CN110893240B - Nme2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用 - Google Patents

Nme2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了禽源NME2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用。本发明提供了NME2基因或其相关生物材料在制备用于抑制禽呼肠病毒复制的产品中的应用；所述相关生物材料为含有所述NME2基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或由所述NME2基因编码的蛋白质。实验证明，在DF1细胞中过表达NME2基因，并进行荧光定量PCR检测，结果发现，过表达NME2基因，会抑制ARV感的复制。本发明为制备能临床治疗ARV感染的生物制剂，提供了新的思路，对于ARV的临床治疗具有重要意义。

Description

NME2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及NME2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用。
背景技术
NME(non-metastasis cells)基因即nm23基因，是Steeg等学者从7株转移能力不同的小鼠黑色素瘤细胞系中，用差示杂交的方法蹄选鉴定出的一种与肿瘤转移抑制相关的基因，他们将此基因命名为NME基因。迄今为止，已发现属于基因家族的有10种，它们分别是到NME1到NME10。NDPK(nucleoside diphosphate kinase)活性是NME家族共同的特征，其中，NME2(NME/NM23核苷二磷酸激酶2)编码的NDPK的B亚基，具有核苷二磷酸激酶活性，催化二磷酸核苷转化为相对应的三磷酸核苷，参与细胞的能量代谢、微管解聚等过程，影响肿瘤的浸润和转移。
禽呼肠孤病毒(ARV)是禽类重要的病原之一，ARV感染可引起鸡多种疾病，包括病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和所谓吸收不良综合征。σA基因蛋白是禽呼肠孤病毒S2基因编码的结构蛋白，能激活PI3K-AKT信号通路的作用，与禽呼肠孤病毒抗干扰素作用有关，在ARV的感染致病过程中发挥重要作用。σC基因蛋白是禽呼肠孤病毒S1基因编码的结构蛋白，携带有特异性中和反应的表面抗原，与ARV的感染力相关，在ARV的感染及其致病上起着重要的作用。
目前，尚未有NME2基因与ARV复制之间相互关系的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种NME2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用。
第一方面，本发明要求保护NME2基因或其相关生物材料在制备用于抑制禽呼肠病毒复制的产品中的应用。
所述相关生物材料为含有所述NME2基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或由所述NME2基因编码的蛋白质。
第二方面，本发明要求保护NME2基因或其相关生物材料在制备用于降低禽呼肠病毒中σA基因和/或σC基因表达量的产品中的应用。
所述相关生物材料为含有所述NME2基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或由所述NME2基因编码的蛋白质。
第三方面，本发明要求保护能够促进NME2基因表达的物质在制备用于抑制禽呼肠病毒复制的产品中的应用。
第四方面，本发明要求保护能够促进NME2基因表达的物质在制备用于降低禽呼肠病毒中σA基因和/或σC基因表达量的产品中的应用。
在本发明的具体实施方式中，前文所述降低禽呼肠病毒中σA基因和/或σC基因表达量具体体现为在转录水平上降低禽呼肠病毒中σA基因和/或σC基因表达量。
第五方面，本发明要求保护如下任一应用：
(A1)NME2基因或其相关生物材料或能够促进NME2基因表达的物质在制备用于抑制禽呼肠病毒的产品中的应用；
(A2)NME2基因或其相关生物材料或能够促进NME2基因表达的物质在制备用于预防和/或治疗禽呼肠病毒感染所致疾病的产品中的应用。
所述相关生物材料为含有所述NME2基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或由所述NME2基因编码的蛋白质。
其中，所述产品可为生物制剂。
在上述各方面中，所述NME2基因具体可为禽源NME2基因。
在上述各方面中，由所述NME2基因编码的蛋白质可为SEQ ID No.1所示蛋白质。
在上述各方面中，所述NME2基因可为能够编码SEQ ID No.1所示蛋白质的基因。
进一步地，所述NME2基因的核苷酸序列具体可如SEQ ID No.2所示。
在上述各方面中，所述禽呼肠病毒中σA基因的核苷酸序列可如SEQ ID No.3所示。所述禽呼肠病毒中σC基因的核苷酸序列可如SEQ ID No.4所示。
在上述各方面中，所述产品可为药品或试剂盒。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为将所述NME2基因(如SEQ IDNo.2)克隆到pEF1α-Myc的质粒的酶切位点EcoR I和NotⅠ之间后得到的重组质粒。
实验证明，在DF1细胞中过表达NME2基因，并进行荧光定量PCR检测，结果发现，过表达NME2基因，会抑制ARV感的复制。本发明为制备能临床治疗ARV感染的生物制剂，提供了新的思路，对于ARV的临床治疗具有重要意义。
附图说明
图1为真核表达重组质粒pEF1α-Myc-NME2的PCR鉴定。M：Trans DNA Marker I；1-2：pEF1α-Myc-NME2。
图2为真核表达重组质粒pEF1α-Myc-NME2的双酶切验证。M：Trans2K Plus DNAMaker；1-2：pEF1α-Myc-NME2。
图3为间接免疫荧光结果。A：阴性对照；B：pEF1α-Myc-NME2。
图4为Western blot检测目的基因的表达。M：蛋白Maker；1：阴性对照；2：pEF1α-Myc-NME2。
图5为过表达NME2基因对ARV的转录的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
