CN112063596A

CN112063596A - 鸽副黏病毒1型ppmv-1/bj-c株及其应用

Info

Publication number: CN112063596A
Application number: CN202010872170.4A
Authority: CN
Inventors: 崔尚金; 梁琳; 梁瑞英; 韩坤
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明提供一种鸽副黏病毒1型PPMV‑1/BJ‑C株及其应用。弱毒株PPMV‑1/BJ‑C是在鸽瘟病毒强毒株PPMV‑1/BJ基础上，将其F蛋白裂解位点突变为La Sota株对应位点，构建得到的。PPMV‑1/BJ‑C具有免疫原性好、培养特性好、效价稳定等优点，将鸽瘟病毒PPMV‑1/BJ‑C株经尿囊腔接种于9～11日龄SPF鸡胚，收获感染鸡胚尿囊液，用二乙烯亚胺灭活后，加入氢氧化铝佐剂制成鸽瘟病毒灭活疫苗。用PPMV‑1/BJ‑C株制备的灭活疫苗能产生较高的抗体，可预防鸽瘟病毒引起的ND，该疫苗具有安全、起效快、免疫期持久等优点，应用前景广阔。

Description

鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品和预防兽医领域，具体地说，涉及鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株及其应用。

背景技术

鸽瘟，因其引起鸽子发病症状与鸡新城疫神经型相似，又被称为鸽新城疫(Newcastle Disease,ND)，是由鸽I型副黏病毒(Pigeon Paramyxo VirusI，PPMV-I)引起的以腹泻和神经症状为主要症状的高接触性传染病。PPMV-I是新城疫病毒(NewcastleDisease Virus,NDV)的抗原变种。鸽瘟一直是影响我国养鸽业发展的重要传染病。研究发现，鸽瘟病毒的基因型与我国现有鸡NDV相关疫苗株基因型存在较大差异，对鸽子的免疫效果并不理想，保护效率低。目前，市场上并没有一种疫苗用来专门预防鸽瘟。因此，鸽瘟灭活疫苗的研发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫原性好、培养特性好、效价稳定的鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株(鸽瘟病毒弱毒株PPMV-1/BJ-C)。

本发明的另一目的是提供鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株在制备疫苗中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供鸽瘟病毒(Pigeon Paramyxo VirusI)弱毒株PPMV-1/BJ-C。发明人前期通过流行病学调查，从分离获得的鸽瘟病毒株中筛选到一株鸽瘟强毒株PPMV-1/BJ(鸽瘟病毒强毒株PPMV-1/BJ的全基因组序列如SEQ ID NO:1所示)，并借助反向遗传技术构建了该毒株的致弱毒株PPMV-1/BJ-C株。其是将PPMV-1/BJ株的F蛋白裂解位点突变为La Sota株对应位点进行弱毒性突变构建得到的。经试验证实，PPMV-1/BJ-C毒株具有良好的免疫原性。

鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.19989，保藏日期2020年5月28日。

第二方面，本发明提供所述鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株的以下任一应用：

1)用于制备疫苗；

2)用于制备鸽瘟病毒感染以及由其感染所致相关疾病的诊断试剂。

第三方面，本发明提供一种组合物，其包含灭活后的所述鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株以及药学上可接受的载体。

第四方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。

第五方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含上述免疫原性组合物。

第六方面，本发明提供一种鸽瘟病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养所述鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株，得到病毒液；

(2)将收获的病毒液用二乙烯亚胺(BEI)灭活；

(3)将灭活后的病毒液与佐剂混合，即得。

优选地，步骤(1)中将鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株接种至SPF鸡胚(接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔)进行培养。

优选地，步骤(3)所述佐剂为氢氧化铝佐剂。

前述的方法，步骤(2)包括：将收获的病毒液采用0.02％～0.03％的二乙烯亚胺在32℃～37℃条件下灭活48～96小时后，加入0.2％硫代硫酸钠终止灭活，即得灭活鸽瘟病毒抗原。

优选地，所述鸽瘟病毒灭活疫苗的制备方法包括：取灭菌的氢氧化铝佐剂1份，加入检验合格的灭活鸽瘟病毒抗原1份，即按体积比1:1混合，低速搅拌30-60分钟，乳化后制得。

第七方面，本发明提供所述疫苗组合物或者按照上述方法制备的鸽瘟病毒灭活疫苗在制备治疗或预防鸽瘟病毒感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

所述疾病以患病鸽出现下痢、神经症状等为特征。

本发明提供的鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株具有免疫原性好、培养特性好、效价稳定等优点，将鸽瘟病毒PPMV-1/BJ-C株经尿囊腔接种于9～11日龄SPF鸡胚，收获感染鸡胚尿囊液，用二乙烯亚胺灭活后，加入氢氧化铝佐剂制成鸽瘟病毒灭活疫苗。本发明构建的PPMV-1/BJ-C株制备的灭活疫苗能产生较高的抗体，能够预防鸽瘟病毒引起的包括ND在内的多种疾病，此疫苗具有安全、起效快、免疫期持久等优点，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中PPMV-1/BJ株的全基因组电泳图；其中，M代表2K plusDNA Marker，泳道1～6代表PPMV-1/BJ株全基因组的各个片段F1～F6。

具体实施方式

本发明人前期通过流行病学调查，从分离获得的鸽瘟病毒株中筛选到一株鸽瘟强毒株PPMV-1/BJ株，并借助反向遗传技术构建了该毒株的致弱毒株PPMV-1/BJ-C株。经过相关试验证实，PPMV-1/BJ-C毒株具有良好的免疫原性。进一步对其进行灭活疫苗的研究。经实验室试制、安全性研究、效力研究等，该疫苗具有安全、有效的特点，对目前流行毒株起到很好的防护作用。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

1、筛选鸽瘟强毒BJ-C株

鸽瘟强毒BJ-C株的获得：本发明人在北京某鸽子养殖基地的疑似鸽瘟的病例中采集肝脏等组织，研磨后加1500单位青、链霉素溶液于4℃处理12h，2000r/min离心，取上清接种鸡胚，收集48h-96h死亡鸡胚尿囊液。经过血凝和血凝抑制试验证明，本发明所分离的病毒株为鸽瘟病毒强毒株PPMV-1/BJ(鸽副黏病毒I型)。进一步对分离的PPMV-1/BJ株进行毒力指标测定；主要检测鸡胚平均死亡时间(Mean death time,MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(Intracerebral pathogenicity index,ICPI)和6周龄雏鸡静脉接种致病指数(Intravenous pathogenic index,IVPI)三个指标。

2、弱毒株PPMV-1/BJ-C的构建

鸽瘟弱毒株PPMV-1/BJ-C的构建：利用反向遗传技术成功构建鸽瘟病毒弱毒株PPMV-1/BJ-C，其是将鸽瘟病毒PPMV-1/BJ株F蛋白裂解位点突变为La Sota株对应位点进行致弱突变。主要包括：表达T7 RNA聚合酶的细胞系的构建、全长cDNA克隆载体的构建、辅助质粒的构建、病毒拯救及鉴定。

3、鸽瘟病毒弱毒PPMV-1/BJ-C株灭活疫苗制备

本发明用所制备的鸽瘟病毒PPMV-1/BJ-C株制成鸽瘟病毒灭活疫苗，将其用于预防鸽瘟。由此，本发明提供了一种鸽瘟病毒PPMV-1/BJ-C株灭活疫苗的制备方法，包括：(1)培养制备的鸽瘟病毒弱毒PPMV-1/BJ-C株，得到病毒液；(2)向病毒液中加入灭活剂，将病毒液灭活；(3)向灭活后的病毒液中加入佐剂制备得到水相；(4)将水相加入到油相中，混合均匀，乳化，即得。

本发明涉及的试验方法：

一、微量红细胞凝集(HA)试验

1、向微量血凝板每孔中加入PBS 25μl，共做4个平行重复。

2、吸取抗原加入到第1列各孔，每孔25μl，然后从左向右进行2倍系列稀释至第11列孔，从第11列各孔吸取25μl混合液，弃去。第12列各孔不加抗原，作为对照孔。

3、向每孔中加入1％红细胞悬液25μl。

4、将微量血凝板置微型震荡器上震荡1分钟。

5、将微量血凝板置室温作用30分钟，判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为该抗原的HA效价。

