CN110713987B - 一种重组基因vii型新城疫病毒毒株及其疫苗组合物、制备方法及应用 - Google Patents

一种重组基因vii型新城疫病毒毒株及其疫苗组合物、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株，该rN7a株为保藏号为CCTCC NO:V201545的新城疫病毒N7a株的P蛋白基因序列替换为SEQ ID No.1所示的P蛋白基因序列。本发明的rN7a株培养后病毒滴度高、HA效价高。本发明还公开了包含该rN7a株或其培养物灭活抗原的疫苗组合物，本发明的疫苗组合物能能对多种毒株提供完全保护。

Description

一种重组基因VII型新城疫病毒毒株及其疫苗组合物、制备方 法及应用
技术领域
本发明涉及一种重组基因VII型新城疫病毒毒株、其疫苗组合物、制备方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
新城疫(Newcastle disease,ND)又称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟，是禽副粘病毒9种血清型中的血清I型禽副粘病毒(即新城疫病毒，NDV)引起的鸡和火鸡等多种禽类急性、高度接触性传染病，常呈败血症症状。新城疫是一种严重的高度传染性、病毒性疾病，其在全球许多国家分布广泛并造成了重大的经济损失；同时，临床上新城疫病毒与其它呼吸道病原体协同致病的现象也较为常见，是家禽行业的一个主要威胁。
从近十年来新城疫的流行特点来看，临床上所分离到的新城疫强毒大多数属于基因VII型，然而不同新城疫病毒分离株之间的毒力差异较大，在鸡胚上的生长特性差异明显。在制备新的新城疫疫苗过程中，常用新城疫病毒拯救方法对新城疫病毒毒株进行致弱，从而开发出与临床流行毒株相匹配的、免疫原性良好的疫苗组合物。但是拯救后的毒株在实际大规模生产时发现生产效率低，在病毒含量、血凝活性的提高上还需要进一步改善。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株，其中，所述rN7a株为保藏号为CCTCC NO:V201545 的新城疫病毒N7a株的P蛋白基因序列经替换为SEQ ID No.1所示的P 蛋白基因序列后得到的弱毒株。
基因VII型新城疫毒株N7a株的保藏号为CCTCC No.V201545，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年10月19日，参见中国专利CN107287168A。
本发明的重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株具有扩增后病毒滴度高、HA效价高的优点，是优良的疫苗制备用毒株。
本发明还涉及一种预防和/或治疗新城疫病毒感染的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述的重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株或其培养物的抗原，以及药学上可以接受的载体，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株N7a-FJ-02株或其培养物的抗原选自灭活全病毒抗原、活的减毒全病毒抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或/和活载体抗原。
本发明的疫苗组合物能对多种新城疫病毒毒株提供完全保护，具有广谱的免疫原性。本发明的疫苗组合物制备时重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株稀释倍数高，大幅度地降低了生产成本、提高了经济效益；免疫动物后产生的HI抗体效价较快且较高，可完全保护多个临床野毒株及标准强毒株的攻击。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株N7a-FJ-02株或其培养物的抗原为灭活全病毒抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株的培养物为1～50代次的培养物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株的培养物为1～40代次的培养物。
作为本发明的一种更优选的实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株的培养物为1～35 代次的培养物。
作为本发明的进一步优选的实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株的培养物为1～30 代次的培养物。
作为本发明的进一步优选的实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株的培养物为1～25 代次的培养物。
作为本发明的进一步优选的实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株的培养物为1～20 代次的培养物。
作为本发明的进一步优选的实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株的培养物1～16代次的培养物。
本发明的重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株培养物可以选自 1代次培养物、2代次培养物、3代次培养物、4代次培养物、5代次培养物、6代次培养物、7代次培养物、8代次培养物、9代次培养物、10 代次培养物、11代次培养物、12代次培养物、13代次培养物、14代次培养物、15代次培养物、16代次培养物、20代次培养物、25代次培养物、30代次培养物、35代次培养物、40代次培养物、45代次培养物、 50代次培养物。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株或其培养物灭活全病毒抗原含量为灭活前≥108.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株或其培养物灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml～109.0EID50/0.1ml。
