CN115779084A - 激活猪的tusc1基因表达的制剂在制备猪抗伪狂犬病毒感染药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及生物医药领域，公开了激活猪的TUSC1基因表达的制剂在制备猪抗伪狂犬病毒感染药物中的应用，所述的TUSC1基因包括猪中的NCBI登录号为NC_010443.5的TUSC1基因或猪中与该基因同源的TUSC1基因。本发明发现该基因在IPEC‑J2细胞（猪小肠上皮细胞）中被激活之后能够抑制PRV的增殖，故本基因可作为抑制PRV复制的疫苗药物的开发与抗病育种研究的新型靶点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及生物医药领域，具体涉及激活猪的TUSC1基因表达的制剂在制备猪抗伪狂犬病毒感染药物中的应用。
背景技术
伪狂犬病PR(Pseudorabies，简称PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，简称PRV)引起的以种公猪不育、母猪繁殖障碍、新生仔猪死亡、育肥猪生长受阻为主要临床特征的病毒性传染病，对生猪养殖行业造成了巨大经济损失，并严重制约了其持续健康发展(陈焕春和何启盖2015)。本世纪初，尽管PR疫情在全球范围内得到有效控制，但近几年还有PRV感染人类的相关报道，对公共卫生安全也造成了潜在威胁(Liu et al.2021)。因此，亟需开展PRV感染相关的宿主基因鉴定及其互作研究，为抗PR猪品种培育和疫苗药物研发等提供理论基础及靶基因。
发明内容
本发明的目的在于提供了激活猪的TUSC1基因表达的制剂在制备猪抗伪狂犬病毒感染药物中的应用，所述的TUSC1基因包括猪中的NCBI登录号为NC_010443.5的TUSC1基因或猪中与该基因同源的TUSC1基因，或是编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
激活猪TUSC1基因表达的制剂在制备抗PRV感染药物中的应用；所述的TUSC1基因为猪中的NCBI登录号为NC_010443.5的TUSC1基因或猪中与该基因同源的TUSC1基因，或是编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因；
以上所述的应用中，所述的TUSC1基因为SEQ ID NO.1所示；
以上所述的应用中，优选的，所述的激活方法包括但不限于针对猪TUSC1基因的CRISPR/SAM激活技术、或基因过表达技术。
当使用CRISPR/SAM激活技术时，激活猪中NCBI登录号为NC_010443.5的TUSC1基因表达的制剂为gRNA：GGCGAGTTCGGGGCCCGGCG。
本发明的保护内容还包括：通过激活猪TUSC1基因的表达来制备抗PRV感染的细胞模型。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
申请人通过CRISPR/SAM激活技术在IPEC-J2细胞中靶向激活TUSC1的表达，首次发现激活TUSC1的表达的细胞可以通过影响PRV的复制从而抑制PRV的感染，该基因可作为PRV的新型抗病靶点。本发明为研制有效安全防治伪狂犬病的新型疫苗药物提供了新的靶标，也为抗伪狂犬病育种研究提供了新型候选基因，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：IPEC-J2-SAM单克隆细胞系的激活基因表达效果验证；
IPEC-J2-SAM中转入靶向B4GALNT2基因的4条gRNA，qPCR检测B4GALNT2基因的激活效果，β-actin为内参基因(*P<0.05，t-test)。
图2：IPEC-J2-SAM-TUSC1细胞的构建及验证：
A：qPCR检测TUSC1基因在IPEC-J2-SAM-NTC细胞(图中标记为NTC)和IPEC-J2-SAM-TUSC1细胞(图中标记为TUSC1)中的表达，β-actin为内参基因(**P<0.01，t-test)；
B：EdU法检测IPEC-J2-SAM-NTC细胞(图中标记为NTC)和IPEC-J2-SAM-TUSC1细胞(图中标记为TUSC1)的活性；
C：统计B图中两组细胞的EdU阳性比例(ns，t-test)。
图3：TUSC1基因激活细胞对PRV增殖的作用检测：
A：IPEC-J2细胞激活TUSC1后，qPCR检测感染12h后PRVUL54 mRNA的表达水平(*P<0.05，t-test)；
B：IPEC-J2细胞激活TUSC1后，流式检测感染12h后被感染细胞的比例；
