CN110904056A

CN110904056A - 一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN110904056A
Application number: CN201911264929.4A
Authority: CN
Inventors: 周生; 唐梦君; 程旭; 姜逸; 俞燕; 赵秀美; 高明艳; 韦玉勇
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN110904056B

Abstract

本发明提供了一种传染性支气管炎病毒rH120‑YZS1Δ5a及其构建方法和应用，属于分子生物学和基因工程技术领域，所述传染性支气管炎病毒rH120‑YZS1Δ5a保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10499。采用本发明提供的传染性支气管炎病毒能够同时表达QX型和Mass型鸡传染性支气管炎病毒的S1蛋白，进而可用于制备预防鸡传染性支气管炎的双价疫苗。

Description

一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用。

背景技术

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)为冠状病毒科冠状病毒属的代表种，其基因组为单股正链RNA，长约27.6kb，至少有10个明显的开放阅读框(ORF)，分别编码病毒的结构蛋白和非结构蛋白，现已确定的ORF的定位次序是5′1ab-S-3ab-E-M-5ab-N-3′。3ab和5ab均为病毒编码的非结构蛋白，在IBV感染细胞内均可检测到，但其功能目前尚不清楚。已有研究表明3ab、5ab编码区的缺失并不影响IBV的复制和病毒的致病性[Casais R,Davies M,CavanaghD,et al.Gene 5ofthe avian coronavirus infectious bronchitis virus is notessential forreplication.JVirol,2005,79(13):8065-8078.]。

随着冠状病毒反向遗传操作技术的日趋成熟，构建以冠状病毒为载体的表达系统成为近几年研究的热点之一[Enjuanes L,Sola I,Alonso S,et al.Coronavirus reversegenetics and development of vectors for gene expression.Curr Top MicrobiolImmunol.2005.287:161-97.]。以冠状病毒为活载体的表达系统主要具有以下几个优点：1)冠状病毒的基因组全长27～31kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的一类病毒，作为载体可以容纳不少于6kb以上的外源基因，因此可以用来构建多基因共表达系统；2)具有独特的转录机制，可以简单的通过引入转录调控序列(TRS)的方法表达外源基因；3)其基因组为单股正链RNA，基因复制定位于细胞质中，因此不会整合到宿主细胞染色体中；4)粘膜是冠状病毒感染的自然途径，以该病毒为载体研制的重组疫苗能够诱导机体产生粘膜免疫。

现有技术中建立了IBV H120疫苗株的反向遗传操作系统[周生,戴亚斌,唐梦君等.鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建.中国家禽，2010，32(23):22-26.]。为了研究IBV的载体特性，首先采用绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换H120株病毒基因组中的5a基因编码区，成功拯救获得重组病毒H120-5a/EGFP[周生,唐梦君,戴亚斌等.表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建.病毒学报，2011，(01):11-17.]。重组病毒H120-5a/EGFP能在鸡胚中有效的复制和传代，并在感染鸡胚的绒毛尿囊膜、羊膜等组织中表达绿色荧光蛋白。

申请号为CN201310660009.0的中国发明专利公开了一种鸡传染性支气管炎病毒致弱株rH120-YZ及其构建方法，申请号为CN201310196897.5的中国发明专利公开了一种适于细胞培养的嵌合IBV H120 S1基因膜外区的重组病毒及其构建方法和应用，申请号为CN201310573277.9的中国发明专利公开了一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒及其构建方法和应用。它们的共同之处是以传染性支气管炎病毒H120疫苗株或Beaudette株基因组为骨架，采用分离株的S或S1基因替换对应的区域，拯救获得的是嵌合病毒株，但是均只能表达一种基因类型的S或S1基因。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用，采用本发明提供的传染性支气管炎病毒能够同时表达QX型和Mass型鸡传染性支气管炎病毒的S1蛋白，进而可用于制备预防鸡传染性支气管炎的双价疫苗。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a，拉丁文为Infectiousbronchitis virus，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10499。

