CN111500547A - 一种鸡传染性支气管炎重组病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

一种鸡传染性支气管炎重组病毒及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鸡传染性支气管炎重组病毒及其构建方法和应用，属于疫苗制备技术领域，缺失鸡传染性支气管炎病毒的3a3b基因和/或5a5b基因后得到。通过缺失鸡传染性支气管炎重组病毒的3a3b基因和/或5a5b基因后，获得毒力减弱的基因缺失毒株，能对同型强毒的感染提供有效保护，用于研制安全、有效的鸡传染性支气管炎基因缺失活疫苗。

Description

一种鸡传染性支气管炎重组病毒及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎重组病毒及其构建方法和应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)，为国际兽医局规定的家禽二类传染病之一，是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV属于冠状病毒科的Gamma冠状病毒，是有囊膜不分节段单股正链RNA病毒，基因组长约27.6kb，具有典型的5′帽子和3′PolyA尾巴结构，至少有10个明显的开放阅读框(ORF)，分别编码病毒的结构蛋白和非结构蛋白。其5′端2/3基因组编码具有活性的复制酶，3′端1/3基因组主要编码结构蛋白，如纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和小膜蛋白(E)。基因3在S和M蛋白之间，编码3a3b3c蛋白，基因5在M和N蛋白之间，编码5a5b蛋白。
IBV结构蛋白在病毒感染细胞过程中各自发挥着不同的作用。M蛋白与病毒复制有关，它的免疫原性较弱。N蛋白在病毒复制、组装中有重要作用，能识别免疫相关靶位点，在细胞免疫和体液免疫中起重要作用。E蛋白在病毒复制过程中参与病毒样颗粒形成和病毒出芽，与M蛋白协同作用，在粘膜免疫中发挥作用。S蛋白是重要的保护性抗原，可刺激机体产生中和抗体，在病毒血清学分类、病毒吸附细胞中发挥作用。
由于IBV极易发生变异，导致新的变异株不断出现，且不同毒株之间交叉保护性弱，使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发，造成了巨大的经济损失，严重制约了我国养禽业的健康发展。疫苗接种是预防IB的重要手段，相继研制出常规的IB活苗和灭活苗，其中鸡胚适应毒H120和H52弱毒苗已被世界各国广泛应用。由于不同血清型IBV毒株之间交叉保护力弱，这给IB的免疫预防带来了很大的困难。常规单一毒株疫苗常有免疫失败的报道，弱毒疫苗还存在重组、毒力返强等问题。针对IBV新的流行情况研制安全有效的新疫苗迫在眉睫。现在大量文献报道基因缺失减毒活疫苗具有高效、安全的特点，例如伪狂犬病毒的TK基因缺失疫苗，人免疫缺陷病毒nef基因缺失疫苗、牛白血病病毒px基因缺失疫苗等，但目前国内外尚未有鸡传染性支气管炎基因缺失疫苗的研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸡传染性支气管炎重组病毒及其构建方法和应用，采用本发明提供的鸡传染性支气管炎重组病毒，能对同型强毒的感染提供有效保护，用于研制安全、有效的鸡传染性支气管炎基因缺失活疫苗。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种鸡传染性支气管炎重组病毒，缺失鸡传染性支气管炎病毒的3a3b基因和/或5a5b基因后得到。
优选的，所述3a3b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述5a5b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，所述鸡传染性支气管炎病毒的保藏编号为CGMCC No.14682。
本发明还提供了上述技术方案所述的鸡传染性支气管炎重组病毒的构建方法，包括：通过反向遗传操作技术缺失鸡传染性支气管炎病毒的3a3b基因和/或5a5b基因，得到鸡传染性支气管炎重组病毒。
优选的，缺失所述3a3b基因使用的引物对包括3a3bS引物和3a3bA引物，所述3a3bS引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述3a3bA引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，缺失所述5a5b基因使用的引物对包括5a5bS引物和5a5bA引物，所述5a5bS引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述5a5bA引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的鸡传染性支气管炎重组病毒在制备防治鸡传染性支气管炎的疫苗中的应用。
本发明提供了一种鸡传染性支气管炎重组病毒，其特征在于，缺失鸡传染性支气管炎病毒的3a3b基因和/或5a5b基因后得到。通过缺失鸡传染性支气管炎重组病毒的3a3b基因和/或5a5b基因后，获得毒力减弱的基因缺失毒株，能对同型强毒的感染提供有效保护，用于研制安全、有效的鸡传染性支气管炎基因缺失活疫苗。
附图说明
图1为鸡传染性支气管炎病毒全基因组的分段扩增；
