CN110575539B

CN110575539B - 一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用

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Publication number: CN110575539B
Application number: CN201810597638.6A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 王同燕; 张盼涛; 孙进忠; 张许科
Original assignee: Puleco Nanjing Bioengineering Co ltd; Puleco Nanjing Biotechnology Co ltd; Luoyang Huizhong Biotech Co ltd
Current assignee: Luoyang Huizhong Biotech Co ltd; Puleco Nanjing Bioengineering Co ltd; Puleco Nanjing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-06-11
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2038-06-11
Also published as: CN110575539A

Abstract

本发明涉及一种禽流感病毒样颗粒疫苗，该禽流感病毒样颗粒疫苗包括免疫量的H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体，该禽流感病毒样颗粒抗原由H9亚型禽流感病毒HA、NA和牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白组装而成。本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗不仅具有较更高抗原含量的灭活疫苗更好的免疫效力，且具有广谱的免疫原性，能针对不同地域来源、不同亚群的H9亚型禽流感病毒进行完全保护。

Description

一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种提供对禽流感病毒进行保护的病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用。

背景技术

病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，是由病毒的结构蛋白组装而成的介于15nm～400nm的空心颗粒。VLPs的制备可以通过体外高效表达某种病毒的一种(或几种)结构蛋白，使其自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒。其方法主要是将病毒结构蛋白基因克隆到表达载体中，再将这些载体转入原核或真核细胞中进行表达。

禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科，流感病毒属，A型流感病毒。禽流感(Avian Influenza，AI)是由该病毒引起的禽类感染和疾病综合征。根据病原的致病力不同，分为高致病性和低致病性两种类型。低致病性禽流感病毒中以H9亚型分布最为广泛，最具危害性。H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)单病原感染往往不引起临床症状，但由于其易与其它病原共存，造成继发感染，从而引起肉鸡和蛋鸡的复合型呼吸道疾病甚至死亡、禽类产蛋下降及免疫抑制等，可对养禽业造成重大损失。另外，它可以跨越宿主障碍感染哺乳动物(包括人)。因此，控制H9亚型禽流感疫情的发生和流行具有重要的经济与公共卫生意义。

截止到目前，接种全病毒疫苗仍然是预防和控制禽流感病毒大流行的最有效手段。然而，禽流感病毒有着较强的进化变异能力，同时，由于疫苗的广泛使用，使野生病毒在免疫选择压力下朝着偏离疫苗株的方向加速进化，其结果会导致现有疫苗株对野毒株的免疫保护效力逐渐下降，并且禽流感病毒的变异速度远远大于现有变异株相应疫苗的研发、制备速度，因此禽流感疫苗的现在生产需要时时、不断更新，而针对流感病毒流行株相应疫苗的生产周期较长、生产成本较高，造成人力、物力的浪费，还有可能达不到理想的防控效果。

目前现有技术中文献研究发表的禽流感病毒样颗粒疫苗虽然能产生较好的免疫应答，但依然达不到商品化全病毒疫苗的免疫效果，且普遍表达效率较低，为此，急需一种免疫效果良好、安全、成本可控的禽流感病毒样颗粒疫苗。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗包括免疫量的H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体，所述禽流感病毒样颗粒抗原由H9亚型禽流感病毒HA、NA和牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白组装而成。

本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗其抗原为禽流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA、神经氨酸酶NA和牛免疫缺陷病毒结构蛋白Gag的自我装配体。其能提供良好的免疫原性，不仅能对H9亚型禽流感提供完全保护，且较相同含量的亚单位疫苗免疫效力大大提高，在免疫后第14日，较有更高抗原含量的灭活疫苗相比，具有更优的免疫效力。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述H9亚型禽流感病毒HA抗原蛋白由SEQ ID NO.1所示序列或其简并序列编码，所述H9亚型禽流感病毒NA抗原蛋白由SEQ ID NO.2所示序列或其简并序列编码，所述牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白由SEQ ID NO.3所示序列或其简并序列编码。

本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗具有抗原广谱性，能针对不同地域来源、不同亚群的H9亚型禽流感提供完全保护。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述H9亚型禽流感病毒HA抗原蛋白由SEQ ID NO.1所示序列编码，所述H9亚型禽流感病毒NA抗原蛋白由SEQ ID NO.2所示序列编码，所述牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白由SEQ ID NO.3所示序列编码。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价≥6log2。

本发明的H9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗中禽流感病毒样颗粒抗原含量HA效价可以任意选自6.0log2、6.1log2、6.2log2、6.3log2、6.4log2、6.5log2、6.6log2、6.7log2、6.8log2、6.9log2、7.0log2、7.1log2、7.2log2、7.3log2、7.4log2、7.5log2、7.6log2、7.7log2、7.8log2、7.9log2、8.0log2、8.1log2、8.2log2、8.3log2、8.4log2、8.5log2、8.6log2、8.7log2、8.8log2、8.9log2、9.0log2。

本发明的禽流感病毒样颗粒抗原免疫原性好，当抗原含量为HA效价6log2时，即能提供完全保护，在免疫后14天就能对鸡产生完全保护。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～9log2。

作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)白油，铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％V/V，更优选66％V/V。

作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)白油，铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；

