JP2018532419A - ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｇＲＮＡライブラリー - Google Patents

Abstract

本発明は、CRISPR-Cas系sgRNAライブラリーを得るための方法、並びに選択圧下で生存する個別の細胞ノックアウトを選択するため、及び/又は対象によって示される1若しくは複数の生物学的症状若しくは医学的症状の遺伝的基盤を同定するため、及び/又はゲノム内の全ての遺伝子を並行してノックアウトするためのライブラリーの使用に言及するものである。

Description

クラスター化等間隔回文リピート(CRISPR)系は、細菌の後天性免疫に関与し(1)、それは真正細菌の40%において、及び古細菌の90%において共有されている(2)。細菌が、ファージ又はプラスミドのような感染性因子に攻撃されるとき、細菌の亜集団は、細菌の適応免疫系の記憶としてCRISPR座位に感染性DNAのセグメントを組み込む(1)。細菌が同一の病原体に感染する場合、CRISPR座位から転写される短鎖RNAが、CRISPR関連タンパク質9(Cas 9)へと組み込まれ、それが配列特異的エンドヌクレアーゼとして作用し、感染性病原体を排除する(3)。

ガイドRNA(gRNA)が提供される場合、CRISPR/Cas9は、ゲノムの任意の座位を切断できる配列特異的エンドヌクレアーゼとして利用可能である(4,5)。非相同末端結合(NHEJ)によって生じるゲノム座位上の挿入欠失は、対応する遺伝子をノックアウトできる(4,5)。目的の遺伝子に対するgRNAを設計することによって、個別の遺伝子を一つずつノックアウトすることができる(リバースジェネティクス);しかしながら、目的の現象に関与する遺伝子が同定されていないとき、この戦略は、役に立たない。適切な読み出し及び選択の方法が利用可能である場合、表現型スクリーニング(フォワードジェネティクス)は、魅力的な代替物である。

近年、ゲノムスケールのプールされたgRNAライブラリーが、哺乳動物におけるフォワードジェネティクススクリーニングに適用されている(6〜9)。表現型スクリーニングは実験の設定に依存するが、最も単純な方法は、陽性選択又は陰性選択のいずれかと組み合わされた変異細胞株の生存率に基づくスクリーニングである。ヒトgRNAライブラリーの陰性選択スクリーニングは、基本的プロセスに関与する必須遺伝子セットを同定している(6〜8)。ヌクレオチド類似体又は抗癌薬への耐性のスクリーニングは、これまでに検証された遺伝子及び新規の標的を成功裏に同定した(6〜8)。したがって、Cas9/gRNAスクリーニングは、哺乳動物細胞における組織的な遺伝学的解析のための強力なツールであることが示されている。

ストレプトコッカスピオゲネス(Streptococcus pyogenes)(Sp)のCas9に対するgRNAは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)NGGに隣接する20bpの配列として設計できる(4,5)。そのような配列は、通常、バイオインフォマティクス技術によって目的のコード配列又は座位から同定できるが、このアプローチは、アノテーションされた遺伝情報が乏しい種にとっては難しい。ゲノムバイオインフォマティクスの現在の進歩にも関わらず、遺伝情報のアノテーションは、ヒト、マウス、又は酵母のような、よく確立されたモデル生物を除いて、多くの種において不完全である。種の多様性は、生物による特殊な生物能力の多様性を表しているが、様々な種において特殊な能力をコードする多くの遺伝子が、手付かずのままであり、遺伝情報の未開拓な金鉱を残している。にもかかわらず、種特異的な能力は、ヒト又は医学研究への応用における移植の可能性のために、確実に有用である。

標的のDNA配列の事前の知識なしにmRNAをgRNAに転換する場合、主な課題は、PAMに隣接する配列を見つけること及び20-bpの断片を切り出すことである。

Shalem, O.、Sanjana, N.E.、Hartenian, E.、Shi, X.、Scott, D.A.、Mikkelsen, T.S.、Heckl, D.、Ebert, B.L.、Root, D.E.、Doench, J.G.及びZhang, F.「Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.」Science 343, 84〜87頁(2014)は、64,751のユニークなガイド配列を有する18,080遺伝子を標的化するゲノムスケールのCRISPR-Cas9ノックアウト(GeCKO)ライブラリーのレンチウイルスによる送達が、ヒト細胞における陰性選択スクリーニングと陽性選択スクリーニングの両方を可能にすることを示す。開示されるsgRNAライブラリーは、化学合成オリゴヌクレオチドを用いて構築された。ゲノムスケールsgRNAライブラリーは強力であるが、この方法によるsgRNAの構築は、ガイド配列を設計するために種の十分な遺伝情報、及び膨大な数のオリゴを合成するための膨大な費用を必要とする。これは、異なる生物学的モデル種においてsgRNAライブラリーを新規に作製することを困難にする。

Wang, T.、Wei, J.J.、Sabatini, D.M.及びLander, E.S.「Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.」Science 343, 80〜84頁(2014)は、ゲノムスケールのレンチウイルスのシングルガイドRNA(sgRNA)ライブラリーを用いる陽性選択と陰性選択の両方に好適なプールされた機能喪失型遺伝子スクリーニングのアプローチに言及する。sgRNA発現カセットがゲノムに安定的に組み込まれ、それは超並列シークエンシングによって追跡される複合突然変異プールを可能にする。73,000のsgRNAを含むライブラリーを使用して、ノックアウトのコレクションを生成し、2つのヒト細胞株においてスクリーニングを実施した。ヌクレオチド類似体6-チオグアニンへの耐性のスクリーニングは、全ての予測されるDNAミスマッチ修復経路のメンバーを同定したが、DNAトポイソメラーゼII(TOP2A)と別のものとして、毒性のエトポシドは、予測されたようにTOP2Aを同定し、サイクリン依存性キナーゼ6、CDK6をもまた同定した。必須遺伝子に対する陰性選択スクリーニングは基本的プロセスに対応する数多くの遺伝子セットを同定した。最後に、sgRNAの有効性が特異的な配列モチーフと関連し、より効果的なsgRNAの予測を可能にすることが示された。まとめると、これらの結果は、哺乳動物細胞における組織的な遺伝子解析のための強力なツールとしてCas9/sgRNAスクリーニングを確立した。sgRNAライブリーはまた、膨大な数の化学合成オリゴヌクレオチドを用いて構築された。

Laneらは、PAM様制限酵素を使用してガイドライブラリーを生成する洗練されたアプローチを開発し、それは、Xenopus卵抽出物における染色体座位を標識することができるか、又は大腸菌(E.coli)ゲノムを高頻度で標的化することができる(18)。

特許出願WO2015065964は、細胞における遺伝子機能に焦点を当てた機能ゲノミクスにおいて使用され、ベクター系を使用することもできる、ライブラリー、キット、方法、用途、及びスクリーニングに関し、他の態様は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)-Cas系及びそれらの成分に関する。特許出願はまた、CRISPR-Cas系において使用するための強力なシングルガイドRNA(sgRNA)の作製規則にも関する。ゲノムライブラリー及びゲノムワイドライブラリー、キット、ゲノム内の全ての遺伝子を並行してノックアウトする方法、選択圧下で生存する個別の細胞ノックアウトを選択する方法、患者によって示される医学的症状の1又は複数の遺伝的基盤を同定する方法、及びゲノムスケールsgRNAライブラリーを設計するための方法が提供される。得られるsgRNAライブラリーは、バイオインフォマティクス及び膨大な数のオリゴヌクレオチドのクローニングに基づく。

米国特許出願US2014357523は、ゲノムを断片化するための方法に言及する。ある実施形態において、方法は: (a)ゲノムDNAを含むゲノム試料を、Cas9タンパク質と、ゲノム内の異なる、予め規定された部位に相補的なCas9結合ガイドRNAの少なくとも10のセットとを含む複数のCas9-gRNA複合体と合わせて、反応混合物を作製する工程と、(b)反応混合物をインキュベートして、ゲノムDNAの少なくとも5の断片を産生する工程とを含む。各々がゲノム内の異なる、予め規定された部位に相補的である少なくとも100のCas9結合ガイドRNAを含む組成物もまた提供される。方法を実施するためのキットもまた提供される。更に、核酸を操作するための他の方法、組成物、及びキットもまた提供される。このアプローチは、最初に同定された遺伝子の標的の断片化(リバースジェネティクス)を目的とし、ゲノムスケールsgRNAライブラリーの構築には関しない。

クラスター化等間隔回文リピート(CRISPR)/Cas9系は、ゲノム編集のための強力なツールであり^{4, 5}、それは、遺伝子スクリーニングのためのガイドRNA(gRNA)ライブラリーを構築するのに使用できる^{6, 7}。gRNAの設計のために、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する20-merの配列を知る必要があり^{4, 5}、それは実験的にgRNAを作製することを著しく妨げる。

WO2015065964 米国特許出願US2014357523 米国特許第8,697,359号 米国特許第8,771,945号 米国特許第8,795,965号 米国特許第8,865,406号 米国特許第8,871,445号 米国特許出願公開第2014-0287938(A1)号(米国特許出願連続番号第14/213,991号) 米国特許出願公開第014-0273234(A1)号(米国特許出願連続番号第14/293,674号) 米国特許出願公開第2014-0273232(A1)号(米国特許出願連続番号第14/290,575号) 米国特許出願公開第2014-0273231号(米国特許出願連続番号第14/259,420号) 米国特許出願公開第2014-0256046(A1)号(米国特許出願連続番号第14/226,274号) 米国特許出願公開第2014-0248702(A1)号(米国特許出願連続番号第14/258,458号) 米国特許出願公開第2014-0242700(A1)号(米国特許出願連続番号第14/222,930号) 米国特許出願公開第2014-0242699(A1)号(米国特許出願連続番号第14/183,512号) 米国特許出願公開第2014-0242664(A1)号(米国特許出願連続番号第14/104,990号) 米国特許出願公開第2014-0234972(A1)号(米国特許出願連続番号第14/183,471号) 米国特許出願公開第2014-0227787(A1)号(米国特許出願連続番号第14/256,912号) 米国特許出願公開第2014-0189896(A1)号(米国特許出願連続番号第14/105,035号) 米国特許出願公開第2014-0186958号(米国特許出願連続番号第14/105,017号) 米国特許出願公開第2014-0186919(A1)号(米国特許出願連続番号第14/104,977号) 米国特許出願公開第2014-0186843(A1)号(米国特許出願連続番号第14/104,900号) 米国特許出願公開第2014-0179770(A1)号(米国特許出願連続番号第14/104,837号) 米国特許出願公開第2014-0179006(A1)号(米国特許出願連続番号第14/183,486) PCT特許公開WO 2014/093661(PCT/US2013/074743) WO2014/093694(PCT/US2013/074790) WO2014/093595(PCT/US2013/074611) WO2014/09371 8(PCT/US2013/074825) WO2014/093709(PCT/US2013/074812) WO2014/093622(PCT/US2013/074667) WO2014/093635(PCT/US2013/074691) WO2014/093655(PCT/US2013/074736) WO2014/093712(PCT/US2013/074819) WO2014/093701(PCT/US2013/074800) WO2014/018423(PCT/US2013/051418) 米国仮特許出願第61/961,980号 米国仮特許出願第61/963,643号 PCT/US2014/041806 米国仮特許出願第61/836,123号 米国仮特許出願第61/960,777号 米国仮特許出願第61/995,636号 PCT/US 13/74800 米国仮特許出願第61/736,527号 米国仮特許出願第61/748,427号 米国仮許出願第61/791,409号 米国仮特許出願第61/835,931号 米国仮特許出願第61/757,972号 米国仮特許出願第61/768,959号 米国仮特許出願第61/835,936号 米国仮特許出願第61/836,127号 米国仮特許出願第61/836,101号 米国仮特許出願第61/836,080号 米国仮特許出願第61/835,973号

Shalem, O.、Sanjana, N.E.、Hartenian, E.、Shi, X.、Scott, D.A.、Mikkelsen, T.S.、Heckl, D.、Ebert, B.L.、Root, D.E.、Doench, J.G.及びZhang, F.「Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.」Science 343, 84〜87頁(2014) Wang, T.、Wei, J.J.、Sabatini, D.M.及びLander, E.S.「Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.」Science 343, 80〜84頁(2014) 「Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.」Cong, L.、Ran, F.A.、Cox, D.Lin, S.、Barretto, R.、Habib, N.、Hsu, P.D.、Wu, X.、Jiang, W.、Marraffini, L.A.、及びZhang, F. Science 2月15日15;339(6121):819〜23頁(2013) 「RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.」Jiang W.、Bikard D.、Cox D.、Zhang F、Marraffini LA. Nat Biotechnol 3月;31(3):233〜9頁(2013) 「One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas- Mediated Genome Engineering.」Wang H.、Yang H.、Shivalila CS.、Dawlaty MM、Cheng AW.、Zhang F.、Jaenisch R. Cell 5月9日;153(4):910〜8頁(2013) 「Optical control of mammalian endogenous transcription and epi genetic states.」onermann S、Brigham MD、Trevino AE、Hsu PD、Heidenreich M、Cong L、Piatt RJ、Scott DA、Church GM、Zhang F. Nature. 2013年8月22日;500(7463):472〜6頁. doi: 10.1038/Naturel 2466. Epub 2013年8月23日 「Double Niching by RNA-Guided CRISPR Cas for Enhanced Genome Editing Specificity.」Ran, FA.、Hsu, PD.、Lin, CY.、Gootenberg, JS.、Konermann, S.、Trevino, AE.、Scott, DA.、Inoue, A.、Matoba, S.、Zhang, Y.、及びZhang, F. Cell 8月28日. pii: 80092-8674(13)01015-5. (2013/ 「DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.」Hsu, P.、Scott, D.、Weinstein, J.、Ran, FA.、Konermann, S.、Agarwala, V.、Li, Y.、Fine, E.、Wu, X.、Shalem, O.、Cradick, TJ.、Marraffini, LA.、Bao, G.、及びZhang, F. Nat Biotechnol 2013年9月;31(9):827〜32頁. doi: 10.1038/nbt2647. Epub 2013年7月21日 「Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.」Ran, FA.、Hsu, PD.、Wright, J.、Agarwala, V.、Scott, DA.、Zhang, F. Nature Protocols 11月;8(l 1):2281〜308頁. (2013) 「Genome-Scale CRISPR- Cas9 Knockout Screening in Human Cells.」Shalem, O.、Sanjana, NE.、Hartenian, E.、Shi, X.、Scott, DA.、Mikkelson, T.、Heckl, D.、Ebert, BL.、Root, DE.、Doench, JG.、Zhang, F. Science 12月12日, (2013). [Epub ahead of print] 「Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA.」Nishimasu, FL、Ran, FA、Hsu, PD.、Konermann, S.、Shehata, SI、Dohmae、Ishitatii, R.、Zhang, F.、Nureki, O. Cell 2月27日(2014). 156(5):935〜49頁 「Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.」Wu X.、Scott DA.、Kriz AJ.、Chiu AC、Hsu PD.、Dadon DB.、Cheng AW.、Trevino AE.、Konermann S.、Chen S.、Jaenisch R.、Zhang F.、Sharp PA. Nat Biotechnol. (2014)4月20日. doi: 10.1038/nbt.2889 「Development and Applications of CRISPR- Cas 9 for Genome Engineering」Hsuら、Cell 157, 1262〜1278頁(2014年6月5日) (Hsu 2014) 「Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation」Doenchら、Nature Biotechnology published online 2014年9月3日; doi: 10.1038/nbt.3026 Tijssen(1993)、「Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology- Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter『Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay』」、Elsevier、N.Y Goeddel、「GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185」Academic Press、San Diego、Calif. (1990) Boshartら、Cell, 41 :521〜530頁(1985) Mol. Cell. Biol, Vol. 8(1), 466〜472頁, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), 1527〜31頁, 1981 Ishinoら、J. Bacterid., 169:5429〜5433頁[1987] Nakataら、J. Bacterid., 171 :3553〜3556頁[1989] Groenenら、Mol. Microbiol, 10: 1057〜1065頁[1993] Hoeら、Emerg. Infect. Dis., 5:254〜263頁[1999] Masepohlら、Biochim. Biophys. Acta 1307:26〜30頁[1996] Mojicaら、Mol. Microbiol, 17:85〜93頁[1995] Janssenら、OMICS J. Integ. Biol, 6:23〜33頁[2002] Mojicaら、Mol. Microbiol, 36:244〜246頁[2000] van Embdenら、J, Bacteriol, 182:2393〜2401頁[2000] Jansenら、Mol. Microbiol, 43 ; 1565〜1575頁[2002] Mistili及びSpector、Nature Biotechnology 15:961〜964頁(1997)

