CN111840533B - A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了A型口蹄疫病毒样颗粒抗原，其由A型口蹄疫病毒流行株VP0、VP3、VP1抗原蛋白组装而成，VP0、VP3、VP1抗原蛋白分别由特定序列的核苷酸序列编码。由该A型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备的疫苗，具有针对A型口蹄疫病毒流行株良好的免疫原性。其与O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备的疫苗能分别针对A型口蹄疫病毒流行株、O型口蹄疫病毒进行保护。

Description

A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和 应用

技术领域

本发明属于含抗原的医药配制品领域。具体地，本发明涉及一种A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、其制备的疫苗组合物、制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)为一种急性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病，是哺乳类动物中感染性最强的疾病之一，其中偶蹄类动物染病更会造成全球重大的经济损失。遭受口蹄疫危害的动物包括牛、羊和猪。致病因子为口蹄疫病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asia l、SAT1、SAT2和SAT3型)，其中我国主要流行O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒。疫苗免疫是控制此病、保护家畜免受危害的有效措施。

近年来，我国流行的A型口蹄疫病毒发生了极大的变化，与以往不同的是，在自然流行的过程中，A型口蹄疫病毒主要引起牛、羊感染和发病，猪的病例较少；然而目前流行的A型口蹄疫对牛、猪都有致病性，且毒力高于之前A型病毒10倍之多。目前还未有关于针对该新的A型口蹄疫病毒流行株的疫苗实际应用的报道。

病毒样颗粒(VLPs)是一种在体外和/或体内表达时能够自主包装成病毒外壳结构的类病毒粒子，它们是具有病毒的相似外壳结构但不具有病毒复制能力的假病毒。VLPs疫苗能有效地激发机体产生抗感染，抗肿瘤免疫，基于病毒样颗粒设计的疫苗是一种较为理想的疫苗形式。因此，筛选理想的口蹄疫毒株序列制备病毒样颗粒是当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病，保障畜牧业健康可持续发展的需要。

发明内容

为解决现有技术中A型口蹄疫病毒流行株无疫苗可用的问题，本发明提供了A型口蹄疫病毒样颗粒抗原，其中，所述A型口蹄疫病毒样颗粒抗原由A型口蹄疫病毒流行株VP0、VP3、VP1抗原蛋白组装而成，所述A型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白如Seq ID No.1所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述A型口蹄疫病毒VP1抗原蛋白如Seq ID No.3所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述A型口蹄疫病毒VP3抗原蛋白如Seq ID No.2所示核苷酸序列或其简并序列编码。

所述口蹄疫病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，其制备的疫苗组合物仅一次免疫就能提供对现在A型口蹄疫病毒流行株的完全保护。同时所述口蹄疫病毒样颗粒抗原具有良好的稳定性，在4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察仍可见病毒样颗粒依旧饱满，无聚集现象。

所述A型口蹄疫病毒样颗粒抗原来源于现在的流行株，能针对现在的流行野毒株产生完全保护，弥补了现有技术中灭活疫苗不能进行免疫保护的缺陷。

本发明还提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的A型口蹄疫病毒样颗粒抗原和药学上可接受的载体。

本发明的A型流行株口蹄疫病毒样颗粒疫苗在抗原含量仅为160μg/ml时，免疫后第14日也能达到1:128以上的抗体效价，且能维持长时期高滴度抗体效价，能针对整个育肥期产生保护；显示了良好的免疫原性。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述A型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160～240μg/ml。

A型流行株口蹄疫病毒样颗粒抗原含量可选自160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml、210μg/ml、220μg/ml、230μg/ml、240μg/ml。

即使当A型流行株口蹄疫病毒样颗粒抗原含量仅为160μg/ml，免疫后第14日也能达到1:128以上的抗体效价，即能产生免疫保护，且能维持长时期的高滴度的抗体效价。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述A型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160μg/ml、或200μg/ml、或240μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂选自：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；优选地，所述佐剂为ISA 206佐剂。

所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选从30％-60％V/V，更优选50％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括免疫量的SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和/或免疫量的CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原；其中，所述SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原由SEA型O型口蹄疫病毒流行株VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白组装而成，其中，所述SEA型O型口蹄疫病毒VP4抗原蛋白如Seq IDNo.4所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述SEA型O型口蹄疫病毒VP2抗原蛋白如Seq IDNo.5所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述SEA型O型口蹄疫病毒VP3抗原蛋白如Seq IDNo.6所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述SEA型O型口蹄疫病毒VP1抗原蛋白如Seq IDNo.7所示核苷酸序列或其简并序列编码；以及所述CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原由CATHAY型O型口蹄疫病毒流行株VP0、VP3、VP1抗原蛋白组装而成，其中，所述CATHAY型O型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白如Seq ID No.8所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述CATHAY型O型口蹄疫病毒VP3抗原蛋白如Seq ID No.9所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述CATHAY型O型口蹄疫病毒VP1抗原蛋白如Seq ID No.10所示核苷酸序列或其简并序列编码。

本发明的SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，疫苗免疫后第14日即能达到1:128以上的SEA型O型口蹄疫抗体效价。所述SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原具有良好的稳定性，在4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察仍可见病毒样颗粒依旧饱满，无聚集现象。