图2为鸡传染性支气管炎病毒全长基因组cDNA的体外拼接策略；
图3为基因缺失株rIBYZΔ3a3b、rIBYZΔ5a5b和rIBYZΔ3ab5ab的全长基因组结构示意图；
图4为基因缺失株rIBYZΔ3a3b、rIBYZΔ5a5b和rIBYZΔ3ab5ab在鸡胚中的增殖曲线；
图5为rIBYZΔ3a3b免疫雏鸡后攻毒的存活试验。
生物保藏说明
鸡传染性支气管炎病毒IBYZ，拉丁文为Infectious bronchitis virus，于2017年08月31日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.14682。
具体实施方式
本发明提供了一种鸡传染性支气管炎重组病毒，缺失鸡传染性支气管炎病毒的3a3b基因和/或5a5b基因后得到。
在本发明中，所述3a3b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
atggttcaaactcccgcgtcttttgtaatattattaatttttctctggtttaaacttgcattaagttgtttcagtgagtgcattgtagcacttcaacatctaatacaaattctactccaaattattaataataatttacaatctaggctgctcctttggcacagcctagactaatgttagattttgagaaaacaattgaaacaggtgaacagttagtacaacaaatcagtttcaatttacaacatatctcaagtgttctagaaacacaaatatttgacccatttgagtgttgctattattcaagtggtagtttttatgaaatagagtcagctgacgattgttcaggtgatgaattttattaa。
在本发明中，所述5a5b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
atgaaatggctgactagttttggaagggcattcatctcctgttataaatccctattactaactcaacttagagttttagataggtttattttagagcacggtacaaagcgcggttttatctgtgctaggcgagtgcttttattccaattagatttagtttataggttggcatatacacctgcccaatcgctggtatgaataatagtaaaggtaatccttttcgcggagcaatagcaagaaaagcgcgaatttatctgagaggaggattagattgtgtttactttcttaacaaagcaggacaagcagagccttgtcccgcgtgcacatcactagtattccaagggaaaacttgtgaggagcacatagataataacgacttgctatcatggcgagcggtaaagtatctggaaagtcagactcccccgcgccaatcatcaaactag。
本发明对所述鸡传染性支气管炎病毒的来源没有特殊限定，采用常规病毒菌种即可，在本发明具体实施方式中，所述鸡传染性支气管炎病毒优选为保藏编号为CGMCCNo.14682的鸡传染性支气管炎病毒。
本发明还提供了上述技术方案所述的鸡传染性支气管炎重组病毒的构建方法，包括：通过反向遗传操作技术缺失鸡传染性支气管炎病毒的3a3b基因和/或5a5b基因，得到鸡传染性支气管炎重组病毒。
本发明对所述反向遗传操作技术缺失鸡传染性支气管炎病毒的3a3b基因和/或5a5b基因的具体步骤没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法操作即可。
在本发明中，缺失所述3a3b基因使用的引物对包括3a3bS引物和3a3bA引物，所述3a3bS引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
5’ttgagaaaacaattgaaacagg 3’；
所述3a3bA引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下所示：
5’cttaatgcaagtttaaaccagag 3’。
在本发明中，缺失所述5a5b基因使用的引物对包括5a5bS引物和5a5bA引物，所述5a5bS引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：
5’tccttttcgcggagcaatagcaag 3’；
所述5a5bA引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下：
5’tgaatgcccttccaaaactagtcag 3’。
本发明还提供了上述技术方案所述的鸡传染性支气管炎重组病毒在制备防治鸡传染性支气管炎的疫苗中的应用。本发明对将鸡传染性支气管炎重组病毒制备成疫苗的方法没有特殊限定，采用本领域常规将病毒制成疫苗的方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
IBYZ株(鸡传染性支气管炎病毒，保藏编号为CGMCC No.14682，GenBank登录号为KT750258)全长基因组cDNA的构建及病毒拯救
1、引物设计
