CN110240634B - 一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种禽流感病毒样颗粒抗原以及其制备方法和使用该抗原制备的疫苗。该禽流感病毒样颗粒抗原在使用昆虫细胞制备时能有效组装，呈现为病毒样颗粒粒子。该禽流感病毒样颗粒抗原制备的疫苗能有效提供针对H5亚型和/或H9亚型禽流感病毒的有效保护，其保护效力较相同HA抗原含量的灭活苗相当或更优。

Description

一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种提供针对禽流感病毒进行保护的病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用。
背景技术
病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，是由病毒的结构蛋白组装而成的介于15nm～400nm的空心颗粒。VLPs的制备可以通过体外高效表达某种病毒的一种(或几种)结构蛋白，使其自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒。其方法主要是将病毒结构蛋白基因克隆到表达载体中，再将这些载体转入原核或真核细胞中进行表达。
禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科，流感病毒属，A型流感病毒。禽流感(Avian Influenza，AI)是由该病毒引起的禽类感染和疾病综合症。国际兽医局(OIE)和我国《家畜家禽防疫条例》均将该病列为A类烈性传染病。目前在世界上许多国家和地区都有该病发生的报道，其中尤为以H5亚型毒株引起的高致病性禽流感(HPAI)更为严重，其以突然发病和高死亡率为主要特征，常常导致饲养鸡群的全部死亡。
截止到目前，接种全病毒疫苗仍然是预防和控制禽流感病毒流行的最有效手段。然而，由于禽流感病毒的变异速度远远大于变异株相应疫苗的研发制备速度，而且不同亚型之间几乎不产生交叉免疫保护，因此禽流感疫苗的生产需要时时、不断更新，而针对流感病毒流行株相应疫苗的生产周期较长、生产成本较高，造成人力、物力的浪费，还有可能达不到理想的防控效果。
目前现有技术中文献研究发表的禽流感病毒样颗粒疫苗虽然能产生较好的免疫应答，但依然达不到商品化全病毒疫苗的免疫效果，且普遍表达效率较低，为此，急需一种免疫效果良好、安全、成本可控的禽流感病毒样颗粒疫苗。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种禽流感病毒样颗粒抗原，其中，所述禽流感病毒样颗粒抗原由H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原组装而成。所述禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，能提供对禽流感病毒的完全保护，其免疫效力与相同HA抗原含量的灭活苗相当或更优。
本发明还涉及一种禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗包括免疫量的所述的禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体。
本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗其免疫效力与相同HA抗原含量的商用灭活苗相当或更优；且不仅对H5亚型禽流感提供保护，还能对H9亚型禽流感提供保护。
本发明的另一个目的在于提供制备所述的禽流感病毒样颗粒抗原的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将所述HA、NA、M1抗原蛋白基因克隆到同一载体，所述H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因分别由序列SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.3、SEQ.ID No.5所示或由序列SEQ.ID No.2、SEQ.ID No.4、SEQ.ID No.6所示；步骤(2)将所述步骤(1)获得的载体经转化重组获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒；步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述含有HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9，串联表达所述HA、NA、M1抗原蛋白；以及步骤(4)分离在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中的由所述HA、NA、M1抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒抗原。
本发明利用昆虫杆状病毒表达系统生产包含禽流感HA、NA、M1的H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原，所述HA、NA、M1抗原能在昆虫细胞内自我组装，呈病毒样颗粒粒子释放到细胞外培养基上清中，表达组装高效。
本发明利用昆虫杆状病毒表达系统生产禽流感病毒样颗粒，具有产量高，生产成本低，免疫原性好，无生物安全风险等优点，不仅对H5亚型禽流感提供保护活性，还能对H9亚型禽流感提供保护活性。
本发明的再一目的在于提供所述的禽流感病毒样颗粒疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及一种禽流感病毒样颗粒抗原，其中，所述禽流感病毒样颗粒抗原由H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原组装而成。
“病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒抗原中，所述H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因分别由序列SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.3、SEQ.ID No.5所示或由序列SEQ.ID No.2、SEQ.ID No.4、SEQ.ID No.6所示。
本发明的禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，其制备的疫苗能对禽流感完全保护。
本发明还涉及一种禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗包括免疫量的所述的禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体。
本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗抗原为禽流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA、神经氨酸酶NA和基质蛋白M1的自我装配体。其能提供良好的免疫原性，较相同含量的亚单位疫苗免疫效力大大提高，具有与灭活疫苗相同或更优的免疫效力。
本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有禽流感病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对禽流感的免疫反应。
