CN116356431A - 基于牛全基因组CRISPR-Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于牛全基因组CRISPR‑Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法,涉及文库构建技术领域。本发明提供了一种牛全基因组编码基因CRISPR‑Cas9文库的构建方法,并基于构建得到的牛全基因组CRISPR/Cas9敲除文库,首次构建了MDBK牛肾上皮细胞全基因组敲除细胞库。本发明基于牛全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略,首次筛选并鉴定了9个与β羟丁酸(BHBA)作用相关的候选基因,可作为药物筛选、标记辅助管理的分子标记或制备基因编辑抗病动物模型的分子靶点。
Description
技术领域
本发明属于文库构建技术领域,具体涉及基于牛全基因组CRISPR-Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法。
背景技术
传统的奶牛育种目标集中于提高牛奶或蛋白质产量,但同时忽视了功能性状与健康相关性状。作为一种拮抗作用,长期选择提高生产力与生理和免疫失衡有关,尤其是在哺乳期早期,奶牛经历代谢失衡与免疫失调最为明显,从而对环境影响的易感性增加,影响奶牛健康状态,继发疾病成高发态势。
产奶量和动物健康受许多因素的影响并与之相关,如遗传、环境压力、饮食、代谢和免疫,这些因素都相互作用。长期以来,人工选择高泌乳量和对乳质提升的角度筛选优质奶牛群体,这也与奶牛应激抵抗能力下降有关。
奶牛酮病(Ketosis)是围产期奶牛常见的代谢性疾病。围产期奶牛由于受孕晚期激素变化、胎儿迅速增长、分娩、泌乳等高耗能生理应激,同时食欲下降、营养摄入不足,能量“入不敷出”而导致能量负平衡,严重的能量负平衡将导致血酮升高,演变为亚临床酮病或临床酮病。酮病会显著降低奶牛泌乳量和乳质,降低繁殖效率,也会增加皱胃移位、跛行和子宫炎的风险,场造成较为严重的经济损失。β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)是酮体的重要组成分子,能量限制、生酮饮食、能量负平衡均能够促使机体脂肪动员、脂解,通过肝脏生酮作用(ketogenesis)最终产生BHBA。
近年来的研究表明BHBA不仅是一种能量物质,而且在细胞表面和细胞内具有其受体分子,介导多种信号传导功能,可以影响基因表达、脂质代谢、神经元功能,还能够调控炎症反应,例如激活羟基羧酸受体2(Hydroxy-carboxylic acid receptor 2,HCA2)和NLRP3炎症小体,从而阻断炎症中间体的合成。此外,组蛋白赖氨酸β-羟基丁基化修饰是一种新发现的表观遗传修饰形式,BHBA介导的表观遗传修饰参与重要的细胞生理和代谢调节。因此筛选与BHBA作用相关的基因对于未来解析奶牛酮病发病机制、筛选和鉴定主要的分子标记、筛选药物作用靶点等研究奠定基础。
随着测序技术和生物信息学的飞速发展,对代谢、免疫相关机制的研究已经由单个基因或通路研究发展为高通量、互作网络式研究。近年来,随着全基因组CRISPR-Cas9基因编辑技术的发展,对于高通量基因筛选和功能研究“如虎添翼”。
CRISPR-Cas9技术已经彻底改变了遗传学传统研究方法,并为人类基因组的编辑提供了一种简单而廉价的方法,例如产生突变导致基因敲除表型。当Cas9靶向与引导sgRNA和原间隔邻近基序NGG具有相同序列的位点时,Cas9酶切双链DNA使之断裂,修复后通常会导致插入或缺失,从而有效地导致基因敲除。混合sgRNA库利用CRISPR-Cas9基因编辑技术的能力,并将其应用于基因组水平。目前已开发针对人类蛋白质编码基因的全基因组gRNA文库,允许同时产生几乎每个人类蛋白质编码基因的敲除。编辑后的细胞群可以暴露在不同的条件下,通过提取基因组DNA,生成测序库,并通过下一代测序测量sgRNA的丰度,可以测量sgRNA随时间的消耗或富集。重要的是,CRISPR基因敲除筛选在敏感性和特异性方面都优于shRNA筛选。CRISPR基因敲除文库可用于识别敲除引起细胞适应性缺陷、改变药物敏感性(增敏剂或耐药基因)、调控报告基因或蛋白表达、或特定通路的某种细胞状态或功能所需的基因。
全基因组CRISPR-Cas9基因敲除技术已经应用于畜牧业相关研究中。目前我国学者们已经成功构建猪、鸡、家蚕CRISPR-Cas9全基因敲除文库,在世界范围内也均属首次。基于该技术已经筛选出猪流感病毒、日本乙型脑炎病毒、新城疫病毒、结核分枝杆菌、家蚕抗氟/镉污染物等相关抗性基因。目前对于牛CRISPR-Cas9全基因敲除文库尚无相关报导。
发明内容
本发明的目的在于提供了基于牛全基因组CRISPR-Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法,构建牛全基因组CRISPR-Cas9文库以及MDBK敲除细胞库,并首次用于酮体作用和病毒感染相关基因筛选,为反刍动物相关研究构建新的研究平台。
本发明提供了一种牛全基因组编码基因CRISPR-Cas9文库的构建方法,包括针对牛的全基因组基因设计并合成sgRNA,以所述sgRNA为模板,利用合成的全基因CRISPR-Cas9sgRNA文库寡核苷酸探针进行扩增,回收扩增产物,得文库扩增产物;