RT-PCR试剂盒、pMDTM 18-T Vector Cloning Kit、PrimeScript II 1st StrandcDNA Synthesis Kit、pEF1α-Myc载体和限制性内切酶SalI和NotⅠ购自宝日医生物技术(北京)公司；pEF1α-Myc载体的品牌货号为Clontech 631991。T4 DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自Promega公司；LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent购自Invitrogen公司；Anti-Myc tag Mouse mAb购自Cell Signaling Technology公司；Goat pAb to Ms IgG(FITC)购自Abcam公司；碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG碧云天公司。
实施例1、NME2基因抑制禽呼肠病毒复制
一、重组表达载体pEF1α-Myc-NME2的构建及鉴定
根据GenBank中NME2基因序列(登录号：NM_205047.1)，设计合成了1对特异性引物(表1)。
表1引物序列
Figure BDA0002288779880000031
提取鸡胚成纤维细胞传代系(DF-1)的RNA，使用PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit反转录城cDNA，并用表1中的特异性引物，对NME2基因进行PCR扩增。
将50μl PCR产物电泳后，切胶经DNA片断胶回收试剂盒纯化回收。将纯化PCR产物克隆至pMD-18T载体，得到pMD-18T-NME2重组菌。抽提重组菌及空载体pEF1α-Myc的质粒，分别用限制性内切酶EcoR I和NotⅠ同时进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4 DNA连接酶连接转化到DH5α感受态细胞中，得到pEF1α-Myc-NME2重组菌。对重组菌进行PCR检测、双酶切验证，并送深圳华大基因科技服务有限公司进行测序验证。
通过菌液PCR对所构建的真核表达重组质粒pEF1α-Myc-NME2的阳性克隆进行筛选。如图1所示，NME2扩增的基因片段大小与预期大小相符。测序结果也证实了pEF1α-Myc-NME2重组质粒的正确性。
对真核表达重组质粒pEF1α-Myc-NME2的双酶切鉴定结果，见图2。重组质粒pEF1α-Myc-NME2双酶切后，得到4622bp的载体条带和462bp的NME2基因条带，说明NME2基因已经正确插入到表达载体pEF1α-Myc。
pEF1α-Myc-NME2的结构描述为：将SEQ ID No.2所示DNA片段插入到pEF1α-Myc质粒的酶切位点EcoR I和NotⅠ之间后得到的重组质粒。SEQ ID No.2为禽源NME2基因的核苷酸序列，编码SEQ ID No.1所示蛋白质。
二、在DF1细胞中过表达NME2基因
参照无内毒素质粒大量提取试剂盒说明书大量提取质粒(pEF1α-Myc、pEF1α-Myc-NME2)，-20℃保存备用。参照脂质体转染试剂盒LipofectamineTM 3000的使用说明，将质粒分别转染长成单层的DF1细胞(6孔板)，同时设立阴性细胞组(未转染质粒)。
细胞转染24h后弃掉培养液，用PBST洗涤3次，用预冷的甲醇和丙酮混合溶液于冰上固定细胞10min，用PBS(4℃预冷)洗涤3次，在pEF1α-Myc、pEF1α-Myc-NME2转染的细胞中加入Anti-Myc tag Mouse mAb(1:1000稀释)，37℃作用2h。弃去细胞板中的一抗，用PBS(4℃预冷)轻洗细胞5次，加入FITC标记的山羊抗鼠IgG(1:1000稀释)，37℃避光作用1.5h。弃去细胞板中的二抗，用PBS(4℃预冷)轻洗细胞5次，荧光显微镜观察结果。
同时，收集转染后的DF1细胞，参照参考文献“Xie Z,Qin C,Xie L,etal.Recombinant protein-based ELISA for detection and differentiation ofantibodies against avian reovirus in vaccinated and non-vaccinated chickens[J].J Virol Methods,2010,165(1):108-11.”的方法，使用Anti-Myc tag Mouse mAb和碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG，对Myc-NME2融合蛋白进行Western blot检测。
如图3所示，在荧光显微镜下，真核表达重组质粒pEF1α-Myc-NME2转染组的DF1细胞均可观察到绿色荧光的出现，而阴性对照组则无绿色荧光的出现。
如图4所示，真核表达重组质粒pEF1α-Myc-NME2表达的Myc-NME2融合蛋白在约为19.4kDa处有单一的目的条带，而阴性对照组没有目的条带。
三、过表达NME2基因对ARV复制的影响
在将DF1细胞转染pEF1α-Myc-NME2质粒，进行过表达NME2基因，24h后接种禽呼肠病毒(ARV)，然后24h收集细胞提取RNA，使用荧光定量PCR检测NME2基因、ARV的σA基因(SEQID No.3所示)和σC基因(SEQ ID No.4所示)的表达量，以GAPDH基因为内参基因，评价过表达NME2基因对ARV复制的影响。所使用的引物如下：
σC-F3：5’-CCACGGGAAATCTCACGGTCACT-3’；
σC-R3：5’-TACGCACGGTCAAGGAACGAATGT-3’。
σA-F3：5’-TTACGCAGAGGCATTTCGCTTACG-3’；
σA-R3：5’-TTGCCCCTTCGCTGCTGACA-3’。
GAPDH-F：5’-GCACTGTCAAGGCTGAGAACG-3’；
GAPDH-R：5’-GATGATAACACGCTTAGCACCAC-3’。
NME2 262-1：5’-CGGGGGCTGGTGGGGGAGAT-3’；
NME2 262-2：5’-GGATGGTGCCGGGCTTTGAGTC-3’。
为了验证外源转染NME2是否会对ARV的复制产生影响，本发明将pEF1α-Myc空载体、pEF1α-Myc-NME2分别转染DF1细胞，24h后，分别感染1MOI的ARV，24h后收集细胞样品，进行荧光定量PCR检测，结果显示ARV的σA和σC基因在转录水平上相对于空载体转染组下降了50％左右，说明过表达NME2基因，会抑制ARV的复制(图5)。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> NME2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用