本发明还提供了上述技术方案所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的构建方法，包括：将纤突蛋白膜外区S1基因插入IBV H120疫苗株mRNA编码区转录调控序列下游，拯救获得传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a。

优选的，所述纤突蛋白膜外区S1基因来源于QX型传染性支气管炎病毒分离株IBYZ，保藏号为CGMCC No.14682。

优选的，包括以下步骤：

1)以QX型传染性支气管炎病毒分离株IBYZ的基因组RNA为模板，采用YZS1U上游引物和YZS1L下游引物经RT-PCR，得到含纤突蛋白膜外区S1基因的扩增产物，将所述扩增产物加T处理后连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMDYZS1；

所述YZS1U上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述YZS1L下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

2)将pMDTM9质粒用5aU上游引物和5aL下游引物进行PCR扩增，添加6×His标签，得到PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物连接到步骤1)得到的质粒pMDYZS1中，得到质粒pMDTM9-YZS1Δ5a；

所述5aU上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述5aL下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

3)将含有IBV H120疫苗株基因组骨架片段的9个重组质粒pMDTM1～pMDTM8、pMDTM10和步骤2)得到的pMDTM9-YZS1Δ5a经BsaI酶酶切，分别得到酶切片段，连接酶切片段后，得到传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的cDNA；

4)以步骤3)得到的cDNA为模板，RNA体外转录后得到病毒基因组，将所述病毒基因组转染细胞系，得到细胞和细胞上清，将所述细胞和细胞上清接种鸡胚，得到传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a。

本发明还提供了上述技术方案所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a在制备纤突蛋白膜外区S1蛋白中的应用。

优选的，所述应用包括：将所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a经PBS缓冲液稀释后，得到稀释病毒；

将所述稀释病毒接种于鸡胚尿囊腔中，37℃孵化48h后，获取尿囊液；

将所述尿囊液离心，得到上清液，采用Ni-NTA法获得上清液中的纤突蛋白膜外区S1蛋白。

优选的，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a为传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的第3代病毒。

优选的，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a与PBS缓冲液的体积比为0.5～1.5:90～110。

优选的，所述离心的离心力为4000～6000g，所述离心的时间为8～12min。

本发明还提供了上述技术方案所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a在制备预防鸡传染性支气管炎双价疫苗中的应用。

本发明提供了一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10499。本发明提供的传染性支气管炎重组病毒，是以传染性支气管炎病毒H120疫苗株为载体，其本身能表达Mass型的S1蛋白。将QX型S1基因插入H120疫苗株基因组的mRNA编码区转录调控序列下游后，其又获得了表达QX型S1蛋白的能力，因此该重组病毒能够同时表达QX型和Mass型鸡传染性支气管炎病毒的S1蛋白，进而可用于制备预防鸡传染性支气管炎的双价疫苗。

附图说明

图1为重组质粒pMDTM9-YZS1Δ5a结构示意图；

图2重组病毒rH120-YZS1Δ5a基因组的结构示意图；

图3目的蛋白的表达检测图。

保藏说明

传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a，拉丁文为Infectious bronchitisvirus，于2015年04月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.10499。

具体实施方式

在本发明中，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a能够同时表达QX型和Mass型鸡传染性支气管炎病毒的S1蛋白，进而可用于制备预防鸡传染性支气管炎的双价疫苗。

本发明还提供了上述技术方案所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的构建方法，其特征在于，包括：将纤突蛋白膜外区S1基因插入IBV H120疫苗株mRNA编码区转录调控序列下游，拯救获得传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a。在本发明中，所述纤突蛋白膜外区S1基因优选来源于QX型传染性支气管炎病毒分离株IBYZ，保藏号为CGMCCNo.14682。