利用线性化的CRISPR-Cas9文库载体与所述文库扩增产物进行连接,连接后转化Trans1-T1感受态细胞,提取质粒得牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库。
优选的,除看家基因和生存必须基因外,针对全基因组的其余基因,每基因设计4条sgRNA。
优选的,所述线性化的CRISPR-Cas9文库载体包括利用XhoI酶酶切Lenti-CRISPR.v2 vector。
本发明还提供了一种慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库,所述牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库由上述构建方法构建得到。
本发明还提供了MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库的构建方法,包括以下步骤:(1)将MDBK细胞培养至汇合为50%~60%,与经含有DMEM高糖培养基稀释的上述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库和聚凝胺(polybrene)混合,培养24h后更换新的DMEM完全培养基继续培养;
(2)病毒库感染细胞3d后,更换Puro培养基筛选培养至7d后,得MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库;所述Puro培养基为含有最佳致死浓度的嘌呤霉素的DMEM完全培养基。
优选的,步骤(1)所述polybrene的终浓度为8μg/mL。
优选的,所述Puro培养基中嘌呤霉素的终浓度为1μg/mL。
本发明还提供了上述构建方法构建得到的MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库
本发明提供了上述构建方法构建得到的牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库或上述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库或上述MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库在筛选功能基因和/或相关作用基因中的应用。
优选的,所述功能基因和/或相关作用基因包括酮体作用相关基因和/或病毒感染相关基因。
本发明还提供了一种筛选与酮体分子BHBA代谢相关的基因的方法,包括以下步骤:(1)将上述MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库中的MDBK敲除细胞分别用三种培养基进行连续培养,待b组培养基细胞大批量死亡,存活率降至10%,三组细胞全部更换为DMEM完全培养基,待细胞生长汇合至80%以上再分别更换为对应的原始培养基进行筛选,收集每组细胞,并提取基因组DNA;所述三种培养基包括a组培养基、b组培养基和c组培养基,其中a组培养基为含FBS和双抗的DMEM完全培养基,b组培养基为含FBS和双抗的DMEM无糖培养基,c组培养基为含FBS、双抗和BHBA的DMEM无糖培养基;
(3)利用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的sgRNA与提取得到的基因组DNA混合进行PCR扩增,回收目的片段后纯化,对纯化产物进行二代测序;
(4)将二代测序的数据与上述构建方法构建得到的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库进行比对,进行sgRNA富集数的统计和标准化,筛选得到与酮体分子BHBA代谢相关的基因。
有益效果:本发明提供了一种牛全基因组编码基因CRISPR-Cas9文库的构建方法,并基于构建得到的牛全基因组CRISPR/Cas9敲除文库,首次构建了MDBK牛肾上皮细胞全基因组敲除细胞库。本发明基于牛全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略,首次筛选并鉴定了9个与β-羟丁酸(BHBA)作用相关的候选基因,这些基因可作为药物筛选、标记辅助管理的分子标记或制备基因编辑抗病动物模型的分子靶点。本发明实施例中,首次筛选到与酮体作用相关基因:HOXD8、PTAFR/PAFR、PODN、LOC107132284、FOXJ3、ZSCAN20、HIBCH、HIPK1和DEPDC1。所述相关基因编码转录因子、G蛋白偶联受体、丝氨酸/酪氨酸激酶等关键蛋白,在调控基因转录表达、信号转导方面有重要作用,也与研究BHBA引起细胞相关通路变化的研究结果相符,再次证明酮体BHBA对细胞的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Lenti-CRISPR.v2载体的质粒图谱;
图2为靶基因对应sgRNA数量统计图;
图3为MDBK基因敲除细胞克隆sgRNA鉴定结果图;
图4为MDBK基因敲除细胞库BHBA处理筛选镜检结果图(5×10),图中MDBK基因敲除细胞库感染BPIV3病毒,筛选抗病毒感染细胞,经过4轮筛选得到;
图5为MDBK全基因组敲除细胞库不同处理组sgRNA测序比对率结果图,图中ctrl为正常对照组、day0筛选前起始细胞库、t2为无糖培养基+5mM BHBA筛选组;
图6为BHBA代谢相关基因筛选结果展示图。
具体实施方式
