CN116832162A - Cd244在作为抗非洲猪瘟的基因编辑靶点中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CD244在作为抗非洲猪瘟的基因编辑靶点中的应用。本发明提供了能够抑制CD244表达的物质在制备用于治疗和/或预防非洲猪瘟病毒感染的产品中的应用。本发明在猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)中抑制CD244基因的表达可显著干扰ASFV复制，过表达CD244可显著促进ASFV在iPAM细胞系中的复制。本发明为抗ASFV感染药物研发和开展猪的抗病育种研究提供了新的素材。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及CD244在作为抗非洲猪瘟的基因编辑靶点中的应用。
背景技术
抗病育种一直是动物遗传育种领域研究的重点和热点，其最终目的是为有效的疾病防控而产生新的抗病品系或品种。非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种烈性传染病毒，严重威胁着全球养猪业。截止目前，还未发现行之有效的疫苗和治疗手段，抗病育种是控制病毒传播的可行途径之一。当前，加强病毒感染分子机理研究，结合多组学数据鉴定出候选的宿主抗性功能位点，为抗病育种提供靶点是突破非洲猪瘟抗病育种瓶颈的关键。虽然各国科学家已经在非洲猪瘟疫苗的研究上获得了重大突破，但是我们目前仍然没有可以投入产业化的可靠疫苗。这让研究者不得不从另外一个方向思考，如何抵御非洲猪瘟病毒的侵袭。1998年，对靠近马拉维边境的莫桑比克太特省Angonia区的乡村猪进行血清学调查发现，在采样的54头健康猪中，有近40％的猪都具有ASFV抗体。此后攻毒实验也证实了存在天然抗性的猪种，但遗憾的是研究者并没有发现这种抵抗能力是可遗传的，这表明非洲猪瘟病毒有着复杂的致病机理。肌瘤病毒抗性(Mx)基因是干扰素调控的基因，可以抑制多种病毒的复制。研究表明，MxA同样可以抑制ASFV在宿主细胞中的复制，这种抑制作用与MxA蛋白被招募到核周围的病毒组装点有关。进一步研究发现，ASFV进入细胞似乎直接刺激了宿主葡聚糖的吸收、肌动蛋白的极化以及EGFR、PI3K-Akt、Pak1和Rac1的激活，通过抑制这些细胞关键调节基因或者用药物EIPA(一种TRPP3通道抑制剂)治疗，会显著降低ASFV的入侵和病毒复制。研究者还发现，ARG1-聚胺的宿主代谢途径对病毒的复制很重要，暗示ASFV可能通过调节宿主细胞中的小分子水平来促进自身的复制。虽然研究者已经寻找出一些ASFV感染过程的关键参与基因，但是并未锁定关键的抗性基因和受体基因。我国非洲猪瘟已经呈现大面积流行，虽然各地已经实施行之有效的防疫政策，但是非瘟病毒已经存在于我国自然环境中，目前并没有有效的疫苗防疫手段。结合我国畜牧业现状，疫病净化是疫病防控的最根本策略，抗病育种作为疫病净化最有效的手段之一，将成为未来畜牧业防控非洲猪瘟的重要策略。开展非洲猪瘟病毒抗性基因研究，将为非洲猪瘟抗病猪培育奠定重要基础，为非洲猪瘟防控提供新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供CD244在作为抗非洲猪瘟的基因编辑靶点中的应用。
第一方面，本发明要求保护能够抑制CD244表达的物质在如下任一中的应用：
(A1)制备用于治疗和/或预防非洲猪瘟病毒(ASFV)感染的产品；
(A2)治疗和/或预防非洲猪瘟病毒(ASFV)感染。
第二方面，本发明要求保护能够抑制CD244表达的物质在如下任一中的应用：
(B1)制备用于在宿主细胞中抑制非洲猪瘟病毒(ASFV)复制的产品；
(B2)在宿主细胞中抑制非洲猪瘟病毒(ASFV)复制；
(B3)制备对非洲猪瘟病毒(ASFV)抗性增强的细胞模型或动物模型。
在第一方面和第二方面中，所述产品可为抗ASFV的药物或疫苗。
在第一方面和第二方面中，所述能够抑制CD244表达的物质可为直接以CD244为靶点的敲除CD244表达的物质或敲低CD244表达的物质或CD244抑制剂。
进一步地，所述能够抑制CD244表达的物质可为CD244 siRNA。
在本发明的具体实施方式中，所述CD244 siRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
第三方面，本发明要求保护能够促进CD244表达的物质在如下任一中的应用：
(C1)制备用于提高宿主细胞对非洲猪瘟病毒(ASFV)易感性的产品；