术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述的禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价≥6log2。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述的禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～9log2。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述的禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2。
本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗中禽流感病毒样颗粒抗原含量HA效价可以任意选自6.0log2、6.1log2、6.2log2、6.3log2、6.4log2、6.5log2、6.6log2、6.7log2、6.8log2、6.9log2、7.0log2、7.1log2、7.2log2、7.3log2、7.4log2、7.5log2、7.6log2、7.7log2、7.8log2、7.9log2、8.0log2、8.1log2、8.2log2、8.3log2、8.4log2、8.5log2、8.6log2、8.7log2、8.8log2、8.9log2、9.0log2。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述药学上可以接受的载体为佐剂；所述佐剂含量为5％到70％V/V，优选从30％到70％，更优选66％V/V。术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除禽腺病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(Cambridge BiotechIncorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；
优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其
Figure BDA0001591903730000071
特别是L121))；
优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；
优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；
优选地，所述佐剂为白油佐剂，其用于制备油包水乳剂；
所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％，更优选66％V/V。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗还包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。
为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
本发明还涉及一种制备所述的禽流感病毒样颗粒抗原的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将所述HA、NA、M1抗原蛋白基因克隆到同一载体，所述H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因分别由序列SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.3、SEQ.ID No.5所示或由序列SEQ.IDNo.2、SEQ.ID No.4、SEQ.ID No.6所示；步骤(2)将所述步骤(1)获得的载体经转化重组获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒；步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述含有HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9，串联表达所述HA、NA、M1抗原蛋白；以及步骤(4)分离在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中的由所述HA、NA、M1抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的制备方法中，所述步骤(1)中载体为pFastBac I；所述步骤(2)中所述的杆状病毒质粒为Bacmid。
本发明还涉及所述的禽流感病毒样颗粒疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的应用中，所述禽流感病毒为H5亚型或H9亚型禽流感病毒。
本发明所述的制备预防和/或治疗禽流感病毒感染的药物的施用对象包括鸡。
术语“预防和/或治疗”在涉及禽流感病毒感染时是指抑制禽流感病毒的复制、抑制禽流感病毒的传播或防止禽流感病毒在其宿主体内定居，以及减轻禽流感病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1禽流感HA蛋白的表达
1、供体质粒的构建
由金唯智合成序列表SEQ.ID NO.1所示的HA基因，基因上游、下游分别加内切酶BamHI和HindIII。将合成的HA基因通过BamHI和HindIII酶切，与同样酶切的pFastBacI载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确的质粒命名为pFastBac-HA。
2、重组Bacmid构建及鉴定
将2μl pFastBac-HA质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激45s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基37℃200rpm 4h，取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物大小为3900bp左右，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组杆粒的提取，命名为Bacmid-HA。
3、重组杆状病毒的获得及传代：
将重组杆粒Bacmid–HA转染昆虫细胞sf9。参照
Figure BDA0001591903730000091
II Regent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为rBac-HA P1。
将对数生长期的sf9细胞按照0.9×106cell/dish接种10cm细胞培养皿，待细胞完全贴壁后，将P1代重组杆状病毒按1:20-1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤按照1:100-200比例接种获得P3、P4代重组杆状病毒。
4、蛋白的表达及鉴定
将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心分别收获上清和细胞。细胞进行重悬破碎，再离心收获上清。经测定上清中HA含量为0，细胞内HA含量为8log2。通过透射电镜观察，结果显示蛋白片段聚集，无病毒样颗粒形成。
实施例2禽流感HA蛋白的高效表达
根据序列表SEQ.ID NO.1所示的HA基因进行高效表达序列优化，优化后的序列如序列表SEQ.ID NO.2所示。
参照实施例1的方法进行禽流感HA蛋白的高效表达，经测定上清中HA含量为0，细胞内HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示蛋白片段聚集，无病毒样颗粒形成。
实施例3禽流感病毒样颗粒的表达
1、载体改造