本发明提供了一种牛全基因组编码基因CRISPR-Cas9文库的构建方法,包括针对牛的全基因组基因设计并合成sgRNA,以所述sgRNA为模板,利用合成的全基因CRISPR-Cas9sgRNA文库寡核苷酸探针进行扩增,回收扩增产物,得文库扩增产物;
利用线性化的CRISPR-Cas9文库载体与所述文库扩增产物进行连接,连接后转化Trans1-T1感受态细胞,提取质粒得牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库。
本发明首先针对牛的全基因组基因设计并合成sgRNA,实施例中所用的基因组信息优选为参考基因组:GCF_002263795.1_ARS-UCD1.2_genomic。本发明针对所述基因组信息对全基因组基因设计并合成sgRNA,且设计所述sgRNA时,优选遵循以下原则:选取靶基因起始密码子ATG下游200bp基因组序列,sgRNA所针对的靶基因位点含有的PAM为NGG,sgRNA长度为20nt,GC含量范围为40%~60%,且靠近起始密码子ATG。本发明对设计得到的所述sgRNA的全基因组脱靶评估优选考察3个碱基错配,筛选基因组上唯一存在,不含1个和2个碱基错配脱靶位点,且全部脱靶位点最少的sgRNA。利用sgRNACas9在线软件搜寻特异性较高的sgRNA作为候选sgRNA,无靶点的sgRNA设计2000条作为阴性对照。在本发明实施例中,除看家基因和生存必须基因,共针对20371个基因设计sgRNA,每个基因设计4条sgRNA,所有sgRNA委托苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。
本发明以设计并合成的所述sgRNA为模板,利用合成的全基因CRISPR-Cas9 sgRNA文库寡核苷酸探针进行扩增,所述全基因CRISPR-Cas9sgRNA文库寡核苷酸探针优选同样由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。本发明进行所述扩增时,优选在高保真酶作用下进行,其扩增体系以50μL计,优选包括2╳Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HFBuffer 25μL、Lenti-F(10μM)1.5μL、Lenti-R(10μM)1.5μL、sgRNA文库~50ng和余量的无酶水;扩增程序优选为98℃1min;98℃10s,60℃15s,72℃30s,20个循环;72℃5min;4℃5min。本发明优选用2%琼脂糖凝胶电泳并回收扩增产物,得文库扩增产物。
得所述文库扩增产物后,本发明利用线性化的CRISPR-Cas9文库载体与所述文库扩增产物进行连接,所述CRISPR-Cas9文库载体优选包括Lenti-CRISPR.v2,购自苏州泓迅生物科技股份有限公司,质粒图谱如图1所示。本发明对所述Lenti-CRISPR.v2进行酶切使其线性化,所述酶切优选包括XhoI。本发明所述连接优选包括利用Gibson Master Mix将线性化的CRISPR-Cas9文库载体与所述文库扩增产物进行连接,对多数连接的具体操作并没有特殊限定,根据制造商的说明书操作即可。本发明实施例中将连接后的产物称为Gibson组装产物。
本发明利用所述Gibson组装产物转化Trans1-T1感受态细胞,提取质粒得牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库,所述提取优选包括采用质粒大量提取试剂盒进行。本发明在构建得到牛全基因组编码基因CRISPR-Cas9文库(sgRNA质粒文库)后,优选还包括利用NGS(Next generation sequencing)鉴定sgRNA质粒文库sgRNA丰度,其中NGS建库测序由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。
本发明还提供了一种慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库,所述牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库由上述构建方法构建得到。
本发明对所述慢病毒包装的方法并没有特殊限定,实施例中优选由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。
本发明还提供了MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库的构建方法,包括以下步骤:(1)将MDBK细胞培养至汇合为50%~60%,与经含有DMEM高糖培养基稀释的上述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库和polybrene混合,培养24h后更换新的DMEM完全培养基继续培养;
(2)病毒库感染细胞3d后,更换Puro培养基筛选培养至7d后,得MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库;所述Puro培养基为含有最佳致死浓度的嘌呤霉素的DMEM完全培养基。