本发明的CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，疫苗免疫后第14日即能达到1:128以上的CATHAY型O型口蹄疫抗体效价。所述CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原具有良好的稳定性，在4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察仍可见病毒样颗粒依旧饱满，无聚集现象。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160～240μg/ml；所述CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160～240μg/ml。

SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量可选自160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml、210μg/ml、220μg/ml、230μg/ml、240μg/ml。

即使当SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量仅为160μg/ml，免疫后第14日也能达到1:128以上的抗体效价，即能产生免疫保护，且能维持长时期的高滴度的抗体效价，显示了良好的免疫原性。

CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量可选自160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml、210μg/ml、220μg/ml、230μg/ml、240μg/ml。

即使当CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量仅为160μg/ml，免疫后第14日也能达到1:128以上的抗体效价，即能产生免疫保护，且能维持长时期的高滴度的抗体效价，显示了良好的免疫原性。

本发明含有A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物，在三种抗原含量分别为160～240μg/ml的条件下，三种抗原协同增效，即使免疫剂量减半也能发挥各组分单苗的免疫效果。

作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160μg/ml、或200μg/ml、或240μg/ml；以及所述CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160μg/ml、或200μg/ml、或240μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)分别克隆、重组所述A型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白的基因、所述A型口蹄疫病毒VP1抗原蛋白的基因和所述A型口蹄疫病毒VP3抗原蛋白的基因到同一串联表达载体；步骤(2)转化或转导所述步骤(1)的重组表达载体到宿主，可溶性表达A型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白、VP1抗原蛋白和VP3抗原蛋白，表达的A型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白、VP1抗原蛋白和VP3抗原蛋白自我组装为病毒样颗粒抗原；以及步骤(3)分离、纯化所述步骤(2)的A型口蹄疫病毒样颗粒抗原，加入佐剂，得到所述的疫苗组合物。本发明通过表达A型流行株口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1抗原蛋白，能够得到稳定的自我组装的病毒样颗粒，表达高效，表达蛋白可占总蛋白的20％；通过串联表达A型流行株口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1抗原蛋白，表达的活性蛋白能高效自我组装成A型流行株口蹄疫病毒样颗粒抗原，利于后续的抗原纯化和分离。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(1)的串联表达载体为pET28a；所述步骤(2)的宿主为E.coli BL21(DE3)。

本发明通过选择串联表达载体和宿主菌，对VP0、VP3、VP1抗原蛋白进行串联表达，表达的可溶性蛋白具有生物活性，自我组装成为病毒样颗粒抗原，利于后续的抗原分离和纯化，简化了程序。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(2)中在宿主细胞扩增后，加入IPTG，诱导所述蛋白表达。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(3)的分离、纯化工序为破碎所述菌体后，取上清，采用硫酸铵分级沉淀法和色谱纯化所述病毒样颗粒抗原。

本发明利用大肠杆菌表达系统生产口蹄疫病毒样颗粒，具有产量高、生产成本低、免疫原性好、无生物安全风险等优点。本发明制备的病毒样颗粒疫苗组合物不仅能对A型流行株口蹄疫提供保护活性，并且抗体产生快，抗体产生水平高，免疫持续期长，能维持长时间的免疫保护。

本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗A型口蹄疫的药物中的应用。

本发明所述的制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的药物的施用对象包括猪。

本发明的疫苗组合物在一次免疫后，长达133天的时间里维持1:128以上的抗体效价，对猪体产生完全保护，该时长能涵盖整个育肥期。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

定义

“口蹄疫病毒”属于小RNA病毒科，口疮病毒属，该病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型，各型之间无交叉保护反应，每个类型内又有多个亚型。在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着的蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。口蹄疫病毒是偶蹄类动物高度传染性疾病——口蹄疫的病原，国际兽疫局将口蹄疫列为“A类动物传染病名单”中的首位，中国把它列为“进境动物检疫一类传染病”，我国对口蹄疫的防治，预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的动物则捕杀。

“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

“病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。

“口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1抗原蛋白”：FMDV结构蛋白前体蛋白P1被蛋白酶3C催化加工成VP0、VP1和VP3，这3种蛋白质自我组装成二十面体的病毒衣壳。VP0蛋白是P1经蛋白酶3C裂解后的中间体，在病毒粒子形成的最后阶段，VP0成熟裂解为VP2和VP4。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有口蹄疫病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对口蹄疫的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除口蹄疫病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括白油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。

“简并序列”：在分子生物学中，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性(degeneracy)，这样的序列就叫简并序列。

“基因重组”：是指控制不同性状的基因重新组合。现代基因工程技术在试管内按人为的设计实施基因重组，也称为重组DNA，目的是将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不同性状的个体细胞内DNA分子上，使之发生遗传变异。来自供体的目的基因被转入受体细菌后，可进行基因产物的表达，从而获得用一般方法难以获得的产品。

“转化(transformation)”是指通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。

“转导(transduction)”是指当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导。

术语“预防和/或治疗”在涉及口蹄疫病毒感染时是指抑制口蹄疫病毒的复制、抑制口蹄疫病毒的传播或防止口蹄疫病毒在其宿主体内定居，以及减轻口蹄疫病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例