IBV基因组大小在27.6kb左右，根据鸡传染性支气管炎病毒上IIs型限制性内切酶Bsa I的分布情况，分YZ1、YZ2、YZ3、YZ4、YZ5、YZ6、YZ7、YZ8、YZ9和YZ10共10个片段对全基因组进行分段扩增。设计覆盖该病毒全基因组的10对引物，引物序列见表1。在YZ1扩增片段的上游引物YZ1S中引入T7 RNA聚合酶启动子的核心序列，以保证完成全长cDNA拼接后能在体外转录产生病毒基因组RNA；在下游引物YZ10A中引入28个碱基T，以保证在YZ10片段3'端具有polyA尾巴结构。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1 IBYZ基因组全长cDNA扩增引物
Figure BDA0002457738190000051
Figure BDA0002457738190000061
2、PCR分段扩增
采用RNAiso Plus(TaKaRa)按照试剂盒使用说明书中的步骤提取基因组RNA。以提取的IBYZ株病毒基因组RNA为模板，反转录采用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒(TaKaRa)，按照使用说明书构建100μL的反应体系，以Oligo dT和Random Primers作为反转录引物，先进行30℃，5min反应，然后42℃，30min反转录反应。
以上述cDNA为模板，采用表1中的引物对YZ1S+YZ1A、YZ2S+YZ2A、YZ3S+YZ3A、YZ4S+YZ4A、YZ5S+YZ5A、YZ6S+YZ6A、YZ7S+YZ7A、YZ8S+YZ8A、YZ9S+YZ9A和YZ10S+YZ10A分10个片段(YZ1～YZ10)进行PCR扩增。PCR反应采用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)，按照产品说明书构建50μL的反应体系。反应条件为：95℃，30s；52℃，30s；72℃，3min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，片段的大小与理论值一致，分别为0.9kb、3.7kb、2.9kb、2.6kb、3.7kb、3.7kb、3.6kb、3.2kb、3.1kb、0.9kb(图1)。
3、PCR产物克隆测序
将上述10个DNA片段用Taq酶进行加T处理后，分别连接到pMD19-T载体(TaKaRa)中，转化JM109基因工程菌。将获得的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，以确定重组质粒pMDYZ1、pMDYZ2、pMDYZ3、pMDYZ4、pMDYZ5、pMDYZ6、pMDYZ7、pMDYZ8、pMDYZ9和pMDYZ10中插入的cDNA片段与病毒基因组序列完全一致。其中pMDYZ1重组质粒中的YZ1 DNA片段，其5'端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子的核心序列；pMDYZ10重组质粒中的YZ10 DNA片段,其3'端具有polyA尾巴结构。
4、全长基因组的体外拼接
将携带重组质粒的JM109基因工程菌分别接种LB培养基进行培养，采用TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit(TaKaRa)按照使用说明书提取重组质粒pMDYZ1、pMDYZ2、pMDYZ3、pMDYZ4、pMDYZ5、pMDYZ6、pMDYZ7、pMDYZ8、pMDYZ9和pMDYZ10。分别对上述重组质粒经Bsa I酶切后，采用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit(TaKaRa)按照使用说明书胶回收目的片段YZ1、YZ2、YZ3、YZ4、YZ5、YZ6、YZ7、YZ8、YZ9和YZ10。
采用紫外分光光度计测定上述10个DNA片段的质量浓度，并换算成摩尔浓度。根据DNA片段的摩尔浓度，按照1:1的比例将YZ1、YZ2、YZ3和YZ4，YZ5、YZ6和YZ7，YZ8、YZ9和YZ10混合，利用各个片段间的酶切位点进行连接，获取中间产物YZ1-4、YZ5-7、YZ8-10并进行胶回收和浓度测定。再次将YZ1-4、YZ5-7、YZ8-10按照1:1:1的比例混合后连接，获取传染性支气管炎病毒IBYZ株全长cDNA(图2)。
5、病毒的拯救与鉴定
取上述构建的传染性支气管炎病毒IBYZ株全长cDNA，采用in vitroTranscription T7体外转录试剂盒(TaKaRa)，经T7启动子进行体外转录，同时在转录体系中加入2.5mM/μL的RNA帽结构类似物(NEB)，使转录获取的RNA 5′端具有帽子结构。将BHK-21细胞传至培养皿中，在10％DMEM高糖(GIBCO)培养基中37℃下培养，当细胞密度达到80％以上时即进行转染。将全长基因组cDNA的转录产物加入到150μL RNase-free PBS溶液中混匀；取10μL GenJet Plus(SignaGen)转染试剂溶于150μL RNase-free PBS溶液中混匀；将GenJet Plus转染试剂溶液加入到上述RNA混合溶液中立即混匀，室温孵育15min。在此期间，用RNase-free PBS溶液洗涤培养皿中的BHK-21细胞3次，然后将GenJet Plus/RNA复合物加入到单层的BHK-21细胞上，置于37℃的CO2培养箱中培养5h后，吸弃转染液，加入10％DMEM高糖培养基3mL继续培养。48h后，刮取培养板上的BHK-21细胞，将培养液及细胞混合物冻融3次后，接种11日龄SPF鸡胚。将接种鸡胚置于37℃的培养箱中孵育48h后，置4℃冰箱中过夜，然后收获RT-PCR鉴定为阳性的鸡胚尿囊液，命名为rIBYZ株。