したがって、バイオインフォマティクスに依存せず、且つ標的のDNA配列に関する事前の知識を必要とせず、分子生物学的技術によって、任意の種に対して適用可能な方法となるようなsgRNAライブラリーを得るための方法の必要性が未だに感じられている。

本発明者は、本明細書において、バイオインフォマティクスに依存せず、分子生物学的技術によって、任意の種のフォワードジェネティクススクリーニングをそれらの遺伝的特徴と無関係に可能にするようなgRNAライブラリーを構築する方法を記載する。本方法は、バイオインフォマティクスに基づかないため、未知の遺伝子情報からガイド配列を作出することが可能である。

簡潔に、PAMに相補的な配列を含むセミランダムプライマーを用いてmRNA配列からcDNAを合成し、そしてIIS型及びIII型制限酵素を用いてPAMに隣接する20-merを切り出し、gRNAライブラリーを作出する。

記載されたアプローチは、標的のDNA配列に関する事前の知識を必要とせず、それを任意の種に適用可能とし、一方でこの方法によって生成されたgRNAライブラリーは、オリゴクローニングに基づくライブラリーよりも、少なくとも100倍安価である。

したがって、クラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)-CasシングルガイドRNA(sgRNA)ライブラリー又はsgRNA又はガイド配列を産生するための、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)相補的配列を含むセミランダムプライマーの使用は、本発明の目的である。

好ましくは、前記セミランダムプライマーをcDNA合成プライマーとして使用して、クラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)-CasシングルガイドRNA(sgRNA)ライブラリー又はsgRNA又はガイド配列を産生する。

前記セミランダムプライマーは、好ましくは4から10ヌクレオチド長である。

PAM相補的配列は、好ましくは、S.ピオゲネス(progenies)(Sp)のCas9、ナイセリアメニンギティディス(Neisseria meningitidis)(NM)のCas9、ストレプトコッカスサーモフィルス(Streptococcus thermophilus)(ST)のCas9若しくはトレポネーマデンティコラ(Treponema denticola)(TD)のCas9、又はそれらの相同分子種、相同体、又は変異体に特異的なPAM配列と相補的である。

前記PAM相補的配列は、PAM配列に対して好ましくは実質的に相補的であり、より好ましくは完全に相補的である配列である。

本発明の好ましい実施形態において、PAM配列は、5'-NGG-3'、5'-NNNNGATT-3'、5'-NNAGAAW-3'、及び5'-NAAAAC-3'、それらの相同分子種、相同体、又は変異体からなる群から選択され、式中、Nは、C、G、A、及びTから選択されるヌクレオチドである。

前記PAM相補的配列は、好ましくは、配列5- CCN-3'を含み、式中、Nは、C、G、A、及びTから選択されるヌクレオチドであり、前記プライマーは、好ましくは5'末端においてリン酸化されている。

好ましくは、セミランダムプライマーは、配列番号1(5'-NNNCCN-3')の配列を含むか、又は本質的にその配列を有する。

本発明の更なる目的は、ガイド配列を得るための方法であって、以下の工程:
a)先行する請求項のいずれか一項に規定のセミランダムプライマーを使用するRNA又はDNAからのDNA合成と、
b)分子生物学的方法によるガイド配列の生成と
を含む方法である。

ガイド配列は、好ましくは、cDNA合成及び/又は制限消化及び/又はDNAライゲーション及び/又はPCRを含む分子生物学的方法によって、大規模RNA又はDNAから生成される。

前記ガイド配列は、好ましくは、ガイド配列を得るために合成されたDNAを切断して生成される。得られたガイド配列は、好ましくは20塩基対からなる。

切断は、好ましくは、少なくとも1つのIII型制限酵素及び/又はIIS型制限酵素によって実施される。

好ましくは、切断は、その認識部位から25/27塩基対及び/又は14/16塩基対離れて切断する酵素によって実施される。

本発明の方法は、好ましくは、合成されたDNAを切断する前に、前記制限酵素のための制限部位を付加することによって合成されたDNAを修飾する工程を更に含む。

本発明の方法の好ましい実施形態において、工程b)は、以下の工程:
i)合成されたDNAの、
- III型の第1の制限部位及び/又はIIS型の第2の制限部位を含むリンカー配列の合成されたDNAの5'末端への付加、並びに/又は
- IIS型の第3の制限部位及び/又はIII型の第4の制限部位を含むリンカー配列の合成されたDNAの3'末端への付加
による修飾と、
ii)上に規定されるように修飾されたDNAを切断する工程と
を含む。

本発明の好ましい実施形態において、合成されたDNAは、
- III型の第1の制限部位及び/又はIIS型の第2の制限部位を含むリンカー配列の合成されたDNAの5'末端への付加、並びに
- IIS型の第3の制限部位及び/又はIII型の第4の制限部位を含むリンカー配列の合成されたDNAの3'末端への付加
によって修飾される。

より好ましくは、合成されたDNAは、
- III型の第1の制限部位を含むリンカー配列の合成されたDNAの5'末端への付加、並びに
- IIS型の第3の制限部位及びIII型の第4の制限部位を含むリンカー配列の合成されたDNAの3'末端への付加
によって修飾される。

好ましくは、合成されたDNAはdsDNAである。

好ましくは、RNAはmRNAであり、より好ましくは精製されたポリ(A)RNAである。

III型制限部位は、好ましくはEcoP15I又はEcoP1I制限部位からなる群から選択され、より好ましくはIII型制限部位はEcoP15Iである。

IIS型制限部位は、好ましくはAcuI、BbvI、BpmI、FokI、GsuI、BsgI、Eco57I、Eco57MI、BpuEI、又はMmeI制限部位からなる群から選択され、より好ましくはIIS型制限部位はAcuIである。

本発明の好ましい実施形態において、合成されたDNAの5'末端のリンカー配列は、好ましくはEcoP15I制限部位を含む。

好ましくは、合成されたDNAの3'末端のリンカー配列は、EcoP15I制限部位及びAcuI制限部位を含む。

好ましい実施形態において、合成されたDNAの5'末端のリンカー配列は、第5の制限部位、好ましくはBglII制限部位を更に含み、且つ/又は合成されたDNAの3'末端のリンカー配列は、第6の制限部位、好ましくはXbaI制限部位を更に含む。

BglII又はXbaIの代わりに他の好適な制限部位を使用してもよい。

好ましい実施形態において、合成されたDNAの3'末端のリンカーは:

又は

である。

好ましくは、上述の方法は、修飾されたDNAを特異的なIII型制限酵素により消化する工程i')を更に含む。

より好ましくは、方法は、消化されたDNAの5'末端に対してgRNA発現ベクターのためのクローニング部位である第7の制限部位、及び第8の制限部位、好ましくはAatII制限部位を含む、更なるリンカー配列を付加し、次いで任意選択で、5'の第5の制限部位に特異的な制限酵素、好ましくはBglII制限酵素に特異的な制限酵素によってDNAを消化する工程i'')を更に含む。

AatII又はBglIIの代わりに他の好適な制限部位を使用してもよい。

好ましくは、クローニング部位である制限部位は、BsmBI部位である。

上に規定される方法は、好ましくは、DNAを、好ましくはPCRによって増幅し、3'の第3の制限部位に特異的なIIS型制限酵素、及び任意選択で、第6の制限部位に特異的な制限酵素、好ましくはXbaIに特異的な制限酵素によって消化する工程i''')を更に含む。

上に規定される方法は、好ましくは、ガイド配列断片を消化したDNAから精製し、gRNA発現ベクターのためのクローニング部位である制限部位、及び任意選択で、第9の制限部位、好ましくはAatII制限部位を含む、更なるリンカー配列と3'末端において連結する工程i'''')を更に含む。

上に規定される方法は、好ましくは、DNAを、好ましくはPCRによって増幅し、クローニング部位に特異的な制限酵素、及び任意選択で、第9の制限部位に特異的な制限酵素、好ましくはAatIIによって消化する工程i''''')を更に含む。

次いで、好ましい実施形態において、25-bpの断片が精製される。

本発明の別の目的は、本発明の方法によって得ることが可能である、単離したガイド配列である。

本発明の更なる目的は、上に規定される単離したガイド配列に対応するRNAを含む、単離したsgRNAである。

本発明の別の目的は、CRISPR-Cas系sgRNAライブラリーを得るための方法であって、上に規定されるガイド配列をsgRNA発現ベクターにクローニングする工程と、前記ベクターをコンピテント細胞へと形質転換して、CRISPR-Cas系sgRNAライブラリーを得る工程とを含む方法である。

好ましくは、発現ベクターはレンチウイルスであり、且つ/又はベクターは、種特異的な機能性プロモーター、好ましくはpol IIIプロモーター、より好ましくはU6プロモーター、及び/若しくはgRNAスキャフォールド配列を含む。

本発明の更なる目的は、上に規定される方法によって得ることが可能である、CRISPR-Cas系sgRNAライブラリーである。

本発明の別の目的は、複数の遺伝子のゲノム座位における複数の標的配列を標的化する、複数のCRISPR-Cas系ガイド配列を含むライブラリーであり、前記標的化が遺伝子機能のノックアウトを生じ、
ユニークなCRISPR-Cas系ガイド配列は、上に規定されるセミランダムプライマーを用いて得られる。

前記複数の遺伝子は、好ましくは、セキショクヤケイ(Gallus gallus)遺伝子である。

本発明の別の目的は、本発明のライブラリーから選択される、単離したsgRNA又は単離したガイド配列である。

本発明の更なる目的は、好ましくは選択圧下で生存する個別の細胞ノックアウトを選択するため、及び/又対象によって示される1又は複数の生物学的症状又は医学的症状の遺伝的基盤を同定するため、及び/又はゲノム内の全ての遺伝子を並行してノックアウトするための、機能ゲノム研究用の上に規定されるガイド配列又は上に規定されるCRISPR-Cas系sgRNAライブラリー又は上に規定されるsgRNAの使用である。

本発明の他の目的は、上に規定される方法を実施するための上に規定されるセミランダムプライマーを含むキット、上に規定されるガイド配列又は上に規定されるCRISPR-Cas系sgRNAライブラリー又は上に規定されるsgRNAを含むキット;1又は複数のベクターを含むキットであって、各々のベクターが、本発明による少なくとも1つのガイド配列を含み、ベクターがtracrメイト配列に作動可能に連結された第1の調節エレメント及びtracrメイト配列の上流にあるガイド配列を含み、発現するとき、ガイド配列が、真核細胞内の標的配列とCRISPR複合体の配列特異的結合を導き、CRISPR複合体が、(1)ガイド配列及び(2)tracr配列にハイブリダイズしたtracrメイト配列と複合体化したCas9酵素を含む、キット;上に規定されるガイド配列又は上に規定されるsgRNAをコードする単離したDNA分子;上に規定されるDNA分子を含むベクター;上に規定されるDNA分子又は上に規定されるベクターを含む単離した宿主細胞であって、上に規定されるライブラリーによって形質導入されている、単離した宿主細胞である。

本発明において使用されるプライマーは、セミランダムプライマーであり、それは固定された配列とランダム配列の混合からなる。

一態様において、本発明は、ゲノム座位における複数の標的配列を標的化することができる複数のCRISPR-Cas系ガイド配列を含むライブラリーを提供し、前記標的化は遺伝子機能のノックアウトを生じる。

本発明はまた、本発明のライブラリーを含むキットをもまた包含する。ある態様において、キットは、本発明のライブラリーを含むベクターを含む単一の容器を含む。他の態様において、キットは、本発明のライブラリーを含むプラスミドを含む単一の容器を含む。本発明は、本発明のライブラリーからのユニークなCRISPR-Cas系ガイド配列の選択を含むパネルを含むキットをもまた包含し、選択は特定の生理的状態の指標である。キットは、本発明のライブラリーからのガイド配列を含むユニークなCRISPR-Cas系ガイドRNAの選択を含むパネルを含んでもよく、選択は特定の生理的状態の指標である。好ましい実施形態において、標的化は、全ゲノムの約100以上の配列、約1000以上の配列又は約20,000以上の配列であり、他の実施形態において、標的配列のパネルは、免疫経路又は細胞分裂のような関連するか又は所望の経路に焦点を当てる。一態様において、本発明は、複数の遺伝子のゲノム座位における複数の標的配列を標的化することができる複数のユニークなCRISPR-Cas系ガイド配列を含むゲノムワイドライブラリーを提供し、前記標的化は遺伝子機能のノックアウトを生じる。

本発明のある実施形態において、ガイド配列は全ゲノムから選択される複数の遺伝子のゲノム座位における複数の標的配列を標的化することができ、実施形態において、遺伝子は、全ゲノムの一部分を表し、例えば、特定の経路(例えば酵素経路)、或いは、特定の疾患又は疾患又は障害の群に関連する遺伝子を選択してもよい。遺伝子の1又は複数は、複数の標的配列を含んでもよく、すなわち、1つの遺伝子が、複数のガイド配列によって標的化されてもよい。ある実施形態において、遺伝子機能のノックアウトは必須ではなく、ある用途において、本発明は、前記標的化が遺伝子機能のノックダウンのみを生じるように実施してもよい。しかしながら、これは好ましくない。

別の態様において、本発明は、ゲノム内の全ての遺伝子を並行してノックアウトする方法であって、細胞集団を、
a)遺伝子産物をコードするDNA分子を標的化するCRISPR-Cas系キメラRNA (chiRNA)ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が
(a)標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列、
(b)tracrメイト配列、及び
(c)tracr配列
を含む、第1の調節エレメント、並びに
b)Casタンパク質及び選択マーカーに作動可能に連結された第2の調節エレメントを含む、1又は複数のパッケージ化されたベクターを含むベクター系を含む組成物と接触させる工程であって、成分(a)及び(b)が、系の同一又は異なるベクター上に配置され、各々の細胞が、単一のパッケージ化されたベクターによって形質導入又はトランスフェクトされる、工程と、
成功裏に形質導入された細胞を選択する工程であって、
転写されるとき、tracrメイト配列はtracr配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位内の標的配列とCRISPR複合体の配列特異的結合を導き、
CRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体化するCRISPR酵素を含み、
ガイド配列が、本発明のライブラリーから選択され、
ガイド配列が、遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位を標的化し、CRISPR酵素が遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位を切断し、それによって、細胞集団中の各々の細胞が、並行してユニークなノックアウトされた遺伝子を有する、工程と
を含む方法を提供する。

本方法及び使用は、任意の種類の細胞又は生物において実施してもよい。好ましい実施形態において、細胞は真核細胞である。真核細胞は、植物細胞又は動物細胞であってよく、例えば藻類又は微細藻類;プラナリアのような無脊椎動物;脊椎動物、好ましくはマウス、有蹄類、霊長類、ヒトを含む哺乳動物;昆虫であってよい。更なる実施形態において、ベクターはレンチウイルス、アデノウイルス又はAAVであり、且つ/又は第1の調節エレメントがU6プロモーターであり、及び/又は第2の調節エレメントがEPSプロモーター又はドキシサイクリン誘導性プロモーターであり、且つ/又はベクター系は1つのベクターを含み、且つ/又はCRISPR酵素はCas9である。本発明の態様において、細胞は真核細胞、好ましくはヒト細胞である。更なる実施形態において、細胞は0.3〜0.75の感染多重度(MOI)で形質導入され、好ましくはMOIは0.4に近い値を有し、より好ましくはMOIは0.3又は0.4である。