在本发明中，传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的构建方法，优选包括以下步骤：

在本发明中，含有IBV H120疫苗株基因组骨架片段的重组质粒pMDTM1、pMDTM2、pMDTM3、pMDTM4、pMDTM5、pMDTM6、pMDTM7、pMDTM9和pMDTM10同文献[周生,戴亚斌,唐梦君等.鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建.中国家禽，2010，(23):22-26.]，由江苏省家禽科学研究所禽病防治研究所构建并保存。申请人承诺自申请日起向公众发放20年。

本发明以QX型传染性支气管炎病毒分离株IBYZ的基因组RNA为模板，采用YZS1U上游引物和YZS1L下游引物经RT-PCR，得到含纤突蛋白膜外区S1基因的扩增产物，将所述扩增产物加T处理后连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMDYZS1；所述YZS1U上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述YZS1L下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明对提取QX型传染性支气管炎病毒分离株IBYZ的基因组RNA的方法没有特殊限定，采用常规提取方法即可。

在本发明中，所述YZS1U上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

5’ttggtctcagatgttggggaagtc 3’；

所述YZS1L下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

5’ttggtctcaggtgatgtgagctattgg 3’。

在本发明中，所述RT-PCR采用PrimeScript One Step RT-PCR Kit(TaKaRa)按照产品使用说明书配置反应体系，优选包括PrimeScript 1StepEnzyme Mix 2μL，2×1StepBuffer 25μL，YZS1U 1μL，YZS1L 1μL，RNA2μL，RNase Free dH₂O 19μL，所述RT-PCR的扩增程序优选为50℃，30min；95℃，60s；95℃，30s；52℃，30s；72℃，3min；25个循环。

本发明将所述扩增产物采用DNAA-Tailing Kit(TaKaRa)进行加T处理，反应体系优选包括10×A-Tailing Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，A-TailingEnzyme 1μL，DNA 10μL，dH₂O 30μL，反应程序优选为72℃，20min；4℃，10min。

本发明将上述加T产物采用DNALigation Kit(TaKaRa)连接到pMD19-T载体(TaKaRa)上，反应体系优选包括LigationMix 5μL，pMD19-T 1μL，DNA4μL，反应程序优选为16℃，30min；4℃，30min，获得质粒pMDYZS1。

本发明将pMDTM9质粒用5aU上游引物和5aL下游引物进行PCR扩增，添加6×His标签，得到PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物连接到步骤1)得到的质粒pMDYZS1中，得到质粒pMDTM9-YZS1Δ5a；所述5aU上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述5aL下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明中，所述5aU上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：

5’-taggtctcgcaccatcaccatcaccattaatggctgactagtt-3’；

所述5aL下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下所示：

5’-gttctggtctcgcatcgtctgtatttgttaag-3’。

在本发明中，所述PCR扩增采用TaKaRa公司的PrimeSTAR HS(Premix)，体系优选包括Premix PrimeSTAR HS 25μL，5aU 1μL，5aL 1μL，DNA2μL，dH2O 21μL。所述PCR扩增的程序优选为95℃25s；52℃30s，72℃6min，共25个循环。

在本发明中，所述PCR扩增产物和质粒pMDYZS1经过Bsa I限制性内切酶酶切后优选以质量比为1:1通过T4连接酶进行连接，连接后转化JM109基因工程菌，提取的质粒为质粒pMDTM9-YZS1Δ5a。本发明对酶切和连接的条件没有特殊限定，采用常规条件即可。

本发明优选将含有IBV H120疫苗株基因组骨架片段的9个重组质粒pMDTM1～pMDTM8、pMDTM10和步骤2)得到的pMDTM9-YZS1Δ5a经BsaI酶酶切，分别得到酶切片段。连接酶切片段，连接酶切片段后，得到传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的cDNA。