本发明的重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株或其培养物灭活全病毒抗原含量可以选自108.0EID50/0.1ml、108.1EID50/0.1ml、 108.2EID50/0.1ml、108.3EID50/0.1ml、108.4EID50/0.1ml、108.5EID50/0.1ml、 108.6EID50/0.1ml、108.7EID50/0.1ml、108.8EID50/0.1ml、108.9EID50/0.1ml、 109.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种更优选的实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株或其培养物灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。
作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括(1)氢氧化铝、皂苷、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，或(3) 水包油乳剂、油包水乳剂或水包油包水乳剂，所述佐剂的浓度范围是从 10％到70％V/V，优选为30％到60％V/V，更有选为60％V/V。
作为本发明的一种优选实施方式，所述佐剂包括(1)皂苷QuilA； (2)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物与糖或多元醇的聚链烯基醚交联产物卡波姆；或(3)所述佐剂包括基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油的乳剂，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或葵烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/葵酸酯)，甘油三(辛酸酯/葵酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯、油与乳化剂一起使用形成乳剂，乳化剂优选非离子表面活性剂；特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121。
优选地，所用佐剂为白油佐剂，制备油包水乳剂。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述佐剂的浓度为10％～70％V/V。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述佐剂的浓度为30％～60％V/V。
作为本发明的进一步优选的实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述佐剂的浓度为60％V/V。
本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物，例如，本发明的组合物还可以包含试剂，如药物、免疫刺激剂(如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子CM-CSF、巨噬细胞集落刺激因子M-CSF和白介素2(IL2)、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂、防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述的疫苗组合物还包括以下抗原的一种或多种：禽流感病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、禽减蛋综合征病毒抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原、禽腺病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性喉气管炎病毒抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述的疫苗组合物还包括以下抗原的一种或多种：禽流感病毒灭活抗原或病毒样颗粒抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原、禽减蛋综合征病毒灭活抗原或亚单位抗原、鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原、禽腺病毒灭活抗原或亚单位抗原。
本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗新城疫病毒导致的疾病的药物中的应用。
本发明的疫苗组合物在免疫后14天至多第21天即提供了对多种毒株的完全保护。
本发明还涉及一种制备所述的重组基因VII型新城疫病毒弱毒株 rN7a株的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)扩增所述SEQ ID No.1 所示的P蛋白基因；步骤(2)扩增所述基因VII型新城疫病毒弱毒株 N7a株基因组中P蛋白基因的下游序列；步骤(3)连接所述步骤(1) 中扩增的P蛋白基因与所述步骤(2)中扩增的N7a株基因组中P蛋白基因的下游序列，扩增后，导入质粒，得到重组质粒；步骤(4)将所述步骤(3)中所述重组质粒和含N7a株全长cDNA序列的质粒分别酶切，连接获得重组载体；以及步骤(5)将所述步骤(4)获得的重组载体、与表达N7a株NP蛋白的质粒、N7a株P蛋白的质粒、N7a株L蛋白的质粒共转染BHK-21细胞，拯救出所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株。
本发明用生物工程手段将基因VII型新城疫病毒弱毒株N7a株的P 蛋白基因序列进行置换，获得重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a 株，该毒株增殖特性良好，不仅具有较好的血凝活性，还可获得较高的病毒含量；用该毒株或其培养物制备疫苗时稀释倍数较大，节省生产成本，更适合于疫苗的大规模生产，特别地免疫动物后HI抗体效价产生较快且较高，可完全保护多个临床野毒株及标准强毒株的攻击。
本发明还提供了一种新城疫病毒P蛋白，由如SEQ ID No.1所示的 DNA序列或其简并序列编码。