以商品化载体pFastBac I为模板，利用引物pFBmut-F和pFBmut-R对pFastBac I的4413-4414位处依次插入NdeI、NotI、SalI和XbaI限制性酶切位点，引物见表1。PCR产物加入DpnI酶1μl消化掉模板质粒，取5μl按照常规方法转化DH5α，改造成功的质粒命名为pFastBac mut。
表1载体改造引物表
Figure BDA0001591903730000101
Figure BDA0001591903730000111
2、三表达盒供体质粒的构建
由金唯智合成序列表SEQ.ID NO.1所示的HA基因、SEQ.ID NO.3所示的NA基因、SEQ.ID NO.5所示的M1基因，基因上游、下游分别加内切酶BamHI和HindIII。分别将合成的HA基因、NA基因、M1基因通过BamHI和HindIII酶切，和同样酶切的pFastBac mut进行连接，连接产物转化DH5α，鉴定正确的质粒命名为pFastBac mut-HA、pFastBac mut-NA和pFastBac mut-M1。
以pFastBac mut-HA和pFastBac mut-NA为模板，分别利用引物PH-F(NdeI)+PA-R(NotI)和PH-F(SalI)+PA-R(XbaI)扩增HA和NA表达盒，通过NdeI+NotI将HA表达盒插入pFastBac mut-M1质粒中，质粒命名为pFastBac mut-M1-HA；通过SalI+XbaI将NA表达盒插入pFastBac mut-M1-HA中，质粒命名为pFastBac mut-M1-HA-NA。
3、重组Bacmid构建及鉴定
将2μl pFastBac mut-M1-HA-NA质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激45s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基37℃200rpm 4h，取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物大小为7600bp左右，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组杆粒的提取，命名为Bacmid-M1。
4、重组杆状病毒的获得及传代：
将重组杆粒Bacmid-M1转染昆虫细胞sf9。参照
Figure BDA0001591903730000121
II Regent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为rBac-M1P1。
将对数生长期的sf9细胞按照0.9×106cell/dish接种10cm细胞培养皿，待细胞完全贴壁后，将P1代重组杆状病毒按1:20-1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤按照1:100-200比例接种获得P3、P4代重组杆状病毒。
5、蛋白的表达及鉴定
将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心分别收获上清和细胞。细胞进行重悬破碎，再离心收获上清。经测定上清中HA含量为5log2，细胞内HA含量为6log2。通过透射电镜观察，结果显示上清收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态；而胞内收获的蛋白片段聚集，无病毒样颗粒形成。
实施例4禽流感病毒样颗粒的高效表达
根据序列表SEQ.ID NO.1所示的HA基因、SEQ.ID NO.3所示的NA基因、SEQ.ID NO.5所示的M1基因进行高效表达序列优化，优化后的序列分别如序列表SEQ.ID NO.2、SEQ.IDNO.4、SEQ.ID NO.6所示。
参照实施例3的方法进行禽流感病毒样颗粒的高效表达，经测定上清中HA含量为11log2，细胞内HA含量为3log2。通过透射电镜观察，结果显示上清收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小均匀，呈现为空心粒子状态；而胞内收获的蛋白片段聚集，无病毒样颗粒形成。
实施例5禽流感亚单位疫苗及病毒样颗粒疫苗的制备
将实施例1胞内收获的HA蛋白、实施例2胞内收获的HA蛋白、实施例3胞内收获的HA、NA、M1蛋白、实施例4胞内收获的HA、NA、M1蛋白、高、低两种含量的实施例3胞外上清收获的病毒样颗粒、高、低两种含量的实施例4胞外上清收获的病毒样颗粒分别加入到白油佐剂中，制备疫苗组合物，具体配比见表2。
表2禽流感疫苗组合物配比
Figure BDA0001591903730000131
实施例6禽流感亚单位疫苗免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第1组～第4组分别经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗1～疫苗4，第5组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-8)、H7二价灭活苗，H5HA含量8log2)，免疫剂量为0.3ml，第6组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后14日、21日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表3。
表3禽流感亚单位疫苗免疫原性试验结果
Figure BDA0001591903730000141
*备注：使用哈兽研H5(Re-8)标准抗原
结果显示，第1组～第4组免疫组14日HI抗体效价平均值均低于6.0log2，不能有效提供针对H5亚型感染的免疫保护；第1组～第4组免疫组21日HI抗体效价平均值均达到6.0log2以上，可有效提供针对H5亚型感染的免疫保护；第5组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6.0log2以上，即可有效提供针对H5亚型感染的免疫保护。上述结果说明本发明实施例5制备的亚单位疫苗(疫苗1～3)或含有不同蛋白抗原的亚单位疫苗(疫苗4)均不能提供理想的免疫效力。
实施例7禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第7组～第10组分别经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗5～疫苗8，第11组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-8)、H7二价灭活苗，H5HA含量8log2)，免疫剂量为0.3ml，第12组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后14日、21日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表4。
表4禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果
Figure BDA0001591903730000151
*备注：使用哈兽研H5(Re-8)标准抗原
结果显示，第7组～第10组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6.0log2，即可有效提供针对H5亚型感染的免疫保护，达到或超过第11组商品化疫苗免疫组免疫效果；第7组和第9组在较商品化灭活苗低剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值依然可以达到商品化疫苗免疫组免疫效果；第10组免疫组和商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第10组免疫反应更快，14日即可达到商品化疫苗21日的免疫效果。表明本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。