本発明はまた、選択圧下で生存する個別の細胞ノックアウトを選択する方法であって、
細胞集団を、
a)遺伝子産物をコードするDNA分子を標的化するCRISPR-Cas系キメラRNA (chiRNA)ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が
(a)標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列、
(b)tracrメイト配列、及び
(c)tracr配列
を含む、第1の調節エレメント、並びに
b)Casタンパク質及び選択マーカーに作動可能に連結された第2の調節エレメントを含む、1又は複数のパッケージ化されたベクターを含むベクター系を含む組成物と接触させる工程であって、成分(a)及び(b)が、系の同一又は異なるベクター上に配置され、各々の細胞が、単一のパッケージ化されたベクターによって形質導入又はトランスフェクトされる、工程と、
成功裏に形質導入された細胞を選択する工程であって、
転写されるとき、tracrメイト配列はtracr配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位内の標的配列とCRISPR複合体の配列特異的結合を導き、
CRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体化するCRISPR酵素を含み、
ガイド配列が、本発明のライブラリーから選択され、
ガイド配列が、遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位を標的化し、CRISPR酵素が遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位を切断し、それによって、細胞集団中の各々の細胞が、並行してユニークなノックアウトされた遺伝子を有する、工程と、
選択圧を適用する工程と、
選択圧下で生存する細胞を選択する工程と
を含む方法を包含する。

好ましい実施形態において、選択圧は、薬物の適用、細胞マーカーのFACSソーティング又は老化であり、且つ/又はベクターはレンチウイルス、アデノウイルス又はAAVであり、且つ/又は第1の調節エレメントがU6プロモーターであり、及び/又は第2の調節エレメントがEFSプロモーター又はドキシサイクリン誘導性プロモーターであり、且つ/又はベクター系は1つのベクターを含み、且つ/又はCRISPR酵素はCas9である。更なる実施形態において、細胞は0.3〜0.75の感染多重度(MOI)で形質導入され、好ましくはMOIは0.4に近い値を有し、より好ましくはMOIは0.3又は0.4である。本発明の態様において、細胞は真核細胞である。真核細胞は、植物細胞又は動物細胞であってよく、例えば藻類又は微細藻類;無脊椎動物;脊椎動物、好ましくはマウス、有蹄類、霊長類、ヒトを含む哺乳動物;昆虫であってよい。好ましくは細胞はヒト細胞である。本発明の好ましい実施形態において、方法は、DNAを抽出すること、及びディープシークエンシングによって、ガイド配列の欠失又は濃縮を決定することを更に含む。

他の態様において、本発明は、対象によって示される1又は複数の医学的症状の遺伝的基盤を同定する方法であって、
対象から生体試料を得、生体試料から第1の表現型を有する細胞集団を単離する工程と、
第1の表現型を有する細胞を、
a)遺伝子産物をコードするDNA分子を標的化するCRISPR-Cas系キメラRNA (chiRNA)ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が
(a)標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列、
(b)tracrメイト配列、及び
(c)tracr配列
を含む、第1の調節エレメント、並びに
b)Casタンパク質及び選択マーカーに作動可能に連結された第2の調節エレメントを含む、1又は複数のパッケージ化されたベクターを含むベクター系を含む組成物と接触させる工程であって、成分(a)及び(b)が、系の同一又は異なるベクター上に配置され、各々の細胞が、単一のパッケージ化されたベクターによって形質導入又はトランスフェクトされる、工程と、
成功裏に形質導入された細胞を選択する工程であって、
転写されるとき、tracrメイト配列はtracr配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位内の標的配列とCRISPR複合体の配列特異的結合を導き、
CRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体化するCRISPR酵素を含み、
ガイド配列が、本発明のライブラリーから選択され、
ガイド配列が、遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位を標的化し、CRISPR酵素が遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位を切断し、それによって、細胞集団中の各々の細胞が、並行してユニークなノックアウトされた遺伝子を有する、工程と、
選択圧を適用し、選択圧下で生存する細胞を選択する工程と、
第1の表現型と相互作用するDNA分子のゲノム座位を決定して対象によって示される1又は複数の医学的症状の遺伝的基盤を同定する工程と
を含む方法を包含する。

好ましい実施形態において、選択圧は、薬物の適用、細胞マーカーのFACSソーティング又は老化であり、且つ/又はベクターはレンチウイルス、アデノウイルス又はAAVであり、且つ/又は第1の調節エレメントがU6プロモーターであり、及び/又は第2の調節エレメントがEFSプロモーター又はドキシサイクリン誘導性プロモーターであり、且つ/又はベクター系は1つのベクターを含み、且つ/又はCRISPR酵素はCas9である。更なる実施形態において、細胞は0.3〜0.75の感染多重度(MOI)で形質導入され、好ましくはMOIは0.4に近い値を有し、より好ましくはMOIは0.3又は0.4であり、本発明の態様において、細胞は真核細胞、好ましくはヒト細胞である。

一態様において、本発明は、候補遺伝子がノックダウン又はノックアウトされている、記載される任意の実施形態による真核宿主細胞を含む、非ヒト真核生物、好ましくは多細胞真核生物を提供する。好ましくは、遺伝子はノックアウトされている。他の態様において、本発明は、記載される任意の実施形態によって改変されている真核宿主細胞を含む、真核生物、好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様のいくつかの実施形態における生物は、動物、例えば哺乳動物であってよい。同様に、生物は昆虫のような節足動物であってよい。生物はまた、植物であってもよい。更に、生物は真菌であってもよい。いくつかの実施形態において本発明は、非ヒト真核生物のセットを提供し、その各々が、候補遺伝子がノックダウン又はノックアウトされている、記載される任意の実施形態による真核宿主細胞を含む。好ましい実施形態において、セットは、複数の生物を含み、その各々において、異なる遺伝子がノックダウン又はノックアウトされている。

いくつかの実施形態において、CRISPR酵素は、真核細胞の核における検出可能な量の前記CRISPR酵素の蓄積を導くのに十分な強度の1又は複数の核酸局在配列を含む。いくつかの実施形態において、CRISPR酵素はII型CRISPR系酵素である。いくつかの実施形態において、CRISPR酵素はCas9酵素である。いくつかの実施形態において、Cas9酵素は、S. pneumoniae、S. pyogenes又はS. thermophilusのCas9であり、これらの生物由来の変異型Cas9を含んでもよい。酵素はCas9相同体又は相同分子種であってよい。いくつかの実施形態において、CRISPR酵素は、真核細胞における発現に最適化されたコドンである。いくつかの実施形態において、CRISPR酵素は標的配列の位置における1又は複数の鎖の切断を導き、いくつかの実施形態において、CRISPR酵素はDNA鎖切断能を欠く。いくつかの実施形態において、第1の調節エレメントはポリメラーゼIIIプロモーターである。いくつかの実施形態において、第2の調節エレメントはポリメラーゼIIプロモーターである。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、少なくとも15、16、17、18、19、20、25のヌクレオチド長、又は10〜30の間の、又は15〜25の間の、又は15〜20の間のヌクレオチド長である。有用な実施形態において、ガイド配列は20ヌクレオチド長である。

好ましい実施形態において、本発明は、有用な製薬用途を有し、例えば、本発明は、細胞を殺傷するように設計された任意の新薬(例えば、化学療法薬)が、KO遺伝子の突然変異に対していかに頑強であるかを試験するために利用され得る。癌は非常に速いペースで変異し、本発明のライブラリー及び方法は、化学療法が「エスケープ変異」に対して頑強である能力を予測するために、機能的ゲノムスクリーニングにおいて使用され得る。

本発明の一態様によると、真核細胞のゲノムDNAに相補的なRNAをコードする核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程と、RNAと相互作用し、部位特異的様式でゲノムDNAを切断する酵素をコードする核酸を真核生物にトランスフェクトする工程とを含む、真核細胞を改変する方法が提供され、細胞がRNAと酵素を発現し、RNAが相補的なゲノムDNAに結合し、そして酵素が部位特異的様式でゲノムDNAを切断する。前記ゲノムDNAに相補的なRNAをコードする核酸は、好ましくは本発明のガイド配列である。好ましくは、酵素はCas9又は修飾されたCas9又はCas9の相同体である。より好ましくは、真核細胞は酵母細胞、植物細胞、又は哺乳動物細胞である。一態様によると、RNAは、約20〜約100の間のヌクレオチドを含む。

本発明の一態様によると、目的の配列を切断するようCas9を導くために、ヒトU6ポリメラーゼIIIプロモーターから、本明細書において「ガイドRNA」(gRNA)とも呼ばれる、crRNA-tracrRNA融合転写物が発現される。gRNAは、細胞によって直接的に転写されてもよい。

本発明はまた、遺伝子ノックアウト細胞ライブラリーを生成する方法であって、I. Casタンパク質及びII.本発明のライブラリーの1又は複数のガイドRNAを含む操作された、天然に存在しないCRISPR-Cas系を含んでもよい1又は複数のベクターのベクター系を細胞集団の各々の細胞に導入する工程であって、成分I及びIIが、系の同一又は異なるベクター上にあってもよい、工程と、成分I及びIIを各々の細胞に組み込む工程であって、ガイド配列が各々の細胞のユニークな遺伝子を標的化し、Casタンパク質が調節エレメントに作動可能に連結され、転写されるとき、ガイド配列を含むガイドRNAはユニークな遺伝子のゲノム座位の標的配列とCRISPR-Cas系の配列特異的結合を導く、工程と、Casタンパク質によるゲノム座位の切断を誘導する工程と、細胞集団の各々の細胞の複数のユニークな遺伝子における異なるノックアウト変異を確認し、それによって遺伝子ノックアウト細胞ライブラリーを生成する工程を含む方法を提供する。本発明の実施形態において、Casタンパク質はCas9タンパク質である。別の実施形態において、1又は複数のベクターはプラスミドベクターである。更なる実施形態において、Casタンパク質に作動可能に連結された調節エレメントは、例えばドキシサイクリン誘導性プロモーターのような誘導性プロモーターである。本発明は、細胞集団が真核細胞の集団であることを包含し、好ましい実施形態において、細胞集団が胚性幹(ES)細胞の集団であり、好ましくは非ヒトである。別の態様において、本発明は、機能的ゲノム研究のためのゲノムワイドライブラリーの使用を提供する。そのような研究は、DNA配列又は構造のようなゲノム情報の静的な側面とは対照的に、遺伝子転写、翻訳、及びタンパク質間の相互作用のような、動的な側面に焦点を当てるものであるが、それらの静的な側面が非常に重要であり、細胞メカニズム及び分子メカニズムの理解を補うものである。機能ゲノミクスは、遺伝子、RNA転写物、及びタンパク質産物のレベルでDNAの機能に関する問いに答えることを試みる。機能ゲノミクス研究の主要な特徴はこれらの問いに対するゲノムワイドなアプローチであり、より伝統的な「遺伝子ごとの」アプローチではなく、ハイスループットの方法を一般的に用いる。遺伝子及び遺伝情報の膨大な
在庫を考慮すると、遺伝子スクリーニングを用いて、これらの遺伝子が何をするのか、それらがどのような細胞経路に関与するのか、及び遺伝子発現の任意の変動がいかに特定の生物学的プロセスをもたらし得るのかという情報を提供することは有益である。

好ましくは、送達は、レンチウイルス、若しくはバキュロウイルス、又は好ましくはアデノウイルス/アデノ随伴ウイルスのベクターのようなウイルスベクターであってよいベクターの形態であるが、(酵母系、微小胞、遺伝子銃/ベクターを金ナノ粒子に付着させる手段のような)他の送達の手段も公知であり、提供される。ベクターはウイルス又は酵母系(例えば、目的の核酸がプロモーターに作動可能に連結されプロモーターの制御下(最終的にプロセシングされたRNAを提供するような発現に関して)にあってよい)のみを意味するのではなく、核酸の宿主細胞への直接的な送達をも意味してもよい。本明細書における方法において、ベクターがウイルスベクターであってよく、これは有利にはAAVである一方で、本明細書において論じられるような、レンチウイルスのような他のウイルスもまた利用できる。例えば、バキュロウイルスを昆虫細胞における発現のために使用してもよい。これらの昆虫細胞は、結果的に、本発明の送達に適合したAAV又はレンチウイルスベクターのような、更なるベクターを大容量産生するのに有用である。また、CRISPR酵素をコードするmRNAを細胞に送達する工程を含む、本発明のCRISP酵素を送達する方法も想定される。ある実施形態において、CRISR酵素が短縮されており、且つ/又は1000アミノ酸未満か若しくは4000アミノ酸未満からなり、且つ/又はヌクレアーゼ若しくはニッカーゼであり、且つ/又はコドン最適化されており、且つ/又は1又は複数の変異を含み、且つ/又はキメラCRISPR酵素を含み、且つ/又は本明細書において論じられるような他の選択肢のものであることが理解されるであろう。AAV及びレンチウイルスベクターが好ましい。

ウイルス送達:CRISPR酵素、例えばCas9、及び/又は本発明のRNAの任意のもの、例えば、ガイドRNAは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、アデノウイルス、若しくは他のウイルスベクター型、又はそれらの組み合わせを用いて送達できる。Cas9及び1又は複数のガイドRNAは、1又は複数のウイルスベクターへとパッケージ化することができる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、例えば筋肉内注射によって目的の組織へと送達され、一方で他のときには、ウイルス送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、経口、粘膜又は他の送達方法を介する。そのような送達は、単回投与又は複数回投与のいずれかであってよい。当業者なら、本明細書における送達すべき実際の用量が、ベクター選択、標的細胞、生物又は組織、処置される対象の一般的な状態、求められている形質転換/修飾の程度、投与経路、投与様式、求められている形質転換/修飾の型等のような、様々な要素に依存して大きく変動し得ことを理解する。

本発明の一態様は、複数のゲノム座位における複数の標的配列を標的化することができる複数のガイド配列を含んでもよい複数のCRISPR-Cas系ガイドRNAを含んでもよいゲノムワイドライブラリーを包含し、前記標的化は遺伝子機能のノックアウトを生じる。このライブラリーは、生物のゲノムの各々の遺伝子を標的化するガイドRNAを潜在的に含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態において、生物又は対象は、真核生物(ヒトを含む哺乳動物を含む)、又は非ヒト真核生物、若しくは非ヒト動物、若しくは非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態において、生物又は対象は、非ヒト動物であり、節足動物、例えば昆虫であってもよく、又は線虫であってもよい。本発明のいくつかの方法において、生物又は対象は植物である。本発明のいくつかの方法において、生物又は対象は哺乳動物又は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えば、げっ歯類(好ましくはマウス若しくはラット)、有蹄動物、又は霊長類である。本発明のいくつかの方法において、生物又は対象は微細藻類を含む藻類、又は真菌である。

セミランダムプライマーの長さ及び配列は、ガイド配列生成戦略によって修正してもよい。EcoP15Iは、本発明の方法にとって、現在最も好適なIII型制限酵素である。この酵素は、その認識配列から27bp離れた位置を切断し、ガイド配列は、17bpの最小限の長さを必要とするであろう。セミランダムプライマーは、認識部位とガイド配列の橋渡しをし、セミランダムプライマーの最大限の長さは10merであり得る。cDNA合成プライマーの最小限の長さは4merであり得る。したがって、PAMを含むセミランダムプライマーは、N(0〜7)CCN(1〜8)の4〜10merの変動を有し得る。この配列はSpのCas9に最適化されている一方で、セミランダムプライマーの配列は、異なる種由来のCas9のPAM配列に応じて更にカスタマイズすることができる。

標的配列を認識するために、Cas9は、標的配列に近接するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要とする。PAM配列は、標的DNA中において必要とされるが、gRNA中においてはそうではない。PAM配列は、異なる細菌種由来のCas9に応じて変動する。例えば、NGGは、S.ピオゲネス(Sp)のCas9のためのPAM配列であり、それは、最も広く用いられるII型CRISPR系のためのエンドヌクレアーゼである。他の種由来のCas9のPAM配列は、例えば、ナイセリアメニンギティディス(NM)に対してNNNNGATT、ストレプトコッカスサーモフィルス(ST)に対してNNAGAAW、及びトレポネーマデンティコラ(TD)に対してNAAAACである。