本发明的新城疫病毒P蛋白在置换了N7a株的P蛋白后使得该毒株扩增的病毒滴度高、HA效价增高，改善了疫苗毒株的增殖特性和血凝活性。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
“新城疫病毒”属于ssRNA病毒，有包膜，包膜为双层结构膜，由宿主细胞外膜的脂类与病毒糖蛋白结合衍生而来。包膜表面有长12～ 15nm的刺突，具有血凝素、神经氨酸酶和溶血素。病毒的中心是ssRNA 分子与附在其上的蛋白质衣壳粒，缠绕成螺旋对称的核衣壳，直径约 18nm。所有的NDV都含有6种病毒特异性结构蛋白(L、NP、P、HN、 F、M)。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。
术语“P蛋白”为基因VII型新城疫病毒磷蛋白(Phosphorprotein)，基因全长约1450bp，蛋白分子量为50-55kD，由395个氨基酸组成。
术语“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能发生微小的变异。
术语“疫苗组合物”指含有基因VII型新城疫病毒免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对基因VII型新城疫病毒的免疫反应。所述疫苗组合物包括免疫量的基因VII型新城疫病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗、活载体疫苗。
术语“灭活疫苗”又称失活疫苗，指用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗，如通过甲醛溶液、或β-丙内酯、或 BEI等处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。如用本发明的弱毒株rN7a株可通过灭活的方法制备成灭活疫苗。裂解型疫苗可用醚处理后由病毒包膜制备得到。
术语“治疗有效量”是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除新城疫病毒抗原之外的其它成分，不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine，如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，或(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成。尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油的乳剂，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或葵烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/葵酸酯)，甘油三(辛酸酯/葵酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照 Hunter等，1995，“The theoryand Practical Application of Adjuvants” (Steward-Tull，D.E.S主编)John Wileyand Sons，NY，51-94；Todd 等，Vaccine，1997,15,564-570)。特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联，这些化合物被称作卡波姆。
术语“预防”指通过其与基因VII型新城疫病毒相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟，术语“治疗”指通过与基因VII型新城疫病毒先关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到PBS缓冲液(0.02mol/L，pH值7.4)按此配方进行配制：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调pH7.4，定容1L，但不限于此；化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1基因VII型新城疫病毒的分离和鉴定
1.1新城疫病毒的分离
从河南、湖南等多地养殖场采集具有新城疫典型症状的发病鸡的呼吸道分泌物及气囊组织，加入含青霉素-链霉素双抗的PBS缓冲液研磨，将研磨液经1000转/分钟离心10分钟，取上清接种9-11日龄鸡胚，0.1ml/胚，石蜡封口后置37℃培养箱培养120小时。逐日观察鸡胚死亡情况，24小时内死亡鸡胚弃去，24～120小时死亡鸡胚置于 2～8℃冰箱1小时后收获尿囊液；120小时未死亡鸡胚，收获尿囊液，将收获的120小时未死亡鸡胚尿囊液按上述方法盲传2代，若未出现死亡鸡胚，判为新城疫阴性。
死亡鸡胚收获尿囊液，分别测定对鸡红细胞的血凝效价，取血凝效价＞1:16的尿囊液，与已知新城疫病毒阳性血清(购自中国兽医药品监察所)进行血凝抑制试验，其血凝活性能被抑制的判为新城疫病毒阳性。上述病料共分离到9株新城疫病毒株，分别命名为HN-03 株、HN-07株、HB-2株、HuN-01株、HuN-03株、FJ-02株、FJ-05 株、GD-05株、GD-09株。
1.2病毒纯化
取1.1分离的9株病毒株，分别用无菌PBS缓冲液进行106、107、 108、109倍稀释，每个稀释度分别经尿囊腔接种9-11日龄鸡胚，0.1ml/ 胚，石蜡封口后置37℃培养箱培养120小时。逐日观察鸡胚死亡情况， 24小时死亡鸡胚弃去，收获每株病毒出现最高稀释度的死亡鸡胚尿囊液。按上述方法将每株病毒纯化3次，最后1次纯化收获的尿囊液即为纯化病毒液，置-70℃以下保存。
1.3基因型分析
根据已报道的F基因序列，设计F基因引物F：GCCGAATTCCCG AATCATCACGACGCTTAA、R：GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTC GTAC，分别扩增1.2纯化的9株病毒株的F基因。扩增出的PCR片段克隆入pEasy-blunt vector进行测序，用邻接法分别构建遗传进化树，并进行基因分型，结果：共分离到5株基因VII型新城疫病毒株 (HN-07株、HuN-01株、HuN-03株、FJ-02株、GD-05株)，另外有3株基因II型病毒株、1株基因I型病毒株。
1.4基因VII型新城疫病毒HA效价及病毒含量测定