<130> GNCLN192507
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Met Ala Ala Asn Cys Glu Arg Thr Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Val Gln Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys
20 25 30
Gly Phe Arg Leu Val Ala Met Lys Phe Val His Ala Ser Glu Asp Leu
35 40 45
Leu Lys Gln His Tyr Ile Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Tyr Pro Gly
50 55 60
Leu Val Lys Tyr Met Asn Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu
65 70 75 80
Gly Leu Asn Val Val Lys Thr Gly Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn
85 90 95
Pro Ala Asp Ser Lys Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln
100 105 110
Val Gly Arg Asn Ile Ile His Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Gln
115 120 125
Lys Glu Ile Ser Leu Trp Phe Lys Pro Ala Glu Leu Ile Asp Tyr Arg
130 135 140
Ser Cys Ala His Asp Trp Val Tyr Glu
145 150
<210> 2
<211> 462
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
atggctgcca actgcgagcg caccttcatc gccatcaagc ccgacggcgt gcagcggggg 60
ctggtggggg agatcatcaa acgcttcgag cagaagggct tccgcctggt ggccatgaag 120
ttcgtgcacg cctctgaaga cctcctgaag cagcattaca tcgacctgaa ggatcggccc 180
ttctaccccg gcctggtgaa gtacatgaac tccggccccg ttgtggccat ggtgtgggaa 240
gggctcaacg tggtgaaaac aggcagggtg atgctggggg aaaccaaccc tgcagactca 300
aagcccggca ccatccgcgg ggatttctgc atccaagtgg gaagaaacat catccatggc 360
agcgactctg tagaaagcgc ccagaaggag atcagccttt ggttcaaacc agcagagctc 420
atcgactaca gatcgtgtgc acatgactgg gtctatgagt ga 462
<210> 3
<211> 1251
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atggcgcgtg ccatatacga cttcttttca acgcctttcg ggaatcgtgg tctagcgacg 60
aatcgtactc aactgtcatc actactatcg agctcgaatt ccccatggca acggtttcta 120
tcatcaatga ctccattgac agcgccaggt atcgtttcaa cgcctgaagc accctatcca 180
ggttcgttga tgtatcaaga gtctatgctc cacagtgcta ctgtccctgg agtactcggt 240
agtcgtgatg cttggcgtac atttaatgtc ttcgggcttt cgtggactga tgaaggattg 300
tcaggactag tagctgccca agatcctccc cctgccgccc cgtatcagcc agcctctgct 360
cagtggtcgg atctcctcaa ctaccctaga tgggcaaaca gacgtcgtga gctgcaatct 420
aaatacccac ttctgcttcg gtccacgctg ctttctgcca tgcgagctgg tcctgttctc 480
tacgttgaga cgtggccgaa tatgatctca ggacgattag ctgactggtt catgtcccaa 540
tatggcaaca atttcgttga catgtgcgcc aggttgaccc agtcttgttc gaacatgcct 600
gttgagcctg atggaaatta tgatcagcag atgcgtgctt taattagttt gtggcttctt 660
tcatacattg gggtggtcaa tcagaccaac accatcagcg gcttctactt ctcctcgaag 720
actcggggtc aagcgttgga cagttggact ttattctaca ctacaaacac taatcgtgtt 780
caaattacgc agaggcattt cgcttacgtg tgtgctcggt ctcccgactg gaacgtggat 840
aaatcatgga tcgctgcagc gaacttaacc gctatcgtca tggcttgccg tcaaccgccg 900
gtgttcgcca atcaaggcgt tattaaccaa gcgcagaacc gacctggctt ttccatgaat 960
ggggggacgc ccgtccatga gctcaactta ctgactaccg cgcaggaatg tattcggcag 1020
tgggtgatgg ccggtttggt gtcagcagcg aaggggcaag ccttaacgca ggaggctaat 1080
gacttctcaa acctcatcca ggcggatcta ggacaaatca aagcgcagga tgatgctctg 1140