实施例2
鸡传染性支气管炎病毒基因缺失株的构建
1、3a3b基因、5a5b基因缺失质粒的构建
3a3b基因、5a5b基因均位于上述构建的重组质粒pMDYZ9中，根据IBYZ的全基因组序列设计引物，分别用于缺失3a3b基因和或5a5b基因片段，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3a3b基因、5a5b基因缺失引物序列为：
3a3bS(SEQ ID No.3)：5’TTGAGAAAACAATTGAAACAGG 3’；
3a3bA(SEQ ID No.4)：5’CTTAATGCAAGTTTAAACCAGAG 3’；
5a5bS(SEQ ID No.5)：5’TCCTTTTCGCGGAGCAATAGCAAG 3’
5a5bA(SEQ ID No.6)：5’TGAATGCCCTTCCAAAACTAGTCAG 3’。
以pMDYZ9质粒为模板，分别采用引物对3a3bS+3a3bA、5a5bS+5a5bA进行PCR扩增。PCR反应采用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)，按照产品说明书构建50μL的反应体系。反应条件为：95℃，30s；52℃，30s；72℃，5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收。将PCR产物采用Blunting Kination Ligation(BKL)Kit(TaKaRa)进行末端磷酸化处理和连接，转化JM109基因工程菌(TaKaRa)，将获得的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，筛选阳性质粒分别命名为pMDYZ9Δ3a3b、pMDYZ9Δ5a5b和pMDYZ9Δ3ab5ab。
2、基因缺失株全长基因组的体外拼接
分别采用pMDYZ9Δ3a3b、pMDYZ9Δ5a5b或pMDYZ9Δ3ab5ab替换pMDYZ9质粒，制备覆盖IBYZ株全长基因组的10个片段。采用紫外分光光度计测定10个DNA片段的质量浓度，并换算成摩尔浓度。根据DNA片段的摩尔浓度，按照比例顺序依次将10个片段进行拼接，获取传染性支气管炎病毒基因缺失株的全长cDNA(图3)。
3、病毒的拯救与鉴定
取上述构建的全长cDNA，采用in vitro Transcription T7体外转录试剂盒(TaKaRa)，经T7启动子进行体外转录，同时在转录体系中加入2.5mM/μL的RNA帽结构类似物(NEB)，使转录获取的RNA 5′端具有帽子结构。将BHK-21细胞传至培养皿中，在10％DMEM高糖(GIBCO)培养基中37℃下培养，当细胞密度达到80％以上时即进行转染。将全长基因组cDNA的转录产物加入到150μL RNase-free PBS溶液中混匀；取10μL GenJet Plus(SignaGen)转染试剂溶于150μL RNase-free PBS溶液中混匀；将GenJet Plus转染试剂溶液加入到上述RNA混合溶液中立即混匀，室温孵育15min。在此期间，用RNase-free PBS溶液洗涤培养皿中的BHK-21细胞3次，然后将GenJet Plus/RNA复合物加入到单层的BHK-21细胞上，置于37℃的CO2培养箱中培养5h后，吸弃转染液，加入10％DMEM高糖培养基3mL继续培养。48h后，刮取培养板上的BHK-21细胞，将培养液及细胞混合物冻融3次后，接种11日龄SPF鸡胚。将接种鸡胚置于37℃的培养箱中孵育48h后，置4℃冰箱中过夜，然后收获RT-PCR鉴定为阳性的鸡胚尿囊液，分别命名为rIBYZΔ3a3b、rIBYZΔ5a5b和rIBYZΔ3ab5ab。
实施例3
鸡传染性支气管炎病毒基因缺失株的生物学特性检测
1、病毒血凝活性的测定
将rIBYZΔ3a3b、rIBYZΔ5a5b和rIBYZΔ3ab5ab株的P3代种毒，接种于10日龄SPF鸡胚，收获其36h～48h的尿囊液，经终浓度为1U/mL的I型卵磷脂酶C(Sigma)于37℃处理90min，并于4℃冰箱放置2周后，按微量法操作进行血凝试验。结果表明，未经I型卵磷脂酶C处理的rIBYZΔ3a3b、rIBYZΔ5a5b和rIBYZΔ3ab5ab株种毒及其亲本毒株rIBYZ均无血凝活性；经I型卵磷脂酶C处理后，rIBYZΔ3a3b、rIBYZΔ5a5b及rIBYZΔ3ab5ab株的血凝价介于5log2～7log2之间，与亲本毒株rIBYZ的平均血凝价6.2log2基本一致。
2、病毒生长曲线的测定
将rIBYZΔ3a3b、rIBYZΔ5a5b和rIBYZΔ3ab5ab株的P3代种毒及亲本毒株rIBYZ的种毒，用PBS进行1:10000倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各32枚。分别于接种后12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h收获尿囊液，采用荧光定量RT-PCR测定不同时间段的病毒滴度。结果表明基因缺失株rIBYZΔ3a3b、rIBYZΔ5a5b和rIBYZΔ3ab5ab株的P3代种毒及亲本毒株rIBYZ的病毒滴度均在接种鸡胚36h后达到最高峰，然后逐渐下降，表明辅助蛋白基因3a3b和/或5a5b的缺失对病毒在鸡胚中的增殖没有明显的影响(图4)。