材料及方法

载体的构建和转化

含有A型口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1基因的重组载体pET28a-VP0-VP3-VP1

由金唯智公司合成序列表SEQ ID NO.1所示的A型口蹄疫病毒VP0基因片段、序列表SEQ ID NO.2所示的A型口蹄疫病毒VP3基因片段、序列表SEQ ID NO.3所示的A型口蹄疫病毒VP1基因片段，分别与pBLUE-T Vector载体连接，将连接成功的重组克隆分别经BamHI/EcoR I、Sac I/Sal I、Hind III/Xho I酶切消化后得到的片段，与经过相同的酶切的pET28a载体连接。

将连接产物转化到用CaCl₂制备的DH5α感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基上，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取重组质粒pET28a-VP0-VP3-VP1。

将上述的插入A型口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1基因的重组质粒pET28a-VP0-VP3-VP1转化40μl以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可见时，挑取单克隆至含4ml卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃，230转/分振荡培养12小时，从中取1ml菌液于-80℃冻干保存。

含有SEA型O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1基因的重组载体

由金唯智公司合成序列表SEQ ID NO.4所示的SEA型O型VP4基因片段、序列表SEQID NO.5所示的SEA型O型VP2基因片段、序列表SEQ ID NO.6所示的SEA型O型VP3基因片段、序列表SEQ ID NO.7所示的SEA型O型VP1基因片段，构建带有重组质粒pET28a-VP4-VP2-VP3-VP1、能串联表达SEA型O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1基因的大肠杆菌表达菌株，于-80℃冻干保存。

含有CATHAY型O型口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1基因的重组载体

由金唯智公司合成序列表SEQ ID NO.8所示的CATHAY型O型VP0基因片段、序列表SEQ ID NO.9所示的CATHAY型O型VP3基因片段、序列表SEQ ID NO.10所示的CATHAY型O型VP1基因片段，构建带有重组质粒pET28a-VP0-VP3-VP1(CATHAY型O型)、能串联表达CATHAY型O型口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1基因的大肠杆菌表达菌株，于-80℃冻干保存。

抗原蛋白的表达及口蹄疫病毒样颗粒粒子的鉴定

A型口蹄疫病毒抗原和病毒样颗粒粒子

从-80℃中取出带有重组质粒pET28a-VP0-VP3-VP1的大肠杆菌菌种接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，37℃，230转/分振荡培养12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃培养，制备发酵用种子液。

使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将5L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到OD₆₀₀值大约10左右时将培养温度降至25℃，加入4gIPTG诱导培养12小时。终浓度OD₆₀₀值大约为40左右拆下发酵罐，离心收集菌体。

重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体4次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过15％SDS-PAGE电泳检测。采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳。

通过磷钨酸负染及电镜观察A型口蹄疫病毒样颗粒。

SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和病毒样颗粒粒子

从-80℃中取出带有重组质粒pET28a-VP4-VP2-VP3-VP1的大肠杆菌菌种接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，按上述制备A型口蹄疫病毒抗原相似的制备条件培养菌种，再转接入1L LB液体培养基中，37℃培养。

使用50L发酵罐，按上述A型口蹄疫病毒抗原相似的制备条件大规模发酵、表达SEA型O型口蹄疫病毒抗原。

按上述A型口蹄疫病毒抗原相似的制备条件分离、纯化和鉴定菌体中的串联表达的四个SEA型O型口蹄疫病毒抗原。

通过磷钨酸负染及电镜观察SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒。

CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和病毒样颗粒粒子

从-80℃中取出带有重组质粒pET28a-VP0-VP3-VP1(CATHAY型O型)的大肠杆菌菌种接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，按上述制备A型口蹄疫病毒抗原相似的制备条件培养菌种，再转接入1L LB液体培养基中，37℃培养。

使用50L发酵罐，按上述A型口蹄疫病毒抗原相似的制备条件大规模发酵、表达CATHAY型O型口蹄疫病毒抗原。

按上述A型口蹄疫病毒抗原相似的制备条件分离、纯化和鉴定菌体中的串联表达的三个CATHAY型O型口蹄疫病毒抗原。

通过磷钨酸负染及电镜观察CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒。

口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的制备

含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原疫苗组合物

取制备的A型口蹄疫病毒样颗粒抗原缓缓加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。

含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原和SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物

取制备的A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原，按上述制备含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原疫苗组合物的方法，制备疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。

含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物

取制备的A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原、CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原，按上述制备含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原疫苗组合物的方法，制备疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。

A型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的免疫原性分析

A型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的免疫原性

采用免疫后猪血清中抗体的ELISA抗体水平检测疫苗组合物中抗原的免疫原性。

选取A型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪，免疫制备的含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物，免疫途径为颈部肌肉注射2ml，空白对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后分别于第7日、14日、21日、28日采血。对采集的血清使用A型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行抗体的检测。

A型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的免疫持续期实验

采用免疫后猪血清中抗体的ELISA抗体水平检测疫苗组合物中抗原的免疫持续期。

选取A型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪，免疫制备的含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物，免疫途径为颈部肌肉注射2ml，空白对照组免疫等量的PBS，均一次免疫，疫苗免疫前每头猪采血，免疫后21日、28日、35日、77日、105日、133日采血。