优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；

优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其

特别是L121))；

优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；

优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；

优选地，所述佐剂为白油佐剂，其用于制备油包水乳剂；

所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％V/V，更优选66％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗还包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明的H9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗还可以进一步包含其他病原体或抗原组合，以制备抵抗包括H9亚型禽流感病毒感染的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述的禽流感病毒样颗粒疫苗还包括以下抗原的一种或多种：鸡新城疫病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、禽减蛋综合征病毒抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原、禽腺病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性喉气管炎病毒抗原。

本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗还可以包括一种或多种其他抗原，禽流感病毒样颗粒疫苗中的两种或多种抗原免疫原性之间不发生干扰，能提供各自独立的免疫保护。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗包括以下抗原的一种或多种：鸡新城疫病毒灭活抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原、禽减蛋综合征病毒灭活抗原或亚单位抗原、鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原、禽腺病毒灭活抗原或亚单位抗原。

作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述鸡新城疫病毒灭活抗原为N7a株灭活抗原、所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原为M41株灭活抗原、所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原为AV127株灭活抗原、所述禽减蛋综合征病毒亚单位抗原为禽减蛋综合征病毒Penton蛋白或Fiber蛋白、所述鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原为鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、所述禽腺病毒灭活抗原为FAV-HN株灭活抗原、所述禽腺病毒亚单位抗原为禽腺病毒Penton蛋白或Fiber-2蛋白。

新城疫病毒株(基因Ⅶ型)N7a株(Newcastle Disease Virus(genotypeⅦ),strain N7a)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201545，保藏日期为2015年10月19日，保藏地址为中国武汉·武汉大学,公开于中国专利申请CN107281479A。

鸡传染性支气管炎病毒M41购自中国兽医药品监察所、禽减蛋综合征病毒AV127株可以商业上获得。

禽腺病毒FAV-HN株(Fowl aviadenovirus,strain FAV-HN)，保藏号为：CCTCCNO.V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日,公开于中国专利申请CN107523556A。

作为本发明的一种进一步优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～9log2，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0～10^9.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0～10^7.0EID₅₀/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原含量为灭活前10^7.0～10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白含量为10.2μg/ml～40.8μg/ml，所述禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白含量为HA效价8log2～10log2，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16～1:128，所述禽腺病毒灭活抗原含量为灭活前10^5.0～10^8.0EID₅₀/0.1ml或10^5.0～10^8.0TCID₅₀/0.1ml，所述禽腺病毒Penton蛋白含量为AGP效价1:2～1:16，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:2～1:16。

本发明的H9亚型禽流感病毒样颗粒联合或复合疫苗中鸡新城疫病毒灭活抗原含量可以任意选自灭活前10^8.0EID₅₀/0.1ml、10^8.1EID₅₀/0.1ml、10^8.2EID₅₀/0.1ml、10^8.3EID₅₀/0.1ml、10^8.4EID₅₀/0.1ml、10^8.5EID₅₀/0.1ml、10^8.6EID₅₀/0.1ml、10^8.7EID₅₀/0.1ml、10^8.8EID₅₀/0.1ml、10^8.9EID₅₀/0.1ml、10^9.0EID₅₀/0.1ml；

鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量可以任意选自灭活前10^6.0EID₅₀/0.1ml、10^6.1EID₅₀/0.1ml、10^6.2EID₅₀/0.1ml、10^6.3EID₅₀/0.1ml、10^6.4EID₅₀/0.1ml、10^6.5EID₅₀/0.1ml、10^6.6EID₅₀/0.1ml、10^6.7EID₅₀/0.1ml、10^6.8EID₅₀/0.1ml、10^6.9EID₅₀/0.1ml、10^7.0EID₅₀/0.1ml；

禽减蛋综合征病毒灭活抗原含量可以任意选自灭活前10^7.0EID₅₀/0.1ml、10^7.1EID₅₀/0.1ml、10^7.2EID₅₀/0.1ml、10^7.3EID₅₀/0.1ml、10^7.4EID₅₀/0.1ml、10^7.5EID₅₀/0.1ml、10^7.6EID₅₀/0.1ml、10^7.7EID₅₀/0.1ml、10^7.8EID₅₀/0.1ml、10^7.9EID₅₀/0.1ml、10^8.0EID₅₀/0.1ml；

禽减蛋综合征病毒Penton蛋白含量可以任意选自10.2μg/ml、10.3μg/ml、10.4μg/ml、10.5μg/ml、10.6μg/ml、10.7μg/ml、10.8μg/ml、10.9μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml、26μg/ml、27μg/ml、28μg/ml、29μg/ml、30μg/ml、31μg/ml、32μg/ml、33μg/ml、34μg/ml、35μg/ml、36μg/ml、37μg/ml、38μg/ml、39μg/ml、40μg/ml、40.1μg/ml、40.2μg/ml、40.3μg/ml、40.4μg/ml、40.5μg/ml、40.6μg/ml、40.7μg/ml、40.8μg/ml；

禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白含量可以任意选自HA效价8log2、8.1log2、8.2log2、8.3log2、8.4log2、8.5log2、8.6log2、8.7log2、8.8log2、8.9log2、9.0log2、9.1log2、9.2log2、9.3log2、9.4log2、9.5log2、9.6log2、9.7log2、9.8log2、9.9log2、10log2；

所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量可以任意选自AGP效价1:16、1:32、1:64、1:128；