C：统计B图中两组细胞的GFP阳性比例(**P<0.01，t-test)。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
IPEC-J2-SAM细胞的构建和验证
1.1IPEC-J2-SAM细胞的构建
(1)按NEOFECT公司的DNA转染试剂(TF201201)的操作说明书利用辅助质粒psPax2(Addgene，12260)、pMD2.G(Addgene，12259)，以及两种核心质粒lenti dCAS-VP64_Blast(Addgene，61425)、lentiMPH v2(Addgene，89308)分别包装慢病毒。
(2)将IPEC-J2细胞(猪小肠上皮细胞)接种到6孔细胞培养板的2个孔，一孔作为实验组，另一孔作为对照组，用含有10％FBS的DMEM高糖培养基培养。
(3)待细胞汇合度达到60％～70％时，进行感染(MOI～1)。用含有10％FBS的DMEM高糖培养基稀释步骤1制备的慢病毒，并加入终浓度为8μg/mL的polybrene。
(4)感染1d后，细胞传代至10cm细胞培养皿，继续培养。
(5)培养2d后，加含有杀稻瘟菌素和潮霉素的培养基(10％FBS的DMEM高糖培养基)，杀稻瘟菌素和在潮霉素该培养基中的终浓度分别为6μg/mL和300μg/mL(以下简称培养基)。
(6)每天更换新鲜的培养基，待对照组细胞全部死完，实验组有细胞存活时，将实验组细胞接种到10cm细胞培养皿，使其形成单个细胞，加入培养基。
(7)继续培养14d左右，待单个细胞长成单克隆细胞团，用玻璃针刮下来放置24孔培养板中，加入培养基获得IPEC-J2-SAM单克隆细胞系。
1.2IPEC-J2-SAM单克隆细胞系的验证
1.2.1利用qPCR检测激活元件dCas9-VP64和MS2-HSF1-P65在单克隆细胞IPEC-J2-SAM中的表达
(1)按Omega公司总RNA提取试剂盒(R6834-01)的操作说明书提取野生型细胞IPEC-J2和单克隆细胞IPEC-J2-SAM的总RNA。
(2)测得RNA浓度后，按艾科瑞生物公司反转录试剂盒(AG11705)的操作说明书将RNA反转录成cDNA。
(3)cDNA经RNase Free H2O 5倍稀释后，qPCR检测两种激活元件的表达水平。
cDNA样本通过Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行扩增，检测不同样本中特定基因表达的差异，同时设置内参基因β-actin作为对照，每个样本设置3个复孔。三步法的扩增反应条件为：预变性95℃4min，循环反应为变性95℃5sec，退火60℃20sec，延伸72℃20sec，并收集荧光信号，共进行40个循环，最后延伸72℃2min。65℃-95℃升温，升温速度0.5℃/5sec以检测融解曲线。所使用的体系(Takara，RR820Q)和引物分别见表1和2。
表1qPCR扩增体系
表2qPCR引物
qPCR分别检测单克隆细胞IPEC-J2-SAM和野生型细胞IPEC-J2中激活元件dCas9-VP64和MS2-HSF1-P65的表达。两种激活元件dCas9-VP64和MS2-HSF1-P65在单克隆细胞系IPEC-J2-SAM中均可高效表达(如下表)，说明单克隆细胞IPEC-J2-SAM已构建成功。
SAM系统元件在IPEC-J2-SAM细胞系中的表达
1.2.2单克隆细胞IPEC-J2-SAM可激活内源基因表达的验证
随机选取一个猪基因B4GALNT2(Gene ID:100621328)，根据其序列设计4条gRNA，分别转入单克隆细胞IPEC-J2-SAM后确认该基因的激活效果，以验证构建的单克隆细胞IPEC-J2-SAM能否有效激活猪内源基因的表达。
(1)gRNA的设计：选择需要gRNA靶向基因位置的部分序列，使用http://crispr.mit.edu/，http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html和http://www.rgenome.net/cas-database/网站进行设计。激活B4GALNT2基因的gRNA序列见表3。
(2)将公司合成的gRNA稀释为100nM后，互补序列各取5μL混合。
(3)将混合液上PCR仪器，退火得到双链gRNA。程序如下：95℃，10min，65℃，40min，10℃，10min。
(4)将lentigRNA(MS2)_puro backbone载体(Addgene，73795)使用BbsI或BsmbI酶切回收后，使用T4连接酶将gRNA与载体连接。
(5)转化载体到DH5α，涂平板，挑单克隆菌落送往测序验证。
(6)阳性菌落测序鉴定正确后，扩繁菌液，按TIANGEN公司的质粒小提试剂盒(DP103)的操作说明书提取质粒。