(C2)提高宿主细胞对非洲猪瘟病毒(ASFV)易感性；
(C3)制备对非洲猪瘟病毒(ASFV)易感的细胞模型或动物模型；
(C4)制备用于在宿主细胞促进非洲猪瘟病毒(ASFV)复制的产品；
(C5)在宿主细胞促进非洲猪瘟病毒(ASFV)复制；
(C6)制备对非洲猪瘟病毒(ASFV)抗性减弱的细胞模型或动物模型。
其中，所述能够促进CD244表达的物质可为能够编码CD244的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒或重组载体或CD244促进剂。
在本发明的具体实施方式中，所述能够促进CD244表达的物质为能够表达CD244的重组慢病毒。
第四方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法I：一种制备对非洲猪瘟病毒(ASFV)抗性增强的细胞模型或动物模型的方法，包括如下步骤：降低宿主细胞或动物中CD244的表达，得到重组细胞或动物；与所述宿主细胞或动物相比，所述重组细胞或动物对非洲猪瘟病毒(ASFV)的抗性增强。
方法II：一种制备对非洲猪瘟病毒(ASFV)抗性减弱的细胞模型或动物模型的方法，包括如下步骤：提高宿主细胞或动物中CD244的表达，得到重组细胞或动物；与所述宿主细胞或动物相比，所述重组细胞或动物对非洲猪瘟病毒(ASFV)的抗性减弱。
方法III：一种制备对非洲猪瘟病毒(ASFV)易感的细胞模型或动物模型，包括如下步骤：提高宿主细胞或动物中CD244的表达，得到重组细胞或动物；与所述宿主细胞或动物相比，所述重组细胞或动物对非洲猪瘟病毒(ASFV)更加易感。
在所述方法I中，降低所述宿主细胞或动物中CD244的表达可通过任何技术手段实现，如通过向所述宿主细胞或动物中导入CD244 siRNA。在本发明的具体实施方式中，所述CD244 siRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
在所述方法II和所述方法III中，提高所述宿主细胞或动物中CD244的表达可通过任何技术手段实现。在本发明的具体实施方式中，是通过将能够表达CD244的重组慢病毒感染所述宿主细胞或动物实现的。进一步地，包装所述重组慢病毒时采用的三质粒系统，具体质粒为携带有CD244编码基因的pLVX-2A-mCHerry-puro重组载体、PMD2.G和PSPAX，包装细胞为293T细胞。
第五方面，本发明要求保护如下任一应用：
(D1)CD244作为靶点在调控宿主细胞或动物对非洲猪瘟病毒(ASFV)易感性中的应用；
(D2)CD244作为靶点在调控非洲猪瘟病毒(ASFV)在宿主细胞或动物中的复制能力中的应用；
(D3)CD244作为靶点在制备用于调控宿主细胞或动物对非洲猪瘟病毒(ASFV)易感性的产品中的应用；
(D4)CD244作为靶点在制备用于调控非洲猪瘟病毒(ASFV)在宿主细胞或动物中的复制能力的产品中的应用。
第六方面，本发明要求保护利用前文第五方面中所述方法制备得到的细胞模型。
第七方面，本发明要求保护利用前文第五方面中所述方法II或所述方法III制备得到的细胞模型在筛选抗非洲猪瘟病毒的药物中的应用
在上述各方面中，所述宿主细胞可为任何能够被非洲猪瘟病毒(ASFV)感染的细胞。在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为猪原代肺泡巨噬细胞。
在上述各方面中，所述动物可为任何能够被非洲猪瘟病毒(ASFV)感染的动物，如猪。
在上述各方面中，所述CD244为SEQ ID No.2所示的蛋白质。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明综合采用多种方法评估靶向控制CD244基因对ASFV在宿主细胞中复制的影响，所采用的主要技术手段有：利用相对定量和绝对定量检测CD244基因抑制后对ASFV编码P72基因的拷贝数和病毒核心基因P30的表达；利用免疫荧光技术检测过表达CD244基因对ASFV编码P30基因的表达影响。以多种不同的实验技术由多个层面分别验证CD244基因对ASFV在原代肺泡巨噬细胞和iPAM细胞株中复制的影响，提高了结果的准确性。
(2)非洲猪瘟是由ASFV引起的一种烈性传染病。ASFV感染通常会导致急性出血性疾病，感染后的家猪死亡率接近100％，对我国养猪业造成了巨大损失。当前，尽管我国非瘟疫情已经有所控制，但是非瘟病毒已经广泛存在于自然环境并将持续威胁我国生猪养殖产业。但由于ASFV感染机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗药物，主要是缺乏有效分子靶点。本发明通过分子和病毒学实验研究发现，利用RNA干扰技术抑制CD244基因的表达，可显著抑制ASFV复制，同时利用慢病毒转导技术构建CD244超表达细胞株，显著提升ASFV的感染能力，为ASFV的后续研究提供了优质的研究材料。本发明为抗ASFV药物开发、基因编辑细胞与动物模型制备提供了新的靶点。