在本发明中，所述连接酶切片段的方法优选包括：酶切重组质粒得到的酶切片段依次标记为TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7、TM8、TM9-YZS1Δ5a和TM10，采用紫外分光光度计测定上述10个DNA片段的质量浓度，并换算成摩尔浓度，根据DNA片段的摩尔浓度，按等摩尔浓度比例分别将TM1+TM2+TM3+TM4连接、TM5+TM6+TM7连接、TM8+TM9-YZS1Δ5a+TM10连接，利用各个片段间的酶切位点进行连接，分别获取中间产物TM1-4、TM5-7和TM8-10，并进行胶回收和浓度测定。再次将TM1-4+TM5-7+TM8-10等摩尔浓度比例混合后连接，获取传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a株全长基因组cDNA。

在本发明中，所述含有IBV H120疫苗株基因组骨架片段的重组质粒pMDTM1～pMDTM8、pMDTM10同文献[周生,戴亚斌,唐梦君等.鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建.中国家禽，2010，32(23):22-26.]，由江苏省家禽科学研究所禽病预防与控制研究室构建并保存，申请人承诺自申请日起向公众发放20年。

本发明对含有IBV H120疫苗株基因组骨架片段的9个重组质粒pMDTM1～pMDTM8、pMDTM10和pMDTM9-YZS1Δ5a经BsaI酶酶切的条件没有特殊限定，采用常规即可。

本发明优选以得到的cDNA为模板，RNA体外转录后得到病毒基因组，将所述病毒基因组转染细胞系，得到细胞和细胞上清，将所述细胞和细胞上清接种鸡胚，得到传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a。本发明对RNA体外转录的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。

在本发明中，所述应用优选包括：将所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a经PBS缓冲液稀释后，得到稀释病毒；将所述稀释病毒接种于鸡胚尿囊腔中，37℃孵化48h后，获取尿囊液；将所述尿囊液离心，得到上清液，采用Ni-NTA法获得上清液中的纤突蛋白膜外区S1蛋白。

在本发明中，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a优选为传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的第3代病毒。在本发明中，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a与PBS缓冲液的体积比优选为0.5～1.5:90～110，更优选为1:100。在本发明中，所述离心的离心力优选为4000～6000g，所述离心的时间优选为8～12min。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

重组质粒pMDTM9-YZS1Δ5a的构建

生物材料的准备：

鸡传染性支气管炎病毒分离株IBYZ的保藏编号为CGMCC No.14682。JM109基因工程菌购自大连宝生物工程有限公司；pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司。

1、IBYZ株纤突蛋白膜外区基因片段S1的克隆

根据鸡传染性支气管炎病毒分离株IBYZ的全基因组序列设计引物，用于扩增其纤突蛋白膜外区基因片段S1。在扩增引物对的5'端分别引入Bsa I限制性内切酶识别序列；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以鸡传染性支气管炎病毒分离株IBYZ的基因组RNA为模板，采用高保真RT-PCR扩增其病毒基因组20371nt～21978nt位置的基因片段，该基因片段包含了IBYZ株完整的纤突蛋白膜外区S1基因片段。RT-PCR采用PrimeScriptOneStep RT-PCR Kit(TaKaRa)按照产品使用说明书配置反应体系，包括PrimeScript 1StepEnzyme Mix 2μL，2×1Step Buffer 25μL，YZS1U 1μL，YZS1L 1μL，RNA2μL，RNase FreedH₂O 19μL。RT-PCR的扩增程序为50℃，30min；95℃，60s；95℃，30s；52℃，30s；72℃，3min；25个循环。

将所述扩增产物采用DNAA-Tailing Kit(TaKaRa)进行加T处理，反应体系包括10×A-Tailing Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，A-Tailing Enzyme 1μL，DNA 10μL，dH₂O 30μL，反应程序为72℃，20min；4℃，10min。

本发明将上述加T产物采用DNALigation Kit(TaKaRa)连接到pMD19-T载体(TaKaRa)上，反应体系优选包括Ligation Mix 5μL，pMD19-T 1μL，DNA4μL，反应程序优选为16℃，30min；4℃，30min，通过测序筛选获得阳性质粒pMDYZS1，用于上述扩增的引物序列为：