二、微量血凝抑制(HI)试验

1、在96孔微量板上，第1孔至第12孔，每孔加入25μl PBS。

2、向第1孔中加入被检血清25μl，依次2倍系列稀释至第12孔，最后从第12孔弃去25μl混合液。

3、向每孔中加入25μl 4HA单位工作抗原液，置微型震荡器上震荡1min。

4、置于室温下孵育30min。

5、向每孔加入1％红细胞悬液25μl，置微型震荡器上震荡1min。

6、置室温作用30min，判定结果。

7、每次测定时应设阴性血清对照和已知HI抗体效价的阳性血清对照。

8、结果判定当阴性血清HI效价不高于1：8(微量法)、阳性血清HI效价与规定效价相比误差不超过1个滴度时，方可成立。红细胞沉淀呈泪珠状流淌，判为HI阳性；红细胞在孔底均匀分布或呈锯齿状凝集，判为HI阴性。以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为待检血清的HI抗体效价。

三、病毒含量的测定试验

将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-9 3个稀释度，各尿囊腔内接种10-11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36℃-37℃继续孵育，48h以前死亡的鸡胚弃去不计，在48-120小时死亡的鸡胚随时取出，至120小时，取出所有活胚，逐枚收获鸡胚尿囊液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:160(微量法1:128)者判为感染，计算EID50。每0.1ml病毒含量应不低于10^8.0EID50。

方案1：鸽瘟病毒强毒株(BJ-C株)分离、培养和鉴定

1、病料采集

鸽病料来北京某鸽子养殖基地，采集疑似鸽瘟病例的肝脏等组织，研磨后用1500单位青、链霉素溶液于4℃处理12h，2000r/min离心，取上清接种鸡胚，收集48h～96h死亡鸡胚尿囊液。

2、分离株血凝(HA)和血凝抑制(HI)

对收获的鸡胚尿囊液进行血凝试验，HA血凝价为8log2。分别用禽流感H5、H7和H9亚型标准阳性血清及ND、EDS标准阳性血清与鸡胚尿囊液进行HI试验。结果表明，与禽流感H5、H9、H7亚型和EDS病毒标准阳性血清反应为阴性，与ND标准阳性血清反应为阳性。

3、分离培养

3.1 细胞的制备

取9-11日龄SPF鸡胚，去除头、四肢和内脏，剪成1mm³左右的组织块。PBS洗3遍，用0.25％胰酶消化5-15min，弃去胰酶，加入含10％犊牛血清的DMEM，用吸管将CEF细胞轻轻吹打均匀至培养瓶中，37℃、5％CO₂环境培养，待细胞长成单层后使用。

3.2 接种与收获

用PBS将长成单层的CEF清洗3遍，接种万倍稀释的鸡胚毒，37℃吸附1小时后，加入含2％犊牛血清的DMEM，至37℃、5％CO₂环境培养，待细胞80％出现病变后，至-20℃冻融3次后，收获细胞毒。

3.3 毒力测定

3.3.1 鸡胚平均死亡时间的测定(MDT)

将病毒(稀释前病毒滴度为8log2)用灭菌生理盐水倍比稀释为10^-6～10^-9四个稀释度的病毒，每个浓度接胚5枚，0.2ml/胚，接种后继续在37℃孵化箱培养7天。剩余的病毒液4℃保存8h后，每个稀释度再接种另外的5个鸡胚。每12h照胚一次，检出24h内死亡鸡胚，观察并记录鸡胚死亡时间。病毒可以引起全部鸡胚死亡的最大稀释倍数为该病毒的最小致死量(Minimum lethal dose,MLD)，MDT是最小致死量引起鸡胚死亡的平均时间。公式如下：

MDT＝(NX×X+NY×Y)/T

式中，NX表示X小时死亡鸡胚数，NY表示Y小时死亡鸡胚数，X、Y表示死亡时间(h)，T表示死亡总鸡胚数。

判定标准：MDT<60h，判定为强毒株；60h<MDT<90h，为中等毒力；MDT>90h，为弱毒株。

3.3.2 1日龄雏鸡脑内致病指数的测定(ICPI)

将HA滴度在8log2的病毒用灭菌生理盐水进行十倍稀释，脑内接种1日龄SPF雏鸡，0.05ml/只，共接种10只。接种后每天观察雏鸡临床症状，观察8天，并对每只鸡进行打分，正常记为0分，发病为1分，死亡为2分。死亡鸡在其死亡后每天仍然按2分记录，观察期结束后根据标准公式：

ICPI＝(8天累计发病数×1+8天累计死亡数×2)/8天观察鸡只总数

判定标准：ICPI值最强接近2.0，最弱接近0；ICPI值越大，表明毒力越强。

周龄雏鸡静脉致病指数的测定(IVPI)

用灭菌生理盐水将病毒原液(稀释前滴度为8log2)进行十倍稀释，经翅静脉途径接种6周龄SPF雏鸡，每只0.1ml，共10只。饲养于隔离环境内，自由采食和饮水，连续观察10天，每天对其观察并根据临床症状对其进行打分。正常记做0分，发病记做1分，瘫痪或出现其它神经症状记做2分，死亡记做3分。死亡鸡在其死亡后每天仍然按3分记录，观察期结束后根据记录，按标准公式计算：

IVPI＝(10天累计发病数×1+8天累计瘫痪数×2+10天累计死亡数×3)/10天观察鸡只总数

判定标准：IVPI值最强接近3.0，最弱接近0；ICPI值越大，表明毒力越强。

最终筛选获得一株鸽瘟强毒PPMV-1/BJ。

方案2：鸽瘟病毒弱毒株(PPMV-1/BJ-C株)的构建

本发明在鸽瘟病毒反向遗传操作平台基础上，将病毒F蛋白裂解位点突变为LaSota相应序列，构建和拯救毒力致弱的重组病毒。

1、鸽瘟病毒PPMV-1/BJ株全基因组序列测定

根据NCBI公布的NDV基因序列，设计相关引物(由华大基因公司合成)用于扩增鸽瘟病毒PPMV-1/BJ株基因序列。常规方法提取RNA，反转录，用相关引物(表1)进行PCR扩增，最终获得PPMV-1/BJ株的全基因组序列。电泳图见图1。

表1 PPMV-1全基因组扩增用引物

2、鸽瘟病毒PPMV-1/BJ株致弱毒株构建

反向遗传操作技术一般是指通过构建病毒的基因组cDNA克隆，在培养细胞或易感宿主中重新“复活”病毒，通过基因插入或缺失等方法修饰病毒的基因组序列，以此来进行病毒的功能基因组研究和新型疫苗的研制。本发明中的NDV的拯救过程是将构建的全基因组cDNA克隆(转录载体)和分别含NP、P和L基因的辅助质粒(表达载体)共转染细胞，在辅助质粒提供有关酶的作用下，cDNA克隆进行转录和各基因的表达，最终组装成有感染性的病毒粒子，然后通过接种鸡胚来大量扩增病毒而获得拯救的NDV。拯救出的NDV基因组最终来源于cDNA克隆。

2.1 表达T7RNA聚合酶的细胞系的构建

根据NCBI公布的NDV T7 RNA聚合酶基因序列，设计引物，上游引物含Xho I酶切位点，下游引物含Xba I酶切切位点。以制备的DNA作为模板进行PCR扩增。经PCR扩增，双酶切，胶回收，连接至真核表达载体pCI-neo中(Biomed品牌，购自北京金瑞科生物技术有限公司)，转化DH5α感受态细胞中，提质粒。阳性质粒送测序，获得重组质粒PCI-T7。将PCI-T7重组质粒，按磷酸钙转染试剂盒说明书的要求转染DFl细胞。细胞连续传代20代，提取RNA，用DNA酶处理后反转录，用引物T7-F/T7-R扩增，鉴定T7 RNA聚合酶的表达情况。经鉴定，构建的细胞系可稳定传代，并且转染获得的T7 RNA聚合酶基因可持续表达。将构建的稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系命名为DF1-T7。