(3)本发明还提供了一种高效构建CD244基因超表达细胞模型的方法，优选慢病毒转导技术，可用于高效制备CD244基因超表达细胞株。本发明方法还为构建CD244基因编辑动物模型提供了技术参考与载体材料。
本发明通过RNA干扰技术在猪原代肺泡巨噬细胞上抑制CD244基因的表达，通过基因编辑技术在iPAM细胞系上构建了CD244基因的超表达细胞株，并结合一系列分子和病毒学实验，证明在猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)中抑制CD244基因的表达可显著干扰ASFV复制，过表达CD244可显著促进ASFV在iPAM细胞系中的复制。经文献调研发现，目前尚无关于CD244参与介导ASFV复制的研究报道。因此，本发明为抗ASFV感染药物研发和开展猪的抗病育种研究提供了新的素材。
附图说明
图1为采用小RNA干扰技术抑制CD244基因在原代肺泡巨噬细胞中的表达。纵坐标为目的基因在随机干扰组和靶标干扰组中的相对表达量，“**”表示显著差异(P<0.01)。
图2为利用荧光定量PCR技术检测CD244基因表达抑制组(si-CD244)和对照组(si-NC)中病毒基因P30的相对表达量。病毒感染复数为1，感染时间为24小时。“**”表示显著差异(P<0.01)。
图3为绝对定量技术检测CD244基因表达抑制组(si-CD244)和对照组(si-NC)培养上清中病毒基因P72的拷贝数。病毒感染复数为1，感染时间为24小时。“**”表示显著差异(P<0.01)。
图4为利用荧光定量PCR实验评价CD244超表达单克隆细胞株(CD244-OE)和野生型iPAM细胞(WT)中CD244基因的相对表达量。“**”表示显著差异(P<0.01)。
图5为利用Western Blot技术检测CD244超表达细胞株(CD244-OE)与野生型iPAM细胞(WT)中CD244蛋白、β-Tubulin微管蛋白以及病毒P72蛋白的表达情况。病毒感染复数为10，感染时间为24小时。
图6为利用免疫荧光技术检测CD244超表达细胞株(CD244-OE)与野生型iPAM细胞(WT)中病毒蛋白P30的表达情况。病毒感染复数为10和50，感染时间为24小时。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及到的CD244的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其cDNA序列如SEQ ID No.3所示。
实施例1、利用RNA干扰技术在猪原代肺泡巨噬细胞中抑制CD244基因的表达
首先，分别从ensemble数据库(www.ensembl.org)下载猪CD244基因外显子序列和猪的全基因组序列(版本号：Sus_scrofa.Sscrofa11.1)，然后设计靶向猪CD244基因的小干扰RNA(表1)。
表1、小干扰RNA核苷酸序列
| 基因名称 | 基因ID | 小干扰RNA序列(siRNA) |
| CD244 | ENSSSCG00000006374 | 5′-ACAGCCATTAGAAGAGCAA-3′(SEQ ID No.1) |
前一天，将猪原代肺泡巨噬细胞(按照常规方法从离体的健康猪肺组织中分离获得)接种到12孔培养板中，培养12-24小时。进一步将合成的siRNA干粉用无RNA酶水稀释到20μM，取5mol加入到500μl的500μl JetPrime Buffer(Jet-101000046)稀释液中涡旋混匀，随后加入40μl JetPrime(Jet-101000046),涡旋10s后室温静置10min，等待JetPrime脂质体包裹siRNA形成脂质体复合物。实验同时设置转染随机siRNA序列(5′-TACGTTCAGCGACTGCATCG-3′)的对照组。
进一步，将脂质体复合物加入到培养的猪原代肺泡巨噬细胞中培养24小时，收取细胞后利用Trizol(Invitrogen 15596026)提取培养物的总RNA，随后利用High-CapacitycDNA Reverse Transcription试剂盒(Thermo Fisher 4374967)反转录得到cDNA文库。
