＡ構築体を含む、
   長鎖ノンコーディングＲＮＡの機能プロファイルを決定するための方法。
4. 前記機能プロファイルは、細胞表現型の変化および／またはコード遺伝子または非コード遺伝子の発現の増加または減少を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記コード遺伝子は、外因性レポーター遺伝子またはゲノム内の元のコード遺伝子である、請求項４に記載の方法。
6. 真核細胞ゲノム中で長鎖ノンコーディングＲＮＡをスクリーニングまたは同定するためのハイスループット方法である、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 長鎖ノンコーディングＲＮＡの１つまたは複数のスプライス部位周辺の１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を標的とする１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを真核細胞に導入し、これによって１つまたは複数のガイドＲＮＡは、長鎖ノンコーディングＲＮＡの１つまたは複数のスプライス部位周辺の１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を標的とし、Ｃａｓタンパク質の存在下で前記１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を切断し、長鎖ノンコーディングＲＮＡのイントロン保持および／またはエクソンスキッピングをもたらし、これによって長鎖ノンコーディングＲＮＡの機能を干渉または排除することを含む、真核細胞における長鎖ノンコーディングＲＮＡの機能を干渉または排除するための方法であって、前記ガイドＲＮＡのガイド配列は、長鎖ノンコーディングＲＮＡのＳＤ部位またはＳＡ部位周辺の－３０ｂｐ～＋３０ｂｐの領域のポリヌクレオチド配列を標的とする、方法（但し、人間の生体内にある細胞にＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを導入する方法を除く）を使用して腫瘍細胞の成長または増殖に必要なＩｎｃＲＮＡを同定および破壊して腫瘍細胞の成長または増殖を阻害することを含む、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）の機能を干渉することによって腫瘍細胞の成長または増殖を阻害する方法。
8. 前記腫瘍細胞の成長または増殖に必要なＩｎｃＲＮＡは、ＸＸｂａｃ－Ｂ１３５Ｈ６．１５、ＲＰ１１－８４８Ｐ１．５、ＡＣ００５３３０．２、ＡＰ００１０６２．９、ＡＰ００５１３５．２、ＲＰ１１－８６７Ｇ２３．４、ＬＩＮＣ０１０４９、ＤＧＣＲ５、ＲＰ１１－５０９Ａ１７．３、ＣＴＢ－２５Ｊ１９．１、ＣＴＤ－２５１７Ｍ２２．１７、ＣＲＯＣＣＰ２、ＡＣ０１６６２９．８、ＣＴＣ－４９０Ｇ２３．４、ＲＰ１１－１１７Ｄ２２．１、ＡＣ０６７９６９．２、ＲＰ１１－２５１Ｍ１．１、ＡＣ００４４７１．９、ＡＣ００４４７１．１０、ＡＣ００２４７２．１１、ＲＰ１１－４２９Ｊ１７．７、ＲＰ１１－５６Ｎ１９．５、ＴＭＥＭ１９１Ａ、ＬＬ２２ＮＣ０３－１０２Ｄ１．１８、ＬＩＮＣ００４１０、ＬＬ２２ＮＣ０３－２３Ｃ６．１３、ＲＰ１１－８３Ｊ２１．３、ＲＰ１１－５４４Ａ１２．４、ＡＮＫＲＤ６２Ｐ１－ＰＡＲＰ４Ｐ３、ＣＴＤ－２０３１Ｐ１９．５、ＸＸｂａｃ－Ｂ４４４Ｐ２４．８、ＲＰ１１－４６４Ｆ９．２１、ＴＰＴＥＰ１、ＭＩＲ１７ＨＧ、およびＢＭＳ１Ｐ２０からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。

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