2.2 全长cDNA克隆载体的构建

根据测得的PPMV-1/BJ株全基因组序列，用Oligo 7软件分析其酶切位点。将全基因组分成7段，分段连接到经过改造的载体上。引物由上海生工生物工程有限公司合成。对F基因进行点突变，突变为La Sota株对应位点序列，阳性质粒测序正确后保存。

2.3 辅助质粒的构建

分别在鸽瘟病毒PPMV-1/BJ株NP、P和L基因的上下游引入酶切位点，PCR扩增后酶切，连接经酶处理过的PCI-neo载体(Biomed品牌，购自北京金瑞科生物技术有限公司)，测序后保存，分别命名为PCI-NP、PCI-P和PCI-L。所用引物由华大基因公司合成。

2.4 病毒拯救及鉴定

待DF1-T7细胞生长至80％-90％时，于6孔板内每孔加入重组病毒作用1h。将上述2.2中构建的全长cDNA质粒(全长cDNA克隆载体)与3种辅助质粒按比例混合，根据转染试剂操作说明转染接种DF1-T7细胞；72小时收取细胞液，反复冻融后取上清液接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔，3d后收取尿囊液以NDV阳性血清进行病毒的HA/HI试验。对HI阳性病毒提取RNA扩增其F基因和含有遗传标记部位的基因片段进行测序鉴定并分析，鉴定。得到拯救病毒PPMV-1/BJ-C。

3、突变株的主要生物学特性和遗传稳定性测定

拯救病毒PPMV-1/BJ-C株经3代鸡胚有限稀释法纯化，分别进行SPF鸡胚扩繁，测定两种病毒对1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)、最小致死量，致死鸡胚平均死亡时间(MDT)、鸡胚半数感染量(EID₅₀)和对CEF半数感染量(TCID₅₀)。将拯救病毒株在鸡胚连续传代20次，收集每一代的尿囊液检测HA，并用5、10、15、20代的鸡胚尿囊液进行RT-PCR扩增病毒F基因和遗传标记位点，并测序后评价其遗传稳定性。

方案3：鸽瘟病毒(PPMV-1/BJ-C株)灭活疫苗制备

1、毒种

1.1 毒种标准

1.1.1 病毒含量

将毒种用灭菌生理盐水按1：10000倍稀释，经尿囊腔接种于9～11日龄发育良好的鸡胚，0.1ml/胚。置孵化箱中培养并观察96小时后，将死亡鸡胚放4℃收获尿囊液。将病毒滴度在8log2及以上的尿囊液作为灭活疫苗的病毒。

1.1.2 对雏鸽的毒力

分离的亲本毒株BJ-C株对雏鸽有一定的毒力，接种后能使多数雏鸽发病，通过感染性克隆平台构建的致弱毒株PPMV-1/BJ-C株对雏鸽比较安全，注射10^5.0ELD₅₀/只，接种后14日内接种鸽无异常临床症状。

1.1.3 免疫原性

将毒种接种SPF鸡胚，收获感染鸡胚尿囊液，按本规程制备灭活疫苗。用健康雏鸽(PCR抗原检测均为阴性)20只，每只皮下接种疫苗0.2ml，同时设对照雏鸽10只。免疫后21日同样剂量加强免疫一次。二免后21日，对所有组别的动物用鸽新城疫强毒株进行攻毒，每只鸽子肌肉注射0.5ml(含10^5.0ELD₅₀)。攻毒后连续观察14日，对照组应全部发病，免疫组鸽子应全部保护。

1.1.4 纯净

按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，应符合规定。

1.1.5 特异性

收集尿囊液制备成病毒悬液，与等量鸽新城疫病毒特异性阳性血清混匀，置于37℃中和1小时，接种于已长成良好单层的96孔CEF细胞培养板，每孔0.1ml，接种6孔，同时设正常细胞对照和病毒对照各2孔。置37℃、含5％CO₂培养箱中培养，观察5日，病毒对照孔应出现CPE，正常细胞对照孔和病毒中和孔均应不产生CPE。

1.1.6 毒种代数：5～10代。

1.1.7 毒种保存：-70℃以下保存，保存期暂定为24个月。

1.2 强毒标准

1.2.1 病毒含量：每毫升病毒含量应≥10^5.0ELD₅₀。

1.2.2 特异性：按步骤1.1.5进行，应符合规定。

1.2.3 毒力

用鸽瘟病毒BJ-C株进行鸽子人工感染试验，将10只ND抗体阴性的30～40日龄幼鸽随机分为2组，感染组和对照组。感染组肌肉注射0.2ml病毒液，对照组注射生理盐水。接种后连续观察14日，接种鸽子应全部发病，且至少死亡1只。

1.2.4 纯净

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.5 毒种代次：5～10代。

1.2.6 毒种保存：冻干毒种置于-70℃以下保存，保存期为60个月；病毒液-20℃以下保存，保存期为2个月。

2、鸽瘟病毒弱毒PPMV-1/BJ-C株灭活疫苗制备

2.1 生产用毒种制备

2.1.1 毒种繁殖：将已成长单层的CEF细胞弃去生长液，按2％的量接种毒种，加入含2％新生牛血清的CEF细胞培养液，置37℃培养24小时，当75％以上细胞出现病变时收获，置于-80℃反复冻融3次，定量分装，注明收获日期、毒种代数等，冷冻保存。

2.1.2 毒种鉴定：按步骤1.2.4、1.2.5进行，应符合规定。符合上述标准的毒种作为生产用毒种。

2.1.3 毒种保存置-40℃以下保存，保存期为6个月。

2.1.4 毒种传代应不超过5代。

2.2 制苗用毒液的繁殖

2.2.1 接种：将毒种用灭菌生理盐水按1：10000倍稀释，经尿囊腔接种于9～11日龄发育良好的鸡胚，0.1ml/胚。

2.2.2 收获：置于孵化箱中培养并观察96小时后，每日检查鸡胚是否出现死亡，将死亡鸡胚放4℃收获尿囊液。将病毒滴度在8log2及以上的尿囊液作为灭活疫苗的病毒。

2.3 灭活：选择终浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的甲醛溶液和终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％的二乙烯亚胺(BEI)对PPMV-1/BJ-C株进行灭活比较试验，试验结果表明，0.03％-0.05％的BEI在34℃-37℃条件下96小时后可将PPMV-1/BJ-C株完全灭活，而且，试验结果表明BEI对细胞的损伤较小；PPMV-1/BJ-C株抗原加入0.3％的甲醛溶液，经37℃灭活48小时亦可达到完全灭活病毒的目的；但甲醛具有强刺激性，如果疫苗中残留游离的BEI进入动物机体，会产生不良反应。因而最终确定用0.03％-0.05％的BEI在34℃-37℃条件下灭活PPMV-1/BJ-C株96小时后，加入0.2％硫代硫酸钠终止灭活。灭活后抗原于2～8℃保存，保存时间应不超过1个月。

2.4 半成品检验

2.4.1 灭活检验：取灭活后的病毒液，按5％的比例接种已单层的CEF细胞，吸附1小时后，换成含2％新生牛血清的细胞维持液，置37℃培养观察5日。收获细胞培养物，冻融，在CEF细胞上再盲传1次，应无细胞病变。

2.4.2 无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

2.5 疫苗制备：取灭菌的氢氧化铝佐剂1份，加检验合格的灭活鸽瘟病毒抗原1份，即按体积比1:1混合，低速搅拌30-60分钟，乳化，制成疫苗。

2.6 分装：将疫苗无菌定量分装于灭菌疫苗瓶中，加盖密封，粘贴标签。置于2-8℃保存。

3、灭活疫苗

3.1 性状外观：均匀乳剂。

剂型：呈水包油包水剂型(w/o/w)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不破乳，并且水相析出应不超过0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

3.2 装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

3.3 无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

3.4 安全检验：用30～40日龄未经任何免疫试验雏鸽(PCR抗原检测为阴性)10只，每只肌肉或皮下注射疫苗1.0ml，连续观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