从ensemble数据库下载猪CD244的cDNA序列，设计检测CD244基因cDNA序列的PCR引物，CD244的定量引物见表2。
表2、荧光定量PCR引物
| 基因名称 | 上游引物(5'-3') | 下游引物(5'-3') |
| CD244 | TCCTGAAGAAGGGACCACCA | ATGCTCTCTGTCCAACCTCTTG |
| GAPDH | AGGTCGGTGTGAACGGATTTG | TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA |
利用cDNA文库为模板，GAPDH为内参基因进行荧光定量PCR检测靶标基因的表达情况，具体定量PCR反应体系和条件如下：
PCR反应体系：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(2×)25.0μl；上游引物(10μm)1.0μl；下游引物(10μm)1.0μl；模板200ng；H2O补充至50.0μl。
PCR反应条件：98℃30sec；98℃10sec，56℃5sec，72℃10sec，40个循环；72℃2min；15℃2min。
最后搜集数据，评估基因表达抑制效果。定量检测结果显示经过小RNA干扰后，靶标基因CD244的表达极显著降低(图1)。
实施例2、相对定量和绝对定量实验发现抑制CD244基因可显著抑制ASFV在宿主细胞中的复制能力
为了检测抑制CD244基因是否能够抑制ASFV在猪原代肺泡巨噬细胞中的复制，利用相对定量检测细胞内ASFV病毒核心基因P30的表达情况，利用绝对定量检测ASFV复制的情况，具体实验流程如下：
首先，接种转染靶向CD244 siRNA的细胞(参见实施例1)，并设置转染随机siRNA序列(5′-TACGTTCAGCGACTGCATCG-3′)的猪原代肺泡巨噬细胞作为对照组(si-NC组)，在生物安全三级实验室中，以MOI＝1加入对应体积的ASFV毒株Pig/HLJ/2018(GenBank:MK333180.1)(后文也称ASFV野生型病毒)，摇匀后放回细胞培养箱培养，两小时后更换新鲜培养基，继续培养24小时后，收集培养物总RNA样品和上清样本。
总RNA样本被用于反转录获取培养物的cDNA文库样本，反转录具体方法如下：
1、去除基因组DNA反应
反应体系：5×gDNA Eraser Buffer(Novoprotein E047-01B)2.0μl；gDNA Eraser1.0μl；总RNA 2.0μl；无RNA酶的水5.0μl。
反应条件为：42℃，2min；4℃，2min。
2、反转录反应(SYBR Green qPCR法)
反应体系：步骤1中反应液10.0μl；PrimeScript RT Enzyme MixⅠ(NovoproteinE047-01B)1.0μl；RT Primer Mix(Novoprotein E047-01B)1.0μl；5×PrimeScript Buffer2(Novoprotein E047-01B)4.0μl；无RNA酶的水4.0μl。
反应条件为：37℃，15min；85℃，5s；4℃，2min。
以上述cDNA为模板，按照SYRB Green qPCR法进行荧光定量PCR扩增。
针对ASFV编码的P30基因cDNA序列设计合成特异的定量PCR引物，如下：
ASFV-P30-F：5′-TGTTTCATGCGGGTAGCCTG-3′；
ASFV-P30-R：5′-GGGCTCTTGCTCAAACAACG-3′。
以GAPDH为内参基因，引物序列如下：
GAPDH-F：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；
GAPDH-R：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。
取200μl的培养上清样本利用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0(Cat#9766,Takara)试剂盒提取病毒DNA。针对ASFV编码的P72基因DNA序列设计合成特异的定量PCR引物，如下：
ASFV-P72-F：5′-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3′；
ASFV-P72-R：5′-GATACCACAAGATCAGCCGTA-3′。