所述禽腺病毒灭活抗原含量可以任意选自灭活前10^5.0EID₅₀/0.1ml、10^5.5EID₅₀/0.1ml、10^6.0EID₅₀/0.1ml、10^6.5EID₅₀/0.1ml、10^7.0EID₅₀/0.1ml、10^7.5EID₅₀/0.1ml、10^8.0EID₅₀/0.1ml；或10^5.0TCID₅₀/0.1ml、10^5.5TCID₅₀/0.1ml、10^6.0TCID₅₀/0.1ml、10^6.5TCID₅₀/0.1ml、10^7.0TCID₅₀/0.1ml、10^7.5TCID₅₀/0.1ml、10^8.0TCID₅₀/0.1ml；

所述禽腺病毒Penton蛋白含量可以任意选自AGP效价1:2、1:4、1:8、1:16；

所述禽腺病毒Fiber-2蛋白含量可以任意选自AGP效价1:2、1:4、1:8、1:16。

作为本发明的一种进一步优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～9log2，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0EID₅₀/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原含量为灭活前10^7.0EID₅₀/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白含量为20μg/ml，所述禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白含量为HA效价9log2，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16，所述禽腺病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.5EID₅₀/0.1ml或10^6.5TCID₅₀/0.1ml，所述禽腺病毒Penton蛋白含量为AGP效价1:4，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:4。

本发明还提供一种制备所述的禽流感病毒样颗粒疫苗的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将所述H9亚型禽流感病毒HA、NA抗原蛋白基因、牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白基因克隆到同一载体，所述HA、NA和Gag抗原蛋白基因分别如序列SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.2、SEQ.ID No.3所示；步骤(2)将所述步骤(1)获得的载体经转化重组获得含有所述HA、NA、Gag抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒；步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述含有HA、NA、Gag抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9，串联表达所述HA、NA、Gag抗原蛋白；步骤(4)分离在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中、由所述HA、NA、Gag抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒抗原；以及步骤(5)在所述步骤(4)得到的禽流感病毒样颗粒抗原中加入佐剂，混匀得到所述禽流感病毒样颗粒疫苗。

本发明利用昆虫杆状病毒表达系统生产包含禽流感HA、NA和牛免疫缺陷病毒Gag的禽流感病毒样颗粒抗原，所述HA、NA、Gag抗原能在昆虫细胞内自我组装，呈病毒样颗粒粒子释放到细胞外培养基上清中，表达组装高效。

本发明利用昆虫杆状病毒表达系统生产禽流感病毒样颗粒，具有产量高，生产成本低，免疫原性好，无生物安全风险等优点，可对不同分支、不同地域来源H9亚型禽流感提供保护活性。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的制备方法中，所述步骤(1)中载体为pFastBac I；所述步骤(2)中所述的杆状病毒质粒为Bacmid。

本发明还涉及所述的禽流感病毒样颗粒疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的应用中，所述禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒。

本发明所述的制备预防和/或治疗禽流感病毒感染的药物的施用对象包括鸡。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

“病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。

本发明所用术语“疫苗”指含有禽流感病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对禽流感的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除禽流感病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。

术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

术语“联合疫苗”指本发明的H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原与至少一种不同病毒的抗原混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指本发明的H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原与细菌抗原制备的疫苗。

术语“预防和/或治疗”在涉及禽流感病毒感染时是指抑制禽流感病毒的复制、抑制禽流感病毒的传播或防止禽流感病毒在其宿主体内定居，以及减轻禽流感病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1H9亚型禽流感HA蛋白的表达

1、供体质粒的构建

由金唯智合成序列表SEQ.ID NO.1所示的HA基因，基因上游、下游分别加内切酶BamHI和HindIII酶切位点。将合成的HA基因通过BamHI和HindIII酶切，与同样酶切的pFastBacI载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确的质粒命名为pFastBac-HA。

2、重组Bacmid构建及鉴定

将2μl pFastBac-HA质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激45s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基37℃200rpm 4h，取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物经测序鉴定正确，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组杆粒的提取，命名为Bacmid-HA。

3、重组杆状病毒的获得及传代

将重组杆粒Bacmid–HA转染昆虫细胞sf9。参照

II Regent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为rBac-HA P1。

将对数生长期的sf9细胞按照0.9×10⁶cell/dish接种10cm细胞培养皿，待细胞完全贴壁后，将P1代重组杆状病毒按1:20-1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤按照1:100-200比例接种获得P3、P4代重组杆状病毒。

4、蛋白的表达及鉴定

将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心分别收获上清和细胞。细胞进行重悬破碎，再离心收获。经测定细胞外上清中HA含量为0，细胞内HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示蛋白片段聚集，无病毒样颗粒形成。

实施例2H9亚型禽流感病毒样颗粒的表达

1、载体改造

以商品化载体pFastBac I为模板，利用引物pFBmut-F和pFBmut-R对pFastBac I的4413-4414位处依次插入NdeI、NotI、SalI和XbaI限制性酶切位点，引物见表1。PCR产物加入DpnI酶1μl消化掉模板质粒，取5μl按照常规方法转化DH5α，改造成功的质粒命名为pFastBac mut。