商品化灭活苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株)免疫组作为对照组，免疫途径为颈部肌肉注射2ml，其空白对照组免疫等量的PBS，疫苗免疫前每头猪采血，免疫后第21日采血并进行第2次免疫，2次免疫后分别于第7日、14日、56日、84日、112日采血。

含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原和SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物中抗原免疫原性

采用免疫后猪血清中抗体的ELISA抗体水平检测疫苗组合物中抗原的免疫原性。

选取A型、O型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪，免疫制备的含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原和SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物，免疫途径为颈部肌肉注射2ml，空白对照组免疫2ml的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后分别于第7日、14日、21日、28日采血。

含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物中抗原免疫原性

采用免疫后猪血清中抗体的ELISA抗体水平检测疫苗组合物中抗原的免疫原性。

选取A型、O型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪，免疫制备的含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物，免疫途径为颈部肌肉注射1ml，对照组免疫含SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物，或免疫含CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物，免疫途径为颈部肌肉注射2ml，空白对照组免疫2ml的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后分别于第7日、14日、21日、28日采血。

实施例1 A型口蹄疫病毒样颗粒

重悬表达A型口蹄疫病毒抗原蛋白的菌体，通过SDS-PAGE电泳检测，此时上清中三个串联表达的蛋白其各自表达量均在20％左右。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。

通过磷钨酸负染及电镜观察可见A型口蹄疫蛋白形成了病毒样颗粒，并且形成的病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的病毒样颗粒。

实施例2 A型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的制备

制备的疫苗中各组分的具体配比见表1。

表1 A型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物成分配比

组分	疫苗1	疫苗2	疫苗3
				口蹄疫抗原(μg/ml)	160	200	240
ISA 206佐剂(V/V％)	50％	50％	50％

实施例3 含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物的免疫原性试验

选取A型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪20头，随机分为4组，每组5头。1-3组分别为本发明实施例2制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫组，第4组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS。

抗体效价结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第14日均能达到1:128以上。空白对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表2。

表2 A型口蹄疫ELISA抗体水平

表明本发明制备的病毒样颗粒能快速形成高水平的特异性抗体，即便抗原含量仅为160μg/ml，在免疫后第14天也能对A型口蹄疫起到很好的免疫保护作用。

实施例4 含A型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物的免疫持续期对比试验

选取A型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪20头，随机分为4组，每组5头。第5组为本发明实施例2制备的疫苗2免疫组，第7组为商品化灭活苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株)免疫组，第6组、第8组为对照组。第5组免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，第6组对照组免疫等量的PBS，均一次免疫，疫苗免疫前每头猪采血，免疫后21日、28日、35日、77日、105日、133日采血；第7组免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，第8组对照组免疫等量的PBS，疫苗免疫前每头猪采血，第7组、第8组免疫后第21日采血并进行第2次免疫，2次免疫后分别于第7日、14日、56日、84日、112日采血。

结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第21日疫苗2免疫组能达到1:128以上，商品苗免疫组不能达到1:128，商品苗免疫组2次免疫后第7日才能达到1:128；疫苗2免疫组1次免疫133日，依然维持较高的抗体水平，ELISA抗体可达1:180及以上，而商品苗免疫组2次免疫后第112日，部分猪只抗体水平接近1:128免疫保护临界值。对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表3。

表3 A型口蹄疫ELISA抗体水平比较结果

上述实验表明本发明制备的病毒样颗粒疫苗组合物与商品化全病毒灭活苗相比，对A型口蹄疫病毒样颗粒抗原不仅抗体产生快，抗体水平高，仅一次免疫就能起到很好的免疫保护作用，而且免疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护。

实施例5 SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒

重悬表达SEA型O型口蹄疫病毒蛋白抗原的菌体，通过SDS-PAGE电泳检测，此时上清中四个串联表达的蛋白其各自表达量均在20％左右。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。

通过磷钨酸负染及电镜观察可见SEA型O型口蹄疫蛋白形成了病毒样颗粒，并且形成的病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的病毒样颗粒。

实施例6 SEA型O型、A型二价口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的制备

制备的疫苗中各组分的具体配比见表4。在本实施例中，选用佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。

表4 SEA型O型、A型二价口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物成分配比

组分	疫苗4	疫苗5	疫苗6
				A型口蹄疫抗原(μg/ml)	160	200	240
O型口蹄疫抗原(μg/ml)	160	200	240
				ISA 206佐剂(V/V％)	50％	50％	50％

实施例7 SEA型O型、A型二价口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的免疫原性试验

选取A型、O型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪20头，随机分为4组，每组5头。9-11组分别为本发明实施例6制备的疫苗4、疫苗5、疫苗6免疫组，第12组为空白对照组。免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫2ml的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后分别于第7日、14日、21日、28日采血。

对采集的血清使用A型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第14日均能达到1:128以上；空白对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表5。

表5 A型口蹄疫ELISA抗体水平

对采集的血清使用SEA型O型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前各免疫组所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第14日均能达到1:128以上；空白对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表6。