セミランダムプライマーの配列は、実験デザインに応じて変更できる。代替的な好ましい実施形態において、セミランダムプライマーの配列は5' NNCCNN 3'である。PAMは異なる種由来のCas9の間で異なり、したがってセミランダムプライマーを修正してもよい。

CRISPR系を使用するために、gRNAを発現してCas9に動員する必要がある。gRNA発現ベクターにおいて、gRNA発現を、特定の種又は細胞型において機能するプロモーターによって駆動してもよい。Pol IIIプロモーターは、単鎖RNAの所望の長さの発現に好適であるため、典型的には、U6プロモーターのようなPol IIIプロモーターがgRNA発現に使用される。gRNA発現ベクターにおいて、ガイド配列クローニング部位の後に、gRNAスキャフォールド配列(例えば、図2bに述べられるような配列又はその適切な変異体)が続く。gRNAスキャフォールドは折りたたまれ、Cas9に組み込まれ、したがって、gRNAのCas9エンドヌクレアーゼ中への動員及び適切な配置を可能にする。この場合、Cas9をコードする別のベクターを使用するであろう。

量及び配合について、本発明の実施に有用な全てを含む、方法、物質、送達ビヒクル、ベクター、粒子、AAV、並びにそれらの作製及び使用を含む、CRISPR-Cas系、それらの成分、及びそのような成分の送達の、一般的な情報に関して、以下を参照できる:米国特許第8,697,359号、米国特許第8,771,945号、米国特許第8,795,965号、米国特許第8,865,406号、及び米国特許第8,871,445号、米国特許出願公開第2014-0287938(A1)号(米国特許出願連続番号第14/213,991号)、米国特許出願公開第014-0273234(A1)号(米国特許出願連続番号第14/293,674号)、米国特許出願公開第2014-0273232(A1)号(米国特許出願連続番号第14/290,575号)、米国特許出願公開第2014-0273231号(米国特許出願連続番号第14/259,420号)、米国特許出願公開第2014-0256046(A1)号(米国特許出願連続番号第14/226,274号)、米国特許出願公開第2014-0248702(A1)号(米国特許出願連続番号第14/258,458号)、米国特許出願公開第2014-0242700(A1)号(米国特許出願連続番号第14/222,930号)、米国特許出願公開第2014-0242699(A1)号(米国特許出願連続番号第14/183,512号)、米国特許出願公開第2014-0242664(A1)号(米国特許出願連続番号第14/104,990号)、米国特許出願公開第2014-0234972(A1)号(米国特許出願連続番号第14/183,471号)、米国特許出願公開第2014-0227787(A1)号(米国特許出願連続番号第14/256,912号)、米国特許出願公開第2014-0189896(A1)号(米国特許出願連続番号第14/105,035号)、米国特許出願公開第2014-0186958号(米国特許出願連続番号第14/105,017号)、米国特許出願公開第2014-0186919(A1)号(米国特許出願連続番号第14/104,977号)、米国特許出願公開第2014-0186843(A1)号(米国特許出願連続番号第14/104,900号)、米国特許出願公開第2014-0179770(A1)号(米国特許出願連続番号第14/104,837号)、及び米国特許出願公開第2014-0179006(A1)号(米国特許出願連続番号第14/183,486)、PCT特許公開WO2014/093661(PCT/US2013/074743)、WO2014/093694(PCT/US2013/074790)、WO2014/093595(PCT/US2013/074611)、WO2014/09371 8(PCT/US2013/074825)、WO2014/093709(PCT/US2013/074812)、WO2014/093622(PCT/US2013/074667)、WO2014/093635(PCT/US2013/074691)、WO2014/093655(PCT/US2013/074736)、WO2014/093712(PCT/US2013/074819)、WO2014/093701(PCT/US2013/074800)、及びWO2014/018423(PCT/US2013/051418)、それぞれ2013年10月28日及び2013年12月9日に出願され、いずれも「FUNCTIONAL GENOMICS USING CRISPR-CAS SYSTEMS, COMPOSITIONS, METHODS, SCREENS AND APPLICATIONS THEREOF」の名称である、米国仮特許出願第61/961,980号、及び米国仮特許出願第61/963,643号、2014年6月10日に出願されたPCT/US2014/041806、2013年6月17年、2013年9月25日、及び2014年4月15日に出願された、米国仮特許出願第61/836,123号、米国仮特許出願第61/960,777号、及び米国仮特許出願第61/995,636号、並びに2013年12月12日に出願されたPCT/US 13/74800。:それぞれ2012年12月12日、2013年1月2日、2013年3月15日、及び2013年6月17日に出願された、米国仮特許出願第61/736,527号、米国仮特許出願第61/748,427号、米国仮許出願第61/791,409号、及び米国仮特許出願第61/835,931号もまた参照できる。それぞれ2013年1月29日、及び2013年2月25日に出願された、米国仮特許出願第61/757,972号、及び
米国仮特許出願第61/768,959号もまた参照できる。いずれも2013年6月17日に出願された、米国仮特許出願第61/835,931号、米国仮特許出願第61/835,936号、米国仮特許出願第61/836,127号、米国仮特許出願第61/836,101号、米国仮特許出願第61/836,080号、及び米国仮特許出願第61/835,973号もまた参照できる。これらの出願の各々、及びそれらにおいて、又はその審査経過において引用される全ての文献(「引用文献」)、並びに引用文献において引用されるか又は参照される全ての文献は、それらに述べられるか又はそれらの任意の文献中の、及び本明細書に参照により組み入れられる、製品に関する指示書、説明書、製品仕様、及び製品シートと共に、参照により本明細書に組み入れられ、そして本発明の実施において利用してもよい。全ての文献(例えば、それらの出願及び引用文献)は、それぞれ個別の文献が、具体的に及び個々に、それぞれ参照により組み入れられると示されているのと同じ程度、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に引用される文献への引用は、上述の本明細書において引用される文献、及び、以下で本明細書に引用されるものにも見出し得る。

CRISPR-Cas系に関する一般的な情報に関しても、以下に言及されている:
> 「Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.」Cong, L.、Ran, F.A.、Cox, D.Lin, S.、Barretto, R.、Habib, N.、Hsu, P.D.、Wu, X.、Jiang, W.、Marraffini, L.A.、及びZhang, F. Science 2月15日15;339(6121):819〜23頁(2013);
> 「RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.」Jiang W.、Bikard D.、Cox D.、Zhang F、Marraffini LA. Nat Biotechnol 3月;31(3):233〜9頁(2013);
> 「One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas- Mediated Genome Engineering.」Wang H.、Yang H.、Shivalila CS.、Dawlaty MM、Cheng AW.、Zhang F.、Jaenisch R. Cell 5月9日;153(4):910〜8頁(2013);
> 「Optical control of mammalian endogenous transcription and epi genetic states.」onermann S、Brigham MD、Trevino AE、Hsu PD、Heidenreich M、Cong L、Piatt RJ、Scott DA、Church GM、Zhang F. Nature. 2013年8月22日;500(7463):472〜6頁. doi: 10.1038/Naturel 2466. Epub 2013年8月23日;
> 「Double Niching by RNA-Guided CRISPR Cas for Enhanced Genome Editing Specificity.」Ran, FA.、Hsu, PD.、Lin, CY.、Gootenberg, JS.、Konermann, S.、Trevino, AE.、Scott, DA.、Inoue, A.、Matoba, S.、Zhang, Y.、及びZhang, F. Cell 8月28日. pii: 80092-8674(13)01015-5. (2013/;
> 「DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.」Hsu, P.、Scott, D.、Weinstein, J.、Ran, FA.、Konermann, S.、Agarwala, V.、Li, Y.、Fine, E.、Wu, X.、Shalem, O.、Cradick, TJ.、Marraffini, LA.、Bao, G.、及びZhang, F. Nat Biotechnol 2013年9月;31(9):827〜32頁. doi: 10.1038/nbt2647. Epub 2013年7月21日;
> 「Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.」Ran, FA.、Hsu, PD.、Wright, J.、Agarwala, V.、Scott, DA.、Zhang, F. Nature Protocols 11月;8(l 1):2281〜308頁. (2013);
> 「Genome-Scale CRISPR- Cas9 Knockout Screening in Human Cells.」Shalem, O.、Sanjana, NE.、Hartenian, E.、Shi, X.、Scott, DA.、Mikkelson, T.、Heckl, D.、Ebert, BL.、Root, DE.、Doench, JG.、Zhang, F. Science 12月12日, (2013). [Epub ahead of print];「Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA.」Nishimasu, FL、Ran, FA、Hsu, PD.、Konermann, S.、Shehata, SI、Dohmae、Ishitatii, R.、Zhang, F.、Nureki, O. Cell 2月27日(2014). 156(5):935〜49頁;
> 「Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.」Wu X.、Scott DA.、Kriz AJ.、Chiu AC、Hsu PD.、Dadon DB.、Cheng AW.、Trevino AE.、Konermann S.、Chen S.、Jaenisch R.、Zhang F.、Sharp PA. Nat Biotechnol. (2014)4月20日. doi: 10.1038/nbt.2889,
> 「Development and Applications of CRISPR- Cas 9 for Genome Engineering」Hsuら、Cell 157, 1262〜1278頁(2014年6月5日) (Hsu 2014),
> 「Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system」Wangら、Science.2014年1月3日; 343(6166): 80〜84頁. doi: 10.1126/science.1246981、及び
> 「Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation」Doenchら、Nature Biotechnology published online 2014年9月3日; doi: 10.1038/nbt.3026.
各々は参照により本明細書に組み入れられる。

用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体のような、1又は複数の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。

本発明の一態様において、用語「キメラRNA」、「キメラガイドRNA」、「ガイドRNA」、「シングルガイドRNA」、及び「合成ガイドRNA」は、交換可能に使用され、ガイド配列、tracr配列、及びtracrメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。

用語「ガイド配列」は、標的部位を特定するガイドRNA中の約20bpの配列を指し、用語「ガイド」又は「スペーサー」と交換可能に使用してもよい。本明細書において用語「ガイド配列」は、対応するDNA又はRNAガイド配列をコードするDNAをも含む。

表現「単離したガイド配列に対応するRNA」は、DNAガイド配列にコードされるRNAを含む。用語「tracrメイト配列」は、用語「ダイレクトリピート」と交換可能に使用してもよい。

用語「sgRNAライブラリー」及び「gRNA」ライブラリーは、交換可能に使用してもよい。それらは、シングルガイドRNA又はガイド配列を含み得る。

「相補性」は、伝統的なワトソン・クリック塩基対形成又は他の非伝統的な型のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、第2の核酸配列と(例えばワトソン・クリック塩基対形成によって)水素結合を形成できる核酸分子中の残基の百分率を示す(例えば、10中5、6、7、8、9、10は、50%、60%、70%、80%、90%、及び100%相補的である)。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての連続的な残基が第2の核酸配列の同数の連続的な残基と水素結合するであろうことを意味する。本明細書において使用されるとき、「実質的に相補的」は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、若しくはそれ超のヌクレオチドの領域にわたる、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、若しくは100%である相補的の度合いを指すか、又はストリンジェントな条件においてハイブリダイズする2つの核酸を指す。

本明細書において使用されるとき、ハイブリダイゼーションについての「ストリンジェントな条件」は、標的配列への相補性を有する核酸が標的配列と主にハイブリダイズし、非標的の配列に実質的にハイブリダイズしないような条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に配列依存性であり、いくつかの要素に応じて変動する。一般的に、配列がより長くなると、配列が標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が上昇する。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen(1993)、「Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology- Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter『Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay』」、Elsevier, N.Yに詳細に記載される。

所定の配列にハイブリダイズすることのできる配列は、所定の配列の「相補体」と呼ばれる。

本明細書において使用されるとき、「発現」は、それによってポリヌクレオチドがDNA鋳型より(mRNA若しくは他のRNA転写物へのように)転写されるプロセス、及び/又は、それによって転写されたmRNAが続いて、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドが、集合的に「遺伝子産物」を指してもよい。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含む。

本発明のいくつかの態様は、1若しくは複数のベクターを含むベクター系、又はそのようなベクターに関する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞におけるCRISPR転写物(例えば、核酸転写物、タンパク質又は酵素)の発現のために設計できる。代替的に、組換え発現ベクターは、インビトロにおいて転写及び翻訳することができ、例えば、本発明の態様に包含されるレンチウイルスベクターは、U6 RNA pol IIIプロモーターを含んでもよい。

ベクターは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖である核酸分子、1又は複数の自由末端を含む核酸分子、自由末端を含まない(例えば環状)核酸分子、DNA、RNA又はその両方を含む核酸分子、及び当該技術分野に公知の他の様々なポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。他の型のベクターは「プラスミド」であり、それは、標準的な分子クローニング技術等により、追加的なDNAセグメントを挿入することのできる、環状二重鎖DNAループを指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルス由来のDNA又はRNA配列が、ウイルス(例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)へパッケージ化するためのベクター中に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へとトランスフェクトするためにウイルスによって獲得されたポリヌクレオチドを含む。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的複製が可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。更に、あるベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を駆動し得る。本明細書において、そのようなベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。組換えDNA技術において有用な一般的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。

組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含み得、それは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択してもよい、発現すべき核酸配列に作動可能に連結される1又は複数の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結」は、目的のヌクレオチド配列が調節エレメントにヌクレオチド配列の発現(例えば、インビトロ転写/翻訳系、又はベクターが宿主細胞に導入されるとき、宿主内において)を可能とする様式で連結されることを意味することを意図する。

用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位(IRES)、及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリU配列のような転写終結シグナル)を含むことを意図する。そのような調節エレメントは、例えば、Goeddel、「GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185」Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載される。調節エレメントは、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの、及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの(例えば組織特異的調節配列)を含む。調節エレメントはまた、細胞周期依存的、又は発生段階依存的な様式のような、時間依存的な様式で発現を導いてもよく、それは組織又は細胞の型特異的であっても、そうでなくてもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは、1若しくは複数のpol IIIプロモーター(例えば、1、2、3、4、5若しくはそれ超のpol IIIプロモーター)、1若しくは複数のpol IIプロモーター(例えば、1、2、3、4、5若しくはそれ超のpol IIプロモーター)、1若しくは複数のpol Iプロモーター(例えば、1、2、3、4、5若しくはそれ超のpol Iプロモーター)、又はそれらの組み合わせを含む。Pol IIIプロモーターの例は、U6及びHIプロモーターを含むが、これらに限定されない。Pol IIプロモーターの例は、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(R.SV)LTRプロモーター(任意選択でRSVエンハンサーと共に)、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(任意選択でCMVエンハンサーと共に)[例えばBoshartら、Cell, 41 :521〜530頁(1985)を参照]、SV4Gプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーターを含むが、これらに限定されない。WPRE、CMVエンハンサー、HTLV-IのLTR中のR-U5'セグメント(Mol. Cell. Biol, Vol. 8(1), 466〜472頁, 1988)、SV40エンハンサー、及びウサギβ-グロビンの第2エクソンと第3エクソンの間のイントロン配列(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), 1527〜31頁, 1981)等のエンハンサーエレメントもまた、用語「調節エレメント」によって包含される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベル等の要素に依存し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ベクターは宿主細胞に導入され得、それによって、(例えば、クラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)転写物、タンパク質、酵素、それらの変異体、それらの融合タンパク質等の)本明細書に記載されるような核酸によってコードされる、融合タンパク質又は融合ペプチドを含む転写物、タンパク質又はペプチドを産生することができる。