YZS1U(SEQ ID No.1)：5’TTGGTCTCAGATGTTGGGGAAGTC 3’；

YZS1L(SEQ ID No.2)：5’TTGGTCTCAGGTGATGTGAGCTATTGG 3’；

2、重组质粒pMDTM9-YZS1Δ5a的构建

根据mRNA5 TRS序列所在重组质粒pMDTM9中的位置，设计用于构建pMDTM9-YZS1Δ5a的引物，并引入6×His标签，扩增片段长度约为5.8kb左右。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用上游引物5aU和下游引物5aL，PCR获取pMDTM9重组质粒片段。PCR反应采用TaKaRa公司的PrimeSTAR HS(Premix)，体系包括Premix PrimeSTAR HS 25μL，5aU1μL，5aL 1μL，DNA2μL，dH2O 21μL。反应条件为：95℃25s；52℃30s，72℃，6min，共25个循环。将PCR产物及重组质粒pMDYZS1分别采用Bsa I限制性内切酶处理后，胶回收目的片段，按1:1的分子比例混合后连接，转化JM109基因工程菌，构建重组质粒pMDTM9-YZS1Δ5a，并进行测序鉴定(图1)。

5aU(SEQ ID No.3)：

5’-TAGGTCTCGCACCATCACCATCACCATTAATGGCTGACTAGTT-3’；

5aL(SEQ ID No.4)：

5’-GTTCTGGTCTCGCATCGTCTGTATTTGTTAAG-3’；

实施例2

rH120-YZS1Δ5a全长cDNA的构建

生物材料的准备：

携带传染性支气管炎病毒H120疫苗株基因组片段的重组质粒pMDTM1、pMDTM2、pMDTM3、pMDTM4、pMDTM5、pMDTM6、pMDTM7、pMDTM8和pMDTM10[周生,戴亚斌,唐梦君等.鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建.中国家禽，2010，32(23):22-26.]，由江苏省家禽科学研究所禽病预防与控制研究室构建并保存。申请人承诺自申请日起向公众发放20年。

将携带pMDTM1～pMDTM8、pMDTM9-YZS1Δ5a及pMDTM10重组质粒的JM109分别接种LB培养基，采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit提取质粒。提取的质粒经BsaI酶切后，采用Agarose Gel DNAFragment Recovery Kit胶回收TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7、TM8、TM9-YZS1Δ5a和TM10片段。采用紫外分光光度计测定上述10个DNA片段的质量浓度，并换算成摩尔浓度。根据DNA片段的摩尔浓度，按等比例将TM1+TM2+TM3+TM4、TM5+TM6+TM7、TM8+TM9-YZS1Δ5a+TM10混合，利用各个片段间的酶切位点进行连接，获取中间产物TM1-4、TM5-7、TM8-10并进行胶回收和浓度测定。再次将TM1-4+TM5-7+TM8-10等比例混合后连接，获取传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a株全长基因组cDNA。

重组病毒rH120-YZS1Δ5a的拯救

生物材料的准备：

BHK-21细胞由江苏省家禽科学研究所禽病预防与控制研究室保存；携带有H120疫苗株N基因的真核表达质粒pVAXN，由江苏省家禽科学研究所禽病预防与控制研究室构建并保存。以上生物材料申请人承诺自申请日起向公众发放20年。

1、rH120-YZS1Δ5a基因组RNA的体外转录

取上述构建的rH120-YZS1Δ5a株全长基因组cDNA和pVAXN，采用invitroTranscription T7体外转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，经位于全长基因组cDNA5＇端的T7启动子序列进行体外转录，同时在转录体系中加入2.5mM/μL的RNA帽结构类似物(NEB公司)，使转录获取的病毒基因组RNA 5′端具有帽子结构。根据in vitroTranscription T7体外转录试剂盒产品说明书构建50μL的反应体系，37℃中转录3h后加入2μL的DNaseI处理20min，将获得的RNA转录本经紫外分光光度计测定浓度后，用于病毒拯救。