3.5 效力检验：采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

血清学方法：用30～40日龄健康雏鸽(PCR抗原检测均为阴性)110只，10只各肌肉或皮下注射疫苗20μl，另10只作对照，同条件饲养。接种后21～28日，所有鸽子采血分离血清，进行HI抗体效价测定。对照组抗体效价应不超过1：4，免疫组抗体效价几何平均值不低于1：16。

免疫攻毒法：用30～40日龄健康鸽(PCR抗原检测均为阴性)110只，10只各肌肉或皮下注射疫苗20μl，另10只作对照，同条件饲养。接种后21～28日，每只鸽子各肌肉注射新城疫病毒强毒株0.5ml(10^5.0ELD₅₀)，观察14日。对照组应全部发病；免疫组应至少保护7只。

(1)鸽瘟PCR抗原检测法

1)试验材料病毒RNA提取相关试剂、反转录试剂盒、待检样品、鸽瘟病毒(PPMV-1/BJ株)；

上游引物：NDV-F:5′-TCCAAAGTGCAAGGGCTCCAAA-3′

下游引物：NDV-R:5′-GTGGCTCTGATCGAGGGTAT-3′

2)RNA提取及反转录cDNA制备：病毒全基因组RNA的提取完RNA后依据反转录试剂盒说明书立即进行反转录。所制备的cDNA测定浓度后保存于-20℃。

3)PCR扩增与电泳

以提取的cDNA为模板，扩增NDV F基因的序列，20μl反应体系如下：

PCR的反应条件为：95℃预变性，3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；最终72℃延伸7min；4℃保存。

取适量上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，同时用DL2000 Marker作为分子量参照，以检测所得扩增片段的长度。然后利用凝胶成像系统记录并保存所得扩增结果。

4)结果判定：当阳性对照产物出现大小约为1662bp的扩增条带、阴性对照产物未出现目的条带时，试验结果成立。待检血清出现大小约为1662bp的扩增条带时判为阳性，否则判为阴性。

(2)发病判定标准：出现第①项和第②项任意一项或两项即判为发病。

①精神沉郁、食欲减退或下痢；

②明显神经症状(共济失调、观星状等)或死亡。

(3)攻毒保护判定标准同时未出现①和②项判为保护；

①精神沉郁、食欲减退或下痢；

②明显神经症状(共济失调、观星状等)或死亡。

4、作用与用途：用于预防鸽瘟。免疫期为6个月。

5、用法与用量：肌肉或颈部皮下注射，0.2ml/只。7日龄以上雏鸽免疫；在首免后21天加强免疫1次。

6、注意事项：

6.1 本品仅用于接种健康鸽子。

6.2 本品严禁冻结。若出现破损、异物或破乳分层等异常现象，切勿使用。

6.3 用时摇匀，并使疫苗恢复至室温。疫苗启封后，限当日用完。

6.4 在保存及运输过程中，禁忌阳光照射和高热。

6.5 用过的疫苗瓶、剩余疫苗、器具等污物必须作无害化处理。

7、贮藏与有效期：2-8℃保存，有效期为12个月。

8、规格：(1)100ml/瓶；(2)250ml/瓶；(3)500ml/瓶。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1鸽瘟病毒弱毒株PPMV-1/BJ-C的获得

通过对鸽瘟流行病学调查，筛选出一株鸽瘟病毒强毒株PPMV-1/BJ。并借助感染性克隆平台构建了其致弱毒株PPMV-1/BJ-C株(保藏编号为CGMCC No.19989)，并进行鸽瘟病毒(PPMV-1/BJ-C株)灭活疫苗研究。采用SPF鸡胚培养，经病毒含量测定、甲醛溶液灭活后。然后进行安全性、免疫保护及稳定性等质控指标的检测，结果表明，该疫苗具有安全、有效的特点，对目前流行毒株起到很好的防护作用。具体方法如下：

1、生产用鸡胚

所用SPF鸡胚均由北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司提供。

2、生产用毒种

2.1 毒种来源：保藏编号为CGMCC No.19989的鸽瘟病毒弱毒株PPMV-1/BJ-C。

2.2 生产用毒种标准及制定依据

2.2.1 病毒含量

2.2.2 对雏鸽的毒力：分离的亲本毒株PPMV-1/BJ株对雏鸽有一定的毒力，接种后能使多数雏鸽发病，通过感染性克隆平台构建的致弱毒株PPMV-1/BJ-C株对雏鸽比较安全，注射10^5.0ELD₅₀/只，接种后14日内接种鸽无异常临床症状。

2.2.3 免疫原性：按照本方法制备鸽瘟病毒(PPMV-1/BJ-C株)灭活疫苗。用30～40日龄健康鸽(PCR抗原检测均为阴性)40只分为8组，其中每两组各分别肌肉接种疫苗0.1ml、0.2ml和0.3ml，另设两组对照。免疫后21日同样剂量加强免疫一次。二免后21日，用鸽瘟病毒强毒株PPMV-1/BJ株攻毒，每只鸽肌肉注射0.2ml。攻毒后连续观察14日。结果显示，免疫0.1ml的鸽有1只发病，其余4只无发病症状，免疫0.2ml和0.3ml的鸽均无发病症状，全部保护，对照组鸽子全部发病。所以该灭活疫苗的最佳免疫剂量定为0.2ml，推荐免疫剂量0.3ml。

2.2.4 纯净性：参考现行《中国兽药典》中的相应标准执行。

2.2.5 特异性：采用与阳性血清中和法鉴定种毒的特异性。

2.3 基础种子批和生产种子批的建立：将原始毒种分别在DF1细胞连续传1-30代，结果表明，生产用毒种的各代次病毒含量稳定。为保证生产用毒种有较高的病毒滴度，因此，确定了生产用毒种病毒含量标准为≥10^5.0ELD₅₀，毒种代次限定为基础种子10-20代，基础种子传5代以内为生产用种子。

2.4 稳定性：将原始毒种分别在SPF鸡胚连续传1-30代，选取5、10、20和30代4个代次病毒分别制成灭活疫苗进行免疫原性测定。结果免疫各代病毒的制备的疫苗的雏鸽均能抵抗强毒的攻击，表明各代次生产毒种均具有良好的免疫原性。

2.5 毒种保存期的确定：一般生产用种毒使用湿毒比较方便，因此也考察了湿毒在-35℃条件下的保存期。定期对湿毒和冻干毒种进行病毒含量测定。结果对湿毒连续测定6个月，病毒滴度没有明显下降，冻干毒目前测定到24个月，病毒含量无明显变化，我们继续考察其保存期。

3、效检用强毒

湿毒的保存期为-20℃保存2个月，冻干毒和冻干菌-70℃保存48个月。

4、主要生产工艺：采用SPF鸡胚培养鸽瘟病毒PPMV-1/BJ-C株，经抗原含量测定、BIE灭活，灭活检验合格后，与氢氧化铝佐剂混合制成灭活疫苗。

4.1、制苗用病毒液的制备：HA效价低于1:128者弃去。同时无菌检验为阴性。

4.2 灭活：将鸽瘟病毒以不同BEI溶液、不同时间和不同温度进行灭活。结果表明：0.05％的BEI在37℃条件下灭活鸽瘟病毒弱毒PPMV-1/BJ-C株96小时后，加入0.2％硫代硫酸钠终止灭活。

4.3 半成品检验质量标准：无菌检验采用现行兽药典中的方法。灭活检验采用接种细胞并盲传1代的方法。病毒含量测定采用常规方法进行，根据免疫原性结果和实验室制品效力试验结果，半成品病毒含量标准定为：每毫升病毒含量应≥10^5.0TCID₅₀。