本发明所述MDBK细胞优选为牛肾上皮细胞,由内蒙古自治区农牧业科学院兽医所家畜传染病研究室保存。本发明优选在感染前一天接种MDBK细胞系到T225细胞瓶中,待细胞汇合至50%左右时进行感染(MOI~0.5),用含有DMEM高糖培养基稀释慢病毒,并加入终浓度为8μg/mL的polybrene,培养24h后加入DMEM完全培养基培养。本发明所述DMEM高糖培养基,优选购自thermo Fisher scientific公司;所述DMEM完全培养基优选为含10FBS和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基。本发明优选于感染3d后,更换细胞培养液,加入Puro培养基(终浓度为嘌呤霉素(Puro)1μg/mL的DMEM完全培养基),每日换液,观察细胞状态,必要时进行细胞传代。
用Puro培养基筛选培养到第7d后,收集一部分细胞提取基因组DNA,检测sgRNA丰度。其余细胞用于后续筛选。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库。
本发明提供了上述构建方法构建得到的牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库或上述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库或上述MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库在筛选功能基因和/或相关作用基因中的应用。
利用本发明所述文库可应用于筛选功能基因和/或相关作用基因,所述功能基因和/或相关作用基因包括酮体作用相关基因和/或病毒感染相关基因,如在实施例中用于筛选与酮体分子BHBA代谢相关的基因。
本发明还提供了一种筛选与酮体分子BHBA代谢相关的基因的方法,包括以下步骤:(1)将上述MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库中的MDBK敲除细胞分别用三种培养基进行连续培养,待b组培养基细胞大批量死亡,细胞存活率将至10%,三组细胞全部更换为DMEM完全培养基,待细胞生长汇合度达80%以上,再分别更换为对应的原始培养基进行筛选,收集每组细胞,并提取基因组DNA;所述三种培养基包括a组培养基、b组培养基和c组培养基,其中a组培养基为含FBS和双抗的DMEM完全培养基,b组培养基为含FBS和双抗的DMEM无糖培养基,c组培养基为含FBS、双抗和BHBA的DMEM无糖培养基;
(3)利用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的sgRNA与提取得到的基因组DNA混合进行PCR扩增,回收目的片段后纯化,对纯化产物进行二代测序;
(4)将二代测序的数据与上述构建方法构建得到的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库进行比对,进行sgRNA富集数的统计和标准化,筛选得到与酮体分子BHBA代谢相关的基因。
在本发明中,三种培养基优选包括a组培养基、b组培养基和c组培养基,其中a组培养基优选为含FBS和双抗的DMEM完全培养基,更优选为DMEM完全培养基:DMEM高糖培养基+10%FBS+1%双抗;b组培养基优选为含FBS和双抗的DMEM无糖培养基,更优选为DMEM无糖培养基:DMEM无糖培养基+10%FBS+1%双抗;c组培养基优选为含FBS、双抗和BHBA的DMEM无糖培养基,更优选为DMEM_BHBA无糖培养基:DMEM无糖培养基+10%FBS+1%双抗+5mM BHBA。
本发明优选将上述MDBK敲除细胞分别用以上三种培养基培养,连续培养,待b组培养基细胞存大批量死亡,存活率降至10%,三组细胞全部更换为DMEM完全培养基,恢复细胞状态,待细胞生长至一定数量后再分别更换为上述三种对应培养基进行筛选,连续筛选三轮,收集每组细胞,用于基因组DNA提取。
在本发明中,PCR扩增用sgRNA:
sgRNA1F(SEQ ID No.3):5'TACGATACAAGGCTGTTAG 3';
sgRNA1R(SEQ ID No.4):5'TGATAACGGACTAGCCTTA3';
sgRNA2F(SEQ ID No.1):5'AATTAATTTGACTGTAAACACAA 3';
sgRNA2R(SEQ ID No.2):5'TTCAAGTTGATAACGGACT 3'。
本发明所述PCR反应体系以50μL计,优选包括:PrimeSTAR HS(Premix)25μL、引物-F(10μM)2μL、引物-R(10μM)2μL、基因组DNA 50~100ng,和余量的无酶水。所述PCR的反应程序优选包括95℃5min;95℃20s,55℃20s,72℃20s,30循环;72℃10min;4℃5min。
本发明优选利用胶回收纯化目的片段,纯化过程按照PCR产物胶回收试剂盒说明书步骤操作,而后对纯化产物建库进行二代测序,优选委托诺禾致源进行二代测序。本发明在得到二代测序数据优选优选还包括利用FASTQC软件做质控过滤,获得清洗后的cleandata,用于后续分析。
本发明优选用MaGeck软件将clean data与sgRNA库文件序列比对分析,进行sgRNA富集数的统计和标准化,此过程在Linux系统运行该程序,需要针对设计sgRNA文库建立sgRNA序列库library.csv文件,分析运行代码为:
mageck count-l bovine-libary-full-2.csv-n chrmix--sample-label day0,ctrl,t2--fastq chrmix-0_1.clean.fq.gz chrmix-1_1.clean.fq.gz chrmix-5_1.clean.fq.gz--fastq-2chrmix-0_2.clean.fq.gz chrmix-1_2.clean.fq.gz chrmix-5_2.clean.fq.gz