然后，一方面，将P72基因序列(参见NCBI Reference Sequence:NC_001659.2)克隆到pMD19T(TaKaRa，D102A)获得已知拷贝数的质粒(所得重组质粒命名为ASFV-P72-pMD19T)模板，以倍比稀释的ASFV-P72-pMD19T质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值与拷贝数的相互关系，绘制标准曲线。另一方面，以上述病毒DNA为模板，按照SYRB GreenqPCR法进行荧光定量PCR扩增。再对感染组和对照组的培养上清DNA进行扩增，每组设置三个重复。荧光定量PCR具体反应体系和条件如下：
反应体系：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10.0μl；引物ASFV-P72-F(10μm)0.6μl；引物ASFV-P72-R(10μm)0.6μl；病毒DNA 1.0μl；ddH2O 7.8μl。
反应条件为：95℃10min；95℃10sec，60℃10sec，72℃10sec，45个循环。
针对荧光定量PCR得到的Ct值，根据标准曲线计算对应的病毒拷贝数。
如图2所示，与si-NC组相比，ASFV核心基因P30的转录水平在CD244表达抑制组中显著降低；如图3所示，培养上清中的病毒P72基因拷贝数目也显著降低。
实施例3、利用慢病毒转导技术构建CD244超表达细胞株
首先，分别从ensemble数据库(www.ensembl.org)下载猪CD244基因cDNA序列(登录号：ENSSSCG00000006374，如SEQ ID No.3所示)，然后体外合成该序列，通过XhoI/BamHI两个酶切位点克隆到pLVX-T2A-mCHerry-puro载体(记载于“Limeng Sun,et al.Genome-scale CRISPR screen identifies TMEM41B as a multi-function host factorrequired for coronavirus replication.PLOS Pathogens|https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010113December 6,2021”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)骨架上得到目的质粒。
将目的质粒通过热激法转化进入感受态大肠杆菌DH5a，然后涂布在AMP+抗性的LB固体培养皿中，置于37℃培养箱中过夜培养，挑选单克隆菌落扩大培养后送公司测序，取测序鉴定成功的菌液扩大培养，利用OMEGA去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，命名为pLVX-2A-CD244-mCHerry-puro。
然后，包装pLVX-2A-CD244-mCHerry-puro慢病毒，感染iPAM细胞(为记载于“ElenaG.Sánchez,et al.Phenotyping and susceptibility of established porcine cellslines to African Swine Fever Virus infection and viral production.SCIEntIfICREPOrTS|7:10369|DOI:10.1038/s41598-017-09948-x”一文中的“IPAM-WT”细胞，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)构建CD244基因超表达细胞株，具体实验流程如下：
前一天，接种HEK 293T细胞于10cm2培养皿中，待汇集度70％-90％时进行慢病毒包装。首先，取总量24μg质粒[pMD2.G(addgene：#12259):psPAX2(addgene：#12260):pLVX-2A-CD244-mCHerry-puro＝1:2:3，质量比]入500μL的Jetprime Buffer中，涡旋混匀，再加入40μL的Jetprime转染试剂，振荡混匀，静置10min。然后，将上述溶液加入提前换液为5ml2％FBS培养基的10cm2培养皿中，放回37℃5％CO2培养箱中培养。第6h换液为10mL 2％FBS培养基，第24h补加10mL相同的培养基，继续培养至第60h收取上清液，以4℃30000rpm/min离心3h，倒尽上清，取200μL预冷的PBS重悬慢病毒沉淀，4℃过夜弥散后于-80℃冻存，得到pLVX-2A-CD244-mCHerry-puro慢病毒。