3、基因缺失株对1日龄SPF雏鸡的安全性评价试验
取1日龄SPF雏鸡30只，随机分成3个组，分别通过点眼、滴鼻的方式接种EID50为105.0剂量的rIBYZΔ3a3b、rIBYZΔ5a5b或rIBYZΔ3ab5ab株第3代种毒，并设立10只1日龄的雏鸡接种PBS作为对照组。观察临床症状至21天，对所有鸡剖检后观察病变。结果表明，在整个观察期内，rIBYZΔ3a3b和rIBYZΔ3ab5ab接种组的雏鸡未见鸡只表现临床症状及出现死亡，剖检无明显病变，rIBYZΔ5a5b接种组雏鸡接种后第4天，部分雏鸡出现明显的呼吸道症状，并在5天后出现零星的死亡。
实施例4
鸡传染性支气管炎基因缺失疫苗的研制
1、病毒的纯净性检验
按现行《中华人民共和国兽药典》，对rIBYZΔ3a3b和rIBYZΔ3ab5ab株第1-3代尿囊液种毒进行纯净性检验，结果无支原体、细菌、霉菌及其它外源病毒污染。
2、rIBYZΔ3a3b免疫原性试验
取EID50为104.0的rIBYZΔ3a3b及H120疫苗株通过滴鼻、点眼的方式分别免疫10只1日龄的SPF雏鸡，并设立10只雏鸡作为阴性对照组。免疫后3周采用EID50为105.0的rIBYZ强毒株进行攻毒，通过观察雏鸡的发病情况，气管纤毛的摆动及泄殖腔棉拭子病毒的分离情况，评价重组病毒对变异株感染的保护效果，并与H120疫苗株进行比较。结果表明rIBYZΔ3a3b株能有效抵抗rIBYZ强毒株的感染，抗感染保护率要显著高于H120疫苗株(图5)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种鸡传染性支气管炎重组病毒及其构建方法和应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 362
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggttcaaa ctcccgcgtc ttttgtaata ttattaattt ttctctggtt taaacttgca 60
ttaagttgtt tcagtgagtg cattgtagca cttcaacatc taatacaaat tctactccaa 120
attattaata ataatttaca atctaggctg ctcctttggc acagcctaga ctaatgttag 180
attttgagaa aacaattgaa acaggtgaac agttagtaca acaaatcagt ttcaatttac 240
aacatatctc aagtgttcta gaaacacaaa tatttgaccc atttgagtgt tgctattatt 300
caagtggtag tttttatgaa atagagtcag ctgacgattg ttcaggtgat gaattttatt 360
aa 362
<210> 2
<211> 443
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaatggc tgactagttt tggaagggca ttcatctcct gttataaatc cctattacta 60
actcaactta gagttttaga taggtttatt ttagagcacg gtacaaagcg cggttttatc 120
tgtgctaggc gagtgctttt attccaatta gatttagttt ataggttggc atatacacct 180
gcccaatcgc tggtatgaat aatagtaaag gtaatccttt tcgcggagca atagcaagaa 240
aagcgcgaat ttatctgaga ggaggattag attgtgttta ctttcttaac aaagcaggac 300
aagcagagcc ttgtcccgcg tgcacatcac tagtattcca agggaaaact tgtgaggagc 360
acatagataa taacgacttg ctatcatggc gagcggtaaa gtatctggaa agtcagactc 420
ccccgcgcca atcatcaaac tag 443
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgagaaaac aattgaaaca gg 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttaatgcaa gtttaaacca gag 23
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccttttcgc ggagcaatag caag 24
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgaatgccct tccaaaacta gtcag 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagacctaat acgactcact atagggactg aaaatagata ttatt 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttctacagta agagaccaat gac 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttggtctctt actgtagaag cgctg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggtctccac ccaagaattt agc 23