表6 SEA型O型口蹄疫ELISA抗体水平

上述试验表明本发明制备的A型、SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物能快速形成高水平的特异性抗体，能对A型口蹄疫和SEA型O型口蹄疫起到很好的免疫保护作用。

实施例8 CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒

重悬表达CATHAY型O型口蹄疫病毒蛋白抗原的菌体，通过SDS-PAGE电泳检测，此时上清中三个串联表达的蛋白其各自表达量均在20％左右。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。

通过磷钨酸负染及电镜观察可见CATHAY型O型口蹄疫蛋白形成了病毒样颗粒，并且形成的病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的病毒样颗粒。

实施例9 SEA型O型、CATHAY型O型、A型二价口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的制备

制备的疫苗中各组分的具体配比见表7。在本实施例中，选用佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。

表7 SEA型O型、CATHAY型O型、A型二价口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物成分配比

实施例10 SEA型O型、CATHAY型O型、A型二价口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的免疫原性试验

选取A型、O型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪30头，随机分为6组，每组5头。13-15组分别为本发明实施例9制备的疫苗7、疫苗8、疫苗9免疫组，免疫途径为颈部肌肉注射1ml；16-17组分别为本发明实施例9制备的疫苗10、疫苗11免疫组，免疫途径为颈部肌肉注射2ml；第18组为空白对照组，免疫途径为颈部肌肉注射2ml的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后分别于第7日、14日、21日、28日采血。

对采集的血清使用A型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，第13组、第14组、第15组1次免疫后第14日均能达到1:128以上；第16组、第17组和空白对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表8；，第13组、第14组、第15组与实施例3、表2、实施例7、表5中A型口蹄疫抗体ELISA检测结果相比，在本发明SEA型O型、CATHAY型O型、A型二价口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中，三种抗原之间产生了协同增效作用，使得A型口蹄疫病毒样颗粒抗原在免疫剂量减半时仍能保证免疫效果。

表8 A型口蹄疫ELISA抗体水平

对采集的血清使用SEA型O型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，第13组、第14组、第15组、第16组1次免疫后第14日均能达到1:128以上；二价(三组份)口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物在免疫量1ml(常规用量2ml的一半)抗体水平依然达到或超过单价SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物在免疫量2ml抗体水平；第17组和空白对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表9；第13组、第14组、第15组与第16组中SEA型O型口蹄疫抗体ELISA检测结果相比，在本发明SEA型O型、CATHAY型O型、A型二价口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中，三种抗原之间产生了协同增效作用，使得SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原在免疫剂量减半时仍能保证免疫效果。

表9 SEA型O型口蹄疫ELISA抗体水平

对采集的血清使用CATHAY型O型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，第13组、第14组、第15组、第17组1次免疫后第14日均能达到1:128以上；二价(三组份)口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物在免疫量1ml(常规用量2ml的一半)抗体水平依然达到或超过单价CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物在免疫量2ml抗体水平；第16组和空白对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表10；第13组、第14组、第15组与第17组中CATHAY型O型口蹄疫抗体ELISA检测结果相比，在本发明SEA型O型、CATHAY型O型、A型二价口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中，三种抗原之间产生了协同增效作用，使得CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原在免疫剂量减半时仍能保证免疫效果。

表10 CATHAY型O型口蹄疫ELISA抗体水平

上述实验表明本发明制备的二价(三组份)口蹄疫病毒样颗粒能快速形成高水平的特异性抗体，在各抗原含量范围160～240μg/ml条件下，三种抗原之间相互协同增效，剂量减半时也能对A型口蹄疫、SEA型O型口蹄疫和CATHAY型O型口蹄疫起到很好的免疫保护作用；同时，也表明单价CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒能起很好的免疫反应，实现对猪的完全保护。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 909

<212> DNA

<213> A型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus type A）

<400> 1

ggtgctggtc agtcttctcc ggctaccggt tctcagaacc agtctggtaa caccggttct 60

atcatcaaca actactacat gcagcagtac cagaactcta tggacaccca gctgggtgac 120

aacgctatct ctggtggttc taacgaaggt tctaccgaca ccacctctac ccacaccacc 180

aacacccaga acaacgactg gttctctaaa ctggcttctt ctgctttcac cggtctgttc 240

ggtgctctgc tggctgacaa aaaaaccgaa gaaaccaccc tgctggaaga ccgtatcctg 300

accacccgta acggtcacac cacctctacc acccagtctt ctgttggtgt tacctgcggt 360

tactctaccg gtgaagacca cgtttctggt ccgaacacct ctggtctgga aacccgtgtt 420

gttcaggctg aacgtttctt caaaaaacac ctgttcgact ggaccaccga caaaccgttc 480

ggtcacaccg aaaaactgga actgccgacc gaacacaaag gtgtttacgg tcagctggtt 540

gaatctttcg cttacatgcg taacggttgg gacgttgaag tttctgctgt tggtaaccag 600

ttcaacggtg gttgcctgct ggttgctatg gttccggaat tcaaagaatt cacccagcgt 660

gaaaaatacc agctgaccct gttcccgcac cagttcatct ctccgcgtac caacatgacc 720

gctcacatca ccgttccgta cctgggtgtt aaccgttacg accagtacaa aaaacacaaa 780

ccgtggaccc tggttgttat ggttgtttct ccgctgacca cctcttctat cggtgctacc 840

cagatcaaag tttacgctaa catcgctccg acccacgttc acgttgctgg tgaactgccg 900

tctaaagaa 909

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<213> A型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus type A）