将5株基因VII型(HN-07、HuN-01、HuN-03、FJ-02、GD-05) 纯化病毒分别按现行《中国兽药典》附录方法测定血凝效价，并进行病毒含量测定。
病毒含量测定方法：取5株纯化病毒收获的尿囊液，分别用无菌 PBS缓冲液进行107、108、109、1010倍稀释，每个稀释度经尿囊腔接种10日龄鸡胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，0.1ml/胚，置37℃培养 120小时；判定结果：48小时前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出置2～8℃，至120小时取出所有活胚，48～120小时死亡与120小时存活的鸡胚，逐胚测定红细胞HA效价，HA效价≥1∶128者判为感染，计算病毒含量(EID50)。鸡新城疫病毒VII型各株病毒含量见表1。结果显示：5株临床毒株的HA效价为1∶128～ 1∶1024、病毒含量为105.4EID50/0.1ml～107.0EID50/0.1ml。
表1 5株基因VII型临床分离株血凝效价及病毒含量测定结果
基因VII型毒株名称 HA效价 病毒含量(lgEID50/0.1ml)
HN-07 1∶512 5.9
HuN-01 1∶128 5.8
HuN-03 1∶256 5.4
FJ-02 1∶1024 7.0
GD-05 1∶128 6.8
为研究P蛋白基因对病毒增殖特性的影响，将不同毒株的P蛋白基因替换实验室前期构建的基因VII型新城疫病毒弱毒株N7a株P蛋白基因，比较替换后不同重组毒株的病毒含量、血凝活性，并对其免疫性进行研究。
实施例2重组基因VII型新城疫病毒毒株的构建及鉴定
2.1构建
引物设计：设计引物对1、2、3，以已经构建的基因VII新城疫弱毒株N7a株为骨架，将N7a株的P基因替换成不同毒株的P基因。
2.1.1实施例1.3中分离到的5个VII型毒株P蛋白基因扩增
反转录各株新城疫病毒基因组RNA，分别构建5个基因VII型临床毒株HN-07株、HuN-01株、HuN-03株、FJ-02株、GD-05株的cDNA 克隆。引物对1、2、3的序列如下：
引物对1：
F1：5-GCgtcgacAACCCGCCCAGAGCCCAAG-3；SaII
R1：5-TCGCACAACTGCAACCAATCCAGCT-3；
引物对2：
F2：5-TCGCACAACTGCAACCAATCCAGCT-3；
R2：5-GAGTgccggcTTGAATGATGACTTT-3Nae I
引物对3：
F3：5-GCgtcgacAACCCGCCCAGAGCCCAAG-3；SaII
R3：5-GAGTgccggcTTGAATGATGACTTT-3Nae I
PCR扩增：模板提取与反转录，按试剂盒说明书方法，提取HN-07 株、HuN-01株、HuN-03株、FJ-02株、GD-05株核酸后反转录，将反转录产物作为模板。
PCR扩增体系50μl：premix 25μl，模板10μl，上下游引物各1μl，双蒸馏水13μl；扩增程序：95℃变性10分钟，95℃变性60秒，55℃退火30秒，72℃延伸120秒，最后72℃延伸10分钟。扩增后的产物为反转录产物。
各毒株P蛋白基因的扩增：以反转录产物为模板，用引物对1按上述方法进行扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，结果于约 1500bp出现目的条带，并用胶回收试剂盒回收。
2.1.2基因VII型新城疫弱毒株N7a株P蛋白基因的下游序列的扩增
以构建的含基因VII型新城疫弱毒株N7a株全长cDNA序列的质粒pCMVTNT-FL-N7a为模板，用引物对2按2.1.1中方法进行扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，结果于约1000bp出现目的条带，并用胶回收试剂盒回收。
2.1.3含不同毒株P蛋白基因和N7a株P蛋白基因的下游序列的 pMD-18-T重组载体的构建
将2.1.1中获得的各毒株P蛋白基因分别与2.1.2中获得的基因 VII型新城疫弱毒株N7a株P蛋白基因的下游序列进行连接，将约 1500bp与约1000bp的扩增产物作为模板，用引物对3按上述方法进行扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，结果在约2500bp出现目的条带，用胶回收试剂盒回收目的条带。
将约2500bp产物与pMD-18-T载体进行连接(PCR扩增产物1μl， pMD-18-T载体1μl，H2O 3μl，连接液5μl，37℃连接2小时)，连接产物转化DH5α载体后进行蓝白斑筛选。挑选白色重组菌接种含 50μg/ml氨苄青霉素的Lb培养基进行培养。收获菌液，用质粒提取试剂盒提取质粒，送大连宝生物公司进行测序分析鉴定5个质粒。测序结果鉴定均正确，与目的基因序列均吻合。
2.1.4含不同毒株P基因和N7a株cDNA序列的重组pCMVTNT- FL-N7a质粒的构建
将实施例2.1.3中测序结果鉴定正确的pMD-18-T重组质粒及含 N7a株全长cDNA序列的质粒pCMVTNT-FL-N7a分别用SaI I与 Nae I酶进行酶切。酶切产物分别用0.5％琼脂糖进行电泳。用胶回收试剂盒分别回收含有各毒株P基因的序列及质粒pCMVTNT- FL-N7a。将回收产物用DNA连接试剂盒进行连接。分别构建含有 HN-07株、HuN-01株、HuN-03株、FJ-02株、GD-05株P基因的 pCMVTNT-FL-N7a-HN-07、pCMVTNT-FL-N7a-HuN-01、pCMVTNT- FL-N7a-HuN-03、pCMVTNT-FL-N7a-FJ-02、pCMVTNT-FL-N7a-GD -05质粒。
2.1.5病毒拯救
将构建的pCMVTNT-FL-N7a-HN-07、pCMVTNT-FL-N7a- HuN-01、pCMVTNT-FL-N7a-HuN-03、pCMVTNT-FL-N7a-FJ-02、 pCMVTNT-FL-N7a-GD-05质粒分别与表达N7a株NP蛋白的质粒、N7a 株P蛋白的质粒、N7a株L蛋白的质粒即pCI-NP、pCI-P、pCI-L共转染BHK-21细胞，方法如下：将BHK-21细胞接种6孔板，待细胞长至80％～90％单层时，弃培养基，用PBS缓冲液轻洗3次，用Opti-MEM 培养基培养。将构建的重组质粒、pCI-NP、pCI-P、pCI-L用转染试剂
Figure GDA0003973473930000131