有益なベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスを含み、そのようなベクターの型は、特定の型の細胞を標的とするために選択することもできる。本発明の態様において、ベクターはパッケージ化されたベクターを含んでもよいが、これらに限定されない。本発明の他の態様において、細胞又は宿主細胞の集団は、低い感染多重度(MOI)でベクターを形質導入してもよい。本明細書において使用されるとき、MOIは、感染性因子(例えばファージ又はウイルス)の感染標的(例えば細胞)に対する比である。例えば、感染性ウイルス粒子を播種された細胞集団に言及するとき、感染多重度又はMOIは、感染性ウイルス粒子の数の、規定された空間(例えばプレートのウェル)に存在する標的細胞の数に対する比である。本発明の実施形態において、細胞は、0.3〜0.75又は0.3〜0.5のMOIで形質導入され、好ましい実施形態において、MOIは、0.4に近い値を有し、より好ましい実施形態において、MOIは0.3である。本発明の態様において、本発明のベクターライブラリーは、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、又は80%の形質導入効率を得るためにプレートのウェルに適用してもよい。好ましい実施形態において、形質導入効率は、約30%であり、それは、レンチCRISPRコンストラクト当たり約370〜400個の細胞であってよい。より好ましい実施形態において、それはレンチCRISPRコンストラクト当たり400個の細胞であってよい。

いくつかの実施形態において、調節エレメントは、CRISPR系の1又は複数のエレメントに作動可能に連結して、CRISPR系の1又は複数のエレメントの発現を導く。一般的に、SPIDR(スペーサー散在型ダイレクトリピート)としても知られるCRISPR(クラスター化等間隔短鎖回文リピート)は、通常、特定の細菌種に特異的であるDNA座位のファミリーを構成する。CRISPR座位は、大腸菌において識別された、散在する短鎖リピート(SSR)の異なるクラス、及び関連する遺伝子を含む(Ishinoら、J. Bacterid., 169:5429〜5433頁[1987];及びNakataら、J. Bacterid., 171 :3553〜3556頁[1989])。同様に、散在するSSRは、Haloferax mediterranei、Streptococcus pyogenes、Anabaena、及びMycobacterium、tuberculosisにおいて見出されている(Groenenら、Mol. Microbiol, 10: 1057〜1065頁[1993]; Hoeら、Emerg. Infect. Dis., 5:254〜263頁[1999];Masepohlら、Biochim. Biophys. Acta 1307:26〜30頁[1996];及びMojicaら、Mol. Microbiol, 17:85〜93頁[1995]を参照)CRISPR座位は、典型的には、短鎖等間隔リピート(short regularly spaced repeats)(SRSR)と名付けられたリピートの構造において、他のSSRと異なる(Janssenら、OMICS J. Integ. Biol, 6:23〜33頁[2002];及びMojicaら、Mol. Microbiol, 36:244〜246頁[2000])。一般的に、リピートは、実質的に一定の長さの独特の介在配列によって規則的に間隔を空けられているクラスターに存在する短いエレメントである(Mojicaら、[2000]上述される)。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在するリピートの数及びスペーサー領域の配列は、典型的には株ごとに異なる(van Embdenら、J, Bacteriol, 182:2393〜2401頁[2000])。CRISPR座位は、アエロピルム属、ピロバキュラム属、スルホロブス属、アーケオグロブス属、ハロアーキュラ属(halocarcula)、メタノバクテリウム属(Methanol) acterium)、メタノコッカス属、メタノサルシナ属、メタノピュルス属、パイロコッカス属、ピクロフィルス属、サーモプラズマ属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ストレプトマイセス属、アクウィフェクス属、ポルフィロモナス属、クロロビウム属、テルムス属、バシラス属、リステリア属、ブドウ球菌属、クロストリジウム属、サーモアナエロバクター属(Therrnoanaerobacter)、マイコプラズマ属、フソバクテリウム属、アゾアルカス属(Azarcus)、クロモバクテリウム属、ナイセリア属、ニトロソモナス属、デスルホビブリオ属、ジオバクター属、ミクソコッカス属、カンピロバクター属、ウォリネラ属、アシネトバクター属、エルウイニア属、大腸菌属、レジオネラ属、メチロコッカス属、パスツレラ属、フォトバクテリウム属、サルモネラ属、ザントモナス属、エルシニア属、トレポネーマ属、及びテルモトガ属を含むが、これらに限定されない40超の原核生物において見出されている(例えば、Jansenら、Mol. Microbiol, 43 ; 1565〜1575頁[2002];及びMojicaら[2005]を参照)。

本発明の態様において、機能ゲノミクススクリーンは、例えば遺伝疾患、癌、真菌、原生動物、細菌及びウイルス感染、虚血、血管疾患、関節炎、免疫学的障害等のような治療のための新規薬物の発見を含む、新規のヒト及び哺乳動物の治療応用の発見を可能にする。本明細書において使用されるとき、アッセイ系は、例えば増殖、足場依存性、増殖因子依存性、病巣形成、ソフトアガーにおける増殖、ヌードマウスにおける腫瘍増殖、及びヌードマウスにおける腫瘍血管新生における変化のような例えば形質転換アッセイ;例えばDNAラダー及び細胞死、アポトーシスに関与する遺伝子の発現のようなアポトーシスアッセイ;例えばホルモン及び神経伝達物質放出における細胞内カルシウム、cAMP、cGMPの変化のようなシグナル伝達アッセイ;例えばエストロゲン受容体及び細胞増殖のような受容体アッセイ;例えばEPO、低酸素及び赤血球コロニー形成単位アッセイのような増殖因子アッセイ;例えばFAD-2誘導油不飽和化のような酵素産物アッセイ;例えばレポーター遺伝子アッセイのような転写アッセイ;並びに、例えばVEGFのELISAのようなタンパク質産生アッセイのように細胞の状態又は表現型の変化の読み取りに使用してもよい。

本発明の態様は遺伝子発現の調節に関し、調節は、標的候補遺伝子の発現によって間接的又は直接的に影響を受ける任意のパラメーターを測定することによってアッセイできる。そのようなパラメーターは、本明細書に記載されるような、例えば、RNA又はタンパク質レベルにおける変化、タンパク質活性における変化、生成物レベルにおける変化、下流遺伝子発現における変化、レポーター遺伝子転写(ルシフェラーゼ、CAT、bet.-galactosidase、beta-glucuronidase、GFP(例えばMistili及びSpector、Nature Biotechnology 15:961〜964頁(1997)を参照)における変化;シグナル伝達、リン酸化及び脱リン酸化、受容体-リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度(例えば、cGMP、cAMP、IP3)、細胞増殖、並びに血管新生における変化、等を含む。これらのアッセイは、インビトロ、インビボ及びエクスビボであり得る。そのような機能的効果は、本明細書に記載されるような、例えば、RNA又はタンパク質レベルの測定、RNA安定性の測定、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導性マーカー、リガンド結合アッセイを介する下流又はレポーター遺伝子発現の同定、cGMP及びイノシトール三リン酸(IP3)のような細胞内セカンドメッセンジャーにおける変化、細胞内カルシウムレベルにおける変化、サイトカイン放出等のような、当業者に公知の任意の手段によって測定できる。

CRISPR-Cas系によって調製される遺伝子発現のレベルの測定のために、CRISPR-Cas系と接触した細胞を、例えば、CRISPR-Cas系を含まないか、非特異的CRISPR-Cas系を含む細胞のようなコントロール細胞と比較して、阻害又は活性化の程度を検査する。コントロール試料に、100%の相対遺伝子発現活性値を割り当てることができる。遺伝子発現の調節/阻害は、コントロールと比較した遺伝子発現活性値が約80%、好ましくは50%(すなわち、コントロールの活性の0.5倍)、より好ましくは25%、より好ましくは5〜0%であるとき、達成される。遺伝子発現の調節/活性化は、コントロールと比較した遺伝子発現活性値が110%、より好ましくは150%(すなわち、コントロールの活性の1.5倍)、より好ましくは200〜500%、より好ましくは1000〜2000%以上であるとき、達成される。

一般的に、「CRISPR系」、「CRISPR-Cas」又は「CRISPR-Cas系」は、Cas遺伝子をコードする配列、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えば、tracrRNA又は活性化部分的tracrRNA)、tracrメイト配列(内在性CRISPR系の文脈における「ダイレクトリピート」及びtracrRNA処理部分的ダイレクトリピートを含む)、ガイド配列(内在性CRISPR系文脈において「スペーサー」とも呼ばれる)、又はCRISPR座位からの他の配列及び転写物を含む、CRISPR-関連(「Cas」)遺伝子の発現に関与するか又はその活性を導く転写物又は他の因子を集合的に指してもよい。いくつかの実施形態において、CRISPR系のl又は複数の因子は、I型、II型、又はIII型CRISPR系由来である。いくつかの実施形態において、CRISPR系のl又は複数の因子は、Streptococcus pyogenesのような、内在性CRISPR系を含む特定の生物由来である。一般的に、CRISPR系は、標的配列の部位においてCRISPR複合体の形成を促進する因子(内在性CRISPR系文脈においてプロトスペーサーとも呼ばれる)によって特徴付けられる。CRISPR複合体形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列の間のハイブリダイゼーションがCRISPR複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在するならば、完全な相補性は必要とは限らない。標的配列は、DNA又はRNAのポリヌクレオチドのような任意のポリヌクレオチドを含んでよい。いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置する。いくつかの実施形態において、標的配列は、例えば、ミトコンドリア又は葉緑体のような真核細胞の細胞小器官内に存在してもよい。標的配列を含む標的座位への組換えに使用され得る配列又はテンプレートは、「編集テンプレート」又は「編集ポリヌクレオチド」又は「編集配列」と呼ばれる。本発明の態様において、外来性テンプレートポリヌクレオチドは、編集テンプレートと呼ばれ、本発明の態様において、組換えは相同組換えである。

典型的に、内在性CRISPR系の文脈において、CRISPR複合体(標的配列にハイブリダイズして1又は複数のCasタンパク質と複合体形成するガイド配列を含む)の形成は、標的配列内又はその近接(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50又はそれ超の塩基対離れている)の1又は両方の鎖の切断を生じる。理論に拘束されることは望まないが、野生型のtracr配列の全て又は一部分を含むか、又はそれからなってよい、tracr配列(例えば、野生型tracr配列の約20、26、32、45、48、54、63、67、85又はそれ超のヌクレオチド)はまた、ガイド配列に作動可能に連結するtracrメイト配列の全て又は一部分に対するtracr配列の少なくとも一部分に沿ったハイブリダイゼーションによる等で、CRISPR複合体の部分を形成してもよい。いくつかの実施形態において、tracr配列は、ハイブリダイズしてCRISPR複合体の形成に参加するのに十分なtracrメイト配列に対する相補性を有する。標的配列に関して、十分に機能的であるのなら、完全な相補性は必要ではないと信じられている。いくつかの実施形態において、tracr配列は、最適にアラインメントされるとき、tracrメイト配列の長さに沿って、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は99%の配列相補性を有する。いくつかの実施形態において、CRISPR系の1又は複数の因子の発現を導く1又は複数のベクターを宿主細胞に導入して、CRISPR系の因子の発現が1又は複数の標的部位におけるCRISPR複合体の形成を導くようにする。例えば、Cas酵素、tracrメイト配列に連結したガイド配列、及びtracr配列は、各々別々のベクター上の別々の調節エレメントに作動可能に連結できる。代替的に、同一又は異なる調節エレメントから発現する2又はそれ超のエレメントが単一のベクター中で組み合わされてもよく、第1のベクターに含まれないCRISPR系の任意の成分を提供する1又は複数の追加のベクターを伴い、単一のベクター中で組み合わされたCRISPR系因子は、1の因子が第2の因子に対して5'(上流)に配置されるか又は3'(下流)に配置されるように、任意の好適な向きに配置されてもよい。1の因子のコード配列は、第2の因子のコード配列と同一の鎖又は反対の鎖上に配置されてもよく、且つ同一の又は逆の向きに向けられてもよい。いくつかの実施形態において、単一のプロモーターがCRISPR酵素をコードする転写物の発現を導き、1又は複数のガイド配列、tracrメイト配列(任意にガイド配列に作動可能に連結される)、及びtracr配列が、1又は複数のイントロン配列内(例えば、各々が異なるイントロン、少なくとも1のイントロン中に2若しくはそれ以上、又は単一のイントロンに全て)に埋め込まれる。いくつかの実施形態において、CRISPR酵素、ガイド配列、tracrメイト配列、及びtracr配列が、同一のプロモーターに作動可能に連結されて発現する。

いくつかの実施形態において、ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列のような1又は複数の挿入部位(「クローニング部位」とも呼ばれる)を含み、いくつかの実施形態において、1又は複数の挿入部位(例えば約又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の挿入部位)が、1又は複数のベクターの1又は複数の配列因子の上流及び/又は下流に位置する。いくつかの実施形態において、ベクターは、tracrメイト配列の上流、及び任意である、tracrメイト配列に作動可能に連結された調節エレメントの下流に挿入部位を含み、ガイド配列の挿入部位への挿入に続いて、真核細胞において、発現の際に、ガイド配列がCRISPR複合体の標的配列への配列特異的結合を導くようにする。いくつかの実施形態において、ベクターは、2つ以上の挿入部位を含み、各々の挿入部位が2つのtracrメイト配列間に配置され、各々の部位におけるガイド配列の挿入を可能にする。そのような配置において、2つ以上のガイド配列が単一のガイド配列の2つ以上の複製、2つ以上の異なるガイド配列、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。複数の異なるガイド配列が使用されるとき、単一の発現コンストラクトが、CRISPR活性を細胞内の複数の異なる対応する標的配列へと標的化するために、使用され得る。例えば、単一のベクターは、約又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20以上のガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、約又は約1, 2, 3、4、5、6、7、8、9、10以上のそのようなガイド配列含有ベクターが提供され、任意に細胞に送達される。

いくつかの実施形態において、ベクターは、Casタンパク質のようなCRISPR酵素をコードする酵素コード配列へと作動可能に連結された調節エレメントを含む。Casタンパク質の非限定的な例は、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csnl及びCsl2としても知られる)、Cas1O、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csx14、Csx1O、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、それらの相同体、又はそれらの修正したものを含む。これらの酵素は公知であり、例えば、S. PyogenesのCas9タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Q99ZW2でSwissProtデータベースに見出し得る。いくつかの実施形態において、Cas9のような無修正のCRISPR酵素は、UNA切断活性を有する。いくつかの実施形態において、CRISPR酵素はCas9であり、S. pyogenes又はS. pneumoniae由来のCas9であってよい。いくつかの実施形態において、CRISPR酵素は、標的配列内及び/又は標的配列の相補体内のような標的配列の位置において、1又は両方の鎖の切断を導く。いくつかの実施形態において、CRISPR酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500又はそれ超の塩基対内の1又は両方の鎖の切断を導く。いくつかの実施形態において、ベクターは、変異型CRISPR酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの1又は両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素と比べて変異したCRISPR酵素をコードする。

一般的に、ガイド配列は、標的配列にハイブリダイズして、標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を導くのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する、任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の度合いは、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適なアラインメントがなされるとき、約又は約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムの使用によって決定でき、その非限定的な例は、Smith-Watermanアルゴリズム、Needieman-Wimschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づいたアルゴリズム(例えばBurrows Wheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies社)、ELAND (Illumina社、San Diego、CA)、SOAP (asoap.genomics.org.cnで入手可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netで入手可能)を含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、約又は約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75又はそれ超のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12未満又はそれ未満のヌクレオチド長である。ガイド配列の標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって調査できる。例えば、試験されるガイド配列を含む、CRISPR複合体を形成するのに十分なCRISPR系の成分は、CRISPR配列の成分をコードするベクターによるトランスフェクション等によって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され、標的配列の優先的な切断の調査が後に続く。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるガイド配列、試験のガイド配列と異なるコントロールのガイド配列を含むCRISPR複合体の成分を提供し、試験及びコントロールのガイド配列の反応間で標的配列の結合又はその切断率を比較することによって、試験管内で評価できる。他のアッセイもまた可能であり、当業者には明らかであろう。

本明細書において使用されるとき、用語「変異体」は、親配列、ポリヌクレオチド又はタンパク質に対し実質的に又は有意な配列同一性又は類似性を有する配列、ポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。前記変異体は、機能的、すなわち、それが変異体である、配列、ポリペプチド又はタンパク質の生物活性を保持する。親配列、ポリペプチド又はタンパク質と比べて、機能的変異体は、親配列、ポリヌクレオチド又はタンパク質に対して、アミノ酸配列において、例えば、少なくとも30%、50%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ超、同一である。