4.4 疫苗制备：将检验合格的灭活病毒抗原后。加入氢氧化铝佐剂(美国赛默飞公司)混合均匀。

具体为：取灭菌的氢氧化铝佐剂1份，加检验合格的灭活鸽瘟病毒抗原1份，即按体积比1:1混合，低速搅拌30-60分钟，乳化后制得。

5 成品检验质量标准

5.1 性状：为水包油包水型佐剂疫苗常规参数。装量检查和无菌检验，均按现行《中国兽药典》的要求进行。

5.2 疫苗的安全性试验：将3批实验室制品(批号为202004、202005和202006)分别进行了安全性试验。试验内容包括疫苗对雏鸽1次单剂量接种、单剂量重复接种和超剂量接种的安全试验，对成年鸽及雏鸽的安全性。试验结果表明接种3批疫苗后，动物均不产生下痢或神经症状等，无异常反应，不影响试验动物的免疫学功能和生产性能。

5.2 疫苗的效力试验：将3批实验室制品(批号为202004、202005和202006)分别进行效力试验。效力试验内容包括雏鸽(30～40日龄)免疫攻毒、抗体消长规律、免疫期、对鸽子的被动免疫保护等。

5.2.1 对雏鸽免疫攻毒保护效力实验：用鸽瘟病毒强毒株PPMV-1/BJ攻毒，结果表明，0.1ml剂量组攻毒保护率为80％，0.2ml剂量组和0.3ml剂量组攻毒保护率100％，对照组攻毒后全部发病，说明鸽瘟病毒灭活疫苗对雏鸽的最小免疫剂量为0.2ml，保护效果较好。为保证免疫效果，将每只份剂量定为0.2ml/只。

5.2.2 抗体消长规律和免疫期的确定：免疫攻毒试验结果表明，疫苗免疫后中和抗体的趋势，免疫后7日产生抗体、随后抗体持续上升，至60日抗体达到高峰。

5.2.4 对鸽子的被动免疫研究免疫母鸽所产雏鸽获得的母源抗体在7日龄时，对强毒的攻击保护率为100％；在20日龄时母源抗体下降，保护率为40％。说明鸽瘟病毒弱毒株(PPMV-1/BJ-C)灭活疫苗对鸽子的被动免疫力达到20日龄。

5.3 疫苗保存期(稳定性)试验：将疫苗放置在2-8℃条件下，不同时间取出后进行免疫攻毒保护试验，试验结果表明，鸽瘟病毒弱毒(PPMV-1/BJ-C株)灭活疫苗在2-8℃条件可保存24个月，各项指标符合质量标准要求，故将其保存期定为2～8℃保存18个月，可确保疫苗在保存期内的有效性。

5.4 疫苗与同类制品的对比试验

选用多个厂家生产的灭活疫苗产品进行效力、安全比较试验，结果表明，被检测疫苗对雏鸽均是安全的。但鸽瘟病毒弱毒(PPMV-1/BJ-C株)灭活疫苗能同时保护流行NDV毒株攻击。

本发明的鸽瘟病毒弱毒PPMV-1/BJ-C灭活疫苗与山东绿都生物科技有限公司生产的“鸡新城疫灭活疫苗(LaSota株)”分别皮下注射接种20日龄健康易感鸽(HI抗体不高于1:8)各10只，1ml//只，另取10只20日龄健康易感鸽不接种，作为阴性对照。隔离器饲养，观察14天，每天记录鸽的发病和死亡情况；于免疫前和免疫后7日、14日、21日、30日、2月、4月、6月时采血分离血清，检测免疫鸽血清中PPMV-1血凝抑制效价(HI)；攻毒后第3天和第5天，分别采集各免疫组鸡的喉拭子和泄殖腔拭子接胚，检测排毒情况。结果表明，免疫两种疫苗后2个月左右，免疫鸽血清中PPMV-1血凝抑制效价均达到高峰，至免疫后6个月仍维持在较高水平。且6个月检测期内，二者的PPMV-1HI抗体水平差异不显著。

免疫攻毒后，PPMV-1/BJ-C组、LaSota组均没有鸡只死亡，阴性对照组鸡全部死亡。排毒试验显示，PPMV-1/BJ-C组没有出现排毒，而LaSota免疫组在第五天在喉气管及泄殖腔均有排毒(表2和表3)。

表2 免疫后抗体效价测定表

表3 免疫效力实验结果表

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株及其应用

<130> KHP201110475.1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15192

<212> DNA

<213> 鸽瘟病毒(Pigeon Paramyxo Virus)

<400> 1

accaaacaga gaatctgtga gttacggtaa aaggcgaata agcaatcgaa atcgcacggg 60

tagaaggtgt gaacctcgag tgcgaggccg agactcaagc ctgagggaac cttctgccgg 120

catgtcgtcc gtctttgacg aatatgagca gctcctcgct gctcagactc gccctaatgg 180

agctcacgga gggggagaga aaggtagcac tctaaaggtt gaggtcccag tattcactct 240

taacagtgat gatccagaag atagatggaa ttttgcggta ttctgtctcc ggattgctgt 300

tagcgaggat gccaacaaac cgctcaggca aggtgctctc atatctctct tatgctccca 360

ttctcaagtg atgagaaacc atgttgccct cgcggggaaa cagaatgagg ccacactggc 420

tgttcttgag atcgacagtt ttaccaacag tgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt 480