表1载体改造引物表

2、三表达盒供体质粒的构建

由金唯智合成序列表SEQ.ID NO.1所示的HA基因、SEQ.ID NO.2所示的NA基因、SEQ.ID NO.3所示的Gag基因，基因上游、下游分别加内切酶BamHI和HindIII酶切位点。分别将合成的HA基因、NA基因、Gag基因通过BamHI和HindIII酶切，和同样酶切的pFastBac mut进行连接，连接产物转化DH5α，鉴定正确的质粒命名为pFastBac mut-HA、pFastBac mut-NA和pFastBac mut-Gag。

以pFastBac mut-HA和pFastBac mut-NA为模板，分别利用引物PH-F(NdeI)+PA-R(NotI)和PH-F(SalI)+PA-R(XbaI)扩增HA和NA表达盒，通过NdeI+NotI将HA表达盒插入pFastBac mut-Gag质粒中，质粒命名为pFastBac mut-Gag-HA；通过SalI+XbaI将NA表达盒插入pFastBac mut-Gag-HA中，质粒命名为pFastBac mut-Gag-HA-NA。

3、重组Bacmid构建及鉴定

将2μl pFastBac mut-Gag-HA-NA质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激45s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基37℃200rpm 4h，取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物经测序鉴定正确，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组杆粒的提取，命名为Bacmid-Gag。

4、重组杆状病毒的获得及传代：

将重组杆粒Bacmid-Gag转染昆虫细胞sf9。参照

II Regent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为rBac-Gag P1。

5、蛋白的表达及鉴定

将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心分别收获上清和细胞。细胞进行重悬破碎，再离心收获。经测定细胞外上清中HA含量为12log2，细胞内HA含量为2log2。通过透射电镜观察，结果显示细胞外上清收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态；而细胞内收获的蛋白片段聚集，无病毒样颗粒形成。

实施例3H9亚型禽流感亚单位疫苗及病毒样颗粒疫苗的制备

将实施例1细胞内收获的HA蛋白、实施例2细胞内收获的HA、NA、Gag蛋白、不同含量的实施例2细胞外上清收获的病毒样颗粒抗原分别加入到白油佐剂中，制备疫苗组合物，具体配比见表2。

表2 H9亚型禽流感疫苗组合物配比

组分	疫苗1	疫苗2	疫苗3	疫苗4
					实施例1蛋白(HA含量)	8log2	-	-	-
实施例2蛋白(HA含量)	-	8log2	-	-
					实施例2 VLPs(HA含量)	-	-	6log2	8log2
白油佐剂(V/V％)	66％	66％	66％	66％

实施例4H9亚型禽流感疫苗免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第1组～第4组分别经颈部皮下注射免疫实施例3制备的疫苗1～疫苗4，第5组皮下注射商品化H9亚型禽流感灭活苗(SZ株，HA含量8log2)，免疫剂量为0.3ml，第6组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后14日、21日采血，分离血清，测定HI抗体效价。免疫后不同HI抗体检测结果见表3。

表3 H9亚型禽流感疫苗免疫原性试验结果

结果显示，第1组、第2组免疫组14日HI抗体效价平均值均低于6.0log2，不能有效提供针对H9亚型感染的免疫保护；第1组、第2组免疫组21日HI抗体效价平均值均达到6.0log2以上，可有效提供针对H9亚型感染的免疫保护；第3组、第4组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6.0log2，即可有效提供针对H9亚型感染的免疫保护，超过第5组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第5组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6.0log2以上，即可有效提供针对H9亚型感染的免疫保护；第3组在较灭活苗低的剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第4组免疫组和商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第4组免疫反应更快，14日即可达到商品化疫苗21日的免疫效果。表明本发明实施例3制备的亚单位疫苗(疫苗1)和含有不同抗原成分的亚单位疫苗(疫苗2)不能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。

实施例5H9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗广谱性保护试验

取21日龄的SPF鸡120只，分成12组，每组10只，第7组～第12组分别经颈部皮下注射免疫实施例3制备的疫苗3，免疫剂量为0.3ml，第13组～第18组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日进行攻毒，第7组、第13组用新近从中国江苏分离的H9亚型禽流感JS02株强毒株(G1亚群)攻毒；第8组、第14组用新近从中国河南分离的H9亚型禽流感HN12株强毒株(BJ94-like亚群)攻毒；第9组、第15组用新近从中国吉林分离的H9亚型禽流感JL06株强毒株(Y280-like亚群)攻毒；第10组、第16组用新近从中国重庆分离的H9亚型禽流感CQ07株强毒株(Y280-like亚群)攻毒；第11组、第17组用新近从中国广东分离的H9亚型禽流感GD07株强毒株(S2-like亚群)攻毒；第12组、第18组用H9亚型禽流感早期分离株SZ株强毒株(Y280-like亚群)攻毒；攻毒剂量均为0.2ml(10^7.0EID₅₀)。于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。结果见表4。

表4 H9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗广谱性保护试验结果

结果显示，疫苗3免疫组在免疫后21日均能抵抗不同地域来源、不同分支的H9亚型禽流感病毒的攻击。表明本发明的H9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗可针对不同地域来源、不同亚群的H9亚型禽流感病毒攻毒提供有效、完全免疫保护。本发明的H9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗具有广谱的免疫原性。

实施例6鸡新城疫抗原的制备

取新城疫病毒(基因Ⅶ型)，N7a株(Newcastle Disease Virus(genotypeⅦ),strain N7a)(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201545，保藏日期为2015年10月19日，保藏地址为中国武汉·武汉大学)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-4或10^-5)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育。选接种后48～120小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为10^8.0EID₅₀/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。