取包含CD244表达序列的慢病毒(即上一步骤所得的pLVX-2A-CD244-mCHerry-puro慢病毒)感染iPAM细胞株，培养至48h，利用流式细胞仪分选mCHerry阳性细胞，同时分选单个细胞至96孔培养板挑选单克隆细胞株。从ensemble数据库下载猪CD244基因cDNA序列，设计检测CD244基因表达的定量引物(表2)。收取单克隆细胞的总RNA样品，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。具体操作参见实施例1相关步骤。
如图4所示，选取的单克隆细胞CD244基因表达量极显著提升。
进一步，通过Western Blot技术检测这该细胞株的CD244蛋白表达情况，具体实验流程如下：
接种单克隆细胞于六孔培养板中，设置稳定iPAM野生型细胞作为对照组，待汇集度达到90％左右，每孔加入1mM PMSF和100μl RIPA裂解液，冰浴30min裂解细胞，4℃13000rpm离心20min，收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度。取40μg变性后的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据CD244蛋白分子量大小切割目的条带，同时切割β-tubulin蛋白电泳条带作为阳性内参，利用湿转膜法将两组蛋白分别同时转移至PVDF膜，用脱脂奶粉封闭后，一抗(CD244 1677-1-AP，β-tubulin ab231082)4℃孵育过夜，孵二抗(Thermo Fisher 61-6520)后显影。如图5所示，该株细胞β-actin蛋白表达良好，单克隆细胞株中CD244蛋白表达明显提升，结果表明CD244基因超表达细胞株构建成功，并将超表达细胞株命名为iPAM-CD244-OE。
实施例4、利用Western Blot和免疫荧光实验发现超表达CD244基因可显著提升ASFV编码蛋白在宿主细胞中表达
进一步，利用Western Blot实验检测ASFV感染CD244超表达细胞株第24h时ASFV编码基因P72的表达情况。具体实验流程如下：
接种iPAM-CD244-OE细胞株(参见实施例3)，设置iPAM野生型细胞作为对照，待汇集度达到90％左右，每孔按照MOI＝10加入对应体积的ASFV野生型病毒，摇匀后放回细胞培养箱培养，第2h换为2％FBS培养基继续培养至第24h。每孔加入1mM PMSF和100μl RIPA裂解液，冰浴30min裂解细胞，4℃13000rpm离心20min，收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度。取40μg变性后的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据P72蛋白分子量大小切割目的条带，同时切割β-tubulin蛋白电泳条带作为阳性内参，利用湿转膜法将两组蛋白分别同时转移至PVDF膜，用脱脂奶粉封闭后，一抗(P72抗体，bs-41384R；β-tubulin抗体，ab231082)4℃孵育过夜，孵二抗(Thermo Fisher 61-6520，Thermo Fisher 31460)后显影。如图5所示，该株细胞β-actin蛋白表达良好，单克隆细胞株中P72蛋白表达明显提升，结果表明超表达CD244基因显著提升ASFV编码基因P72在iPAM细胞中的表达。
进一步，利用免疫荧光实验检测ASFV感染CD244超表达细胞株在第24h时ASFV编码基因P30的表达情况。具体实验流程如下：
接种iPAM-CD244-OE细胞株(参见实施例3)，设置iPAM野生型细胞作为对照，待汇集度达到90％左右，每孔按照MOI＝10和50加入对应体积的ASFV野生型病毒，摇匀后放回细胞培养箱培养，第2h换为2％FBS培养基继续培养至第24h。取第24h的细胞用多聚甲醛PFA固定，经0.3％ Tritonx-100处理后加入封闭液室温封闭1h，P30(ASFV)一抗(P30抗体，bs-41382R)4℃孵育过夜，二抗(Thermo Fisher A32731)室温避光孵育2h后DAPI染色即进行荧光成像。结果如图6所示，在MOI＝10的感染复数下，相较于野生型iPAM细胞，接种ASFV的iPAM-CD244-OE细胞株中P30蛋白表达明显提升，在MOI＝50的感染复数下，iPAM-CD244-OE细胞株中P30蛋白表达的提升更加明显。
总之，Western Blot和免疫荧光实验证明超表达CD244基因显著提升ASFV编码基因P72和P30在iPAM细胞中的表达。