<400> 2

ggtatcgttc cggttgcttg ctctgacggt tacggtggtc tggttaccac cgacccgaaa 60

accgctgacc cggcttacgg tatggtttac aacccgccgc gtaccaacta cccgggtcgt 120

ttcaccaacc tgctggacgt tgctgaagct tgcccgacct tcctgtgctt cgacgacggt 180

aaaccgtaca tcgttacccg taccgacgaa cagcgtctgc tggctaaatt cgacctgtct 240

ctggctgcta aacacatgtc taacacctac ctgtctggta tcgctcagta ctacgctcag 300

tactctggta ccatcaacct gcacttcatg ttcaccggtt ctaccgactc taaagctcgt 360

tacatggttg cttacgttcc gccgggtgct gaaaccccgc cggacacccc ggaaaaagct 420

gctcactgca tccacgctga atgggacacc ggtctgaact ctaaattcac cttctctatc 480

ccgtacgttt ctgctgctga ctacgcttac accgcttctg acgaagctga aaccaccaac 540

gttcagggtt gggtttgcat ctaccagatc acccacggta aagctgaaca ggacaccctg 600

gttgtttctg tttctgctgg taaagacttc gaactgcgtc tgccgatcga cccgcgtgct 660

cag 663

<210> 3

<211> 636

<212> DNA

<213> A型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus type A）

<400> 3

accaccgcta ccggtgaatc tgctgacccg gttaccacca ccgttgaaaa ctacggtggt 60

gaaacccagg ttcagcgtcg ttaccacacc gacgttggtt tcctgatgga ccgtttcgtt 120

cagatcaaac cggttggtcc gacccacgtt atcgacctga tgcagaccca ccagcacggt 180

ctggttggtg ctatgctgcg tgctgctacc tactacttct ctgacctgga aatcgttgtt 240

aaccacaccg gtaacctgac ctgggttccg aacggtgctc cggaagctgc tctgcagaac 300

acctctaacc cgaccgctta ccacaaagct ccgttcaccc gtctggctct gccgtacacc 360

gctccgcacc gtgttctggc taccgtttac tctggtacct ctaaatactc tgctccgcag 420

aaccgtcgtg gtgactctgg tccgctggct gctcgtctgg ctgctcagct gccggcttct 480

ttcaacttcg gtgctatccg tgctaccgaa atccgtgaac tgctggttcg tatgaaacgt 540

gctgaactgt actgcccgcg tccgctgctg gctgttgaag tttcttctca ggaccgtcac 600

aaacagaaaa tcatcgctcc ggctaaacag ctgctg 636

<210> 4

<211> 255

<212> DNA

<213> SEA型O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus type O subtypeSEA）

<400> 4

ggtgctggtc agtcttctcc ggctaccggt tctcagaacc agtctggtaa caccggttct 60

atcatcaaca actactacat gcagcagtac cagaactcta tggacaccca gctgggtgac 120

aacgctatct ctggtggttc taacgaaggt tctaccgaca ccacctctac ccacaccacc 180

aacacccaga acaacgactg gttctctaaa ctggcttctt ctgctttctc tggtctgttc 240

ggtgctctgc tggct 255

<210> 5

<211> 654

<212> DNA

<213> SEA型O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus type O subtypeSEA）

<400> 5

gacaaaaaaa ccgaagaaac caccctgctg gaagaccgta tcctgaccac ccgtaacggt 60

cacaccacct ctaccaccca gtcttctgtt ggtatcaccc acggttacgc taccgctgaa 120

gacttcgttt ctggtccgaa cacctctggt ctggaaaccc gtgttatcca ggctgaacgt 180

ttcttcaaaa cccacctgtt cgactgggtt acctctgacc cgttcggtcg ttaccacctg 240

ctggaactgc cgaccgacca caaaggtgtt tacggttctc tgaccgactc ttacgcttac 300

atgcgtaacg gttgggacgt tgaagttacc gctgttggta accagttcaa cggtggttgc 360

ctgctggttg ctatggttcc ggaactgtgc tctatcgaac gtcgtgaact gttccagctg 420

accctgttcc cgcaccagtt catcaacccg cgtaccaaca tgaccgctca catcaaagtt 480

ccgttcgttg gtgttaaccg ttacgaccag tacaaagttc acaaaccgtg gaccctggtt 540

gttatggttg ttgctccgct gaccgttaac accgaaggtg ctccgcagat caaagtttac 600

gctaacatcg ctccgaccaa cgttcacgtt gctggtgaat tcccgtctaa agaa 654

<210> 6

<211> 660

<212> DNA

<213> SEA型O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus type O subtypeSEA）