2、重组病毒rH120-YZS1Δ5a的拯救

取BHK-21细胞，采用0.25％的胰蛋白酶消化后，转至25mm的细胞培养皿中，在10％DMEM高糖(GIBCO)培养基中37℃下培养，当细胞密度达到90％以上时即进行转染。将rH120-YZS1Δ5a株全长基因组cDNA和核蛋白基因cDNA的转录产物按照1:3的质量浓度比混合后，取2μg混合的RNA加入到200μL 1×DMEM溶液中混匀；取12μL GenJet Plus(SignaGen)转染试剂溶于200μL 1×DMEM溶液中混匀；将GenJet Plus转染试剂溶液加入到上述RNA混合溶液中立即混匀，室温孵育15min。在此期间，用RNase-free PBS溶液洗涤培养皿中的BHK-21细胞3次，然后将GenJetPlus/RNA复合物加入到单层的BHK-21细胞上，置于37℃的CO₂培养箱中培养12h后，吸弃转染液，加入10％DMEM高糖培养基3mL继续培养。48h后，刮取培养板上的BHK-21细胞，将培养液及细胞混合物冻融3次后，接种11日龄SPF鸡胚。将接种鸡胚置于37℃的培养箱中孵育48h后，置4℃冰箱中过夜，然后收获RT-PCR鉴定为阳性的鸡胚尿囊液，命名为rH120-YZS1Δ5a株P1代种毒。将rH120-YZS1Δ5a株再次接种11日龄SPF鸡胚进行连续传代培养(图2)。

3、重组病毒rH120-YZS1Δ5a的测序鉴定

根据国际基因库(GenBank)上公布的IBV全基因组序列Beaudette(NC001451)、H120(FJ807652)等经多重比较后，设计合成全基因组测序引物，RT-PCR获得18个覆盖全基因组的cDNA片段，对18个片段直接进行测序。采用DNASTAR中的SeqMan软件，将测序获得的各个片段进行拼接，获取rH120-YZS1Δ5a株的全基因组序列。通过生物信息学比对分析，发现该毒株与H120疫苗株的同源性为94.4％。IBYZ株S1基因位于H12O疫苗株mRNA5 TRS序列的下游。rH120-YZS1Δ5a株的全基因组序列与理论预测的结果完全一致。

实施例3

rH120-YZS1Δ5a株的生物学特性鉴定

生物材料的准备：

鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株的分子克隆株rH120由江苏省家禽科学研究所构建并保存。申请人承诺自申请日起向公众发放20年。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1、致鸡胚矮小化试验

将rH120-YZS1Δ5a株的P3代种毒，用PBS进行1:100倍稀释后，接种于5枚11日龄SPF鸡胚尿囊腔内，0.2mL/枚，置37℃孵化至144h，观察鸡胚的变化。结果表明rH120-YZS1Δ5a株感染鸡胚后出现规律性的鸡胚死亡，表现特征性变化：羊膜增厚，紧贴胚体，胚体比同日龄正常鸡胚矮小，蜷曲，又称“侏儒胚”。

2、病毒EID₅₀的测定

取rH120-YZS1Δ5a株的P3代种毒，用生理盐水连续10倍稀释至10^-8。每个稀释度的病毒液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1mL/胚。鸡胚接种后置37℃孵化，弃24h内死亡胚，以后每隔12h观察1次，及时观察胚体发育和死亡情况。观察记录到接毒后第6天，按Reed～Muench二氏法计算病毒的EID₅₀。

结果表明rH120-YZS1Δ5a株的EID₅₀为10^6.83/0.1mL，与亲本毒株H120的10^7.17/0.1mL基本一致，表明拯救获得的重组病毒具有良好的鸡胚增殖能力。