以2∶2∶1∶1比例共转染BHK-21细胞，6小时后用PBS轻洗3次后，加入含1μg/ml TPCK-trypsin的Opti-MEM培养基，混匀后继续孵育72～96小时，收获培养液及细胞，反复冻融3 次后离心，取上清接种10日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，置37℃孵化器孵化，每日照蛋检查1～2次，选接种后72～120小时死亡与120小时存活的鸡胚，置4℃冰箱24小时，无菌收获鸡胚尿囊液。按此方法传2代，收获的尿囊液即为重组基因VII型新城疫病毒弱毒株，进行血凝检验和RT-PCR检验。
2.2鉴定
2.2.1血凝检验
按现行《中国兽药典》附录方法测定收获的尿囊液对鸡红细胞的血凝效价，选择HA效价＞1∶4的尿囊液用于后续RT-PCR鉴定。结果：5个重组质粒转染后得到的接种鸡胚，传代后收获的尿囊液仅有 2份具有血凝活性，对应质粒分别为pCMVTNT-FL-N7a-HuN-01和pCMVTNT-FL-N7a-FJ-02，其HA效价分别为1∶256和1∶2048。将具有血凝活性的病毒液稀释为4单位抗原，按现行《中国兽药典》附录方法与新城疫病毒阳性血清进行血凝抑制试验，结果显示这2个毒株的血凝活性均可被抑制，其可与新城疫病毒阳性血清反应。
2.2.2RT-PCR检验
按实施例2.1提取基因组的方法对这两株基因组进行反转录，之后用引物对1进行扩增，扩增产物进行电泳，回收1500bp的目的条带后测序，结果显示：N7a株P基因分别替换为HuN-01株和FJ-02 株的P基因，将其分别命名为N7a-HuN-01和N7a-FJ-02株。
2.3重组基因VII型新城疫病毒毒株纯化后HA效价及病毒含量测定
将N7a株及获得的N7a-HuN-01株和N7a-FJ-02株按实施例1.2 的方法纯化3次，最后1次纯化收获的N7a-HuN-01株和N7a-FJ-02 株尿囊液。用无菌PBS缓冲液将收获N7a株、N7a-HuN-01株和 N7a-FJ-02株尿囊液按实施例1.4的方法进行HA效价检测及病毒含量测定。结果见表2，N7a-FJ-02株的病毒含量和HA效价显著高于N7a 株的，而N7a-HuN-01株的明显低于N7a株的。
3株病毒按现行《中国兽药典》附录进行鸡脑内致病指数(ICPI) 和对鸡胚的最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)，结果见表2，表明重组毒株均为弱毒株。
表2三株病毒株的HA效价、病毒含量和毒性测定结果
毒株名称 HA效价 病毒含量(lgEID50/0.1ml) ICPI MDT/MLD
N7a 1∶512 9.5 0.25 112
N7a-HuN-01 1∶128 5.5 0.22 106
N7a-FJ-02 1∶8192 10.6 0.27 108
2.4两株重组基因VII型新城疫病毒毒株纯化后鸡胚中和试验
将纯化后的N7a-HuN-01株和N7a-FJ-02株用无菌PBS缓冲液稀释至105.0EID50/0.1ml，分别与等量鸡新城疫病毒阳性血清混合，37℃中和1小时后，各经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.2ml/胚；同时各设5枚SPF鸡胚作未中和组进行对照，每胚经尿囊腔接种稀释后的病毒液0.1ml，置37℃培养120小时，测定所有胚的HA效价。结果， N7a-HuN-01株和N7a-FJ-02株两株病毒与新城疫病毒阳性血清作用后接种鸡胚培养120小时，鸡胚存活，且无血凝活性，而未中和组HA效价分别为1∶64与1∶512。
2.5两株重组基因VII型新城疫病毒毒株纯化后的纯净性检验
按现行《中国兽药典》方法对两株重组基因VII型新城疫病毒进行纯净性检验，结果，两株病毒均纯净，无外源病毒污染。
综上所述，以基因VII型弱毒株N7a株基因组为骨架并将其P蛋白基因分别置换为5个基因VII型新城疫病毒临床分离株的P蛋白基因，构建成功后仅2个重组毒株具有血凝活性。特别地，重组毒株N7a-FJ-02株的病毒含量和HA效价显著高于N7a株的，而重组毒株N7a-HuN-01株的明显低于N7a株的。将具有血凝活性的2个重组毒株分别制备成疫苗组合物通过动物试验进行进一步评价。
实施例3疫苗组合物的制备
3.1病毒液制备
将NDV N7a株及实施例2.3纯化后的N7a-HuN-01株、N7a-FJ-02 株分别用无菌PBS缓冲液按表3中的稀释倍数进行稀释至 105.5EID50/0.1ml，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚20枚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育。将接种后24～120小时之间死亡的胚及时放2～8℃，120小时时收混合样，取样测定各病毒液的HA效价和病毒含量，结果见表3。
表3各毒株培养后HA抗体效价及病毒含量测定结果
Figure GDA0003973473930000151
根据病毒含量，将各毒株分别稀释至108.0EID50/0.1ml、 109.0EID50/0.1ml(由于N7a-HuN-01株的病毒含量为105.7EID50/0.1ml，低于108.0EID50/0.1ml，即现有疫苗抗原含量的标准，弃掉)，用于制备疫苗组合物用抗原；由于重组毒株N7a-FJ-02株的稀释倍数较N7a株的高，同样原料的情况下大幅度节省生产原料，从而提高了生产效率及经济效益。
3.2灭活及检验
将病毒含量分别为108.0EID50/0.1ml的两种病毒液(N7a株、 N7a-FJ-02株)分别加入10％的甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为 0.1％，充分混匀后在37℃灭活16小时。将灭活后的抗原经无菌检验和灭活检验，均合格。
3.3乳化
按两种病毒液体积的4％加入吐温-80，配制水相，按1∶2(水相∶油相)的比例制成油乳剂灭活疫苗，分别作为疫苗组合物1～4，见表4。进行性状与无菌检验，均合格，用于免疫以进行效力评价。
表4各毒株培养后病毒含量测定结果及制备的疫苗组成成分
编号 抗原名称 抗原含量(lgEID50/0.1ml) 油佐剂(V/V)
疫苗1 N7a株 8.0 60％
疫苗2 N7a株 9.0 60％
疫苗3 N7a-FJ-02株 8.0 60％
疫苗4 N7a-FJ-02株 9.0 60％
实施例4疫苗组合物的攻毒试验及免疫原性评价
4.1效力检验