magecktest-k chrmix.count.txt-t t2-c ctrl
本发明利用上述运行代码可获得countsummary.txt、rra.gene_summary.txt和rra.sgrna_summary.txt三个文件,将上述三个文件用R包“MAGeCKFlute”进行下游分析,统计mapping比,正选择和负选择top基因以及功能富集分析,从而筛选得到对应的基因。
为了进一步说明本发明,下面结合附图和实施例对本发明提供的基于牛全基因组CRISPR-Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、实验材料和方法
293FT细胞(苏州泓迅生物科技股份有限公司),DMEM培养基(GIBCO),胎牛血清(BI),0.05%Trypsin(IVGN),0.025%Trypsin(BI);lipofectamine 2000(Invitrogen,Opti-MEM(GIBCO),Trizol Reagent(Invitrogen),限制性内切酶XhoI、KpnI、BamHI(NEB),GibsonMasterMix(NEB,E2611L),T4 DNA连接酶(NEB)去内毒素质粒大量提取试剂盒(Promega),PrimeSTAR GXL(TaKaRa)细胞基因组中量提取试剂盒Blood&CellCulture DNAMidi Kit(QIAGEN)、Polybrene(Sigma-Aldrich),嘌呤霉素(Sigma-Aldrich)。Tango Buffer(10×)(Thermo Fisher)、ATP(100mM)(Thermo Fisher)、dNTPs(25mM)(Thermo Fisher);ThermoPol Reaction Buffer(10×)(NEB)和PrimeSTAR HS(Premix)(宝日医生物技术(北京)有限公司)。
氯仿(国药),异丙醇(国药),75﹪无水乙醇(国药),DEPC水(Invitrogen),逆转录酶SuperScriptIII Reverse Transcriptase(Invitrogen),荧光染料SYBR Green I(Invitrogen),Rnase Inhibitor(Fermentas),oligo dT、Randomprimer、特异性引物(Invitrogen),Platinum Taq DNA Polymerase(Invitrogen),100mM dNTPs(Invitrogen)等。
1、牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库设计及构建
1.1牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库设计与合成
参考基因组:GCF_002263795.1_ARS-UCD1.2_genomic。
针对牛基因组编码基因设计sgRNA。选取靶基因起始密码子ATG下游200bp基因组序列,sgRNA所针对的靶基因位点含有的PAM为NGG,sgRNA长度为20nt,GC含量范围为40%~60%,且靠近起始密码子ATG。sgRNA的全基因组脱靶评估考察3个碱基错配,优选基因组上唯一存在,不含1个和2个碱基错配脱靶位点,且全部脱靶位点最少的sgRNA。利用sgRNACas9在线软件搜寻特异性较高的sgRNA作为候选sgRNA,无靶点的sgRNA设计2000条作为阴性对照。
除看家基因和生存必须基因,共针对20371个基因设计sgRNA,每个基因设计4条sgRNA。
1.2牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库寡核苷酸探针合成
牛全基因CRISPR-Cas9 sgRNA文库寡核苷酸探针由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。
1.3牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA质粒文库构建
(1)将合成的寡核苷酸探针用高保真酶进行扩增,用2%琼脂糖凝胶电泳并回收文库扩增产物。
(2)酶切CRISPR-Cas9慢病毒表达载体Lenti-CRISPR.v2 vector,形成线性化载体。
(4)上一步获得的Gibson组装产物转化Trans1-T1感受态细胞。
(5)使用质粒大量提取试剂盒提取质粒,即sgRNA质粒文库。
(6)NGS(Next generation sequencing)鉴定sgRNA质粒文库sgRNA丰度。NGS建库测序及后续慢病毒包装由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。
2、牛全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库慢病毒包装
全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA文库慢病毒包装由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。
主要慢病毒包装过程如下:
(1)取细胞生长状态良好,并且处于对数生长期的293T细胞,用0.25%胰酶消化,用10倍胰酶体积的完全培养基轻轻吹吸细胞,将其悬浮为单细胞悬液,细胞计数,按照每个10cm的细胞培养皿接种6×106个细胞,置于37℃,5%CO2培养过夜;
(2)次日确认细胞生长状态良好,并在转染前去除培养液,换为5mL Opti-MEM培养液;
(3)质粒混合:取9μg Packaging Mix和3μg慢病毒表达质粒加入经37℃预热的1.5mL Opti-MEM,轻轻混和匀;
(4)稀释Lipofectamine2000:取36μL lipofectamine2000加入另外的1.5mLOpti-MEM中,轻轻混匀,室温放置5min;
(5)轻轻混合质粒溶液(3)和lipofectamine 2000稀释液(4),置室温20min;
(6)转染:将3mL质粒脂质体复合物(5)小心地加入到细胞培养皿中,轻轻混匀,置于37℃,5%CO2的培养箱中孵育6个小时后,更换完全培养液DMEM+10%FBS;
(7)病毒液收集:48h后收集细胞培养上清,3000rpm离心10min,去除细胞和碎片,并用0.45μm的滤器过滤;
(8)浓缩:收集的病毒原液在50000g条件下超速离心2小时,去除上清后,重悬于1mL DMEM培养液中,分装至无菌无酶小管中,放置于-80℃保存备用。
3、慢病毒滴定
(1)感染前一天接种MDBK细胞到六孔培养板中;
(2)待细胞汇合至50%进行感染,用含有1%双抗和10%FBS的DMEM培养基稀释慢病毒溶液(10μL、20μL、30μL、40μL、50μL和对照组),每个孔加终浓度为8μg/mL的polybrene;
(3)感染1d后更换为含有1%双抗,10%FBS新鲜的培养基;
(4)感染3d后,胰酶消化收集细胞,荧光定量PCR定量;
(5)根据公式计算病毒滴度TCID50。
计算公式如下:TCID50/ml=10(a+x)×200/ml其中,a=lg(n);n=感染率高于50%的最接近稀释度;b=n稀释度的感染率;c=低于n的最接近稀释度的感染率;x=(b-50%)/(b-c)。
4、MDBK对嘌呤霉素敏耐受浓度探索实验
(1)嘌呤霉素(Puro)用无菌PBS溶解为1mg/mL过滤除菌,分装保存于-20℃备用。
(2)MDBK细胞铺6孔板中。
(3)待细胞汇合度达到70%时,吸掉旧培养基,PBS冲洗一次,加入含有不同浓度Puro的含有10%FBS,无抗生素的DMEM高糖培养基,Puro设定如下浓度:0μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL。
(4)每天更换新鲜的含有上述Puro浓度的10%FBS的DMEM高糖培养基;
(5)连续培养7d左右,当出现某一个浓度的细胞全部死亡,且相邻的低浓度的细胞大多数存活时,则该浓度为最佳致死浓度,用于后续筛选试验。
5、MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库构建
(1)感染前一天接种MDBK细胞系到T225细胞瓶中。
(2)待细胞汇合至50%左右时进行感染(MOI~0.5),用含有DMEM高糖培养基稀释慢病毒,并加入终浓度为8μg/mL的polybrene,培养24h后加入DMEM完全培养基培养。
(3)感染3d后,更换细胞培养液,加入终浓度为Puro 1μg/mL完全培养基,每日换液,观察细胞状态,必要时进行细胞传代。
(4)用Puro培养基筛选培养到第7d后,收集一部分细胞提取基因组DNA,检测sgRNA丰度。其余细胞用于后续筛选。
6、酮体分子BHBA代谢相关基因筛选
(1)实验用培养基:
a.DMEM完全培养基:DMEM高糖培养基+10%FBS+1%双抗
b.DMEM无糖培养基:DMEM无糖培养基+10%FBS+1%双抗
c.DMEM_BHBA无糖培养基:DMEM无糖培养基+10%FBS+1%双抗+5mM BHBA
(2)将上述MDBK敲除细胞分别用以上三种培养基培养,连续培养,待b组培养基细胞存大批量死亡,存活率约为10%,三组细胞全部更换为DMEM完全培养基,恢复细胞状态,待细胞生长至一定数量后再分别更换为上述三种对应培养基进行筛选,连续筛选三轮,收集每组细胞,用于基因组DNA提取。
(3)细胞基因组DNA提取按照说明书操作。
(4)PCR扩增sgRNA:
sgRNA1F:5'TACGATACAAGGCTGTTAG 3';
sgRNA1R:5'TGATAACGGACTAGCCTTA3';
sgRNA2F:5'AATTAATTTGACTGTAAACACAA3';
sgRNA2R:5'TTCAAGTTGATAACGGACT 3'。
(5)胶回收纯化目的片段,纯化过程按照PCR产物胶回收试剂盒说明书步骤操作。
(6)纯化产物建库进行二代测序,委托诺禾致源进行二代测序。
(7)原始二代测序数据用FASTQC软件做质控过滤,获得清洗后的clean data,用于后续分析。
(8)用MaGeck软件将clean data与sgRNA库文件序列比对分析,进行sgRNA富集数的统计和标准化。此过程在Linux系统运行该程序,需要针对设计sgRNA文库建立sgRNA序列库library.csv文件,分析运行代码为:
mageck count-l bovine-libary-full-2.csv-n chrmix--sample-label day0,ctrl,t2--fastq chrmix-0_1.clean.fq.gz chrmix-1_1.clean.fq.gz chrmix-5_1.clean.fq.gz--fastq-2chrmix-0_2.clean.fq.gz chrmix-1_2.clean.fq.gz chrmix-5_2.clean.fq.gz