以上结果表明：在猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)中抑制CD244基因的表达可显著干扰ASFV复制，过表达CD244可显著促进ASFV在iPAM细胞系中的复制。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.能够抑制CD244表达的物质在如下任一中的应用：
(A1)制备用于治疗和/或预防非洲猪瘟病毒感染的产品；
(A2)治疗和/或预防非洲猪瘟病毒感染。
2.能够抑制CD244表达的物质在如下任一中的应用：
(B1)制备用于在宿主细胞中抑制非洲猪瘟病毒复制的产品；
(B2)在宿主细胞中抑制非洲猪瘟病毒复制；
(B3)制备对非洲猪瘟病毒抗性增强的细胞模型或动物模型。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述能够抑制CD244表达的物质为直接以CD244为靶点的敲除CD244表达的物质或敲低CD244表达的物质或CD244抑制剂；
进一步地，所述能够抑制CD244表达的物质为CD244 siRNA；
更进一步地，所述CD244 siRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.能够促进CD244表达的物质在如下任一中的应用：
(C1)制备用于提高宿主细胞对非洲猪瘟病毒易感性的产品；
(C2)提高宿主细胞对非洲猪瘟病毒易感性；
(C3)制备对非洲猪瘟病毒易感的细胞模型或动物模型；
(C4)制备用于在宿主细胞促进非洲猪瘟病毒复制的产品；
(C5)在宿主细胞促进非洲猪瘟病毒复制；
(C6)制备对非洲猪瘟病毒抗性减弱的细胞模型或动物模型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述能够促进CD244表达的物质为能够编码CD244的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒或重组载体或CD244促进剂；或
所述能够促进CD244表达的物质为能够表达CD244的重组慢病毒。
6.如下任一方法：
方法I：一种制备对非洲猪瘟病毒抗性增强的细胞模型或动物模型的方法，包括如下步骤：降低宿主细胞或动物中CD244的表达，得到重组细胞或动物；与所述宿主细胞或动物相比，所述重组细胞或动物对非洲猪瘟病毒的抗性增强；
方法II：一种制备对非洲猪瘟病毒抗性减弱的细胞模型或动物模型的方法，包括如下步骤：提高宿主细胞或动物中CD244的表达，得到重组细胞或动物；与所述宿主细胞或动物相比，所述重组细胞或动物对非洲猪瘟病毒的抗性减弱；
方法III：一种制备对非洲猪瘟病毒易感的细胞模型或动物模型，包括如下步骤：提高宿主细胞或动物中CD244的表达，得到重组细胞或动物；与所述宿主细胞或动物相比，所述重组细胞或动物对非洲猪瘟病毒更加易感。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在所述方法I中，降低所述宿主细胞或动物中CD244的表达是通过向所述宿主细胞或动物中导入CD244 siRNA实现的；
进一步地，所述CD244 siRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
和/或
在所述方法II和所述方法III中，提高所述宿主细胞或动物中CD244的表达是通过用表达CD244的重组慢病毒感染所述宿主细胞或动物实现的。
8.如下任一应用：
(D1)CD244作为靶点在调控宿主细胞或动物对非洲猪瘟病毒易感性中的应用；
(D2)CD244作为靶点在调控非洲猪瘟病毒在宿主细胞或动物中的复制能力中的应用；
(D3)CD244作为靶点在制备用于调控宿主细胞或动物对非洲猪瘟病毒易感性的产品中的应用；
(D4)CD244作为靶点在制备用于调控非洲猪瘟病毒在宿主细胞或动物中的复制能力的产品中的应用。
9.利用权利要求6所述方法制备得到的细胞模型；
或
利用权利要求6中所述方法II或所述方法III制备得到的细胞模型在筛选抗非洲猪瘟病毒的药物中的应用。
10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法或细胞模型，其特征在于：所述宿主细胞为猪原代肺泡巨噬细胞；和/或
所述动物为猪；和/或
所述CD244为SEQ ID No.2所示的蛋白质。
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