gtctgaagag agagcacaga gattcatggt gatagcagag tctctccccc gggcatgcag 540

taacagtact ccgttcgtta cagttggagt cgaaaatgat gtgccagaag atataactga 600

cactctggaa agaatcttat ctatccaggc tcaggtatgg gtcacagtag caaaagctat 660

gactgcgtat gagacagcag atgagtcaga aacaagaagg atcaataagt atatgcagca 720

gggtagagtc cagaagaagt acatcctcca tcccgtatgc aggagtgcaa ttcaactcac 780

aatcagacat tctctagcag tccgcatttt tttagttagt gagcttaaga gaggtcgcaa 840

tacggcaggt gggagctcca catattacaa cttagttggg gatgtagact catacataag 900

gaacaccgga cttactgcat tcttcctgac cctcaagtac ggaatcaata ccaagacatc 960

agcccttgca ctcagcagcc tcacaggtga tatccaaaaa atgaagcagc tcatgcgttt 1020

atatcggatg aaaggagaaa atgcaccgta catgacattg ctaggtgaca gtgaccagat 1080

gagcttcgca ccagctgaat atgcacaact ctattctttc gccatgggca tggcatcagt 1140

cttggataag ggaactggta aataccaatt tgccagagac ttcatgagta catcattctg 1200

gaggctcggg gtggaatatg cccaggctca ggggagcagc atcaacgaag atatggctgc 1260

tgagctgaaa ctaactccag cagcaaggag gggcctggca gttgctgccc aacgagtatc 1320

cgaggaaact ggcaatgcgg atattcctac tcaacaggct ggggtcctta ctgggctcag 1380

cgacaaaagt ccccgagctc cgcagggtgg accaagcagg ccgcaagggc aaccggacgc 1440

tggggatggg gagacccaat tcttggacct gatgagagca gtagcaaaca gcatgcgaga 1500

agcgccagat tctgcacaga gcaccattca tccggagcct ctcttaactc atgggccatc 1560

tcatgacaac gacaccgact gggggtactg atcgacagaa ttcagcccgc cctcacagga 1620

tcatcccaga ccatccgccg gaaccctccc caagctccac gacccaccga cccacacggc 1680

caaaccggca ggagcatccc tccgatctcc ccctcacccc cagccgcacg accccgcccg 1740

cctagagcaa cacgggcaca acccaatcca ccaacgatcc gtgcagaccc cagaagatta 1800

gaaaaaaata cgggtagaag agagatattc agagatcagg ataagtcacc aaggtctcta 1860

ctctcctctc tacccagtga actagggtga acatggcaac ttttactgat gctgagatag 1920

aggatatatt tgagaccagc gggactgtca ttgacagtat aattacggcc cagagcagac 1980

cagcagagac tgtcgggaag agcgcaatcc cgcaaggtaa aacaaaggtc ctgagcatag 2040

catgggagaa gcacgagagc atccagccat ctgctggcca agacacctcc aatcaacagg 2100

acaaaccaga caaacagcca tccgcatctg agcaggcgac cccacacaat gatcctctag 2160

ctgtacctaa agacccgctc cccacccagg cggcaggtga tgctggtgac acacagctca 2220

agaccggagc aagcaactct cttttgtcaa tgcttgacaa gctgagcaac aaatcatcta 2280

atgctaaaaa ggggccaagg tcgatccccc aggagggcca ccatcagtct ccggcccacc 2340

aacacgggaa tcatccgagc tgtggaaaca accaggaggg accgcagcac caagccaaag 2400

ctgctcctgg aagccggggc acagacgcga gcacagcata tcatggacaa tggaaggggt 2460

cacaactatc agctggtgca acccctcatg cgctccagtc agagcggagc caagacagta 2520

ctcctgtacc tgtggagcat gtccaacttc ctgtcgactt tgtgcaggcg atgatgtcta 2580

tgatggaggc gttatcacag aaggtaagta aaattgacta tcagctagac ctagtctcaa 2640

agcagacatc ctccatccct atgatgcgat ctgaaatcca acagcttaaa acatctgttg 2700

caatcatgga ggccaattta ggcatgatga aaattctaga ccctggttgc gccaacgttt 2760

cgtccttaag tgatctacga gcagttgctc gatcccatcc agttttagtt tcgggccccg 2820

gagacccatc cctttacgtg acacaaaggg gtgaaatgac actcaataag ctctcgcaac 2880

cggtacagca cccttctgag ttaattaaat ctgccatggt gagcgggccc gatatgggag 2940

tggagaagga cactgtccgt gcattaatca catcgcgccc gatgcatcca aactcctcgg 3000

ctaagctcct gagcaagttg gatgcagcca agtcgatcga agagatcagg aaggtcaagc 3060

gccttgcact gaatggttga cagccgtcac agctcatggc aggctcccgc ctcattagta 3120

tcacaaggaa tccttcccga accctccccc acagacccgc gctccaacag cccaagcaac 3180

gaccctctct cgcctctctc acttccccga gtgatcgtgc aactgcaata aatctaacgg 3240

cattagagat taagaaaaaa tacgggtaga atcgaagtac cctaactgtt aaaaaatgga 3300

ctcatctaga acaatcaggc tgcactttga tgctgcccta ccttccagca gcctgttagc 3360

attcccgatt gtcctacaag gcacgggcga tgggaagaag cgaatcaccc cacaatacag 3420

gatccagcgt cttgactcat ggacagacag caaagaagac tcagtattca tcaccaccta 3480

cggattcatc ttccaaattg ggaatgaaga ggtcactgtt ggcacgatca acgacaatcc 3540

cagacatgag ttactttcct cagcaatgct ctgcctagga agtgtgccga atgacggaga 3600

tcttgttgaa ctggcgaggg cctgcctcac catggtgata acttgcaaga aaagtgcaac 3660

taatactgaa agaatagtct tctcagtagt gcaggcacct cgagtgctgc aaagctgtat 3720

ggttgtggca aataagtact catcagtgaa tgcagtgaag cacgtgaaag cacccgagaa 3780

gatccctggg agcggaaccc tagagtataa agtgaatttc gtctccttga ccgtagtgcc 3840

gaggaatgat gtctacagga tcccaactgc agcattgaaa atctctggtt caagcctgta 3900

caacctcgcg ctcaatatca ctattgacgt ggaggtagac ccgaagagcc cgctagtaaa 3960

atctctttct aagtctgata gtggatacta tgctaatctg ttcttgcata tcggactcat 4020

gtctactgta gataagaggg gaaagaaagt tacatttgac aagatagaag aaaagataag 4080

gagactcaat ttatccgtcg ggctcagtga tgtactcgga ccttctgtgc ttgtgaaggc 4140

gaggggtgca cggactaagc tactggcacc ctttttctcc agcagcggga cggcctgcta 4200

tcctatagca aatgcctccc ctcaggttgc taagatactc tggagtcaaa ctgcgcacct 4260

gcgaagtgta aaagtcatca ttcaagctgg cacccaacgt gccgtcgcag tgaccgccga 4320

ccacgaggtc acctccacca agatagagaa gaggcacacc attgccaagt acaatccctt 4380

taagaagtaa gttgcatctc tgagactgcg agccacccac tttcccgaat catcacgaca 4440

ccagataacg atctatcctg attgcttata gtcaatttac ctgcccattt aattagaaaa 4500

aacacgggta gaagagtctg gatcccggcc ggcacatcca gagtgcaata tgggctccaa 4560

accccacatc aggatcccgg cacctctgac gctgatcact cgaatcactc tggtactgag 4620

ctgcatctgc tcgacgagct ctctcgatgg caggccactt gcagctgcgg ggattgtggt 4680

aacaggagat aaagcaatca atatatacac ctcatctcag acagggtcaa tcatagtcaa 4740

gttgctccca aatatgccca aggacaaaga ggcatgtgca aaagccccac tagaggcata 4800

caatagaaca ctgaccactt tactcacccc ccttggtgat tccatccgca ggatacaagg 4860

atctgtgtcc acatcaggag gaaggaggca gaagcgcttt ataggtgcca ttataggcag 4920

tgtagctctt ggggttgcga catcggcaca gataacagcg gctgcggcct taatacaagc 4980

taaccagaat gccgccaaca tcctccggct taaggagagc atcgctgcga ccaatgaagc 5040

tgtgcatgag gtcaccgacg gattatcgca actagcagtg gcaattggga agatgcaaca 5100

gtttgtaaac gaccaattta ataatacagc gcgagaattg gactgtataa aaatttcaca 5160

acaagtcggc atagaactca acttatacct aactgaactg actacagtgt tcgggccaca 5220

aatcacttcc cctgccctaa ctcagctaac catccaagcg ctttataatt tagctggcgg 5280

taacatggat tacctattga ctaaattagg tatagggaac aatcatctca gctcattaat 5340

aggcagtggc ttgatcacag gcaaccctat actgtatgac tcacagactc aactcttggg 5400

catccaggta aatttaccct cagtcgggaa ccttaataat atgcgtgcca cctacctgga 5460

aactttatct gtaagcacaa ccaaagggtt tgcctcagca cttgtcccga aggtagtgac 5520

acaagtcggc tctgtgatag aagaacttga cacctcatac tgtatagaat ctgatctgga 5580

tctatactgt acaaagatag tgacattccc tatgtctcca ggaatttatt cttgtctgag 5640