3、目的蛋白表达检测

取拯救获得的rH120-YZS1Δ5a种毒尿囊液，经20000g离心2h后取沉淀，经5倍蛋白上样缓冲液煮沸8min，制备蛋白样品，进行Western-blot鉴定。取rH120-YZS1Δ5a蛋白样品20μL，用5％的积层胶和10％的分离胶进行SDS-PAGE电泳，积层胶电压140V，分离胶电压为120V；蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，电转至硝酸纤维膜上，用5％的脱脂奶粉封闭液封闭2.5h，分别用IBYZ株S1重组蛋白或M41株S1重组蛋白制备的兔源阳性血清4℃孵育过夜；加入羊抗兔HRP-IgG二抗(1:8000)，37℃孵育1.5h，ECL光学显影。

结果rH120-YZS1Δ5a株样品分别与IBYZ株S1重组蛋白及M41株S1重组蛋白制备的阳性血清作用后，均在约95ku的位置呈现出蛋白的表达条带，且条带的大小与S1蛋白的理论结果基本一致，表明rH120-YZS1Δ5a株能够同时表达QX型和Mass型鸡传染性支气管炎病毒的S1蛋白(图3)。

4、遗传稳定性检测

将rH120-YZS1Δ5a株第6代种毒用PBS进行1:100倍稀释后，接种于5枚11日龄SPF鸡胚尿囊腔内，0.2mL/枚，置37℃孵化至48h后，收获尿囊毒再次接种11日龄SPF鸡胚。将种毒在SPF接胚中进行连续传代，并取P5、P10和P15代病毒尿囊液进行S基因测序分析，及P15代病毒尿囊液进行全基因组序列分析。

结果表明S基因在病毒传代过程中没有发生变异，同源率为100％。表明以H120疫苗株为骨架表达我国IBV流行株S1基因重组病毒H120-YZS1Δ5a株，能在鸡胚中连续传代且保持良好的遗传稳定性。

实施例5

利用重组病毒H120-YZS1Δ5a制备S1重组蛋白

1、S1重组蛋白溶液的制备

将rH120-YZS1Δ5a株第3代种毒用PBS进行1:100倍稀释后，接种于10枚11日龄SPF鸡胚尿囊腔内，0.2mL/枚，置37℃孵化至48h后，将胚至于4℃冰箱中放置过夜。采用注射器吸取清亮的尿囊液混合后，5000g离心10min，取上清在4℃冰箱中保存备用。

2、Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签的S1重组蛋白

将离心后的上清蛋白溶液与Ni-NTA混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1h。将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，用Wash buffer洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50～100倍，以便充分洗去杂蛋白。用Elution buffer洗柱，用1.5mL EP管收集洗脱液。测定收集的洗涤液和洗脱液的A280，选择A280变化明显的取样进行SDS-PAGE，分析组氨酸标签蛋白的分布。采用超滤管对目的蛋白进行脱盐处理，收集的S1重组蛋白溶液置于-80℃保存及Western blot鉴定。

实施例6

鸡传染性支气管炎双价疫苗的研制

生物材料的准备：

鸡传染性支气管炎病毒分离株IBYZ由江苏省家禽科学研究所禽病防治与控制研究室分离、鉴定并保存，微生物保藏号为CGMCC No.14682。Mass型检验用M41株种毒由中国兽药监察所提供。

1、病毒的纯净性检验

按现行《中华人民共和国兽药典》，对rH120-YZS1Δ5a株第1-3代尿囊液种毒进行纯净性检验，结果无支原体、细菌、霉菌及其它外源病毒污染。

2、rH120-YZS1Δ5a株对1日龄SPF雏鸡的安全性评价试验

取1日龄SPF雏鸡10只，通过点眼、滴鼻的方式接种EID₅₀为10^5.17剂量的rH120-YZS1Δ5a株第6代种毒，并设立10只1日龄的雏鸡接种PBS作为对照组。观察临床症状至21天，对所有鸡剖检后观察病变。结果表明，在整个观察期内未见鸡只表现临床症状及出现死亡，剖检无明显病变。结果表明rH120-YZS1Δ5a株对1日龄SPF雏鸡没有致病性。