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgggtggag accctacgga tt 22
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggtctcaga aacgacctcc tgatttgac 29
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggtctcgtt tcttcataac taggtctg 28
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tggtctccag gacgcagctt tctttac 27
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggtctcgtc ctggttttgg agtagatg 28
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggtctccca gaagataaag cacag 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggggtctctt ctggtataac acac 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtatctatga gaccctcagg tgtgac 26
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gggtctcata gatacatcaa taggcaat 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tggtctcttg ttcagttttc aaatttac 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgggtctcg aacaaaagac cgacttag 28
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggtctcgga cgcgggagtt tg 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aggtctcgcg tcttttgtaa tatt 24
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtctcggt tcttcatctt ttgg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgctcttc ttgttggaag tagagtg 27
<210> 26
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttttttttt tttttttttt ttttttttgc tctaactcta tactag 46

Claims (8)

1.一种鸡传染性支气管炎重组病毒，其特征在于，缺失鸡传染性支气管炎病毒的3a3b基因和/或5a5b基因后得到。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎重组病毒，其特征在于，所述3a3b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎重组病毒，其特征在于，所述5a5b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎重组病毒，其特征在于，所述鸡传染性支气管炎病毒的保藏编号为CGMCC No.14682。
5.权利要求1～4任一项所述的鸡传染性支气管炎重组病毒的构建方法，其特征在于，包括：通过反向遗传操作技术缺失鸡传染性支气管炎病毒的3a3b基因和/或5a5b基因，得到鸡传染性支气管炎重组病毒。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，缺失所述3a3b基因使用的引物对包括3a3bS引物和3a3bA引物，所述3a3bS引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述3a3bA引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，缺失所述5a5b基因使用的引物对包括5a5bS引物和5a5bA引物，所述5a5bS引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述5a5bA引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
8.权利要求1～4任一项所述的鸡传染性支气管炎重组病毒在制备防治鸡传染性支气管炎的疫苗中的应用。
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