機能的変異体は、少なくとも1つの非保存的アミノ酸置換を有する、親配列、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。保存的アミノ酸置換は当該技術分野において公知であり、ある物理的及び/又は化学的特性を有する1のアミノ酸が、同一の化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸と交換されているようなアミノ酸置換を含む。

代替的に又は追加的に、機能的変異体は、少なくとも1の非保存的アミノ酸置換を有する、親配列、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換にとって、機能的変異体の生物活性と干渉もそれを阻害することもしないことが好ましい。好ましくは、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物活性を増強し、機能的変異体の生物活性が親配列、ポリヌクレオチド又はタンパク質と比較して改善するようにされる。

変異体はまた、親配列、ポリペプチド又はタンパク質の機能的断片をも含み、例えば、約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%又はそれ超の親配列、ポリペプチド、又はタンパク質を含むことができる。

本明細書において使用されるとき、用語「相同分子種」は、異なる種におけるタンパク質又は対応する配列を指す。

本発明は、次の図を参照して非限定的な例によって説明されるであろう。

セミランダムプライマーを用いるgRNAライブラリー構築。A.セミランダムプライマー。B. 20bpガイド配列を切り出すためのIII型及びIIS制限部位Ec、EcoP15I;Ac、AcuI。 gRNAライブラリー構築のスキームBg、BglII;Xb、XbaI;Bs、BsmBI;Aa、AatII。 PCRサイクル最適化のためのショートレンジPCR及びガイド配列のサイズ分画化PCR産物を20%ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。10bpラダーをサイズマーカーとして使用した。予想されたサイズのバンドを三角形で標識した。 RNAライブラリー中のガイド配列。(A) gRNAライブラリーの大規模シークエンシング。(B) 12のランダムクローンのシークエンシングの例。 ガイド配列のBLAST検索解析の例。図2Aの第1のガイド配列クローンを例として示す。20-bpのガイド配列(第1のフレーム)がプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM;第2のフレーム)を伴う。 図２Ｃ１の続きを示す。 同一の遺伝子、免疫グロブリン(Ig)重鎖Cμ遺伝子由来の3つの異なるガイド配列。 gRNAライブラリーの特徴。PAMグラフにおける百分率は、その起源が同定されたガイド配列中で計算した。gRNA候補グラフ中の「他」は、rRNA及びPSM(-)mRNAのガイド配列の合計を示す。 ガイド配列の機能的変異体。Cμに特異的な3つのレンチウイルスクローン(図2d中のCμガイド1、2、及び3)を、AID^-/-細胞表面IgM(sIgM)(+)DT40細胞株へと形質導入した。形質導入後2週間のFACSプロファイルを、FACSソーティング(上部パネル)において用いたsIgM(-)ゲーティングと共に示す。ソートされたsIgM(-)細胞からのIgM遺伝子のcDNAを、ガイド配列の位置、挿入、欠失、及び変異と共にマッピングする(下部パネル)。ガイド配列付近の詳細なcDNA配列は以下に示す。 gRNAライブラリーの特性決定及び機能評価。(A)染色体上のガイド配列の分布。(B) gRNAライブラリーの多様性。遺伝子当たりの配列読み取りは、ガイド配列のトランスクリプトームランドスケープを反映する(ヒートマップ、スケールバーと共に示す)。遺伝子当たりのガイド配列種(円グラフ)。 (C) gRNAライブラリーのレンチウイルス形質導入。形質導入後2週間のFACSプロファイルを、FACSソーティング(左パネル)において用いたsIgM(-)ゲーティングと共に示す。グラフは、ライブラリーにおいて全配列読み取り対ソートされたsIgM(-)のそれらを示す(右パネル)。各々の点は異なる遺伝子を表す。(D) IgM特異的遺伝子配列。IgMに特異的な配列読み取り(グラフ)。IgMのcDNA上にマッピングされたガイド配列(マップ)。 ソートされたsIgM(-)におけるIgMのcDNA中の欠失。ソートされたsIgM(-)細胞からのIgM遺伝子のcDNAを、ガイド配列の位置、欠失、変異、及びエクソン境界と共に示す(左パネル)。ブレークポイント周辺の詳細な配列を右側のパネルに示す。参照配列におけるマイクロホモロジーに下線を付す。

方法
RNAの調製
全RNAを、TRIzol試薬(Invitrogen社)を用いてDT40^Cre1細胞^{(11, 12)}から調製した。ポリ(A) RNAを、Oligotex mRNA Mini Kit (Qiagen社)を用いてDT40^Cre1の全RNAから調製した。mRNAを濃縮するために、製造業者の推奨事項からのストリンジェントな洗浄プロトコールに従って、ポリ(A)+RNAのハイブリダイゼーションと(Oligotex kitからの)バッファーOBBによる洗浄とを二回繰り返した。

オリゴヌクレオチド
次のオリゴヌクレオチドを使用した。
セミランダムプライマー p NNNCCN(配列番号1)
5' SMART (RNA転写物におけるスイッチ機構)タグTGGTCAAGCTTCAGCAGATCTACACGGACGTCGCrGrGrG(配列番号29)
5' SMART PCRプライマー TGGTCAAGCTTCAGCAGATCTACACG(配列番号30)
3'リンカーIフォワード pCTGCTGACTTCAGTGGTTCTAGAGGTGTCCAA (配列番号31)
3'リンカーIリバース GTTGGACACCTCTAGAACCACTGAAGTCAGCAGT(配列番号32)
5'リンカーIフォワード GCATATAAGCTTGACGTCTCTCACCG(配列番号33)
5'リンカーIリバース pNNCGGTGAGAGACGTCAAGCTTATATGC(配列番号34)
3'リンカーIIフォワード pGTTTGGAGACGTCTTCTAGATCAGCG(配列番号35)
3'リンカーIIリバース CGCTGATCTAGAAGACGTCTCCAAACNN(配列番号36)
3'リンカーI PCRプライマー GTTGGACACCTCTAGAACCACTGAAGTCAGCAGTNNNCC(配列番号37)
3'リンカーII PCRプライマー CGCTGATCTAGAAGACGTCTCCAAAC(配列番号38)
シークエンシングプライマー TTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAG(配列番号39)
lentiCRISPRフォワード CTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG (配列番号40)
lentiCRISPRリバース CGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAG(配列番号41)
ユニバーサルフォワード AGCGGATAACAATTTCACACAGGA(配列番号42)
ユニバーサルリバース CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC(配列番号43)
Ig重鎖1 CCGCAACCAAGCTTATGAGCCCACTCGTCTCCTCCCTCC(配列番号44)
Ig重鎖2 CGTCCATCTAGAATGGACATCTGCTCTTTAATCCCAATCGAG(配列番号45)
Ig重鎖3 GCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACC(配列番号46)
Ig重鎖4 AGCAACGCCCGCCCCCCATCCGTCTACGTCTT(配列番号47)

リンカーの調製
以下の試薬を1.5mlマイクロ遠心チューブ中で合わせた:10μlの100μMリンカーフォワードオリゴ、10μlの100μMリンカーリバースオリゴ、及び2.2μlの10×T4 DNAリガーゼバッファー(NEB社)。2lの沸騰水を含む水浴中にチューブを配置し、水が自然に冷却する間インキュベートした。アニールしたオリゴを、77.8μlのTEバッファー(pH8.0)で希釈し、10μMリンカーとして使用した。

gRNAライブラリー構築
(1)第1の鎖のcDNA合成
以下の試薬を0.2 mlPCRチューブ中で合わせた:200ngのDT40^Cre1のポリ(A) RNA、0.6μlの25μMセミランダムプライマー、及び4.75μl容量のRNaseフリー水。チューブをホットリッドサーマルサイクラー内で72℃で3分間インキュベートし、氷上で2分間冷却し、更に25℃で10分間インキュベートした。次いで温度を42℃に上昇し、次の試薬を含む5.25μlの混合物を添加した:0.5μlの25μM 5' SMARTタグ、2μlの5×SMART Scribeバッファー、0.25μlの100mM DTT、1μlの10mM dNTP Mix、0.5μlのRNaseOUT(Invitrogen社)、及び1μlのSMART Scribe逆転写酵素(100U)(Clontech社)。第1の鎖のcDNA反応混合物を、42℃で90分間インキュベートし、次いで68℃で10分間インキュベートした。RNAを分解するために、1μlのRNase H(Invitrogen社)を混合物に添加し、混合物を37℃で20分間インキュベートした。

(2)プライマー伸長による二重鎖(ds)cDNA合成
11μlの調製した第1の鎖のポリ(A)cDNAを74μlのmilliQ水、10μlの10×Advantage 2 PCRバッファー、2μlの10mM dNTP mix、1μlの25μM 5' SMART PCRプライマー、及び2μlの50×Advantage 2 ポリメラーゼミックス(Clontech社)と混合した。100μl容量のプライマー伸長のための反応混合物を、95℃で1分間、68℃で20分間、及び70℃で10分間インキュベートした。調製したds cDNAをQIAquick PCR Purification Kit (Qiagen社)を用いて精製し、40μlのTEバッファー(pH8.0)で溶出した。

(3)3'リンカーIライゲーション
DT40^Cre1のdsポリ(A) cDNAを、1×Quickライゲーションバッファー中で0.5μlの10μM 3'リンカーI及び1μlのQuick T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs社; NEB社)と混合した。ライゲーション反応混合物を室温で15分間インキュベートして、次いでQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、80μlのTEバッファーで溶出した。

(4)EcoP15I消化
3' linker Iを連結したDNAを、100μl容量中の1×ATPを含む1×NEBuffer 3.1中において、37℃で終夜、1μlのEcoP15I(10U/μl、NEB社)によって消化した。EcoP15Iで消化したDNAをQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、40μlのTEバッファーで溶出した。

(5)5'リンカーライゲーション及びBglII消化
消化したDNAを、1×Quickライゲーションバッファー中で0.5μlの10μM 5'リンカーI及び1μlのQuick T4 DNAリガーゼ(NEB社)と混合した。ライゲーション反応混合物を室温で15分間インキュベートして、QIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、80μlのTEバッファーで溶出した。DNAを、100μl容量中の1×NEBuffer 3.1中において、37℃3時間、1μlのBglII(10U/μl、NEB社)によって更に消化した。EcoP15I/BglIIで消化したDNAをQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、50μlのTEバッファーで溶出した。

(6)第1のPCR最適化
PCRサイクルの最適な数を決定するために、5μlの5'リンカーI/3'リンカーIを連結したds cDNA、0.5μlの25μM 5'リンカーIフォワードプライマー、0.5μlの25μM 3'リンカーI PCRプライマー、5μlの1×Advantage 2 PCRバッファー、1μlの10mM dNTP mix、1μlの50×Advantage 2ポリメラーゼミックス、及び50μl容量のmilliQ水を含む、0.2mlPCRチューブを調製した。次のサイクルパラメーターでPCRを実行した。6サイクルの、98℃10秒及び68℃10秒。6サイクルの後、5μlの反応物を真新しい微量遠心管に移した。PCR反応混合液の残余に、更なる3サイクルの98℃10秒及び68℃10秒を実施した。これらの更なる3サイクルの後、5μlを真新しい微量遠心管に移した。同様に、全部で30サイクルに到達するまで更なるPCRを繰り返した。したがって、6、9、12、15、18、21、24、27、及び30サイクルの一連のPCR反応物が調製され、バンドパターンを比較するために20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析された。最大量の84-bp産物を得る最小の数のPCRサイクルとして、PCRサイクルの最適な数を決定した(典型的に17サイクル近辺)。2つの50μlのPCR反応を最適な数のPCRサイクルで繰り返した。PCR産物をQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、50μlのTEバッファーで溶出した。

(7)AcuI/XbaI消化
PCR産物を、60μl容量中の40μM S-アデノシルメチオニン(SAM)を含む1×CutSmartバッファー中で37℃終夜、2μlのAcuI(5U/μl、NEB社)及び2μlのXbaI(20U/μl、NEB社)によって消化した。AcuI/XbaIで消化したDNAを20%ポリアクリルアミドゲルで泳動した。45-bp断片をゲルから切り出し、粉砕及び浸漬手順により精製し、20μlのTEバッファーに溶解した。

(8)3'リンカーIIライゲーション
消化したDNAを1×Quickライゲーションバッファー中の2μlの10μM 3'リンカーII及び1μlのQuick T4 DNAリガーゼ(NEB社)と混合した。ライゲーション反応混合物を室温で15分間インキュベートして、QIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、100μlのTEバッファーで溶出した。

(9)第2のPCR最適化
PCRサイクルの最適な数を決定するために、5μlの5'リンカーI/3'リンカーIIを連結したds cDNA、0.5μlの25μM 5'リンカーIフォワードプライマー、0.5μlの25μM 3'リンカーII PCRプライマー、5μlの1×Advantage 2 PCRバッファー、1μlの10mM dNTP mix、1μlの50×Advantage 2ポリメラーゼミックス、及び50μl容量のmilliQ水を含む、0.2mlPCRチューブを調製した。次のサイクルパラメーターでPCRを実行した。6サイクルの、98℃10秒及び68℃10秒。6サイクルの後、5μlの反応物を真新しい微量遠心管に移した。PCR反応混合液の残余に、更なる3サイクルの98℃10秒及び68℃10秒を実施した。これらの更なる3サイクルの後、5μlの反応物を真新しい微量遠心管に移した。同様に、全部で18サイクルに到達するまで更なるPCRサイクルを繰り返した。したがって、6、9、12、15、及び18サイクルの一連のPCR反応物が調製され、バンドパターンを比較するために20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析された。最大量の72-bp産物を得る最小の数のPCRサイクルとして、PCRサイクルの最適な数を決定した(典型的に9サイクル近辺)。各々が50μlを含む5つのPCR反応を最適な数のPCRサイクルで繰り返した。PCR産物をQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、100μlのTEバッファーで溶出した。

(10)BsmBI/AatII消化
PCR産物を、100μl容量の1×NEBuffer 3.1中で55℃6時間、10μlのBsmBI(10U/μl、NEB社)で消化し、次いで、5μlのAatII(20U/μl、NEB社)を溶液に添加し、37℃終夜放置した。BsmBI/AatIIで消化したDNAを20%ポリアクリルアミドゲルで泳動した。典型的に、25、24及び23bpに対応する3つのバンドを見ることができた。25-bp断片をゲルから切り出し、粉砕及び浸漬手順により精製し、50μlのTEバッファーに溶解した。精製したDNAの濃度をQubit dsDNA HS Assay Kit(Life Technologies社)によって測定した。

(11)クローニング
lenti CRISPR ver. 2(lentiCRISPR v2)⁽¹⁵⁾(Addgene)をBsmBIによって消化し、ウシ腸ホスファターゼで処理し、フェノール/クロロホルムによって抽出し、エタノール沈殿によって精製した。5ngの精製した25-bpガイド配列断片を40μl容量の1×Quickライゲーションバッファー中の3μgのlentiCRISPR v2及び1μlのQuick T4 DNAリガーゼ(NEB社)と混合した。ライゲーション反応混合物を、室温で15分間インキュベートし、次いで、エタノール沈殿によって精製した。調製したgRNAライブラリーを、次のエレクトロポーレーター条件を用いてSTBL4エレクトロコンピテント細胞(Invitrogen社)にエレクトロポレーションした:1200V、25μF、及び200Ω。