magecktest-k chrmix.count.txt-t t2-c ctrl
(9)将上一步获得的countsummary.txt、rra.gene_summary.txt、rra.sgrna_summary.txt文件用R包“MAGeCKFlute”进行下游分析,统计mapping比,正选择和负选择top基因以及功能富集分析。
二、结果与分析
1、牛CRISPR-Cas9全基因组敲除文库均覆盖度和均一性检测
将构建的CRISPR-Cas9全基因组敲除文库进行二代测序,分析实测sgRNA数量78415247条reads,对应sgRNA 81351个,与原始设计合成sgRNA相比的覆盖度为97.55%,丰度较高,sgRNA均一性11.4,均达到sgRNA文库合格标准(表1),可以用于后续实验。
表1CRISPR-Cas9 sgRNA文库覆盖度和均一性
注:“均一性”即Reads最高的10%中最小的Reads总数同最低的10%中最大的Reads总数的比值必须小于15。
针对牛20371个编码基因设计sgRNA,对已构建sgRNA文库进行NGS测序,结果显示,19595个基因有4条sgRNA(图2),占靶基因总数比例为96.19%。通过高通量测序对sgRNA丰度进行检测,其丰度较高,为97.55%,绝大多数基因对应4条sgRNA。
2、慢病毒滴定
使用MDBK细胞对包装好的文库慢病毒滴定,确定在MDBK细胞的感染用量,最终确定感染复数为0.5MOI慢病毒用量。
3、MDBK细胞嘌呤霉素筛选浓度确定
嘌呤霉素浓度设置为0μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL,作用于MDBK细胞,连续培养7天后,嘌呤霉素浓度为1.5μg/mL组细胞全部死亡,1μg/mL浓度组细胞大部分存活,选择嘌呤霉素为1.5μg/mL为慢病毒感染后筛选浓度。
4、MDBK细胞Cas9全基因组敲除细胞库预实验
预实验在T25瓶接种MDBK细胞5×105个,慢病毒文库按照0.5MOI感染MDBK细胞,同时加入polybrene 8μg/mL,病毒感染72h后传代,更换含有1.5μg/mL嘌呤霉素的DMEM完全培养基,连续培养7天后,收获细胞,亚克隆于96孔板,培养单克隆细胞,随机挑取单克隆细胞5株,提取基因组DNA,PCR扩增含有sgRNA基因片段,将纯化的PCR产物做Sanger测序,验证文库载体是否整合到MDBK基因组。
用两对不同引物扩增5株单克隆细胞株sgRNA片段,均呈现阳性,空白细胞MDBK细胞为阴性,但引物sgRNA-1F/R在约2000bp处有轻微非特异性扩增,而引物sgRNA-2F/R目的条带较为特异,无明显非特异性扩增,因此选用sgRNA-2F/R为后续文库筛选sgRNA扩增用引物(图3)。
上述PCR产物测序获得序列与设计sgRNA序列库比对,均能够与比对上原始sgRNA序列,对应基因分别ANXA9、DEPDC1、GPBP1L1、ALG6(表2)。文库慢病毒感染后,外源基因能够与宿主MDBK基因组整合。
表2MDBK基因敲除细胞克隆sgRNA测序鉴定结果
5、MDBK细胞Cas9全基因组敲除细胞库构建
文库病毒感染MDBK细胞,经过嘌呤霉素筛选获得敲除细胞库,对基因敲除细胞库进行分组处理。
基因敲除细胞库经无糖培养基处理,细胞出现大量死亡;在无糖培养基基础上加入5mM BHBA处理,在初期细胞也出现大量死亡,但随着传代的对筛选条件的适应,对BHBA有良好利用的细胞能够在短期内耐受无糖培养的处理(图4)。
6、BHBA相关基因筛选结果
6.1敲除细胞库sgRNA片段测序质控结果
对经过嘌呤霉素筛选后的起始基因组敲除细胞库(day0)、无处理平行对照细胞库(ctrl)、无糖培养基筛选组(t1)、无糖培养基+5mM BHBA筛选组(t2)细胞提取基因组DNA,纯化回收目的片段进行二代建库测序,测序数据产出及质控情况见表3。质控获得cleanreads平均为1.5G,Q30均值为93.18%,测序数据可用于后续分析。
表3 CRISPR-Cas9敲除细胞库sgRNA基因片段二代测序数据质控表
6.2敲除细胞库sgRNA测序比对率
Clean data与牛sgRNA序列库比对,比对率均大于50%(图5)。由于用PE150双端测序,目的片段大小为250bp,sgRNA序列靠近片段一侧,测序reads有50%reads无法测到sgRNA序列,因此,实际sgRNA序列比对率达到50%左右为正常范围。
6.3酮体BHBA代谢相关基因筛选结果
组间sgRNA差异分析及必需基因筛选,采用MAGeCK和MAGeCKFlute进行组间sgRNA富集数差异分析及必需基因筛选。富集分析方法采用超几何检验(Hypergeometric test,HGT)。
无糖培养基+5mM BHBA处理组与正常对照组相比,正向筛选排序前五个基因分别为:编码富含亮氨酸的小重复蛋白家族成员蛋白基因(PODN)、编码转录因子相关基因(HOXD8)、嗅觉受体家族13亚家族L成员2基因(LOC107132284)、血小板活化因子受体基因(PTAFR/PAFR)和叉头转录因子J3(FOXJ3)。这些这些基因缺失细胞能够在无糖状态下利用酮体BHBA分子延长其生命周期,这些基因是潜在的BHBA抵抗性基因。负向筛选排序前5个基因分别为:锌指和SCAN结构域包含20基因(ZSCAN20)、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因(HIBCH)、编码Ser/Thr激酶家族及HIPK蛋白激酶基因(HIPK1)、转录抑制复合物DEP结构域包含1基因(DEPDC1)(图6)。这些基因缺失细胞在无糖状态下对BHBA处理较为敏感,这些基因可能是酮体BHBA作用或代谢的关键基因。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种牛全基因组编码基因CRISPR-Cas9文库的构建方法,其特征在于,包括针对牛的全基因组基因设计并合成sgRNA,以所述sgRNA为模板,利用合成的全基因CRISPR-Cas9sgRNA文库寡核苷酸探针进行扩增,回收扩增产物,得文库扩增产物;
利用线性化的CRISPR-Cas9文库载体与所述文库扩增产物进行连接,连接后转化Trans1-T1感受态细胞,提取质粒得牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库。
2.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,除看家基因和生存必须基因外,针对全基因组的其余基因,每基因设计4条sgRNA。
3.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,所述线性化的CRISPR-Cas9文库载体包括利用XhoI酶酶切Lenti-CRISPR.v2vector。
4.一种慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库,其特征在于,所述牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库由权利要求1~3任一项所述构建方法构建得到。
5.MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将MDBK细胞培养至汇合为50%-60%,与经含有DMEM高糖培养基稀释的权利要求4所述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库和聚凝胺混合,培养24h后更换新的DMEM完全培养基继续培养;
(2)病毒库感染细胞3d后,更换Puro培养基筛选培养至7d后,获得MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库;所述Puro培养基为含有最佳致死浓度的嘌呤霉素的DMEM完全培养基。
6.根据权利要求5所述构建方法,其特征在于,步骤(1)所述聚凝胺的终浓度为8μg/mL。
7.根据权利要求5所述构建方法,其特征在于,所述Puro培养基中嘌呤霉素的终浓度为1μg/mL。
8.利用权利要求5~7任一项所述构建方法构建得到的MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库。
9.权利要求1~3任一项所述构建方法构建得到的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库或权利要求4所述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库或权利要求8所述MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库在筛选功能基因和/或相关作用基因中的应用。
10.一种筛选与酮体分子BHBA代谢相关的基因的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将权利要求8所述MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库中的MDBK敲除细胞分别用三种培养基进行连续培养,待b组培养基细胞大批量死亡,细胞存活率降至10%,三组细胞全部更换为DMEM完全培养基,待细胞生长至汇合率达80%以上再分别更换为对应的原始培养基进行筛选,收集每组细胞,并提取基因组DNA;所述三种培养基包括a组培养基、b组培养基和c组培养基,其中a组培养基为含FBS和双抗的DMEM完全培养基,b组培养基为含FBS和双抗的DMEM无糖培养基,c组培养基为含FBS、双抗和BHBA的DMEM无糖培养基;
(3)利用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的sgRNA与提取得到的基因组DNA混合进行PCR扩增,回收目的片段后纯化,对纯化产物进行二代测序;
(4)将二代测序的数据与权利要求1~3任一项所述构建方法构建得到的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库进行比对,进行sgRNA富集数的统计和标准化,筛选得到与酮体分子BHBA代谢相关的基因。
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2023
- 2023-03-30 CN CN202310322676.1A patent/CN116356431A/zh active Pending
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