<400> 6

ggtatcttcc cggttgcttg ctctgacggt tacggtggtc tggttaccac cgacccgaaa 60

accgctgacc cggtttacgg taaagttttc aacccgccgc gtaacatgct gccgggtcgt 120

ttcaccaacc tgctggacgt tgctgaagct tgcccgacct tcctgcactt cgacggtgac 180

gttccgtacg ttaccaccaa aaccgactct gaccgtgttc tggctcagtt cgacctgtct 240

ctggctgcta aacacatgtc taacaccttc ctggctggtc tggctcagta ctacacccag 300

tactctggta ccatcaacct gcacttcatg ttcaccggtc cgaccgacgc taaagctcgt 360

tacatgatcg cttacgctcc gccgggtatg gaaccgccga aaaccccgga agctgctgct 420

cactgcatcc acgctgaatg ggacaccggt ctgaactcta aattcacctt ctctatcccg 480

tacctgtctg ctgctgacta cgcttacacc gcttctggtg ctgctgaaac caccaacgtt 540

cagggttggg tttgcctgtt ccagatcacc cacggtaaag ctgaaggtga cgctctggtt 600

gttctggctt ctgctggtaa agacttcgaa ctgcgtctgc cggttgacgc tcgtcagcag 660

<210> 7

<211> 639

<212> DNA

<213> SEA型O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus type O subtypeSEA）

<400> 7

accacctcta ccggtgaatc tgctgacccg gttaccgcta ccgttgaaaa ctacggtggt 60

gaaacccagg ttcagcgtcg tcaccacacc gacgtttctt tcatcctgga ccgtttcgtt 120

aaagttaccc cgaaagactc tatcaacgtt ctggacctga tgcagacccc gccgcacacc 180

ctggttggtg ctctgctgcg taccgctacc tactacttcg ctgacctgga agttgctgtt 240

aaacacaaag gtgacctgac ctgggttccg aacggtgctc cggaagctgc tctggacaac 300

accaccaacc cgaccgctta ccacaaagct ccgctgaccc gtctggctct gccgtacacc 360

gctccgcacc gtgttctggc taccgtttac aacggtaact gcaaatacgc tggtggttct 420

ctgccgaacg ttcgtggtga cctgcaggtt ctggctcaga aagctgcttg gccgctgccg 480

acctctttca actacggtgc tatcaaagct acccgtgtta ccgaactgct gtaccgtatg 540

aaacgtgctg aaacctactg cccgcgtccg ctgctggctg ttcacccgtc tgctgctcgt 600

cacaaacaga aaatcgttgc tccggttaaa cagtctctg 639

<210> 8

<211> 909

<212> DNA

<213> CATHAY型O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus type Osubtype CATHAY）

<400> 8

ggtgctggtc agtcttctcc gaccaccggt tctcagaacc agtctggtaa caccggttct 60

atcatcaaca actactacat gcagcagtac cagaactcta tggacaccca gctgggtgac 120

aacgctatct ctggtggttc taacgaaggt tctaccgaca ccacctctac ccacaccaac 180

aacacccaga acaacgactg gttctctaaa ctggctaaca ccgctttctc tggtctgttc 240

ggtgctctgc tggctgacaa aaaaaccgaa gaaaccaccc tgctggaaga ccgtatcctg 300

accacccgta acggtcacac cacctctacc acccagtctt ctgttggtgt tacctacggt 360

tacgctaccg ctgaagactt cgtttctggt ccgaacacct ctggtctgga aacccgtgtt 420

gttcaggctg aacgtttctt caaaacccac ctgttcgact ggggtaccaa cgactctttc 480

ggtcgttgcc acctgctgga actgccgacc gaccacaaag gtgtttacgg ttctctgacc 540

gactcttacg cttacatgcg taacggttgg gacgttgaag ttaccgctgt tggtaaccag 600

ttcaacggtg gttgcctgct ggttgctatg gttccggaac tgcgttctat caccaaacgt 660

gaactgtacc agctgaccct gttcccgcac cagttcatca acccgcgtac caacatgacc 720

gctcacatca ccgttccgta cctgggtgtt aaccgttacg accagtacaa agttcacaaa 780

ccgtggaccc tggttgttat ggttgttgct ccgctgaccg ttaacaacga aggtgctccg 840

cagatcaaag tttacgctaa catcgctccg accaacgttc acgttgctgg tgaactgccg 900

tctaaagaa 909

<210> 9

<211> 660

<212> DNA

<213> CATHAY型O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus type Osubtype CATHAY）

<400> 9

ggtatcttcc cggttgcttg ctctgacggt tacggtggtc tggttaccac cgacccgaaa 60

accgctgacc cggtttacgg taaagttttc aacccgccgc gtaacctgct gccgggtcgt 120

ttcaccaacc tgctggacgt tgctgaagct tgcccgacct tcctgcactt cgacggtgac 180

gttccgtacg ttgttaccaa aaccgactct gaccgtgttc tggctcagtt cgacctgtct 240

ctggctgcta aacacatgtc taacaccttc ctggctggtc tggctcagta ctacgctcag 300

tactctggta ccatcaacct gcacttcatg ttcaccggtc cgaccgacgc taaagctcgt 360

tacatggttg cttacgctcc gccgggtatg gaaccgccga aaaccccgga agctgctgct 420

cactgcatcc acgctgaatg ggacaccggt ctgaactcta aattcacctt ctctatcccg 480

tacctgtctg ctgctgacta cgcttacacc gcttctgacg ttgctgaaac caccaacgtt 540

cagggttggg tttgcctgtt ccagatcacc cacggtaaag ctgacggtga cgctctggtt 600

gttctggctt ctgctggtaa agacttcgac ctgcgtctgc cggttgacgc tcgtacccag 660

<210> 10

<211> 633

<212> DNA

<213> CATHAY型O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus type Osubtype CATHAY）

<400> 10

accacctctg ctggtgaatc tgctgacccg gttaccacca ccgttgaaaa ctacggtggt 60

gaaacccagg ttcagcgtcg tcagcacacc gacgttgctt tcatcctgga ccgtttcgtt 120

aaagttaaac cgcaggaaca ggttaacgtt ctggacctga tgcagatccc ggctcacacc 180

ctggttggtg ctctgctgcg taccgctacc tactacttct ctgacctgga actggctgtt 240

aaacacgaag gtgacctgac ctgggttccg aacggtgctc cggaaaccgc tctggacaac 300

accaccaacc cgaccgctta ccacaaagaa ccgctgaccc gtctggctct gccgtacacc 360

gctccgcacc gtgttctggc taccgtttac aacggttctt ctaaatacgg tgacgcttct 420

accaacaacg ttcgtggtga cctgcaggtt ctggttaaaa aagctgaacg tgctctgccg 480

acctctttca actacggtgc tatcaaagct gctcgtgtta ccgaactgct gtaccgtatg 540

aaacgtgctg aaacctactg cccgcgtccg ctgctggcta tccagccgtc taccgctcgt 600

cacaaacaga aaatcgttgc tccggctaaa cag 633

Claims (17)

1.A型口蹄疫病毒样颗粒抗原，其中，所述A型口蹄疫病毒样颗粒抗原由A型口蹄疫病毒流行株VP0、VP3、VP1抗原蛋白组装而成，所述A型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白如Seq ID No.1所示核苷酸序列编码，所述A型口蹄疫病毒VP1抗原蛋白如Seq ID No.3所示核苷酸序列编码，所述A型口蹄疫病毒VP3抗原蛋白如Seq ID No.2所示核苷酸序列编码。

2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1所述的A型口蹄疫病毒样颗粒抗原和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述A型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160~240μg/ml。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述A型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160μg/ml、或200μg/ml、或240μg/ml。

5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂选自白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；所述佐剂含量为5%-60%V/V。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，皂苷为Quil A、QS-21或GPI-0100。

7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂为ISA 206佐剂。

8.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂含量为30%-60% V/V。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂含量为50%V/V。

10.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括免疫量的SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和/或免疫量的CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原；其中，

所述SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原由SEA型O型口蹄疫病毒流行株VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白组装而成，其中，所述SEA型O型口蹄疫病毒VP4抗原蛋白如Seq ID No.4所示核苷酸序列编码，所述SEA型O型口蹄疫病毒VP2抗原蛋白如Seq ID No.5所示核苷酸序列编码，所述SEA型O型口蹄疫病毒VP3抗原蛋白如Seq ID No.6所示核苷酸序列编码，所述SEA型O型口蹄疫病毒VP1抗原蛋白如Seq ID No.7所示核苷酸序列编码；以及

所述CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原由CATHAY型O型口蹄疫病毒流行株VP0、VP3、VP1抗原蛋白组装而成，其中，所述CATHAY型O型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白如Seq ID No.8所示核苷酸序列编码，所述CATHAY型O型口蹄疫病毒VP3抗原蛋白如Seq ID No.9所示核苷酸序列编码，所述CATHAY型O型口蹄疫病毒VP1抗原蛋白如Seq ID No.10所示核苷酸序列编码。

11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中，所述SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160~240μg/ml；所述CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160~240μg/ml。

12.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其中，所述SEA型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160μg/ml、或200μg/ml、或240μg/ml。

13.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其中，所述CATHAY型O型口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160μg/ml、或200μg/ml、或240μg/ml。

14.一种制备权利要求2所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：

步骤（1）分别克隆、重组所述A型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白的基因、所述A型口蹄疫病毒VP1抗原蛋白的基因和所述A型口蹄疫病毒VP3抗原蛋白的基因到同一串联表达载体；

步骤（2）转化或转导所述步骤（1）的重组表达载体到宿主，可溶性表达A型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白、VP1抗原蛋白和VP3抗原蛋白，表达的A型口蹄疫病毒VP0抗原蛋白、VP1抗原蛋白和VP3抗原蛋白自我组装为病毒样颗粒抗原；以及

步骤（3）分离、纯化所述步骤（2）的A型口蹄疫病毒样颗粒抗原，加入佐剂，得到所述的疫苗组合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤（1）的串联表达载体为pET28a；所述步骤（2）的宿主为E.coli BL21 DE3。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤（2）中在宿主细胞扩增后，加入IPTG，诱导所述蛋白表达。

17.根据权利要求2~13任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗A型口蹄疫的药物中的应用。