シークエンシング及び配列解析
プラスミドDNAを、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega社)を用いて、製造業者のプロトコールに従ってgRNAライブラリーからランダムに選択した236のクローンから精製した。ガイド配列クローンを、model 373 automated DNA sequencer(Applied Biosystems社)を用いてシークエンシングプライマーによってシーケンシングした。クローンしたガイド配列を、BLASTと用いてGenBankデータベースと比較した。

gRNAライブラリー中のバックグランドノイズを避けるための任意の工程
gRNAライブラリー構築の方法論の設定の間、rRNAの混入がオリゴdtカラムを用いて精製したポリ(A)RNA中に観察され、rRNA由来のガイド配列が全起源ライブラリーの40〜50%をしばしば占めた。rRNAは、細胞内RNAの90%超を占めるため、一般的に、いくつかのrRNA混入を有することを避けるのは困難である。ポリ(A)RNA精製のストリンジェントな洗浄プロトコールは、rRNA由来のガイド配列を約10%まで成功裏に減少した。リンカー配列を増幅するPCRアーチファクトも、方法論の設定中に観察した。この理由のため、リンカー配列を更なる認識部位、すなわち、5' SMART tagに対してBglII、3'リンカーIに対してXbaI、並びに5'リンカーI及び3'リンカーIIに対してAatIIによって消化した。これらの更なる制限酵素による切断によって、リンカー配列を増幅するPCRアーチファクトの大部分を除去することができた。最終的なPCR反応物のBsmBI制限消化は、1又は2bp短い期待してないDNA断片に加えて、正しいサイズのDNA断片(25bp)を生成した。これらのより短いDNA断片は、おそらく、III型及びIIS型制限酵素の切断位置の不正確さによるものであった。BsmBI切断後、20%ポリアクリルアミドゲルによって25-bp断片を注意深く精製することによって、より短いDNAアーチファクトを最小化することができた。

レンチウイルスベクター
lentiCRISPR v2 (15)はFeng Zhangによって提供された(Addgeneプラスミド# 52961)。pCMV-VSV-G (25)はBob Weinbergによって提供された(Addgeneプラスミド# 8454)。psPAX2はDidier Tronoによって提供された(Addgeneプラスミド# 12260)。

レンチウイルスパッケージ化
レンチウイルスを産生するために、HEK293T細胞のT-225 flaskは、トランスフェクションの前日に、D10培地(10%ウシ胎仔血清を補充したDMEM)中で約40%コンフルエントで播種された。トランスフェクションの1時間前に培地を除去し、13mLの予熱した低血清OptiMEM培地(Life Technologies社)をフラスコに添加した。トランスフェクションをLipofectamine 2000 (Life Technologies社)を用いて実施した。20μgのgRNAプラスミドライブラリー、10μgのpCMV-VSV-G(25)(Addgene)、及び15μgのpsPAX2 (Addgene)を4mlのOptiMEM (Life Technologies社)と混合した。100μlのLipofectamine 2000を4mlのOptiMEMで希釈し、5分後にこの溶液をDNA混合物へと添加した。完全な混合物を、細胞に添加する前に20分間インキュベートした。終夜のインキュベーションの後、培地を30mlのD10へと変更した。2日後、培地を除去し、3000rpm、4℃、10分間遠心し、細胞の破片をペレット化した。上清を0.45μmの低タンパク質結合膜(Millipore社、Steriflip HV/PVDF)を通してろ過した。gRNAライブラリーウイルスを、PEG沈殿によって更に100倍濃縮した。

Cμガイド配列を含むレンチウイルスベクターを次の修正を除いて、上述のようにパッケージ化した。20μgのgRNAライブラリーの代わりに5μgのCμガイドレンチウイルスベクターを用いた。実験を、インキュベーション時間を変えずに、溶液又は培養培地に関して四分の一のスケールで実施した。T-225フラスコの代わりに100mmプレートをレンチウイルスのパッケージ化に用いた。Cμ gRNAウイルス、PEG沈殿による濃縮なしに形質導入に直接用いた。

レンチウイルス形質導入
細胞をスピンフェクション(spinfection)を介してgRNAライブラリーによって形質導入した。簡潔に、12ウェルプレートにおいて、8μg/mlのポリブレン(Sigma社)を補充したDT40培地中でウェル当たり2×10⁶個の細胞を播種した。各々のウェルは、1mlのCμ gRNAウイルス、又は100μlの100倍濃縮gRNA library virusを受け、形質導入なしのコントロールを伴った。12ウェルプレートを、2,000rpm、2時間、37℃で遠心した。細胞を終夜インキュベートし、DT40培地を含む培養フラスコへ移し、次いで、1μg/mlのピューロマイシンによって選別した。

sIgM(-)集団のソーティング
レンチウイルス形質導入を含む、又は含まないAID^-/-sIgM(+)細胞株を、最初にニワトリCμモノクローナル抗体(M1) (Southern Biotech社)によって染色し、次いで、マウスIgG(Fab)₂に対するフルオレセインイソチオシアネート結合ポリクローナルヤギ抗体(Sigma社)によって染色した。sIgM(-)集団は、FACSAria(BD Biosciences社)を用いてソートした。

Ig重鎖遺伝子のクローニング及びシークエンシング
ソートしたsIgM(-)細胞を更に拡大し、全RNA及びゲノムDNA調製に用いた。全RNAをTRIzol試薬(Invitrogen社)を用いて精製した。製造者の指示書に従って、オリゴ_dTプライマーと共にSuperScript III逆転写酵素(Invitrogen社)を用いて全RNAを逆転写した。Ig重鎖1及び2プライマーによって、IgM重鎖遺伝子を、ソートしたsIgM(-)集団の全cDNAから増幅した。PCRをQ5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ(NEB社)を用いて次のサイクルパラメーターによって増幅した:98℃における30秒の最初のインキュベーション、10秒98℃及び2分72℃からなる35サイクル、並びに、2分72℃の最終伸長工程。PCR産物をQIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen社)によって精製し、HindIII(NEB社)及びXbaI (NEB社)によって消化し、pUC119プラスミドベクターへとクローニングした。各々のソートしたsIgM(-)集団に対して約30プラスミドクローンが、ユニバーサルフォワード、リバース、及びIg重鎖3及び4プライマーによってシークエンシングされた。

ディープシークエンシング
形質導入した細胞ライブラリー又はソートしたsIgM(-)細胞のゲノムDNAをEasy-DNA Kit(Invitrogen社)を用いて精製した。100ngのレンチウイルスプラスミドライブラリー又は1μgのゲノムDNAのいずれかをPCRテンプレートとして使用した。ガイド配列を、Advantage 2ポリメラーゼ(Clontech社)を用いてlentiCRISPRフォワード及びリバースプライマーによって増幅した。次のサイクルパラメーターでPCRを実行した。プラスミドDNAに対して、15サイクルの98℃10秒間及び68℃10秒間、又はゲノムDNAに対して、27サイクルの98℃10秒間及び68℃10秒間。ガイド配列を含む100bpのPCR断片を、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen社)を用いて精製した。ディープシークエンシングライブラリーを、TruSeq Nano DNA Library Preparation Kit(Illumina社)を用いて調製し、Miseq(Illumina社)を用いてディープシークエンシングした。

バイオインフォマティクス
Illumina Miseqによってデマルチプレックス(demultiplex)したFASTQファイルを、CLC Genomics Workbench(Qiagen社)を用いて分析した。簡潔に、ベクターのバックボーン配列を排除するように配列読み取りをトリミングし、PAM配列NGGを付加した。NGGの付加前又は付加後の配列読み取りを、包括的な分析に最適化された読み取りマッピングパラメーターでRNA seq分析ツールボックスを用いるEnsembleのニワトリゲノムデータベース(16)とアラインメントさせた。アラインメントの後で、異なるガイド配列種を同定するために、マッピングされた配列読み取りから重複を除去した。結局、ガイド配列読み取り及び遺伝子当たりの種は、アノテーションされた遺伝子上にマッピングされた配列読み取りの数から計算した。Ig遺伝子は、Ensembleデータベースにおいてアノテーションされていないため、AIDノックアウトDT40細胞株のIgM遺伝子のcDNA配列を、IgMに特異的なガイド配列のマッピングのための参照として使用した。

結果
mRNAのガイド配列への転換の戦略
cDNA合成のためにランダムプライマーを一般的に用いた。本発明者らは、PAM相補的配列を含むセミランダムプライマーを、ランダムプライマーの代わりにcDNA合成プライマーとして使用できることを見出だした(図1a)。

IIS型又はIII型制限酵素は、それらの認識配列から離れた配列を切断する。III型制限酵素、EcoP15Iは、その認識部位から25/27bp離れて切断するが、効率的な切断のために一対の逆向きの認識部位を必要とする(10)。IIS制限酵素、AcuIは、その認識部位から13/15bp離れて切断する。本発明者らは、これらの制限部位の位置を注意深く配置することによって、20merを切り出すことを可能にするアプローチをここで開発した(図1b)。

分子生物学的技術によるgRNAライブラリー構築
PAM相補的CCNを含むセミランダムプライマー(NCCNNN)を用いて、ニワトリB細胞株DT40^{Cre1(11, 12)}のポリ(A)RNAからcDNAを逆転写した(図1c)。そのとき、EcoP15I部位を含む5' SMARTタグ配列を、RNA転写物における転換機構(SMART)方法¹³によって5'側に付加した。cDNAの第2の鎖を、3'末端にA-オーバーハングを生成するAdvantage 2 PCRポリメラーゼと共に5'SMARTタグ配列にアニールするプライマーを用いるプライマー伸長によって合成した。A-オーバーハングを、後にガイド配列を切り出すためのEcoP15I及びAcuI部位を含む3'リンカーIと連結した。ds cDNAを、EcoP15Iによって消化し、5' SMARTタグ配列を除去し、gRNA発現ベクターのためのクローニング部位であるBsmBI部位を含む5'リンカーIと連結した。DNAをBglIIによって消化し、5' SMARTタグのバックボーンを破壊した。

この段階のgRNAライブラリーをPCRによって増幅した。PCRサイクルの最適な数を決定するために、6及び30サイクルの間の量決めを実施した(図1d;PCR最適化1)。約80bpの予想されたPCR産物は、12サイクル後に目で見えたが、サイクル数が増加するにつれ、より多くの非特異が現れた。更に、不必要なサイクル数の増加は、ライブラリーの複雑性を減じ得る。したがって、PCR増幅は、約17サイクルの最適なPCRサイクル数を用いて大規模で繰り返した。続いてPCR産物を、AcuI及びXbaIによって消化し、20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて試験した。45bp断片を精製し(図1d;サイズ分画化1)、BsmBIクローニング部位を含む3'リンカーIIと連結し、次のPCRに使用した。

最適なPCRサイクル数を決定するために、6及び18PCRサイクルの間の量決めを更に実施した(図1d;PCR最適化2)。PCR増幅は、約9PCRサイクルの最適な数を用いて大規模で繰り返した。次いで、PCR産物をBsmBI及びAatIIによって消化した。制限消化は、25-bp断片、並びに24-bp及び23-bp断片を生じ(図1d;サイズ分画化2)、それは恐らくIIS型及びIII型制限酵素の不正確な切断位置のために生じ¹⁴、25-bp断片の注意深い精製は、これらのアーチファクトによるあり得る問題を最小化する。上述のように生成されるガイド配列挿入ライブラリーは、最終的にBsmBI消化したlentiCRISPR v2¹⁵ベクターにクローニングし、次いで、STBL4エレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションした。

gRNAライブラリー中のガイド配列
プラスミドDNAを生成したgRNAライブラリーから大規模調製によって精製した。最初に、DNAを混合プラスミド集団としてシークエンシングした。高度に複雑で不均一な配列が、lentiCRISPR v2のU6プロモーターとgRNAスキャフォールドの間のクローニング部位において観察され(図2a)、1)挿入のないクローンがめったにないこと、2)クローン下ガイド配列が高度に複雑であること、及び3)大部分のガイド配列は20bp長であることを示す。細菌へのライブラリーの再形質転換の後、全部236の細菌クローンをランダムに選び、プラスミド小規模調製及びシークエンシングに使用した。

12のランダムクローンのシークエンシングの例に示される(図2b)ように、クローンしたガイド配列は不均一であった。これらのガイド配列は、続けてNCBIのBLAST検索を用いて解析された。図2cに示されるように、典型的には、1つの遺伝子が各々のガイド配列によってヒットした。重要なことに、PAMは、ガイド配列に近接して同定された。ガイド配列の四分の三以上において、それらのガイド配列が生成された起源の遺伝子がBLAST検索において同定された。多くのそのようなガイド配列は、単一の遺伝子由来であった。

注目すべきことに、236プラスミドクローンのうち、3つのガイド配列は、免疫グロブリン(Ig)重鎖Cμ遺伝子上のPAmに近接した異なる位置に由来した(図2d)。

したがって、複数のガイド配列が、同一の遺伝子から生成された。予想外にも、Cμガイド3(図2D)のような逆向きのガイド配列もまた比較的低い頻度(約10%)において観察された(Table I(表1))。しかしながら、それらの多くは、PAMを伴った(Table I(表1))。PAMプライミングは、mRNAだけでなく、第一鎖cDNAからも機能していた可能性がある。これらの逆向きのガイド配列は、ゲノム切断において機能し、ノックアウトライブラリーに寄与すると予想される。

ガイド配列のクローニングは効果的であり(100%)、多くのガイド配列(89%)は、20bp長であった(図2e、Table I(表1))。66%の挿入配列がmRNAに由来した一方で、11%の挿入配列がrRNAに由来し、23%が未知の起源に由来し、アノテーションされていない遺伝子に由来した可能性がある(図2e)。重要なことに、起源の同定された91%のガイド配列は、PAMを伴い、セミランダムプライマーを用いるPAMプライミングは、意図通りに機能することを確かにする。更に、PAMは、残余のガイド配列(7%)の大部分に近接して見出されるが、1bp離れている(図2e)。これは、それらのガイド配列の長さがしばしば19bpであるために、AcuIの不正確な切断位置によるものである可能性が高い。

ガイド配列の機能的変異体
3つのCμに特異的なガイド配列(図2D)を、ライブラリーのガイド配列を機能的に評価するために更に試験した。これらのレンチウイルスクローンを、免疫グロブリン遺伝子転換の不在のために細胞表面IgM(sIgM)を構成的に発現するAID^-/-DT40細胞株に形質導入した(12)。形質導入の2週間後、Cμガイド1、2、及び3は、フローサイトメトリー解析によって推定される5.9%、11.7%、及び9.2%のsIgM(-)集団を生じ(図3上部パネル)、これらのsIgM(-)集団を、FACSソーティングによって更に単離した。Ig重鎖ゲノム座位は、分析が乏しく、再構成VDJアリルのみが転写され、そのゲノム座位よりもむしろそのcDNAをSangerシークエンシングによって分析した。各々のソートされたsIgM(-)集団の約30のIgMのcDNA含有プラスミドクローンのシークエンシング解析は、座位上の挿入、欠失、及び変異を明らかにした(図3、下部パネル)。多くの挿入欠失は、ガイド配列の周りに集中した。cDNA配列において観察される比較的大きな欠失は、ライブラリー中のクローンが対応する転写物中に更に大きな機能的欠失をしばしば引き起こすことができることを示す。

gRNAライブラリーのディープ特性決定
gRNAライブラリーの多様性を特性決定するために、ライブラリーを、Illumina Miseqを用いてディープシークエンシングし、Ensembleニワトリゲノムデータベース(16)を参照として用いてRNA seq protocolによって分析した。例えば、約500,000のガイド配列が染色体1にマッピングされ、ゲノム中の様々な座位からのガイド配列の強固な生成を示唆する。Ensembleデータベースは15,916のニワトリ遺伝子を含むが、アノテーションされたニワトリ遺伝子の数は、少なくとも4,000であるらしく、ヒト、マウス、及びゼブラフィッシュのような他の確立された遺伝モデル脊椎動物のものよりも少ない(16)。5,209,083の配列読み取りのうち、4,052,174(77.8%)の読み取りは、ニワトリ遺伝子にマッピングされ、それらの配列の多くはPAMを伴なう(図4B)。にもかかわらず、マッピングされていない読み取りの四分の一は、ニワトリゲノムの比較的乏しい遺伝子アノテーションのためであり得、それは、具体的な種に対するバイオインフォマティクスアプローチの限界を再び強調する。ガイド配列読み取りの平均長は19.9bpであった。エクソン/エクソン接合部にマッピングされるガイド配列の2.0%は、非機能的であるように見えるが、2,626,362の異なるガイド配列を含むガイド配列の3,936,069(75.6%)は、機能的であると考えられる。ガイド配列は、アノテーションされた遺伝子の91.8%を占める(14,617/15,916)低発現レベルの遺伝子からでさえ生成される(図4B、ヒートマップ)。2又はそれ超のユニークなガイド配列が、それらの遺伝子の97.8%について同定され、100以上の異なるガイド配列種が46.0%の遺伝子について同定された(図4B、円グラフ)。したがって、gRNAライブラリーは、遺伝子スクリーニングに十分な多様性を有するように見える。

gRNAライブラリーの機能的評価
ライブラリーのAID^-/- DT40細胞株への形質導入は、母細胞株(図3、左)と比べて有意なsIgM(-)集団(0.3%)を誘導した(図4C、左)。このsIgM(-)集団は、FACSソーティングによって更に100倍濃縮され、それらのガイド配列をディープシークエンシングによって解析した。予想外にも、混入したsIgM(+)細胞は、恐らくB細胞受容体シグナル伝達のためにsIgM(-)よりも早く拡張し、sIgM(-)細胞の不完全な濃縮をもたらす。にもかかわらず、IgM特異的ガイド配列は、ソートしたsIgM(-)集団における配列読み取りの二番目に高いスコアを達成するため(図4C、右)、IgM特異的ガイド配列は、sIgM(-)ソーティングの後、明らかに濃縮された(図4D、左)。IgMに特異的な224のユニークなガイド配列がプラスミドライブラリーにおいて同定された一方で、いくつかのそのようなガイド配列は、ソートされたsIgM(-)集団において非常に増加した(図4D、右)。ソートされたsIgM(-)集団からのIgMのcDNAの29プラスミドクローンのSangerシークエンシングは、4の欠失及び1の変異を独立して同定した(図4E)。3つの大きな欠失は、マイクロホモロジーを介した代替的な非相同末端結合によって恐らく生じ、1つはスプライシングシグナルの付近の挿入欠失のためであり得るミススプライシングによって生じたように思われた。したがって、ライブラリーは、適切なスクリーニング方法が利用可能であるとき、ノックアウトクローンをスクリーニングするために利用することができる。