(7)按NEOFECT公司的DNA转染试剂(TF201201)的操作说明书利用辅助质粒psPax2(Addgene，12260)、pMD2.G(Addgene，12259)，以及上一步中得到的质粒进行慢病毒包装。
(8)将相同数量及适量的实验组细胞(IPEC-J2-SAM)和对照组细胞(IPEC-J2)接种到6孔板中，5％CO2、37℃培养箱培养。24h后，使用适量上一步中得到的慢病毒感染实验组细胞，空载(lentigRNA(MS2)_puro backbone)包装得到的慢病毒感染对照组细胞。48h后，使用嘌呤霉素(3μg/mL)持续筛选7天。
(9)收集细胞提取RNA并利用qPCR检测B4GALNT2基因在实验组细胞和对照组细胞中的表达，具体操作见实施例1中2.1部分，所使用的引物见表3(内参基因为猪的β-actin，序列见表2)。
表3 B4GALNT2基因的gRNA序列和qPCR引物
qPCR结果如图1所示，与对照组相比，实验组细胞中B4GALNT2基因均被显著激活，故IPEC-J2-SAM单克隆细胞系可有效激活内源基因表达，能够用于后续的TUSC1基因激活细胞的制备。
实施例2：
TUSC1基因激活细胞的构建及验证：
目的基因TUSC1基因序列的NCBI号为NC_010443.5，具体为SEQ ID NO.1所示，编码SEQ ID NO.2所示蛋白。
2.1 TUSC1基因激活细胞的构建及验证
TUSC1基因激活细胞的构建和验证的具体操作，可参见实施例1中B4GALNT2基因的构建和基因激活效果检测，所使用的gRNA序列及qPCR引物见表4。
表4 TUSC1基因的gRNA序列和qPCR引物
TUSC1基因激活的qPCR结果如图2中A所示，与对照组相比，实验组细胞中TUSC1基因被显著激活，故TUSC1基因激活细胞构建成功。
2.2利用EdU法检测TUSC1基因激活细胞的活性
(1)前一天接种细胞至12孔培养板中。
(2)待细胞生长至30％～50％时，进行EdU染色。
(3)用细胞培养基按1000:1稀释EdU溶液，制备50μMEdU培养基。
(4)每孔细胞中加入500μL的50μMEdU培养基孵育2h，弃培养基。
(5)预冷的PBS清洗细胞3次，每次5min。
(6)每孔细胞中加入500μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min。
(7)预冷的PBS清洗细胞3次，每次5min。
(8)每孔细胞中加入500μL渗透剂(0.3％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗3次，每次5min。
(9)每孔加入500μL的
染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液。
(10)PBS脱色摇床清洗3次，每次5min。
(11)细胞核染色：加入DAPI，室温避光染色10min。
(12)弃去DAPI，PBS脱色摇床清洗3次，每次5min。
(13)加入1mL PBS，在荧光显微镜下观察荧光。
利用EdU法检测TUSC1基因激活后对细胞活性的影响，结果发现TUSC1激活前后，细胞的Edu阳性细胞比例并无显著差异，说明激活TUSC1基因后对细胞活性并无显著影响(图2中B和C)。
实施例3：
TUSC1基因激活细胞对PRV增殖的作用检测
3.1利用qPCR检测TUSC1基因激活细胞对PRVUL54 mRNA的激活效果。
将相同数量及适量的实验组TUSC1激活细胞(图中TUSC1)和对照组细胞(图中NTC)接种到6孔板中，5％CO2、37℃培养箱培养。24h后弃培养基并用DMEM洗2遍，加入PRV(MOI＝1，Becker毒株，GenBank accession:JF797219.1)混匀，37℃孵育1h后，再加入1mL DMEM+10％FBS完全培养基，继续培养。随后的收样及qPCR操作步骤与实施例1相同，所使用的PRVUL54基因的qPCR引物见表5(内参基因为猪的β-actin，序列见表2)。
表5 PRVUL54基因的qPCR引物
结果发现，在12h时，PRV UL54在实验组中显著降低(图3中A)，说明在IPEC-J2细胞中激活TUSC1基因后显著抑制了PRV的增殖。
3.2利用流式分析检测TUSC1基因激活细胞对PRV的抑制效果。
将相同数量及适量的实验组TUSC1激活细胞(图中TUSC1)和对照组细胞(图中NTC)接种到6孔板中，5％CO2、37℃培养箱培养。24h后弃培养基并用DMEM洗2遍，加入PRV-GFP(MOI＝1，Becker毒株，GenBank accession:JF797219.1，即用GFP标记后的该毒株)混匀，37℃孵育1h后，再加入1mL DMEM+10％FBS完全培养基，继续培养。12h后用胰酶消化细胞，再用PBS悬浮细胞，用流式细胞分析仪检测GFP阳性细胞(PRV感染细胞)比例。