将实施例3中的疫苗1～4进行效力检验。取30日龄的SPF鸡200 只，10只/组，共20组，按表5分别经胸部肌肉注射免疫疫苗1～4，20μl/ 只，另设4组不免疫作对照组(注射无菌PBS缓冲液)。所有试验鸡均隔离饲养，各组免疫后21日分别采血分离血清，测定血清中HI抗体。同时各组分别经肌肉途径注射以下的攻毒毒株：基因VII型鸡新城疫病毒野毒株HN1101株(公开于中国专利CN105985966A)、PLK-N-06 株(公开于中国专利CN107287168A)、FJ-02株及标准强毒株F48E9 株(商购)，105.0ELD50/只，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表5，疫苗3～4免疫后21日产生的HI抗体效价显著(p＜0.05) 高于疫苗1～2，疫苗3～4其免疫后14日产生的HI抗体效价甚至与疫苗1～2免疫后21天产生的HI抗体效价相当或更高，同时也可确认在免疫后14天就能产生完全保护(本领域公认，新城疫HI抗体大于1∶64(log26)即可获得保护)。
经多种流行的强毒株攻毒后，与对照组相比，均可获得完全保护且保护效果无显著差异。表明疫苗3～4均能保护致死剂量的多种强毒攻击，疫苗含量不低于108.0EID50/0.1ml，即可提供对鸡群的完全保护；且免疫谱广，能对多种流行株和标准株进行完全保护。
表5疫苗1～4的效力检验结果
Figure GDA0003973473930000171
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数，x表示为平均数，s表示标准差。
4.2免疫原性评价
取实施例3制备的疫苗1、疫苗3分别经胸部肌肉注射免疫21～ 28日龄SPF鸡各10只，同时在10只SPF鸡上注射免疫无菌PBS缓冲液作为对照组，20μl/只，免前及免后7日、14日、21日、28日分别对各组鸡只均采血分离血清，进行HI抗体效价测定。结果见表6，疫苗3免疫后0～28日血清的HI效价上升趋势更明显，且明显高于疫苗1的。
表6疫苗1、3的免疫效果评价
Figure GDA0003973473930000181
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数，x表示为平均数，s表示标准差。
免后28日，用基因VII型野毒株HN1101株及标准强毒株F48E9 株分别滴鼻点眼按105.0EID50攻毒，攻毒后每天观察至14日，记录免疫组、对照组鸡只食欲、粪便、发病症状及有无死亡，在攻毒后第5 天分别采集免疫组每只鸡的喉头和泄殖腔拭子，将每只鸡的喉头和泄殖腔拭子分别混合后接胚，每个拭子接胚3枚进行病毒分离，鸡胚液 HA＞1∶16即判为病毒分离阳性，阴性样本盲传一代后再进行判定，详情见表6～表7。结果显示攻毒后免疫组均获得完全保护；各免疫组攻毒后观察14天，均未见发病或死亡；攻毒后第5天采集的喉头和泄殖腔棉拭子分别进行病毒分离、检测排毒，结果各免疫组均未见排毒，而对照组均具有典型的NDV临床症状且引发死亡。
表7疫苗1、3免疫后攻毒第5天喉头和泄殖腔的排毒情况
Figure GDA0003973473930000182
注：“﹣”表示喉头和泄殖腔排毒均为阴性。
综上所述，本发明制备的含重组毒株N7a-FJ-02株的疫苗组合物免疫动物后其血清可较快产生较高的HI效价，并且可完全保护多个流行毒株及标准株的攻击。
实施例5毒株P蛋白基因序列分析
N7a株P基因被替换为FJ-02株的P基因后获得重组基因VII型新城疫病毒弱毒株FJ-02-N7a株即rN7a株，rN7a株的病毒含量及HA 效价均显著高于N7a株。为对不同P蛋白基因引入后为何会产生较高的效价及较好的增殖特性进行进一步研究，将基因VII型临床分离株 FJ-02株与重组毒株用骨架即基因VII新城疫弱毒株N7a株的P蛋白基因序列分别扩增、测序并进行比对。
根据实施例1.3的结果，FJ-02株P蛋白基因序列如SEQ ID No.1 所示。按实施例1.3，将N7a株P蛋白基因序列进行扩增并测序，并与FJ-02株P蛋白基因序列进行比较，结果见表8，发现2株P蛋白基因序列如下位点均发生变异，这些位点变异后编码的P蛋白具有提高血凝活性和RNA病毒复制的效果。
表8 N7a株与FJ-02株P蛋白基因比较结果
Figure GDA0003973473930000191
实施例6重组毒株N7a-FJ-02株不同代次培养物制备疫苗组合物及其免疫原性评价
将实施例2.3纯化后的N7a-FJ-02株用无菌PBS缓冲液稀释至 105.5EID50/0.1ml，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚20枚，每胚0.1ml，置 37℃继续孵育。将接种后24～120小时死亡的胚及时放4℃，120小时时收混合样，将混合样标记为F1代，取样测定F1代病毒液的HA效价和病毒含量。根据F1代病毒液的病毒含量，将收获的病毒液稀释至105.5EID50/0.1ml，按上述方法进行培养和收获病毒液，将收获的病毒液标记为F2代，取样测定各病毒液的HA效价和病毒含量。依次按上述方法将病毒传代至F50，结果见表9， HA效价为1∶2048～1∶8192，病毒含量为109.5～1010.8EID50/0.1ml。
表9重组毒株N7a-FJ-02株不同代次病毒血凝效价和病毒含量测定结果
代次 HA效价 病毒含量(lgEID50/0.1ml)
1 1∶8192 10.8
8 1∶4096 10.3
16 1∶4096 10.5
20 1∶8192 10.8
25 1∶4096 10.8
30 1∶8192 10.3
35 1∶8192 9.6
40 1∶2048 9.5
50 1∶2048 9.5
根据病毒含量，分别将F1、F8、F16、F20、F25、F30、F35、F40、 F50稀释至108.0EID50/0.1ml，作为制备疫苗组合物的抗原。将制备的疫苗分别经实施例3中的疫苗3的检验方法进行效力检验。取30日龄的 SPF鸡90只，10只/组，共9组，按表10分别经胸部肌肉注射免疫不同代次病毒制备的疫苗，20μl/只，另设不免疫的攻毒对照组(注射无菌PBS 缓冲液)。所有试验鸡均隔离饲养，各组免疫后21日分别采血分离血清，测定血清中HI抗体效价。同时各组经肌肉途径分别注射基因VII 型新城疫病毒PLK-N-06株，105.0ELD50/只，进行攻毒，观察14日，记录发病、死亡及保护数，结果见表10，表明重组毒株N7a-FJ-02株1～ 50代培养物均能使鸡只免受新城疫病毒的攻击。
表10不同代次病毒免疫原性研究
Figure GDA0003973473930000211