まとめると、多様性及び機能的gRNAライブラリーを、記載される方法を用いて成功裏に生成した。生成したgRNAライブラリーは、特殊な短鎖cDNAライブラリーであり、したがって、器官又は細胞株に特異的にカスタマイズされたgRNAライブラリーとしてもまた有用である。

本発明者らは、分子生物学的技術を用いてより高次の真核生物トランスクリプトームのためのgRNAライブラリーを生成した。これは、mRNAより作出された最初のgRNAライブラリーであり、遺伝的に乏しく特徴付けられた種から作出された最初のライブラリーである。セミランダムプライマーは、mRNA上の任意のNGGを標的化することができ、アノテーションされた遺伝子の90%超を占める高度に複雑なgRNAライブラリーを生成する(図4B)。更に、本明細書に記載される方法は、セミランダムプライマーをカスタマイズすることによって、S. pyogenes以外の生物におけるCRISPR系に適用することもできる。

複数のガイド配列は、細菌中の天然のCRISPR系(1)のように同一の遺伝子から効率的に生成され(図2D、図4B及び図4D)、これは、開発された方法の重要な利点である。各々のガイド配列は、各々の標的遺伝子に対するゲノム切断効率において異なり得るが、各々の遺伝子に対して比較的より効率的なガイド配列がライブラリーに含まれる(図4D)。

本明細書で作出されるgRNAライブラリーは、ゲノムスケールよりもむしろB細胞トランスクリプトームスケールであるため、ガイド配列は、非転写遺伝子からは生成されないであろう。ガイド配列は、豊富に転写されるmRNAからより高頻度に生成されたが、めったにないmRNAからは低頻度に生成された(図4B)。各々の遺伝子に対するmRNAの量を標準化する標準化ライブラリーの技術を組み合せることにより、めったにないmRNAから生成されるガイド配列の頻度を増加させることは可能である(19)。Cas9又はgRNA発現のためのlentiCRISPR v2におけるプロモーター又が、各々の細胞型又は種に最適なプロモーターと置き換えられる場合、これはgRNAライブラリーの形質導入又はノックアウトの効率を更に改善するであろう。

ガイド配列は、コード配列からのみでなく、5'及び3'非翻訳領域(UTR)からもまた生成できる。UTRからのgRNAは、コード配列内の挿入欠失を生じないため、遺伝子のノックアウトを目的として、gRNAは通常、UTR上に設計されないが、mRNA安定性又は翻訳制御のようないくつかの重要な特徴がUTR中の制御配列によって決定されるため、これらの領域中に生じる挿入欠失は、遺伝子機能の予測されない解明をもたらし得る。この観点から、この方法はまた、大規模gRNAライブラリーがすでに構築されている(6-8)ヒトのような種にもまた有用に適用できる。実際、異なるエクソンからの、一塩基多型の収集を表す、個人化されたヒトgRNAライブラリーを作製することはまた有用であり得る。そのような個人化されたヒトgRNAライブラリーは、対立遺伝子変異及びそれらの表現型を研究するのに使用でき、めったにない疾患のより良い特性決定をもたらす。

約23%のガイド配列は未知の起源に由来した(図2E、図4B)。これらの配列は、少なくとも部分的には不十分な遺伝子のアノテーションを有するmRNAに由来し得る。これは、開発された方法の最大の利点であり、これらの未知の配列とPAM(+)のmRNAの合計は、ライブラリーの83%を占め、遺伝子スクリーニングに利用可能であるガイド配列候補であると予想される(図2E)。この方法は、バイオインフォマティクスに基づかないため、未知の遺伝子情報からガイド配列を作出することが可能である。そのようなバイオインフォマティクスに依存しないアプローチは、不十分な遺伝子解析の種にとって明らかに利点である。

いくつかの細胞型/種特異的な生物学的特性は、特性決定されていないか又はアノテーションされていない遺伝子によって導き得る。例えば、本発明者は、そのような未知の遺伝子が、ニワトリB細胞におけるIg遺伝子転換(20)又はハイパー標的化組み込み(21)における重要な役割を果たし得る可能性があると考える。更に、独自の生物学的特性、例えば異常再生能力を有するプラナリア(22)、癌抵抗性を有するハダカデバネズミ(23)、及び200年の寿命を有するアカウニ(24)にもかかわらず、遺伝子モデルとして用いられていない多くの「マイナー」な生物が存在する。ノックアウトライブラリーは、独特な生物学的特性を有する遺伝的背景に光を当てるための重要な遺伝学的ツールであり得る。この技術を用いて、アノテーションされた遺伝的情報の乏しい種からでさえもgRNAライブラリーを作出することができ、いくつかの「忘れられた」種は、この技術によって魅力的な遺伝子モデルに転換することができる。

典型的に、gRNAライブラリーの構築のための膨大な数のオリゴを合成する費用は膨大である^6,7。重要なことに、記載されるアプローチに対して、限られた数のオリゴのみが要求され、オリゴライブラリーを用いる方法と比較して、100倍超のライブラリーの費用を低下させることができる。

実際、そのような「忘れられた」種に対して膨大な技術的コストや経済的費用を負担することは困難である。記載された方法は、オリゴに基づいたgRNAライブラリー生成の高い費用の関連する障害を克服すると予想される。

本発明者は、この研究の出発物質としてポリ(A)RNAを用いたが、原理的には、方法が適切に修正される場合、DNAから開始することも可能である。逆転写酵素よりもむしろDNAポリメラーゼが、セミランダムプライマーで開始されるDNA合成に要求される。このようなDNA合成は、セミランダムプライマーが低いアニーリング温度を有するので、PCRポリメラーゼではなく低温において非熱安定性DNAポリメラーゼを用いて実施されるであろう。5'タグ配列は、SMART方法の代わりに単鎖DNAへのリンカー連結によって付加されるであろう。この方法において、既製のcDNA又はcDNAライブラリーからgRNAライブラリーを作出することもまた魅力的である。

(参考文献)

Claims (40)

1. クラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)-CasシングルガイドRNA(sgRNA)ライブラリー又はsgRNA又はガイド配列を作製するための、cDNA合成プライマーとしてのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)相補的配列を含むセミランダムプライマーの使用。
2. 前記セミランダムプライマーが4〜10ヌクレオチド長である、請求項1に記載のセミランダムプライマーの使用。
3. PAM相補的配列がS.ピオゲネス(Sp)のCas9、ナイセリアメニンギティディス(NM)のCas9、ストレプトコッカスサーモフィルス(ST)のCas9又はトレポネーマデンティコラ(TD)のCas9、それらの相同分子種、相同体、又は変異体に特異的なPAM配列と相補的である、請求項1又は2に記載の使用。
4. PAM配列が、5'-NGG-3'、5'-NNNNGATT-3'、5'-NNAGAAW-3'、及び5'-NAAAAC-3'、それらの相同分子種、相同体、又は変異体からなる群から選択され、式中、Nが、C、G、A、及びTから選択されるヌクレオチドである、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
5. PAM相補的配列が、配列5-CCN-3'を含み、式中、Nが、C、G、A、及びTから選択されるヌクレオチドであり、前記プライマーが、好ましくは5'末端においてリン酸化されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
6. セミランダムプライマーが、配列番号1(5'-NNNCCN-3')の配列を含むか、又は本質的にその配列を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。
7. ガイド配列を得るための方法であって、以下の工程:
   a)請求項1から6のいずれか一項に規定のセミランダムプライマーを使用するRNA又はDNAからのDNA合成と、
   b)分子生物学的方法によるガイド配列の生成と
   を含む方法。
8. ガイド配列が、ガイド配列を得るために合成されたDNAを切断して生成される、請求項7に記載の方法。
9. 得られたガイド配列が、20塩基対からなる、請求項7又は8に記載の方法。
10. 切断が、少なくとも1つのIII型制限酵素及び/又はIIS型制限酵素によって実施される、請求項7から9のいずれか一項に記載の方法。
11. 切断が、その認識部位から25/27塩基対及び/又は14/16塩基対離れて切断する酵素によって実施される、請求項7から10のいずれか一項に記載の方法。
12. 合成されたDNAを切断する前に、前記制限酵素のための制限部位を付加することによって合成されたDNAを修飾する工程を更に含む、請求項7から11のいずれか一項に記載の方法。
13. 工程b)が、以下の工程:
    i)合成されたDNAの、
    - III型の第1の制限部位及び/又はIIS型の第2の制限部位を含むリンカー配列の合成されたDNAの5'末端への付加、並びに/又は
    - IIS型の第3の制限部位及び/又はIII型の第4の制限部位を含むリンカー配列の合成されたDNAの3'末端への付加
    による修飾と、
    ii)請求項8から11に規定の、修飾されたDNAを切断する工程と
    を含む、請求項7から12のいずれか一項に記載の方法。
14. 合成されたDNAがdsDNAである、請求項7から13のいずれか一項に記載の方法。
15. RNAがmRNAであり、好ましくは精製されたポリ(A)RNAである、請求項7から14のいずれか一項に記載の方法。
16. III型制限部位がEcoP151制限部位である、請求項7から15のいずれか一項に記載の方法。
17. IIS型制限部位がAcuI制限部位である、請求項7から16のいずれか一項に記載の方法。
18. 合成されたDNAの5'末端のリンカー配列が、第5の制限部位、好ましくはBglII制限部位を更に含み、且つ/又は合成されたDNAの3'末端のリンカー配列が、第6の制限部位、好ましくはXbaI制限部位を更に含む、請求項7から17のいずれか一項に記載の方法。
19. 修飾されたDNAを特異的なIII型制限酵素により消化する工程i')を更に含む、請求項7から18のいずれか一項に記載の方法。
20. 消化されたDNAの5'末端に対してgRNA発現ベクターのためのクローニング部位である第7の制限部位、及び第8の制限部位、好ましくはAatII制限部位を含む、更なるリンカー配列を付加し、次いで任意選択で、5'の第5の制限部位に特異的な制限酵素、好ましくはBglII制限酵素によってDNAを消化する工程i'')を更に含む、請求項19に記載の方法。
21. DNAを、好ましくはPCRによって増幅し、3'の第3の制限部位に特異的なIIS型制限酵素、及び任意選択で、第6の制限部位に特異的な制限酵素、好ましくはXbaIによって消化する工程i''')を更に含む、請求項20に記載の方法。
22. ガイド配列断片を消化したDNAから精製し、gRNA発現ベクターのためのクローニング部位である制限部位、及び任意選択で、第9の制限部位、好ましくはAatII制限部位を含む、更なるリンカー配列と3'末端において連結する工程i'''')を更に含む、請求項21に記載の方法。
23. DNAを、好ましくはPCRによって増幅し、クローニング部位に特異的な制限酵素、及び任意選択で、第9の制限部位に特異的な制限酵素、好ましくはAatIIによって消化する工程i''''')を更に含む、請求項22に記載の方法。
24. 25-bp断片が精製される、請求項7から23のいずれか一項に記載の方法。
25. 請求項7から24のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能である、単離したガイド配列。
26. 請求項25に記載の単離したガイド配列に対応するRNAを含む、単離したsgRNA。
27. CRISPR-Cas系sgRNAライブラリーを得るための方法であって、請求項25に記載のガイド配列をsgRNA発現ベクターにクローニングする工程と、前記ベクターをコンピテント細胞へと形質転換して、CRISPR-Cas系sgRNAライブラリーを得る工程とを含む方法。
28. 発現ベクターがレンチウイルスであり、且つ/又はベクターが、種特異的な機能性プロモーター、好ましくはpol IIIプロモーター、より好ましくはU6プロモーター、及び/若しくはgRNAスキャフォールド配列を含む、請求項27に記載の方法。
29. 請求項27又は28に記載の方法によって得ることが可能である、CRISPR-Cas系sgRNAライブラリー。
30. 複数の遺伝子のゲノム座位における複数の標的配列を標的化する複数のCRISPR-Cas系ガイド配列を含むライブラリーであって、前記標的化が遺伝子機能のノックアウトを生じ、ユニークなCRISPR-Cas系ガイド配列が、請求項1から6のいずれか一項に規定のセミランダムプライマーを用いて得られる、ライブラリー。
31. 複数の遺伝子が、セキショクヤケイ遺伝子である、請求項29又は30に記載のライブラリー。
32. 請求項29から31のいずれか一項に記載のライブラリーから選択される、単離したsgRNA又は単離したガイド配列。
33. 好ましくは選択圧下で生存する個別の細胞ノックアウトを選択するため、及び/又は対象によって示される1又は複数の生物学的症状若しくは医学的症状の遺伝的基盤を同定するため、及び/又はゲノム内の全ての遺伝子を並行してノックアウトするための、機能ゲノム研究用の請求項25若しくは32に記載のガイド配列、又は請求項29から31のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas系sgRNAライブラリー、又は請求項26若しくは32に記載のsgRNAの使用。
34. 請求項7から24のいずれか一項に記載の方法を実施するための、請求項1から6のいずれか一項に規定のセミランダムプライマーを含むキット。
35. 請求項25若しくは32に記載のガイド配列、又は請求項29から31のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas系sgRNAライブラリー、又は請求項26又は32に記載のsgRNAを含むキット。
36. 1又は複数のベクターを含むキットであって、各々のベクターが請求項25又は32に記載の少なくとも1つのガイド配列を含み、ベクターがtracrメイト配列に作動可能に連結された第1の調節エレメント及びtracrメイト配列の上流にあるガイド配列を含み、発現するとき、ガイド配列が、真核細胞内の標的配列とCRISPR複合体の配列特異的結合を導き、CRISPR複合体が、(1)ガイド配列及び(2)tracr配列にハイブリダイズしたtracrメイト配列と複合体化したCas9酵素を含む、キット。
37. 請求項25若しくは32に記載のガイド配列、又は請求項26若しくは32に記載のsgRNAをコードする、単離したDNA分子。
38. 請求項37に記載のDNA分子を含むベクター。
39. 請求項37に記載のDNA分子又は請求項38に記載のベクターを含む、単離した宿主細胞。
40. 請求項29から31のいずれか一項に記載のライブラリーによって形質導入されている、請求項39に記載の単離した宿主細胞。