结果发现，在12h时，实验组GFP阳性细胞比例显著低于对照组(图3中B和C)，说明在IPEC-J2细胞中激活TUSC1基因后显著抑制了PRV的增殖。
SEQ ID NO.1
>NC_010443.5:197240649-197312349 Sus scrofa isolate TJ Tabasco breedDuroc chromosome 1,Sscrofa11.1,whole genome shotgun sequence
ATGCCACTCACAAAGGAGGACCTGGAATACCGTCGGGTGGCGCGCCGCCTCATTCGGTTTGAGGCTCCCCGGCTCCCGGGCGGCCTTACCTCTGTTCCGGTGGCTCCAGGGGCCAGAACAGTTGGAATCTCGCTGGGGCCTCCAGAAATGTTACAGCAGATACCCAGCAGCCCTGCGCTGCAGCGTATCAGCTCTGGCGACAGCCCCATGGCTGTAGTGTACCAGCTCCAGCAGCTTTGTGGCTGCAGTGGATCAGCTCTTTCACCCGGCGAGAAACCAAGCGAGCACTCAGAGAGTTGAAGAACTCAGTTTTATTATGCCGGTGGGCTCAGAGGAAATCGCTCTCCAGAGTCTGAGCCCGGAAGAAGGGTTTCACAGGCTTTTATGGGCTACGTCTTCCGGGTCCAAGCTTGACTAGTTGGACTGGCATGATGTCAGGCAAGGTAGTAGATATGGAAGCAGATGCATGGGGGAGGACTGGTTGGGGCAGTTGGCTAGACTTTGCTTAGTCATCATGGCTGGGGTCTCTCCTTTCTACATTTTATTGGGACATTTTCTCCTACACCATAATAGGAACTCCCAAAAAGCCAAGTGCTTTTAATGGCCTCTAAGTTTTTTACATTATCTGTTCTTCTATTACCCATCTTATTTTCTACTTATTTCCTACCCACACTGTACTTTTGTCAAACTAGTTTTAATTCCTTCTAAATATAAAATATGTAGCACCACATGGCTTGTGTACTTCCATGTTGGTTCTGTTGGAACCCTTCCCCCACCATCAGCAAGTTCTAATTTTACTAAAAATGCCTTTTAGGCATACATTCCACCACTACCGTTCCTGTTTTATTTTTCTCCATAACTCCTTTGACAATCCAATTTGCTGCATACTTTATTGTTTGTGCTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTGTCTACCACTACTACTATATGTTTCATTAGGGGATGGAGGTCTTCCTATTTTTTTCATGCTGCACACCTCAAACATATAGATACTGAACTATAGCTACTAAATGTATATACATATTTGAATGAATGCATGTGTCCATAATAACATAAATCAGTCTGAGTCATTTTAGCTTTGGCTATGGTTTTGTAAAAACATCATACTTCCTCTGTTCAAGAGAAGTGATGCTACCTCAAGTCTTGGCTGTACTTATCAAGCAAAGCATAGTTTTGAGCAATTTCAGAAGCAATATGAAATGTTTTGCAAATGAAAGACTCATGTAAACATCATCATATTTCCCTGAGCATGGAGTCCTTTCCCAAATATAGTCTGTGTTGTGTTTTAATAAACTGCCTAAATAACTCTTCCAGATTCCTATTTCACAAATTTTCTGAATTAAAATTACTAAATTGATATTATGACCCTCAATTATATTAAATCAAGAAGACATTAAGGCCTTCAAGCAACACCAATTGAATTATGTTCCAGGCACTCAGCTAGGCAATGGAAGTAAAAAAAAAAATGAACAAAACTTGTTTTCCACCCTCGGGTCTACATCATATTACAGAATTTTTAAAGTAGCTTTATCTTGTATAGAAAACAAACTTATGAGAGCTCATTAAGATTATTATTAAGATATTATTTTACTGATTTAATCATATTTCTCATCTTCATATTAATTATAGCTTGTTGGTTATTCTCATCTATTATGTCCATTTCATTATCTTAAGGAATTTTGCTCTTTTTCCCCCAATTTATATCCATTCTTTTCCTTTTTGTTCTTTGTTCACTGTTATCATTCTCATTTCATTTAAGTGTAAGAATTGATTTGAACATAGTGCTTTATTACCTTTTCTTCCAGAGTGTCTCAAATTCTTCAACATTACCCACCTCCTTTTATGCTTTTTGAGCCTTTATGCTTTGACTTCCAGTCACATGTGCTTATCTCTGCTTCCTCCCAAATGGCTACTGAAATGATACTAAAAAACATAAAATGCTATAAACCCACAAGGACAAAGATTATGGGAGAGGAGACAGTGGCAGATAAATTGAAAAGCAAATGGAAGAGGAATAATAAATTCATCTGGGTGGAAGGCCTAAAACCTCAGACACATGGATAGAAGGATACTGTAGATAAAGTGAGTCATTCCTTGGCAAGGGACTTTTAAAAGGTTTGGGGCTCGGAGATATTAAATCCTTTGTTATTGAAACAGGTTCCACTGCTCACTGCTTATATAATCAATACTCACAAATGTTGGTACAGAGGAAAGCTGCTTTTGATCAGATGCTGGCAATCTGAGGAGTTTCGTAGACTCGATGTCCCCCCAAAAATCACTCTGAAGATTCTACTGGGCAGTGAAACTTTTAAGGGGAAGAAGGAAAGTAATCTCAGTTAATTACTGAGATGGGGGGTCAGAGTCTTTGCCATCTCCCATCGTGTTCAGGCTCACTGAATTCTTATGATCTTCCCCTTAACATTATCTTGTTTACACAGTTTATTCACACGGTTTGTTCTTGAGGTTACTGAAGGGGAAACTAGGAAAGATATCTGGTTATCTGTTAATTATACATTCTTCATTTCTACTTCTTTGGTCTATGGAAAGAATGGACAAGGTATTGTGTAGTTAAAATATTTGAAAGGTGTGCTTGGGCTGAGATGAATAGAGCATGGGGGTGCCTGGTAAAAGTTAATTACAAAATAGCTTTGCTAGAGTGATAAGGAAAGGGGCTTCCTGCTGAGGGTAGCTTCCTGCAAAGAGCTACATACACTTTAGTGAATGAGGATAAAGTGGAAAACAGAGTAATTATTTGCAAGTCAGTGTCTGATTATGCCATAATCGCTCCTAGCCATATGAAAGCCCCCAGGCAGGGACCAGAAGTTTACAGTCTGGAGAAACATAATAGGATGTAACTGGCAATTACAGACTCAAGTGTACTAGGAAGCAAAGACAAGATATGTGACTGAAAGTGGAGAATCCATTGAAGGCTTCCATTCCTAGTCCCCTTTGCTCATAGAATGGTCATGGCCACTAAATTCTCCTAAGCAGAAGTCTATCAATTATTTTCTGAAGAAACTGGATACCCACAGGTGAAAATACCTCTATATACTAAATTGCAAGTGTCCCCCTGTTAAATAGGTGGCTCTTTCCCACCTATAGGCAGAACTCACCCATCAGCAACCATGCACGAACTAATAGCCACTCATAAATATGAACAGACACCAAGTGTAGTAGATTGTATTATTTCCAAAATACTCAGTAGCTCTCACCAGGGGACCCATTCCTTGAGAGGAAAATTCATTTAATCTGTTGACATAAACCTTGTTCTCTACCTAATGAAATACCAAAAAAAAAAAAAAGCATTGTATTTGCCCTCTGAGTTAAATAAAGCATTAAGAGCTATCATGCTACTTTATTGTTTGTATTTACCTTCTGCAGTCACACCAACAATGTCTTACATAAGGGACTGAAAAAATAGAAAAAGAAAGTGGTATAAGAAAATTTGAATAATCAAAGTACGTGAAATACTTTACTGAAAATGCTTCTCCAGTGTCCAGGACTGTGGGTAAAAGTAGATTCACATAAAGGCATATCTTGACATTTCAAAAACACCATATATTAAAAGATAATCTCATAAAATTCTAGATTAAAACAAACCATGGCCACCATCACCACTGCTCACTTAAAAGGATTGGGAAGCAGGATAGAGTTAGACTTCTAAAAAGTACTGGAAGCTAGGAGACCATGGTGAAATACCCTTAAATCCTTAGGGAAAATTGACTCTAGAATTCTATATGCAGCCAAAATATCAATCAATTGTGGGGCAAAATATAGGCCTGTGGGTGCTAAGAAAAGAGACTATTTATATGCTTTTCCTTAGAAAATTAGTGAAGGATATCCTGCAAAATGAGGCTTTAAACCAAAAGATTAGAGTCAATAAAAAGTAAATCTCAGGTGAGAGCAAGGTGAATGAAAATCCAGATGTTAGATGAACAGCAGATTTAACAAATCACCAGGTTGAGCTGGAACAGATAGAAAGAAGGCTCTAGGAAGTTTTCCGTAAAAAATAGGAGTCTCTATTATTAGAGAATATTTGGAATGCATTGTTGATAAAGCAGCTGGGAAAAAACAATGCGGAGCCATTTAATGAAACATAGAAGGTAAAAAACAAACAAATATGTGTGTGTGTGTGTGTGGTGTGTGTGTGTGTGTGTATACATATATATATCATACTAAAAATTACCAGAAAAAACAAAAAATAATATAATAAAGGAATCTATATACTATGTGAATATTTGGCTTTATACTTACAAATAATATATATAGCTCACGATAGTGAACACTAATTTTTTAAACTAAAAATCTCACACAACTATATTGGAAAGGTAAAGATGAATAAATCCTATCTATAGTTAATTTAAAATCAACTTATAATGTGCAAAATTTGTATGTCAATTAATGTGTAACTTTTTACTGAGAATTATTGTTCAAATTGTTTTCCTCTTTGATAAAGCAACATTCCTCTCTTGCTCAAGAATTTTTTTTTTTTTTTGGTTTTTAGGTTTTAGAAATTTGACTATGATATACATTTATATGAATTTCTGATGGTTTTTCTTGTCTTGAGTTCACTCAGCTACTTGAATCTCTTAAGTTTATTCCTCTTGCCAAATTTGGAAATTTTCAGCCAAGTGATGTTTAGACCAGCTCTTTCTTTTCTTCCAAGATTCTCACAATATGAATATTTGATCCTTTGCTATAGTTTGAAAGTCCTTAAGGGTCTCATAGTTTTTTTGTTTGTTGTTTTCCCAGTCTATTTTTCCTCTGCTGTTCAGATTGAGTAATTTCTATTGTCCTCTCTTCAGCTTCACTGATTATTTCCTCTGAGTCCTCCATTTTGCTGTTGGACCCTTTCTTTGACTTTGTTTATTTCAGTTCAAAATTTTCTTTATACTTTTTATTTATTTACTAAGAATTTTTGTTTTCATTCTTGCCAACTATTTTTGTAATTGATCTTTGAAGTACACTGAGGACA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TTATAAACTTTTTGCTTTATGTAACAGTGATCTTTTAAAATAATCTAAAAATTAGTCTAAATATTCTTTTTTTTTTACATTTTAGACTTGACATTAGAGTACAGCACAAAGCTACTTTGCCTAATGTTAACTAGTGTTTAAAAATTTTTAAGAAATTATGAATTATTAGTATATCAAAGCCCCAAAACAAAGCGCTTTAAGTCGCAACTGTGATTTCAACACACACACAGAGTTCTAAATGACAAATATTCTAAAATCAGTTCATCATGTTTGGCTACTAATGAAGAAGATACCATTGTCCCTGGTAAAAATCATTGGTTTAAGAGAGTATTTAAGTGGTTGAAAACACTTCAGTTTGAGAAGGAAAAAATATGTGTAGGAAGAGTTTTCGTTAACACCTAGGAAAAAAATCAGGAATTAGAGTTTTTGTTTTATTTGTGGCATGTTCTGAAAGTTTCACAGCATGTATTATAAAACAAGTTACTAGGGACAATAGTTTTGTTCTTTTTCTAATCCTGGGTATTGAAGACATTTTGCACTTTTTGCTTAAGGTAGTTGATACTTGTAAAGATTAAAATCCTCCCGATGACCAAGAAATAAGGAAAAGAAACTTGATGAGAATAAGTAGATATATGAAAAGTATTTTTGTCCCCTTTACTTCATTTTCTAGTAGTGAAAGAAAACAGTTTTTAGGGACAGTAGGAATTGAAGAATGGGAAAATTCGTATCAGCCCTACTGCTACTTAACTGTGATTTGAGGTATAAATTAGTTAATCTCTCTAAACCTTAGTTTTCTCACCATTAAAATGAGTATAACACCTAGTTAAAAATGTTATAAAAATTTTATTGAGGTACAGTATCTCAATGAGATTTATAATTCAAATTGCAAAAGTCACAAATGTATATTTTGTTGAAAATTTGCTTGCCTTCTATATTTTGCTCCTATATGTCTTTATGGGTATTTAGTAGATATGTATATTTTGAGTGAATTGACATTTAGCTCTCCTTATAAGCAAGCAGGAGAGAATTTGCTAAAGCTCTATGTAATAATACAAAAATTTTAAAACTATTTCCCAGTTATGGCAACTGGCAATTTAAGCAAAACTGGCAAAAGGAAGCAAATTAGGAGTTCCCTGGTGGCTCAGTGGGCTAAGGATCTGGTGTTGTCACTGCTGTGGCATGGGTTTGATCCCTGGCCCAGGAAGTTCTGCATGCTGAAGATGTGGCCAAAAACAAATAAATAAATAAAACAAAAAAATGAAGCAAAATATTTAATTTACCTAGTTTTAAACACCTATTGTATTAAAATAATGTATAAGTATGGTAAAAAAAATTTGCAAAGTAATGAGGCACACACATACAAATGAGGAATTCTTTTGAGCATAATTCCTGAAAACTCTTAAAAATTCTGAAACTCAAATACCAAGATGAGTTAAGGCTAATACATATTTCAACTTTGTTGAATTTCCTCACTGATAACTGATAAAGCATCGTGTAGTAATATAACAGATGTTTTATTATATCAAAATATACACCTGTTTGAGAAATAAAGTTAAATTAGAAAAGTTTGATCTAGGCTCTAGTTTGATCTGAAATAAACTAAAACAGCATATTATTATACCTTGTTACAATGACATTTTATTTTCATAACTTCACATTTGTTGTGTAATAAAAAGAGGGCTTATAATTTATAGAAATGAG
SEQ ID NO.2
TGPMWRMRGGATRRGTCGSGGAGDSRGQGRPGRVCGGGGGDGSVGWRGRAGGARQQLEERFADLAASHLEAIRARDERDRQNARLREENARLRLENRRLKRENRSLFRQALRLPSEDGDGASGEVTRATLAPEEPGTDRRARGGGPEDEPGSPRALRARLEKLEAMYRRALLQLHLEQRESRPHGDKEEPSLLKPDSGLQSPEPQPSEPWL
Claims (5)
1.激活猪TUSC1基因表达的制剂在制备抗PRV感染药物中的应用，所述的TUSC1基因包括猪中的NCBI登录号为NC_010443.5的TUSC1基因或猪中与该基因同源的TUSC1基因，或是编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的TUSC1基因为SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的激活的方法为针对猪TUSC1基因的CRISPR/SAM激活方法、或TUSC1基因过表达。
4.根据权利要求3所述的应用，所述的激活的方法为CRISPR/SAM激活方法时，激活猪中NCBI登录号为NC_010443.5的TUSC1基因表达的制剂为gRNA：GGCGAGTTCGGGGCCCGGCG。
5.激活猪TUSC1基因的表达制备抗PRV感染的细胞模型，所述的TUSC1基因为猪中的NCBI登录号为NC_010443.5的TUSC1基因或猪中与该基因同源的TUSC1基因。
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2022
- 2022-09-15 CN CN202211124463.XA patent/CN115779084B/zh active Active
Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115779084B (zh) | 2024-06-18 |
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