实施例8禽流感亚单位疫苗交叉保护试验
取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第13组～第16组分别经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗1～疫苗4，第17组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-8)、H7二价灭活苗，H5HA含量8log2)，免疫剂量为0.3ml，第18组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日用H9亚型禽流感SZ株病毒液静脉注射攻击，每只0.2ml(含107.0EID50)。于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。结果见表5。
表5禽流感亚单位疫苗交叉保护试验结果
Figure BDA0001591903730000161
结果显示，疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4和商品化疫苗免疫组在免疫后21日均不能抵抗H9亚型禽流感强毒的攻击。表明，本发明实施例5的禽流感亚单位疫苗(疫苗1～4)不能提供针对异型H9亚型禽流感感染的保护。
实施例9禽流感病毒样颗粒疫苗交叉保护试验
取21日龄的SPF鸡40只，分成4组，每组10只，第19组～第20组分别经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗5、疫苗7，第21组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-8)、H7二价灭活苗，H5HA含量8log2)，免疫剂量为0.3ml，第22组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日用H9亚型禽流感SZ株病毒液静脉注射攻击，每只0.2ml(含107.0EID50)。于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。结果见表6。
表6禽流感病毒样颗粒疫苗交叉保护试验结果
Figure BDA0001591903730000171
结果显示，疫苗5、疫苗7免疫组在免疫后21日均能抵抗H9亚型禽流感强毒的攻击，商品化疫苗免疫组在免疫后21日不能抵抗H9亚型禽流感强毒的攻击。表明，本发明提供的禽流感病毒样颗粒疫苗能提供针对异型——H9亚型禽流感感染的保护。
实施例10禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验
取21日龄的SPF鸡40只，分成4组，每组10只，第23组～第24组分别经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗5、疫苗7，第25组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-8)、H7二价灭活苗，H5HA含量8log2)，免疫剂量为0.3ml，第26组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日、56日、112日、168日、224日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表7。
表7禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验结果
组别 21天 56天 84天 112天 140天 168天 196天 224天
23 9.0 8.5 7.4 7.2 7.0 6.8 5.8 5.4
24 10.0 10.0 9.2 8.8 8.6 8.2 7.5 7.0
25 9.0 8.5 7.3 7.0 6.8 6.5 5.5 5.0
26 0 0 0 0 0 0 0 0
*备注：使用哈兽研H5(Re-8)标准抗原
结果显示，疫苗5免疫组与商品化疫苗免疫组在免疫持续时间相当，但疫苗5HA含量较商品化疫苗低；疫苗7免疫组在免疫持续期时间较商品化疫苗免疫组长，在32周时HI抗体效价平均值依然高于6.0log2，能达到完全保护。表明本发明提供的高效表达的病毒样颗粒疫苗不仅表达量高，而且免疫原性好，免疫持续期长。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 一种禽流感病毒样颗粒抗原、及其制备方法和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1704
<212> DNA
<213> H5亚型禽流感病毒（H5 subtype avian influenza virus）
<400> 1
atggagaaaa tagtgcttct tcttgcagtg gttagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 60
attggttacc atgcaaataa ctcgacagag caggttgaca cgataatgga aaaaaacgtc 120
actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaggct ctgcgatctg 180
aatggagtga aacctctgat tttaaaggat tgtagtgtag ctggatggct ccttggaaac 240
ccaatgtgcg acgagttcat cagagtgccg gaatggtctt acatagtgga gagggctaac 300
ccatccaatg acctctgtta cccagggaac ctcaatgact atgaagaact gaaacactta 360
ttgagcagaa taaaccattt tgagaagact ctgatcatcc ccaagagttc ttggcccgat 420
catgatacat cattaggggt gagcgcagca tgtccatacc agggaatgcc ctcctttttc 480
agaaatgtgg tatggcttat caagaagaac gatacatacc caacaataaa gatgagctac 540
aataatacca atagggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc caacaacgca 600
gcagagcaga caaatctcta taaaaaccca accacctatg tttccgttgg gacatcaaca 660
ttaaaccaga gattggtgcc caaaatagct actagatccc aagtaaacgg gcaacgtgga 720
agaatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt cgagagtaat 780
ggaaatttta ttgctccaga gtatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatc 840
atgaaaagtg aaatggaata tggccactgc aacaccaaat gtcaaactcc aataggggcg 900
ataaactcta gtatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960
tacgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaataatcc tctaagagag 1020
aggagaagaa aaagaggact atttggagct atagcagggt ttatagaggg aggatggcaa 1080
ggaatggtag atggttggta tgggtaccac catagcaatg aacaggggag tgggtacgct 1140
gcagacaaag aatccaccca aaaggcaata gatggagtta ccaataaggt caactcgatc 1200
attgacaaga tgaacactca atttgaggcc gttggaaggg aatttaataa cttagaacgg 1260
agaatagaga atttaaataa gaaaatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttataat 1320
gctgaacttc tagttctcat ggaaaatgag agaactctag atttccatga ctcaaatgtc 1380
aagaaccttt acgacaaagt ccgactacag cttagggata atgcaaagga gctgggtaat 1440
ggttgtttcg agttctatca caaatgtgat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaatggg 1500
acgtatgact accctcagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagagaaga aataagcgga 1560
gtgaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt 1620
tccctagcac tggcaatcat tgtggctggt ctatctttat ggatgtgctc caatgggtcg 1680
ttacaatgca gaatttgcat ttaa 1704
<210> 2
<211> 1704
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gctgagttgc cattcaccat tgacaagtag 1350
<210> 4
<211> 1350
<212> DNA
<213> H5亚型禽流感病毒（H5 subtype avian influenza virus）
<400> 4
atgaacccta acaagaagat cgtcaccatc ggctctatct gcatcgtgat cggcatcatc 60
tctctgatgc tccagatcgg caacatcatc agcatttgga tctctcacag catccagacc 120
gtcaaccagc accagaccga gcccatccgt aacaccaatt ttctgaccga gaacgccgtg 180
gcttctgtga ctctggctgg caacagctct ctgtgcccca ttagaggctg ggccgtgcat 240
agcaaggaca atagcatccg tatcggcagc aagggtgacg tcttcgtcat ccgtgagccc 300
tttatcagct gctctcacct ggagtgccgt accttcttcc tcacccaggg tgccctgctg 360
aacgacaagc acagcaacgg taccgtgaag gaccgttctc ctcaccgtac tctgatgtct 420
tgccccattg gcgaggcccc tagcccctac aactctcgtt tcgagagcgt cgcctggagc 480
gcttctgctt gtcacgacgg caccagctgg ctgatcatcg gtatcagcgg tcccgacaac 540
ggtgccgtgg ctgtcctcaa gtacaacggc atcatcaccg acaccatcaa gtcttggcgt 600
aacaacatcc tgagaactca ggagagcgag tgcgcctgcg tcaacggcag ctgcttcact 660
gtgatgactg acggcccctc taacggccag gccagctaca agatcttcaa gatcgaaaag 720
ggtaaggtcg tcaagtctgt cgagctcaac gctcccaact accactacga agagtgctct 780
tgctaccccg atgctggcga aatcatctgc gtctgccgtg acaactggca cggctctaac 840
cgtccttgga tcagcttcaa ccagaacctg gagtaccaaa tcggctacat ctgcagcggc 900
gtgttcggtg acaaccctcg tcccaacgac ggtactggtt cttgcggtcc cgtcagctct 960
aacggtgcct atggcgtgaa gggtttcagc ttcaaatacg gcaacggtgt gtggatcggc 1020
cgtaccaaga gcacccatag cagaagcggc ttcgagatga tctgggaccc caatggttgg 1080
accggcaccg actctgagtt cagcatgaag caggacatcg tggccattac cgattggagc 1140
ggttacagcg gcagcttcgt ccaacaccct gagctcaccg gtctcgactg tatccgtccc 1200
tgcttctggg tggagctgat ccgtggtcgt cccaaggagt ctaccatctg gacctctggc 1260
agcagcatca gcttctgcgg tgtcaatagc gacactgtgt cttggagctg gcccgacggt 1320
gccgaactcc ctttcaccat cgacaaataa 1350
<210> 5
<211> 759
<212> DNA
<213> H5亚型禽流感病毒（H5 subtype avian influenza virus）
<400> 5
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccatc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcgcagaa acttgaggat gtgtttgcag ggaagaatgc tgatctcgag 120
gctctcatgg agtggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggatcttg 180
ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgttttgtc 240
cagaatgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat 300
aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggagctaagg aggtcgcact cagttactca 360
accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca gaatgggaac ggtgactaca 420
gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg 480