cggtaataca tcagcttgca tgtactcaaa gactgaaggc gcactcaata cgccatacat 5700

ggccctcaag ggctcagtca ttgccaattg caaaataaca acctgcagat gtgcagaccc 5760

cccaggtatc atatcgcaga actatggaga agctgtatct ctgatagata gacattcatg 5820

caatgtctta tcattagatg ggataaccct gaggctcagt ggggagtttg atgcaactta 5880

tcaaaagaat atctcaatac tagattctca agtcatcgtg acaggcaacc tcgatatatc 5940

aaccgagctt ggaaatgtca acaattcaat aagcaatgcc ctggacaggt tagcagaaag 6000

taatagcaaa ctagacaaag tcaatgtcaa attaaccagc acatctgctc tcattaccta 6060

tatcatccta accaccatat ctcttgtttt cggtgcactt agcttggttt tagcatgcta 6120

tctaatgtac aaacaaaagg cacagcaaaa gactttactg tggcttggga ataataccct 6180

cgatcagatg agagccacta caagaacatg aatgccgacg agatgcggat gtgtccccaa 6240

ttgtaacttg tgtgtcagtt ctgacaacct gttcaatgga agatttaaga aaaaactact 6300

ggatataagc aaccgaaaag caatacacgg gtagaacggt cggagaggcc atcctccaat 6360

cgggaaccag gctccacaac atccgttcta ccacattacc aatattagat tttagccatg 6420

gaccgtgcag tcagcaaagt tgcgctagag aatgaggaaa gagaagcgaa gagcacatgg 6480

cgcttggtct tccggatcgc agttttactt ttaacagtgg tgaccttagc tatctcagta 6540

gctgccttgg tatacagcat gggggccagt acgccccgcg acctcgtagg cgtatcgact 6600

atggtctcta aggtggaaga caagattacg tctttaatca gttcaaatca agatgtagta 6660

gacagaatat acaaacaagt agcccttgaa tttccgctgg cactactaaa tactgaatct 6720

ataattatga atgcaataac gtctctctct catcagatta atggagctgc aaacaatagc 6780

aggtgtggag cgcctattca tgacccagat tatatcgggg ggataggtaa agaactcata 6840

gtagacgaca tcagtggtgc cacatcattc tacccatctg cataccaaga acacctgaat 6900

tttatcccag cgcccactac aggatcaggc tgcactcgga taccctcatt tgatatgagt 6960

gctacccact actgttatac tcataacgtg atactgtctg gctgcataga tcactcacat 7020

tcacatcaat acttagcact tggtgtgctt cggacatctg caacagggag ggtattcttt 7080

tctactctac gttccatcaa cttagatgac aaccaaaatc ggaagtcctg cagtgtgagt 7140

gcaactcctc taggttgtga tatattgtgc tctaaagtca cggaggctga agaagaggat 7200

tataagtcag ttacccccac atcaatggtg cacggaaggt taggttttga cggtcagtac 7260

catgagaagg acttagacac cacagtctta tttaaggatt gggtagcaaa ttacccggga 7320

gttgggagcg gatcttttat tgatgaccgt gtctggttcc cagtttacgg agggttgaaa 7380

cctaattcgc ccagcgacac tgcacaagaa gggaaatatg taatatacaa gcgctataat 7440

aacacatgcc ctgatggaca ggaatatcaa atccggatgg ctaagtcttc atacaagcct 7500

gggcgattcg gtggaaagcg tgtacagcaa gccatcttat ctatcaaagt gtcgacatct 7560

ttgggtgagg acccggtgct gactgttcca cccaatacaa ttacactcat gggggccgaa 7620

ggaagagttc tcacggtagg gacgtctcac ttcttgtatc aacgagggtc ttcatatttc 7680

tcccctgcct tattatatcc tatgacagtc cataacaaaa cagctactct tcataatcct 7740

tatacattta atgccttcac ccggccaggt agtgtccctt gtcaggcatc agcaagatgc 7800

cccaacccgt gcatcactgg agtctacact gatccgtacc ctttggtctt ctataggaac 7860

cacaccttgc ggggggtatt cgggacaatg cttgatgatg aacaaacaag actcaacccc 7920

gtatctgcag tattcgacag catatctcgc agtcgtgtaa cccgagtaag ttcaagcagc 7980

accaaggcag catacacgac atcaacatgc ttcaaagttg tcaagaccaa taaagtttat 8040

tgcctcagca ttgccgaaat atccaacacc ctatttgggg aattcagaat cgttcctttg 8100

ttagttgaga ttctaaagga tgaaagggtt taagaagcta gatctggtca gttgagtcaa 8160

atgtaggatg gctgggagaa tgatgctgca tcacctatct ctcgcaacac caaggatcga 8220

attggatatc aatgcaagct tgaatcccat accatcaggc aggcacaacc cgacaatgct 8280

gatgtgatca gtctgaattc tgtctgcagt cgctttatta agaaaaaata tggatggtag 8340

tgaaatacaa gggaaaacaa catacaaagg ccaacacggg taggaaatgg cgagctccgg 8400

tcctgaaaga gcagagcatc ggatcatcct accagagtca catctatcct ctccattagt 8460

caagcacaaa ctgctctact actggaaatt aactgggtta ccactccctg atgagtgcga 8520

ctttgatcat ctcattatca gcaggcaatg gaagaaaata cttgaatctg ccactcctga 8580

cattgagaga atgataaaac tcggacgggc agtgcatcag actctcaatc acaattccaa 8640

gataaccgga gtactccatc ccaggtgttt agaagaactg tcaagtattg aggtccctga 8700

ttcaaccaac aaatttcgga agatcgaaaa gaagatccaa attcacaaca ctaggtatgg 8760

agacctgttc gccaagctgt gcacgcacgt tgaaaagaaa ttgctgggat catcccgatc 8820

tagcaaagtc ccacgatcag aggagttcaa cagcatccgt acagatccag cattctggtt 8880

tcactcaaag tggtccaggg ccaagtttgc atggctccat ataaaacaga tccagaggca 8940

tctgattgta gcagcaagaa caaggtctgc agtcagcaag ttagtgacat tgacccataa 9000

gttaggccaa gtcttcgtta ctcctgagct tgtcattgtg actcatacag atgagaacaa 9060

gttcacgtgc ctcacccaag aacttgtatt gatgtatgca gatatgatgg agggcaggga 9120

catggtcaac ataatatcat ccacagcgac acatctcaaa aatctatcag agaaaattga 9180

tgatattctg cggttagtag atgccctgtc aaaggatttg ggcaatcaag tctatgatgt 9240

cgtagcattg atggagggat ttgcatatgg tgctgttcag ctgcttgagc cgtcaggtac 9300

attcgcagga gatttctttg cattcaacct acaggagctc aaaaacactc taatagaact 9360

tctcccaaat gatgtagcgg agtcagtaac tcatgcaatc gcctccatat tctctggctt 9420

agaacagaat caagcagctg agatgttatg cttgttgcgt ttgtggggtc acccactact 9480

tgagtcccgt agtgcagcga aagcagtcag gagtcagatg tgcgcaccta aaatggtaga 9540

ctttgatatg atcctccaag tattatcctt ctttaaggga acaatcatca atggatacag 9600

gaagaagaat tcaggtgtgt ggccacgagt caagatagat acgatatatg ggaaggtcat 9660

tgggcagctg catgctgact cagcagagat ttcacatgat gtcatgttga gagagtacaa 9720

aagtttatct gcccttgaat ttgagccatg tatagactat gaccctgtta ccaatctaag 9780

tatgttctta aaagacaagg caatcgcaca tccgaaagat aactggctcg cctcatttag 9840

gcggaacctt ctctctgagg accagaagaa acaggtaaag gaggcaacct caactaaccg 9900

cctcttgata gagtttttag aatcaaatga ttttgatcca tataaggaga tggaatactt 9960

gacaaccctt gagtacctaa gagacgacag tgtggcggtc tcgtactcac tcaaggagaa 10020

ggaggtgaag gttaatgggc ggattttcgc taagttgaca aagagattaa gaaactgcca 10080

ggtaatggca gaagggattc tagccgacca gattgcacct tttttccagg ggaatggagt 10140

cattcaagat agtatatcct tgactaagag catgttagca atgagtcaac tgtcttttaa 10200

cagcaatagg aaacgtatca ctgactgcaa ggaaagggtt tcctcaaatc gcaatcatga 10260

tccgaagagc aagaatcgtc gaagagttgc cacttttatc acgactgact tacagaagta 10320

ttgccttaat tggagatatc agacagttaa gctattcgcc catgctatca atcagctgat 10380

gggcctacct cacttctttg agtggattca tctcagacta atggacacta caatgtttgt 10440

aggagaccct ttcaatcctc caagtgaccc gacagactgt gatctatcaa gagtcccaaa 10500

tgatgacata tacattgtca gtgctagagg gggcattgag ggattatgcc agaagctatg 10560

gacaatgatc tcaattgctg caatccagct tgctgccgca agatcgcatt gtcgagttgc 10620

ctgcatggta caaggtgaca atcaggtaat agctgtaaca agagaagtaa gatcagacga 10680

ctccccagat atagtgttga cacagttgca tcaagctagt gataactttt tcaaagaact 10740