实施例7鸡传染性支气管炎抗原的制备

取鸡传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-2或10^-3)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育。选接种后24～48小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为10^6.0EID₅₀/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放置于37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。

实施例8法氏囊抗原的制备

1.VP2 cDNA制备

按病毒RNA提取试剂盒操作从感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒成都株(公开于中国专利申请CN104274829A)的SPF鸡法氏囊中提取IBDV病毒RNA，并用随机引物进行逆转录。根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，合成寡聚核苷酸引物序列见表5，并进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。

表5法氏囊病毒VP2基因扩增引物

VP2-EcoR1-F	CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAAC
		VP2-Sal1-R	ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT

2.pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株的构建

取上述制备的VP2 cDNA，进行双酶切，并将酶切后的片段连接到pColdⅢ载体上；连接产物直接转化大肠杆菌BL21(DE3)，并涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素LB固体培养基中培养过夜，长出的菌落即为pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株。

3.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备

用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株种子液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。

培养结束后，离心收集菌体，重悬，超声波破碎，离心收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液。

实施例9减蛋综合征抗原的制备

1.EDSV病毒DNA的提取

按照病毒DNA提取试剂盒说明书，从禽减蛋综合征病毒AV127株病毒液中提取DNA基因组。根据Fiber蛋白基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。引物序列见表6，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。

表6 Fiber蛋白基因扩增引物

Fiber-F	atgaagcgactacggttggaccctg
		Fiber-R	ctactgtgctccaacatatgtaaag

2.表达载体构建

将回收的Fiber蛋白基因进行双酶切，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒和分子伴侣质粒pG-Tf2共转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为pET28a-EDSV-Fiber/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)表达菌株。

3.Fiber蛋白的制备

将上述制备的pET28a-EDSV-Fiber/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中，同时LB培养基中含有5-10ng/ml四环素用于分子伴侣蛋白的诱导表达，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH 7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。收集Fiber蛋白液。

实施例10禽腺病毒抗原的制备

1.禽腺病毒DNA的提取

按照病毒DNA提取试剂盒操作从感染禽腺病毒FAV-HN株(禽腺病毒，FAV-HN株(Fowl aviadenovirus,strain FAV-HN)，保藏号为：CCTCC NO：V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日。)中提取FADV病毒DNA。根据Fiber-2蛋白基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，引物序列见表7，并进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。

表7禽腺病毒Fiber-2基因扩增引物

Fiber-2-F	CTCCGGGCCCCTAAAAG
		Fiber-2-R	CGGGACGGAGGCCGC

2.表达载体构建

将回收Fiber-2蛋白基因进行双酶切，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为pET28a-FADV-Fiber-2/E.Coli BL21(DE3)表达菌株。

3.Fiber-2蛋白的制备

将上述制备的pET28a-FADV-Fiber-2/E.Coli BL21(DE3)菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600值达到0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1.0mM，28℃振荡培养24小时。

培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调pH 7.4,定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。收集Fiber-2蛋白液。

实施例11 H9亚型禽流感病毒样颗粒联合疫苗的制备

将实施例2细胞外上清收获的病毒样颗粒抗原分别和实施例6制备的鸡新城疫抗原、实施例7制备的鸡传染性支气管炎抗原、实施例8制备的传染性法氏囊抗原、实施例9制备的减蛋综合征抗原、实施例10制备的禽腺病毒抗原按比例混合，加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表8、9、10、11。

表8 H9亚型禽流感病毒样颗粒二联疫苗配比

组分	疫苗5	疫苗6	疫苗7	疫苗8	疫苗9
						禽流感抗原(HA效价)	6log2	8log2	6log2	8log2	6log2
N7a株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>8.0</sup>	—	—	—	—
						M41株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	—	10<sup>6.0</sup>	—	—	—
VP2蛋白(AGP效价)	—	—	1：16	—	—
						Fiber蛋白(HA效价)	—	—	—	9log2	—
Fiber-2蛋白(AGP效价)	—	—	—	—	1：4
						白油佐剂(V/V％)	66％	66％	66％	66％	66％

表9 H9亚型禽流感病毒样颗粒三联疫苗配比

组分	疫苗10	疫苗11	疫苗12	疫苗13
					禽流感抗原(HA效价)	8log2	6log2	8log2	6log2
N7a株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>
					M41株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>6.0</sup>	—	—	—
VP2蛋白(AGP效价)	—	1：16	—	—
					Fiber蛋白(HA效价)	—	—	9log2	—
Fiber-2蛋白(AGP效价)	—	—	—	1：4
					白油佐剂(V/V％)	66％	66％	66％	66％

表10 H9亚型禽流感病毒样颗粒四联疫苗配比

表11 H9亚型禽流感病毒样颗粒五联疫苗配比

组分	疫苗20	疫苗21	疫苗22
				禽流感抗原(HA效价)	8log2	6log2	8log2
N7a株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>
				M41株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>6.0</sup>	10<sup>6.0</sup>	10<sup>6.0</sup>
VP2蛋白(AGP效价)	1：16	—	1：16
				Fiber蛋白(HA效价)	9log2	9log2	—
Fiber-2蛋白(AGP效价)	—	1：4	1：4
				白油佐剂(V/V％)	66％	66％	66％