注：HI抗体效价测定为免疫鸡抗体的几何平均数，x表示为平均数，s表示标准差。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 洛阳惠中生物技术有限公司
<120> 一种重组基因VII型新城疫病毒毒株及其疫苗组合物、制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1441
<212> DNA
<213> 新城疫病毒FJ-02株 (Newcastle disease virus, strain FJ-02)
<400> 1
acgggtagaa gagagacatc cagagaccag gacgggtcac caagttctct gttctccctt 60
ctacccagtg agttagggtg aagatggcta cttttacaga tgcggagata gatgacatat 120
ttgagaccag tgggactgtc attgacagca taattacggc ccagggtaaa tcagctgaga 180
ccgtcggaag gagcgcgatc ccgcagggca agaccaaagc tctaagcaca gcatgggaga 240
agcacgggag tatccagcca catgccagtc aggacgcccc tgaccaacaa gacagaacag 300
aaaaacagcc atccacacct gagcaggcga ccccacacaa caacccgccg atcacatcca 360
ctgaaccgcc ccccactcag gccgcaagcg agaccagcga cacacagctc aaaaccggag 420
caagcaactc ccttctgtcc atgctcgaca aattgagcaa taaatcgtct aatgctaaaa 480
agggcccatg gtcgggttct caagaagggc atcaccaatc tccggcccaa caacacggga 540
accagccgag ctatggaagc aaccagggaa gaccacagca ccaggccaag gccgtccctg 600
gaaaccgggg catagacgag aacacagcat atcatggaca acggaaggag tcacaaccat 660
cagctggtgc aacccctcat gcgccccagt cagggcagag ccaagacaat actcctgtac 720
ctgtggatcg tgtccagcta cctgccgact ttgcgcaggt gatgatgtct atgatggagg 780
cattatcaca gaaggtaagt aaagttgatc atcagctgga cctagtcttg aaacagacat 840
cctctattcc tatgatgcga tctgaaatcc aacagctcaa aacatctgtt gcgatcatgg 900
aagctaactt aggcatgatg aaaattctgg accctggttg tgctaacgtt tcatccttaa 960
gtgatctccg ggcagtagcc cgatcccgcc cagtcctagt ttcaggccct ggagacccat 1020
ctccttacgt gacacaaggg ggtgaaatga cgctcaataa actatcacaa ccggtgcagc 1080
acccttctga attgattaag tctgccactg caagcgggcc tgacatggga gtggagaagg 1140
acactgtccg cgcattaatc acctcacgcc cgatgcatcc aagctcctcg gctaagctcc 1200
tgagcaagct agatgcagcc aggtcaattg aagagatcag gaagatcaaa cgccttgcgc 1260
tgaatggttg atggccatca caactcataa caggctcctg tcacttcagc gtcacacgga 1320
atcccctggg ggccccccct tgcaaatcca cgcttcaaca ccccaaacaa cagccctctc 1380
tcaccccccc caatcccccg aatgatagca caactgcaac caatccagca gcattagaaa 1440
t 1441

Claims (21)

1.一种重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株，其中，所述rN7a株为保藏号为CCTCCNO:V201545的新城疫病毒N7a株的P蛋白基因序列经替换为SEQ ID No.1所示的P蛋白基因序列后得到的弱毒株。
2.一种预防VII型或IX型新城疫病毒感染的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求1所述的重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株以及药学上可以接受的载体。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株为1～50代次。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株为1～40代次。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株为1～35代次。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株为1～30代次。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株为1～25代次。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株为1～20代次。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株1～16代次。
10.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株为灭活全病毒抗原，含量为灭活前≥108.0EID50/0.1ml。
11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株为灭活全病毒抗原，含量为灭活前108.0EID50/0.1ml～109.0EID50/0.1ml。