tacaaccagc agccagggta cgcgaggaga ataaaaccct tcgttaacgg tgactggaca 1200
ccaggtatga ccgcgcaagc tctggccgtt ctagccactt ttaccgccta g 1251
<210> 4
<211> 981
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
atggcgggtc tcaatccatc gcagcgaaga gaggtcgtca gcttgatact gtcattgact 60
tcgaacgtga ctataagtca tggcgatttg acgccgatct atgaacggct gaccaatcta 120
gaagcgtcta cggagttatt acatcgctcc atttccgata tatccactac tgtctcaaat 180
atttctgcaa gtttacaaga catgacccat accttggatg atgtaactgc taatttagac 240
ggtttgagga ccactgttac tgcacttcag gattccgtct ccattctgtc tacaaatgtg 300
actgacttaa cgaacacatc ctctgcgcac gcggcgacac tatcttcact tcaaactacg 360
gttgacggaa acttcactgc catctccaat ttgaagagtg atgtatcgtc gaacggttta 420
gctattacag atctgcagga tcgtgttaaa tcattggagt ctaccgcgag tcatggtcta 480
tctttttcgc ctccacttag tgtcgctgac ggcgtggttt cattagacat ggacccctac 540
ttctgttctc aacgagtttc tttaacatca tactcggcgg aggctcaact aatgcaattt 600
cggtggatgg cacggggtac taacggatca tctgatacca ttgacatgac cgttaacgct 660
cactgtcatg gaagacgcac tgattatatg atgtcgtcca cgggaaatct cacggtcact 720
agtaacgtcg tgttattaac cttcgattta agttacataa cgcctatccc atcagaccta 780
gcacgtcttg ttcccagtgc gggattccaa gctgcgtcgt tccctgtgga cgtatcattc 840
acccgcgatt ctgcgactca tgcgtaccaa gcgtatgggg tgtactcgag ctcacgtgtc 900
ttcacaatta ctttcccaac cggaggtgat ggtgcagcga acattcgttc cttgaccgtg 960
cgtaccggca tcgacaccta a 981

Claims (10)

1.NME2基因或其相关生物材料在制备用于抑制禽呼肠病毒复制的产品中的应用；
所述相关生物材料为含有所述NME2基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或由所述NME2基因编码的蛋白质；
所述NME2基因为禽源NME2基因；所述NME2基因为能够编码SEQ ID No.1所示蛋白质的基因；
由所述NME2基因编码的蛋白质为SEQ ID No.1所示蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述NME2基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
3.NME2基因或其相关生物材料在制备用于降低禽呼肠病毒中σA基因和/或σC基因表达量的产品中的应用；
所述相关生物材料为含有所述NME2基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或由所述NME2基因编码的蛋白质；
所述NME2基因为禽源NME2基因；所述NME2基因为能够编码SEQ ID No.1所示蛋白质的基因；
由所述NME2基因编码的蛋白质为SEQ ID No.1所示蛋白质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述NME2基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述禽呼肠病毒中σA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述禽呼肠病毒中σC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
7.NME2基因或其相关生物材料在制备用于抑制禽呼肠病毒的产品中的应用；
所述相关生物材料为含有所述NME2基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或由所述NME2基因编码的蛋白质；
所述NME2基因为禽源NME2基因；所述NME2基因为能够编码SEQ ID No.1所示蛋白质的基因；
由所述NME2基因编码的蛋白质为SEQ ID No.1所示蛋白质。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述NME2基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
9.NME2基因或其相关生物材料在制备用于预防和/或治疗禽呼肠病毒感染所致疾病的产品中的应用；
所述相关生物材料为含有所述NME2基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或由所述NME2基因编码的蛋白质；
所述NME2基因为禽源NME2基因；所述NME2基因为能够编码SEQ ID No.1所示蛋白质的基因；
由所述NME2基因编码的蛋白质为SEQ ID No.1所示蛋白质。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述NME2基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
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