tctcacagac agatggcaac catcaccaac ccactaatca ggcatgagaa cagaatggtg 540
ctggccagca ctacagctaa ggctatggag cagatggcgg gatcaagtga gcaggcagca 600
gaagccatgg aggtcgccaa tcaggctaga cagatggtgc aggcaatgag gacaattggg 660
actcatccta attctagtgc tggtctgaga gacaatcttc ttgaaaattt gcaggcctac 720
cagaaacgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtga 759
<210> 6
<211> 759
<212> DNA
<213> H5亚型禽流感病毒（H5 subtype avian influenza virus）
<400> 6
atgagcctgc tgaccgaggt cgagacctac gtcctgagca tcatccccag cggtcccctg 60
aaggccgaaa tcgcccagaa gctggaagac gtgttcgccg gtaagaacgc cgacctggaa 120
gctctgatgg aatggctcaa gaccagaccc atcctgagcc ccctcaccaa aggtatcctg 180
ggtttcgtct tcaccctgac cgtgccctct gaacgtggtc tccagagacg tagattcgtc 240
cagaacgccc tgaacggtaa cggcgacccc aacaacatgg accgtgccgt caagctgtac 300
aagaagctga agcgtgagat taccttccac ggtgctaagg aagtcgccct gtcttacagc 360
accggtgccc tggcctcttg catgggcctg atctacaacc gtatgggcac cgtgactacc 420
gaagtcgcct tcggtctcgt gtgcgccacc tgtgaacaga tcgctgacag ccagcacaga 480
agccaccgtc agatggccac catcaccaac cccctgatcc gtcacgagaa cagaatggtc 540
ctggcctcta ccaccgccaa ggccatggaa cagatggccg gttctagcga acaggccgct 600
gaagccatgg aagtcgctaa ccaggctcgt cagatggtgc aggccatgag aaccatcggc 660
acccacccca acagcagcgc tggtctgaga gacaacctgc tggagaacct gcaggcctac 720
cagaagagaa tgggtgtcca gatgcagcgt ttcaagtaa 759

Claims (14)

1.一种禽流感病毒样颗粒抗原，其中，所述禽流感病毒样颗粒抗原由H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原组装而成，所述H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因分别如序列SEQ.ID No. 1、SEQ.ID No. 3、SEQ.ID No.5所示或如序列SEQ.ID No. 2、SEQ.ID No. 4、SEQ.ID No.6所示。
2.一种禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗包括免疫量的权利要求1所述的禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体。
3.根据权利要求2所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述的禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价≥6 log2。
4.根据权利要求3所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述的禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6 log2~9 log2。
5.根据权利要求3所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述的禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6 log2~8 log2。
6.根据权利要求2所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述药学上可以接受的载体为佐剂；所述佐剂含量为5％到70％V/V。
7.根据权利要求6所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述佐剂含量为30%到70%。
8.根据权利要求6所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述佐剂含量为66％V/V。
9.根据权利要求6所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述佐剂包括：（1）铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；（2）油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或（3）丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种。
10.根据权利要求6所述的禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。
11.一种制备权利要求1所述的禽流感病毒样颗粒抗原的方法，其中，所述方法包括：
步骤（1）将所述HA、NA、M1抗原蛋白基因克隆到同一载体，所述H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因分别如序列SEQ.ID No. 1、SEQ.ID No. 3、SEQ.ID No.5所示或如序列SEQ.ID No. 2、SEQ.ID No. 4、SEQ.ID No.6所示；
步骤（2）将所述步骤（1）获得的载体经转化重组获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒；
步骤（3）将所述步骤（2）获得的所述含有HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9，串联表达所述HA、NA、M1抗原蛋白；以及
步骤（4）分离在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中的由所述HA、NA、M1抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒抗原。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤（1）中载体为pFastBac I；所述步骤（2）中所述的杆状病毒质粒为Bacmid。
13.权利要求2所述的禽流感病毒样颗粒疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其中，所述禽流感病毒为H5亚型或H9亚型禽流感病毒。
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