12.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其中，所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株为灭活全病毒抗原，含量为灭活前108.0EID50/0.1ml。
13.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中，皂苷为QuilA、QS-21、GPI-0100。
15.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂的浓度为10％～70％V/V。
16.根据权利要求15所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂的浓度为30％～60％V/V。
17.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂的浓度为60％V/V。
18.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物还包括以下抗原的一种或多种：禽流感病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、禽减蛋综合征病毒抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原、禽腺病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性喉气管炎病毒抗原。
19.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物还包括以下抗原的一种或多种：禽流感病毒灭活抗原或病毒样颗粒抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原、禽减蛋综合征病毒灭活抗原或亚单位抗原、鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原、禽腺病毒灭活抗原或亚单位抗原。
20.根据权利要求2～19任一项所述的疫苗组合物在制备预防VII型或IX型新城疫病毒导致的疾病的药物中的应用。
21.一种制备权利要求1所述的重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株的方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)扩增所述SEQ ID No.1所示的P蛋白基因；
步骤(2)扩增所述新城疫病毒弱毒株N7a株基因组中P蛋白基因的下游序列，所用引物对如下：
F2：5-TCGCACAACTGCAACCAATCCAGCT-3；
R2：5-GAGTgccggcTTGAATGATGACTTT-3NaeI；
步骤(3)连接所述步骤(1)中扩增的P蛋白基因与所述步骤(2)中扩增的N7a株基因组中P蛋白基因的下游序列，扩增后，导入质粒，得到重组质粒；
步骤(4)将所述步骤(3)中所述重组质粒和含N7a株全长cDNA序列的质粒分别酶切，连接获得重组载体；
步骤(5)将所述步骤(4)获得的重组载体与表达N7a株NP蛋白的质粒、N7a株P蛋白的质粒、N7a株L蛋白的质粒共转染BHK-21细胞，拯救出所述重组基因VII型新城疫病毒弱毒株rN7a株。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3153577A1 (en) * 2015-10-09 2017-04-12 Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Hubei Academy of Agricultural Sciences Method for modification of heat resistance of newcastle disease virus and use thereof
CN107058244A (zh) * 2017-05-27 2017-08-18 山东信得科技股份有限公司 一种p蛋白突变构建的基因vii型新城疫病毒弱毒株
CN107287168A (zh) * 2016-03-31 2017-10-24 普莱柯生物工程股份有限公司 一种新城疫病毒拯救方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3153577A1 (en) * 2015-10-09 2017-04-12 Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Hubei Academy of Agricultural Sciences Method for modification of heat resistance of newcastle disease virus and use thereof
CN107287168A (zh) * 2016-03-31 2017-10-24 普莱柯生物工程股份有限公司 一种新城疫病毒拯救方法及其应用
CN107058244A (zh) * 2017-05-27 2017-08-18 山东信得科技股份有限公司 一种p蛋白突变构建的基因vii型新城疫病毒弱毒株

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A vaccine candidate of attenuated genotype VII Newcastle disease virus generated by reverse genetics;Hu et al.;《Vaccine》;20081216;第27卷(第6期);第904-910页 *
Identification and functional analysis of phosphorylation in Newcastle disease virus phosphoprotein;Qiu et al,;《Arch Virol》;20160509;第161卷(第8期);第2103-2116页 *
慢病毒介导的靶向NDV P基因shRNA对NDV复制的抑制作用;杨少华等;《病毒学报》;20160115;第32卷(第01期);第39-45页 *

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