实施例12 H9亚型禽流感病毒样颗粒联合疫苗免疫原性试验

1.禽流感部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡190只，分成19组，每组10只，第19组～第36组分别经颈部皮下注射免疫实施例11制备的疫苗5～疫苗22，免疫剂量为0.3ml，第37组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日采血，分离血清，测定HI抗体效价，同时用H9亚型禽流感SZ株(公开于中国专利申请CN103789272A)病毒液攻毒，攻毒剂量均为每只0.2ml(10^7.0EID₅₀)。于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。结果见表12。

表12H9亚型禽流感病毒样颗粒联合疫苗禽流感部分免疫原性试验结果

注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均值。

结果显示，疫苗5～疫苗22在免疫后21天均能产生较高的禽流感抗体，而且免疫组和对照组相比，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的H9亚型禽流感病毒样颗粒，作为抗原制备的油乳剂联苗可针对鸡群提供完全保护。

2.新城疫病毒部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡150只，分成15组，每组10只，第38组～第51组分别经颈部皮下注射免疫实施例11制备的疫苗5、疫苗10～疫苗22，20μl/只；第52组皮下注射20μl生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，将第38组～第51组免疫鸡，连同第52组攻毒对照鸡，采血并分离血清。检测新城疫病毒HI抗体，同时用新城疫强毒HN1101株(公开于中国专利申请CN105985966A)病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表13。

表13 H9亚型禽流感病毒样颗粒联合疫苗新城疫部分免疫原性试验结果

注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均值。

结果显示，疫苗5、疫苗10～疫苗22免疫组在免疫后21天均能产生较高的新城疫抗体，而且免疫组和对照相比，可以完全保护强毒的攻击。表明以本发明提供的N7a株新城疫病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。

3.鸡传染性支气管炎部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡90只，分成9组，每组10只，第53组～第60组各点眼、滴鼻接种鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)1羽份(0.05ml)。接种后21日，连同第61组对照鸡，采血并分离血清。同时，第53组～第60组各组经颈部皮下注射免疫实施例11制备的疫苗6、疫苗10、疫苗14、疫苗15、疫苗16、疫苗20、疫苗21、疫苗22，0.3ml/只。接种后28日，连同第61组攻毒对照鸡分别采血并分离血清；第53～第60组免疫鸡在活苗首免后21日、灭活苗免后28日两次采集的血清(第61组攻毒对照鸡同样时间采集血清)测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价几何平均值不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值不高于1:8(微量法)。同时用鸡传染性支气管炎M41强毒每羽滴鼻攻毒10^3.0EID₅₀，作攻毒实验。结果见表14。

表14 H9亚型禽流感病毒样颗粒联合疫苗鸡传染性支气管炎部分免疫原性试验结果

结果显示，疫苗6、疫苗10、疫苗14、疫苗15、疫苗16、疫苗20、疫苗21、疫苗22二免血清HI抗体效价几何平均值均不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，攻毒后全部免疫鸡的气管内未分离出病毒，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的鸡传染性支气管炎病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。

4.法氏囊部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第62组～第68组分别经颈部皮下注射免疫实施例11制备的疫苗7、疫苗11、疫苗14、疫苗17、疫苗18、疫苗20、疫苗22，0.3ml/只；第69组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，第62组～第69组，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85((CVCC AV7株)购于中国兽医药品监察所)株病毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只解剖，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少4只鸡发病，出现明显的法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变)。结果见表15。

表15 H9亚型禽流感病毒样颗粒联合疫苗法氏囊部分免疫原性试验结果

结果显示，疫苗7、疫苗11、疫苗14、疫苗17、疫苗18、疫苗20、疫苗22在免疫后21天，可以完全保护鸡传染性法氏囊病强毒的攻击。

5.禽减蛋综合征病毒部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第70组～第76组分别经颈部皮下注射免疫实施例11制备的疫苗8、疫苗12、疫苗15、疫苗17、疫苗19～疫苗21，0.5ml/只；第77组皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清禽减蛋综合征HI抗体效价。结果见表16。

表16 H9亚型禽流感病毒样颗粒联合疫苗禽减蛋综合征病毒部分免疫原性试验结果

结果显示，疫苗8、疫苗12、疫苗15、疫苗17、疫苗19～疫苗21免疫组在免疫后21天均产生了较高的HI抗体效价，可有效保护鸡群产蛋综合征的发生。表明本发明提供的禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。

6.禽腺病毒部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第78组～第84组分别经颈部皮下注射免疫实施例11制备的疫苗9、疫苗13、疫苗16、疫苗18、疫苗19、疫苗21、疫苗22，0.3ml/只；第85组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用禽腺病毒FAV-HN株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表17。

表17 H9亚型禽流感病毒样颗粒联合疫苗禽腺病毒部分免疫原性试验结果

结果显示，第85组对照组全部发病死亡，而第78组～第84组免疫组对免疫鸡均产生了较好的免疫保护效果，免疫效果良好。表明本发明提供的禽腺病毒抗原，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。

证明了本发明提供的H9亚型禽流感病毒样颗粒联合疫苗能够抵抗相关病原的侵袭，显示出良好的免疫原性，可有效控制我国H9亚型禽流感病毒相关疾病的流行。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳惠中生物技术有限公司

<120> 一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> H9亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus，H9 subtype）