gattcatgtc aatcatctga ttggtcacaa cctgaaagat cgtgaaacca tcaggtcaga 10800

cacattcttc atatacagca agcggatatt caaggacgga gcaatactca gtcaggtcct 10860

taaaaactca tctaaattgg tgttaatatc aggagacctt agtgaaaaca ctgtaatgtc 10920

ctgtgccaac attgcatcca ctgtagcacg gctatgtgag aacgggcttc ctaaggattt 10980

ctgttattat ttaaattact taatgagttg tgtgcagaca tactttgatt ccgaattttc 11040

tattactcac agctcgcagc cggattccaa ccagtcttgg attgaggaca tctcttttgt 11100

acactcgtat gtcttaaccc ctgcccagct aggaggattg agtaaccttc aatactcaag 11160

gctctataca aggaatattg gtgacccggg gactactgct tttgcagaag tcaagcgatt 11220

agaagcagtg gggttgctga gtcctagcat tatgactaat atcttaacta ggccacctgg 11280

caatggagac tgggccagcc tgtgcaatga tccttactca tttaattttg agactgttgc 11340

aagccccaat attgtcctta agaagcacac acagaaagtc ttatttgaga cttgttcaaa 11400

tcctttatta tcaggggtac acacagagga caatgaagca gaagagaagg cactggctga 11460

attcctactc aatcaagaag cggttcaccc gcgtgtcgca catgccatca tggaggcaag 11520

ctctgtgggt aggagaaagc aaattcaagg acttgttgac actacaaaca ctgtaattaa 11580

gattgcgctg accaggagac ccctcggtat caagaggctg acacggataa ttaattactc 11640

gagcatgcat gcaatgttat tcagagatga tgttttcttg cctaatagat ccaaccaccc 11700

attagtttcg tctgctatgt gctcgctgac gctagcagac tatgcccgga acagaagctg 11760

gtcaccttta acagggggta ggaaaatact gggtgtatcc aaccctgata ccatagaact 11820

tgtggaggga gagatcctta gcgtcagtgg gggatgcaca aaatgtgaca gcggagatga 11880

acagtttact tggtttcatc ttccaagcaa tatagagctg actgatgaca ccagcaagaa 11940

tcccccgatg agagtgccgt atcttgggtc aaagactcaa gagagaagag ctgcctcact 12000

cgcgaaaata gctcacatgt cgccccacgt gaaggcagca ctaagggcat catccgtgtt 12060

aatctgggct tatggagaca acgaagtaaa ttggattgct gctcttaaaa ttgccaggtc 12120

tcgatgtaac ataagttcag agtatcttcg gctattgtcg cccctgccca cagctgggaa 12180

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tagagtatca ccttacatcc acatatccaa tgattcccaa agactattta ctgaagaagg 12300

agtcaaagag gggaatgtgg tttatcaaca aattatgctc ctgggcctat ctctaattga 12360

atcacttttc ccaatgacaa caactaagac gtatgatgag atcacattac acctccacag 12420

taagtttagc tgctgtatca gggaagcacc tgttgctgtc cccttcgagt tactcgggat 12480

ggcaccagaa ttaaggacgg taacctcaaa taagttcatg tatgatccta gccctatatc 12540

agagagagat tttgcgagac ttgacctggc catcttcaag agttacgagc ttaatttaga 12600

gtcatattcc acaatggagc taatgaacat tctttcaata tctagcggga agttgattgg 12660

gcagtccgtg gtttcctatg atgaagatac ttctataaag aatgatgcta taatagtgta 12720

tgataacaca cgaaattgga ttagtgaagc ccagaattca gatgtggttc gcctattcga 12780

gtatgcagcg cttgaagtgc tcctcgactg ttcttatcag ctctactatc tgagagtgag 12840

aggtctcaac aacatcgtct tatacatgag tgacttatac aagaatatgc cagggatttt 12900

actctctaat attgcagcta caatttctca ccccatcatt cactcaaggt tgaatgcagt 12960

aggtctggtc ggtcatgacg gttcgcacca gcttgcagac acagatttca ttgaaatgtc 13020

tgcgaaattg ttagtctctt gcactcgacg tgtggtctca ggcttatacg cggggaataa 13080

gtacgatctg ttgttcccat ctgttctgga tgataacctg agtgagaaga tgtttcagct 13140

gatttctcgg ttatgctgtc tgtatacagt actttttgct acaacaagag agatcccaaa 13200

aataaggggc ctgtcagcgg aagagaaatg ctcagtactc actgagtact tattgtcaga 13260

tgctgtgaag ccattgctta agtccgaaca agtgagctct attatgtctc ccaacataat 13320

tacgtttcca gccaatctat attacatgtc taggaagagc cttaatttaa tcagggaacg 13380

agaggacaga gatgccattc tggcgttgtt gttcccccag gaaccactgc tcgagcttcg 13440

tccagtacaa gacattggtg ctcaagtgag agatcctttc actcaacaac ctgcatcatt 13500

catacaagag ctagacctga atgccccggc aaggtatgat gcatttactc ttagcgaggt 13560

ccgccccgag cacacactgc cgaacccaga agaggattac ttagtacggt atttgttcag 13620

agggataggg actgcttcat cttcttggta taaggtatct catcttcttt ctatccctga 13680

ggtcagatgt gcaaggcatg ggaactcctt atacttggcg gaaggaagtg gagccatcat 13740

gagtattctt gaactgcata taccacacga gaccatctat tacaatacac ttttctcgaa 13800

tgagatgaac cccccacagc gacatttcgg accaacccca acacagttcc taaattcagt 13860

cgtttatagg aatctacaag cagaagtgcc atgcaaagat gggtttgtcc aggagttctg 13920

cccgttatgg agagagaacg cagaagaaag cgacctgacc tcggataagg cagtgggata 13980

tatcacatct gtggtgccct acaggtctgt ttcattacta cattgtgaca ttgaaattcc 14040

tccagggtcc aatcagagcc tgttagatca actggccact aatttatctt tgattgccat 14100

gcactccgta agagagggtg gagtggtgat catcaaagta ctgtatgtaa tgggatacta 14160

ctttcatcta ctcatgaact tgtttactcc gtgttccaca aaaggatata ttctctctaa 14220

tggctatgcc tgtagagggg atatggagtg ttacctggta tttgtcatgg gctatttagg 14280

cgggcctaca ttcgtgaacg aagtagtgag gatggcaaaa actctgatac aacagcacgg 14340

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tcgtgtaata gacatcctat ccagcccgtt accgagacta atgaagtatt tgagagataa 14460

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tttagtgggc acattgacag atatgactca ggtggctcag atcattgcca gccacattga 14580

cacagtcatt cgatctgtga tttacatgga ggctgaaggt gaccttgctg acacagtgtt 14640

cttgtttact ccttacaatc tctctacaga cggtaagaag agaacatcac tcaaacagtg 14700

cacgaggcag atcttagagg tcactatatt gggtctcaga gccagagatc tcaataaagt 14760

aggtgatata ataggcttga tactcagagg tatggtttct ctggaggacc tcatcccgct 14820

aaggacatat ttgaagcaca gtacatgccc gaagtatttg aaggcagtgc tcggaattac 14880

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agggcaatca catgttagtg aactatcttc ttaatcaatt gccccctcat tgatgtgata 15060

gtaccgtatt agaaaaaagt taaattctaa tcctctgaag ctcgtattcg gattcaagca 15120

attatctaaa agcagaagtg aacgtggttg tccttaatta tagtcccatc gttcaccaaa 15180

tctttgtttg gt 15192

Claims

1.鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株，其特征在于，保藏号为CGMCC No.19989。

2.权利要求1所述鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株的以下任一应用：

1)用于制备疫苗；

3.一种组合物，其特征在于，其包含灭活后的权利要求1所述鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株以及药学上可接受的载体。

4.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含权利要求3所述的组合物。

5.一种疫苗组合物，其特征在于，其包含权利要求4所述的免疫原性组合物。

6.鸽瘟病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)培养权利要求1所述鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株，得到病毒液；

(2)将收获的病毒液用二乙烯亚胺灭活；

(3)将灭活后的病毒液与佐剂混合，即得。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将鸽副黏病毒1型PPMV-1/BJ-C株接种至SPF鸡胚进行培养；和/或步骤(3)所述佐剂为氢氧化铝佐剂。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将收获的病毒液采用0.02％～0.03％的二乙烯亚胺在32℃～37℃条件下灭活48～96小时后，加入0.2％硫代硫酸钠终止灭活。

9.权利要求5所述疫苗组合物或者按照权利要求6-8任一项所述方法制备的鸽瘟病毒灭活疫苗在制备治疗或预防鸽瘟病毒感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病以患病鸽出现下痢、神经症状为特征。