表1对1日龄SPF雏鸡的致病性试验

组别	1d	2d	3d	4d	5d	6d	7d	8d	9d	10d	发病率
												PBS	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/10
rH120-YZS1Δ5a	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/10

3、rH120-YZS1Δ5a株的毒力返强试验

取1日龄SPF雏鸡10只，通过点眼、滴鼻的方式接种EID₅₀为10^5.17剂量的rH120-YZS1Δ5a株第6代种毒。接种第7天后，放血处死雏鸡，采集气管和肾脏组织，加入5倍量PBS研磨，冻融三次后离心取上清，再次通过点眼、滴鼻的方式接种1日龄SPF雏鸡10只，0.1mL/只，以此进行第2次、第3次及第4次传代。第5次接种后，观察临床症状至21天，对所有鸡剖检后观察病变。

结果表明，在整个观察期内未见鸡只表现临床症状及出现死亡，剖检无明显病变，证明rH120-YZS1Δ5a株在宿主间连续五代传播，病毒毒力未发生改变。

4、rH120-YZS1Δ5a株的免疫原性试验

采用EID₅₀为10^4.0剂量的rH120-YZS1Δ5a株毒种，以及10^4.0EID₅₀的H120疫苗株，通过滴鼻、点眼的方式分别免疫20只1日龄的SPF雏鸡，并设立20只1日龄的雏鸡接种PBS作为阴性对照组。免疫后3周分别采用EID₅₀为10^5.83的QX型强毒IBYZ株及EID₅₀为10^5.5的Mass型检验用M41株进行攻毒，每组10只，通过观察雏鸡的发病情况评价免疫保护效果。

结果表明rH120-YZS1Δ5a株免疫鸡能有效抵抗QX型强毒IBYZ株(保护率8/10)及Mass型检验用M41株(保护率9/10)的感染，而H120免疫鸡只能有效抵抗M41株的感染(保护率10/10)，对QX型强毒IBYZ株的感染不能提供保护(保护率0/10)；PBS接种组对QX型强毒IBYZ株(保护率0/10)及Mass型检验用M41株(保护率0/10)的感染均不能提供保护。

由以上实施例可以得出，本发明成功构建病毒株rH120-YZS1Δ5a，对1日龄的雏鸡没有致病性，免疫1日龄的SPF雏鸡后，能同时抵抗QX强毒IBYZ株及Mass型强毒M41株的感染，可作为研制鸡传染性支气管炎双价疫苗的候选毒株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttggtctcag atgttgggga agtc 24

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttggtctcag gtgatgtgag ctattgg 27

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taggtctcgc accatcacca tcaccattaa tggctgacta gtt 43

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttctggtct cgcatcgtct gtatttgtta ag 32

Claims

1.一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a，拉丁文为Infectious bronchitisvirus，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10499。

2.权利要求1所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的构建方法，其特征在于，包括：将纤突蛋白膜外区S1基因插入IBV H120疫苗株mRNA编码区转录调控序列下游，拯救获得传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述纤突蛋白膜外区S1基因来源于QX型传染性支气管炎病毒分离株IBYZ，保藏号为CGMCC No.14682。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.权利要求1所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a在制备纤突蛋白膜外区S1蛋白中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a经PBS缓冲液稀释后，得到稀释病毒；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a为传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的第3代病毒。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a与PBS缓冲液的体积比为0.5～1.5:90～110。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述离心的离心力为4000～6000g，所述离心的时间为8～12min。

10.权利要求1所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a在制备预防鸡传染性支气管炎双价疫苗中的应用。