<400> 1

atggagacag tatcactaat aactatacta ctagtagcag cagtaagcaa tgcagataaa 60

atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acagaaactg tggacacact aacagagaac 120

aatgtccctg tgacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180

gcaacaagct tgggacaacc tctcattttg gacacctgca ccattgaagg gctaatctat 240

ggcaatcctt cttgtgatct atcgctggaa ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagaga 300

ccatcagctg ttaacggatt gtgttacccc gggaatgtag aaaatctaga agagttaagg 360

tcacttttta gttctgctag gtcttatcaa agaatccaga ttttcccaga cacaatctgg 420

aatgtatctt acgatgggac aagcgcagca tgcccagatt cattctacaa aagcatgagg 480

tggttgactc gaaagaacgg cgattaccct atccaagacg cccaatacac aaataatcaa 540

gggaagaaca ttcttttcat gtggggcata catcacccac ccaccgatac taagcagaga 600

gatctgtaca cgagaactga tacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaatagggtc 660

ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattgattat 720

tattggtcgg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa aatctgatgg gaatctaata 780

gccccatggt ttggacacat tctttcagga gagagccacg gaagaattct gaagactgat 840

ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaga aaggtggctt gaacacaaca 900

ttgccattcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcaaaata cattggcata 960

aagagtctca aatttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta 1020

tttggggcca tagcagggtt tatagaggga ggttggtcag gactagttgc tggttggtat 1080

gggttccagc attcaaatga ccaaggagtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140

aaggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataatatag tagacaaaat gaacaagcag 1200

tatgaaatta ttgatcatga attcagtgag gtagaaacta gacttaacat gatcaataat 1260

aagattgatg atcaaatcca ggatatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt 1320

gaaaaccaaa aaacactcga tgagcacgac gcaaatgtaa acaatctata caataaagta 1380

aagagggcgt tgggttccaa tgcggtggaa gatggaaaag gatgtttcga gctataccac 1440

aaatgtgatg accaatgcat ggagacaatt cggaacggga cctacaacag aagaaagtat 1500

caagaggagt caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga 1560

acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctctcgtgat tgcaatgggg 1620

tttgctgcct ttttgttctg ggccatgtcc aatgggtctt gcagatgcaa catttgtata 1680

taa 1683

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> H9亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus，H9 subtype）

<400> 2

atgaatccaa atcagaagat aacagcaatt ggctctgttt ctctaattat cgcgataata 60

tgtctcctca tgcaaattgc catcttaaca acgactatga cattacattt caggcagaaa 120

ggatgcagta acccatcgaa taatcaagtg atgccatgtg aaccgatcat aatagaaagg 180

aacacagtgc atttgaataa tactaccata gagagggaaa tttgtcctaa agtagcagaa 240

tataagaatt ggtcgaaacc acaatgtcca attacagggt tcgctccttt ctcaaaggac 300

aactcaatta ggctttctgc aggtggggat atctgggtaa caagagaacc ttatgtctca 360

tgcagtcccg acaaatgtta tcaatttgca cttgggcagg gaaccaccct gaaaaacaag 420

cactcaaatg gcactacaca tgatagaacc cctcacagaa ctcttttaat gaatgagtta 480

ggtgtcccat ttcatttggg aaccaaacaa gtgtgcatag catggtctag ttcaagctgc 540

tatgatggaa aagcatggtt acatatttgt gttactgggg atgataaaaa tgctactgct 600

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agaactcagg agtcagaatg cgtttgcatc aatggaactt gtgcagtggt aatgactgat 720

ggaagtgcat caggagtggc cgacactaga gtattattca taagagaagg aaaaattata 780

aatattagac cattgtcagg aagtgctcag catgttgagg aatgctcctg ttatccccgg 840

tatcctgaaa ttaggtgtgt ttgcagagac aattggaagg gctccaatag gccaattata 900

tatataaata tggctgatta tagcattgag tccagttatg tgtgctcagg acttgttggc 960

gacacaccaa gaaatgatga tagctccagc agcagcaact gcagagaccc taataacgaa 1020

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attgtattct gtggaacctc aggtacatat gggacaggct catggcctga tggagcgaat 1380

atcaacttca tgcctatata a 1401

<210> 3

<211> 1431

<212> DNA

<213> 牛免疫缺陷病毒（Bovine immunodeficiency virus）

<400> 3

atgaagagaa gagagttaga aaagaagctt cgtaaggtta gggtgacact ccaacaggat 60

aaatattata ctatagggaa tcttcaatgg gccattagaa tgataaatct aatggggatc 120

aaatgtgtgt gtgacgagga gtgctcggca gcagaggtag cccttatcat aacccaattt 180

tcagctttag acttagaaga ttctcctatc aaaggtaagg aggaagtggc cataaaaaat 240

actctgaagg ttttctggtc cctgctggcg gggtacaaac cagagagtac agaaacggcc 300

ctaggatatt gggaggcctt tacatataga gaaagggagg ccagaactga aaaggaaggc 360

gaaattaaga gtatttaccc ttccctaaca cagaacacac agaataagaa gcagacatcg 420

aatcaaacaa acactcaatc attaccagct atcactactc aagatggtac tcctaggttt 480

gatcctgacc tcatgaagca gcttaagatc tggtcagacg ccactgaaag aaatggaatt 540

gaccttcatg cagtgaatat attaggggtc attacagcaa acctagtaca ggaagaaatt 600

aaactcctct tgaatagtac acccaagtgg agattagatg tacaacttat agaatcaaaa 660

gtaagagaga aagaaaatgc ccacagaaca tggaaacagc atcatccaga agccccaaaa 720

acagatgaaa tcatcggtaa ggggcttagt tctgctgaac aagccaccct gatctcagta 780

gaatgcagag aaactttcag acaatgggtg ctgcaggcag ctatggaggt ggcacaggca 840

aaacatgcta ccccaggtcc catcaacatt catcagggac ccaaggagcc gtacacagac 900

tttataaata gattagtggc agcccttgaa ggtatggcgg ctccagaaac cacaaaagaa 960

tacttactcc aacatctatc tattgatcat gccaatgaag actgccagtc tattctaaga 1020

cctttgggac ccaacacccc aatggagaaa aaattagaag catgtagggt agtgggatct 1080

caaaaatcaa agatgcaatt tttggtagca gctatgaaag aaatggggat ccaatcacca 1140

attccagcag tcttgcctca cacaccagaa gcatatgcct cccaaacctc agggcccgag 1200

gatggtagga gatgttacgg atgtggaaag acaggacatt tgaagaagaa ttgtaaacag 1260

caaaaatgct accattgtgg caaacctggc caccaagcaa gaaactgcag gtcaaaaaac 1320

gggaagtgct cctctgcccc ttatgggcag aggagccaac cacagaacaa ttttcaccag 1380

agcaacatga gttctgtgac cccatctgca ccccctctta tattagatta g 1431

Claims

1.一种禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗包括免疫量的H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体，所述禽流感病毒样颗粒抗原由H9亚型禽流感病毒HA、NA和牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白组装而成；

所述H9亚型禽流感病毒HA抗原蛋白由SEQ ID NO.1所示序列编码，所述H9亚型禽流感病毒NA抗原蛋白由SEQ ID NO.2所示序列编码，所述牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白由SEQ IDNO.3所示序列编码。

2.根据权利要求1所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价≥6log2。

3.根据权利要求2所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2~9log2。

4.根据权利要求3所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2~8log2。

5.根据权利要求1所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V。

6.根据权利要求5所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，皂苷为Quil A、QS-21或GPI-0100。

7.根据权利要求5所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述佐剂的浓度范围是从30%到70% V/V。

8.根据权利要求7所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述佐剂的浓度为66％V/V。

9.根据权利要求1所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗包括以下抗原的一种或多种：鸡新城疫病毒灭活抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原、禽减蛋综合征病毒灭活抗原或亚单位抗原、鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原、禽腺病毒灭活抗原或亚单位抗原；

所述鸡新城疫病毒灭活抗原为N7a株灭活抗原、所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原为M41株灭活抗原、所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原为AV127株灭活抗原、所述禽减蛋综合征病毒亚单位抗原为禽减蛋综合征病毒Penton蛋白或Fiber蛋白、所述鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原为鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、所述禽腺病毒灭活抗原为FAV-HN株灭活抗原、所述禽腺病毒亚单位抗原为禽腺病毒Penton蛋白或Fiber-2蛋白。

10.根据权利要求9所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2~9log2，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0~10^9.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0~10^7.0 EID₅₀/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原含量为灭活前10^7.0~10^8.0 EID₅₀/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白含量为10.2μg/ml～40.8μg/ml，所述禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白含量为HA效价8log2~10log2，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16~1:128，所述禽腺病毒灭活抗原含量为灭活前10^5.0～10^8.0EID₅₀/0.1ml或10^5.0～10^8.0 TCID₅₀/0.1ml，所述禽腺病毒Penton蛋白含量为AGP效价1:2~1:16，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:2~1:16。

11.根据权利要求10所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6 log2~9 log2，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0EID₅₀/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原含量为灭活前10^7.0EID₅₀/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白含量为20μg/ml，所述禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白含量为HA效价9 log2，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16，所述禽腺病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.5EID₅₀/0.1ml或10^6.5TCID₅₀/0.1ml，所述禽腺病毒Penton蛋白含量为AGP效价1:4，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:4。

12.一种制备权利要求1所述的禽流感病毒样颗粒疫苗的方法，其中，所述方法包括：

步骤（1）将所述H9亚型禽流感病毒HA、NA抗原蛋白基因、牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白基因克隆到同一载体，所述HA、NA和Gag抗原蛋白基因分别如序列SEQ.ID No. 1、SEQ.IDNo. 2、SEQ.ID No.3所示；

步骤（2）将所述步骤（1）获得的载体经转化重组获得含有所述HA、NA、Gag抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒；

步骤（3）将所述步骤（2）获得的所述含有HA、NA、Gag抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9，串联表达所述HA、NA、Gag抗原蛋白；

步骤（4）分离在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中、由所述HA、NA、Gag抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒抗原；以及

步骤（5）在所述步骤（4）得到的禽流感病毒样颗粒抗原中加入佐剂，混匀得到所述禽流感病毒样颗粒疫苗。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述步骤（1）中载体为pFastBac I；所述步骤（2）中所述的杆状病毒质粒为Bacmid。

14.根据权利要求1~11任一项所述的禽流感病毒样颗粒疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其中，所述禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒。