CN113461786B - 一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种禽流感病毒样颗粒疫苗，该禽流感病毒样颗粒疫苗包括免疫量的H5亚型和/或H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体，该禽流感病毒样颗粒抗原由H5亚型和/或H7亚型禽流感病毒HA、NA和M1抗原蛋白组装而成。本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗具有良好的免疫原性，低剂量时较更高抗原含量的商用灭活疫苗免疫效果更好。

Description

一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种提供针对禽流感病毒进行保护的病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用。

背景技术

病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，是由病毒的结构蛋白组装而成的介于15nm～400nm的空心颗粒。VLPs的制备可以通过体外高效表达某种病毒的一种(或几种)结构蛋白，使其自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒。其方法主要是将病毒结构蛋白基因克隆到表达载体中，再将这些载体转入原核或真核细胞中进行表达。

禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科，流感病毒属，A型流感病毒。禽流感(Avian Influenza，AI)是由该病毒引起的禽类感染和疾病综合症。国际兽医局(OIE)和我国《家畜家禽防疫条例》均将该病列为A类烈性传染病。目前在世界上许多国家和地区都有该病发生的报道，其中尤为以H5亚型、H7亚型毒株引起的高致病性禽流感(HPAI)更为严重，其以突然发病和高死亡率为主要特征，常常导致饲养鸡群的全部死亡。

截止到目前，接种全病毒疫苗仍然是预防和控制禽流感病毒流行的最有效手段。然而，由于禽流感病毒的变异速度远远大于变异株相应疫苗的研发制备速度，而且不同亚型之间几乎不产生交叉免疫保护，因此禽流感疫苗的生产需要时时、不断更新，而针对流感病毒流行株相应疫苗的生产周期较长、生产成本较高，造成人力、物力的浪费，还有可能达不到理想的防控效果。

目前现有技术中文献研究发表的禽流感病毒样颗粒疫苗虽然能产生较好的免疫应答，但依然达不到商品化全病毒疫苗的免疫效果，且普遍表达效率较低，为此，筛选理想的禽流感毒株序列制备一种免疫效果良好、安全、成本可控的禽流感病毒样颗粒疫苗是当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病，保障畜牧业健康可持续发展的需要。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种禽流感病毒样颗粒抗原，其中，所述禽流感病毒样颗粒抗原由H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白组装而成，所述H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白分别如Seq ID No.1、2、3所示核苷酸序列或其简并序列编码或如SeqID No.4、5、6所示核苷酸序列或其简并序列编码。

所述H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，能提供对H5亚型禽流感病毒的完全保护，其免疫效力与相同HA抗原含量的灭活苗相当或更优。

本发明还提供一种禽流感病毒样颗粒疫苗组合物，其中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗组合物包括免疫量的所述的一种或两种H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗组合物中，所述H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2。

本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗中H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量HA效价可以任意选自6.0log2、6.1log2、6.2log2、6.3log2、6.4log2、6.5log2、6.6log2、6.7log2、6.8log2、6.9log2、7.0log2、7.1log2、7.2log2、7.3log2、7.4log2、7.5log2、7.6log2、7.7log2、7.8log2、7.9log2、8.0log2。

本发明的H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，当其含量为HA效价6log2时，也能产生完全保护，在免疫后14天即可产生针对禽流感的完全保护，其免疫效果较更高HA抗原效价的灭活苗免疫效果更优。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂选自：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；优选地，所述佐剂为矿物油佐剂，其用于制备油包水乳剂。所述佐剂含量为5％-70％V/V，优选从30％-70％V/V，更优选66％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括免疫量的H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原；其中，所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原由H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白组装而成，所述H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白分别如Seq ID No.7、8、9所示核苷酸序列或其简并序列编码。

所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，能提供对H7亚型禽流感病毒的完全保护，其免疫效力与相同HA抗原含量的灭活苗相当或更优。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽流感病毒样颗粒疫苗组合物中，所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2。

本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗中H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量HA效价可以任意选自6.0log2、6.1log2、6.2log2、6.3log2、6.4log2、6.5log2、6.6log2、6.7log2、6.8log2、6.9log2、7.0log2、7.1log2、7.2log2、7.3log2、7.4log2、7.5log2、7.6log2、7.7log2、7.8log2、7.9log2、8.0log2。

本发明的H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，当其含量为HA效价6log2时，也能产生完全保护，在免疫后14天即可产生针对禽流感的完全保护，其免疫效果较更高HA抗原效价的灭活苗免疫效果更优。

作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明还涉及一种制备所述的禽流感病毒样颗粒疫苗的方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)将所述禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因克隆到同一载体；

步骤(2)将所述步骤(1)获得的载体经转化或转导重组获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒；

步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述含有HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9，串联表达所述HA、NA、M1抗原蛋白；以及

步骤(4)分离在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中的由所述HA、NA、M1抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒抗原，加入佐剂，混匀得到所述的疫苗组合物。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的制备禽流感病毒样颗粒疫苗的方法中，所述步骤(1)中所述禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因为H5亚型或H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因，所述H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因分别由序列Seq IDNo.1、2、3所示或由序列Seq ID No.4、5、6所示，所述H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因分别由序列Seq ID No.7、8、9所示。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的制备方禽流感病毒样颗粒疫苗的法中，所述步骤(1)中载体为pFastBac I；所述步骤(2)中所述的杆状病毒质粒为Bacmid。

本发明还涉及所述的禽流感病毒样颗粒疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的应用中，所述禽流感病毒为H5亚型和/或H7亚型禽流感病毒。

本发明所述的制备预防和/或治疗禽流感病毒感染的药物的施用对象包括鸡。

本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗其抗原为禽流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA、神经氨酸酶NA和基质蛋白M1的自我装配体。本发明利用昆虫杆状病毒表达系统生产禽流感病毒样颗粒抗原，具有产量高，生产成本低，免疫原性好，无生物安全风险等优点，不仅能对H5亚型2.3.4.4d分支以及H5亚型2.3.2.1d分支禽流感提供保护活性，还能对H7亚型禽流感提供保护活性。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

定义

“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

“病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有禽流感病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对禽流感的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除禽流感病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括矿物油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。

“简并序列”：在分子生物学中，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性(degeneracy)，这样的序列就叫简并序列。

“基因重组”：是指控制不同性状的基因重新组合。现代基因工程技术在试管内按人为的设计实施基因重组，也称为重组DNA，目的是将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不同性状的个体细胞内DNA分子上，使之发生遗传变异。来自供体的目的基因被转入受体细菌后，可进行基因产物的表达，从而获得用一般方法难以获得的产品。

“转化(transformation)”是指通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。

“转导(transduction)”是指当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导。

术语“预防和/或治疗”在涉及禽流感病毒感染时是指抑制禽流感病毒的复制、抑制禽流感病毒的传播或防止禽流感病毒在其宿主体内定居，以及减轻禽流感病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 H5亚型禽流感病毒样颗粒的表达

1、载体改造

以商品化载体pFastBac I为模板，在4413-4414位处依次插入NdeI、NotI、SalI和XbaI限制性酶切位点。PCR产物加入D pn I酶1μl消化掉模板质粒，取5μl按照常规方法转化DH 5α，改造成功的质粒命名为pFastBac mut。

2、三表达盒供体质粒的构建

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表Seq ID NO.1所示的HA基因、Seq IDNO.2所示的NA基因、Seq ID NO.3所示的M1基因，基因上游、下游分别加内切酶BamHI和HindIII酶切位点。分别将合成的HA基因、NA基因、M1基因通过BamHI和HindIII酶切，和同样酶切的pFastBac mut进行连接，连接产物转化DH5α，鉴定正确的质粒命名为pFastBac mut-HA-1、pFastBac mut-NA-1和pFastBac mut-M1-1。

以pFastBac mut-HA-1和pFastBac mut-NA-1为模板，分别扩增HA和NA表达盒，将HA表达盒插入pFastBac mut-M1-1质粒中，质粒命名为pFastBac mut-M1-HA-1；再将NA表达盒插入pFastBac mut-M1-HA-1中，质粒命名为pFastBac mut-M1-HA-NA-1。

3、重组Bacmid构建及鉴定

将2μl pFastBac mut-M1-HA-NA-1质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激45s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基37℃200rpm 4h，取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物经鉴定正确，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组杆粒的提取，命名为Bacmid-M1-1。

4、重组杆状病毒的获得及传代

将重组杆粒Bacmid-M1-1转染昆虫细胞sf9。参照

Regent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为rBac-M1-1 P1。

将对数生长期的sf9细胞按照0.9×10⁶cell/dish接种10cm细胞培养皿，待细胞完全贴壁后，将P1代重组杆状病毒按1:20-1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤按照1:100-200比例接种获得P3、P4代重组杆状病毒。

5、蛋白的表达及鉴定

将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心收获上清。经测定细胞外上清中HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态。

同上述方法，由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表Seq ID NO.4所示的HA基因、Seq ID NO.5所示的NA基因、Seq ID NO.6所示的M1基因，构建重组杆状病毒，命名为rBac-M1-2。将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心收获上清。经测定细胞外上清中HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态。

实施例2 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备

将实施例1收获的病毒样颗粒分别加入到矿物油佐剂中，制备各疫苗组合物，具体配比见表1。

表1 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗组合物配比

组分

疫苗1

疫苗2

疫苗3

疫苗4

疫苗5

疫苗6

rBac-M1-1(HA含量)

6log2

8log2

-

-

6log2

8log2

rBac-M1-2(HA含量)

-

-

6log2

8log2

6log2

8log2

佐剂(V/V％)

66％

66％

66％

66％

66％

66％

实施例3 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第1组～第6组分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的疫苗1～疫苗6，第7组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-11+Re-12)、H7(H7-Re2)三价灭活苗，H5HA含量均为8log2)，免疫剂量为0.3ml，第8组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后14日、21日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表2、3。

表2 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果1

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-11)标准抗原

结果显示，第1组、第2组、第5组、第6组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护，超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第7组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护；第1组、第5组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第2组、第6组免疫组和第7组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第2组、第6组免疫反应产生更快，14日即可达到第7组商品化疫苗21日的HI抗体平均值；在相同HA剂量免疫下，第5组、第6组多组分免疫组HI抗体效价平均值高于第1组、第2组单组分免疫组。表明本发明实施例2制备的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗1、疫苗2)，还是多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快；本发明提供的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)免疫效果更好。

表3 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果2

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-12)标准抗原

结果显示，第3组、第4组、第5组、第6组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护，超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第7组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护；第3组、第5组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第4组、第6组免疫组和第7组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第2组、第6组免疫反应产生更快，14日即可达到第7组商品化疫苗21日的HI抗体平均值；在相同HA剂量免疫下，第5组、第6组多组分免疫组HI抗体效价平均值高于第3组、第4组单组分免疫组。表明本发明实施例2制备的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗3、疫苗4)，还是多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快；本发明提供的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)免疫效果更好。

表明，本发明提供的病毒样颗粒疫苗均具有较好的免疫效果，多组分的病毒样颗粒疫苗产生了协同作用，免疫效果更好。

实施例4 H7亚型禽流感病毒样颗粒的表达

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表Seq ID NO.7所示的HA基因、Seq IDNO.8所示的NA基因、Seq ID NO.9所示的M1基因，参照实施例1的方法构建重组杆状病毒，命名为rBac-M1-3。将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心收获上清。经测定细胞外上清中HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态。

实施例5 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备

将实施例1、实施例4收获的病毒样颗粒分别加入到矿物油佐剂中，制备各疫苗组合物，具体配比见表1。

表4 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗组合物配比

实施例6H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第9组～第12组分别经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗7～疫苗10，第13组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-11+Re-12)、H7(H7-Re2)三价灭活苗，H7HA含量为8log2)，免疫剂量为0.3ml，第14组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后14日、21日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表5、6、7。

表5 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果1

*备注：使用哈兽研H7(H7-Re2)标准抗原

结果显示，第9组、第10组、第11组、第12组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H7亚型感染的免疫保护，超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第13组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H7亚型感染的免疫保护；第9组、第11组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第10组、第12组免疫组和第13组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第10组、第12组免疫反应产生更快，14日即可达到第13组商品化疫苗21日的HI抗体平均值。表明本发明实施例5制备的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗7、疫苗8)，还是多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗9、疫苗10)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。

表6 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果2

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-11)标准抗原

结果显示，第11组、第12组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护，超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第13组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护；第11组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第12组免疫组和第13组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第12组免疫反应产生更快，14日即可达到第13组商品化疫苗21日的HI抗体平均值。表明本发明实施例5制备的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗9、疫苗10)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。

表7 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果3

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-12)标准抗原

结果显示，第11组、第12组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护，超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第13组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护；第11组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第12组免疫组和第13组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第12组免疫反应产生更快，14日即可达到第13组商品化疫苗21日的HI抗体平均值。表明本发明实施例5制备的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗9、疫苗10)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。

综上，本发明提供的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗，还是多组分的病毒样颗粒疫苗均能提供理想的免疫效力，且本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。实施例7禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验

取21日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第15组经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗9，第16组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-11+Re-12)、H7(H7-Re2)三价灭活苗，H5、H7HA含量均为8log2)，免疫剂量为0.3ml，第17组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日、56日、84日、112日、140日、168日、196日、224日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表8、9、10。

表8禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验结果1

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-11)标准抗原

结果显示，疫苗9免疫组在免疫持续期时间较商品化疫苗免疫组长，在32周(224天)时HI抗体效价平均值依然高于6log2，能达到针对H5亚型2.3.4.4d分支的完全保护。表明本发明提供的高效表达的病毒样颗粒疫苗不仅免疫原性好，同时维持长时期的免疫。

表9禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验结果2

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-12)标准抗原

结果显示，疫苗9免疫组在免疫持续期时间较商品化疫苗免疫组长，在32周(224天)时HI抗体效价平均值依然高于6log2，能达到针对H5亚型2.3.2.1d分支的完全保护。表明本发明提供的高效表达的病毒样颗粒疫苗不仅免疫原性好，同时维持长时期的免疫。

表10禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验结果3

*备注：使用哈兽研H7(H7-Re2)标准抗原

结果显示，疫苗9免疫组在免疫持续期时间较商品化疫苗免疫组长，在32周(224天)时HI抗体效价平均值依然高于6log2，能达到针对H7亚型的完全保护。表明本发明提供的高效表达的病毒样颗粒疫苗不仅免疫原性好，同时维持长时期的免疫。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1692

<212> DNA

<213> H5亚型禽流感病毒

<400> 1

atggaaaaga tcgtgctgct gctcagcgtg gtgtccctgg ttaagtccga ccagatctgc 60

atcggatacc acgccaacaa ctccactgaa caagtggaca ccatcatgga gaagaacgtt 120

accgttactc acgctcagga catcctggag aagacccaca acggcaagct gtgtgacctg 180

aacggtgtga agcccctgat cctgaaggac tgtagcgtgg ctggatggct gctcggtaac 240

ccaatgtgtg acgagttcat ccgtgtgcca gagtggtcct acatcgtcga acgcgctaac 300

ccttccaacg acctgtgcta ccctggcaac ctgaacgact acgaagaact gaagcacctg 360

ctctctcgca ttaaccactt cgaaaaaacc cagatcatcc ccaagagatc ctggtctaac 420

cacacttcat ccggtgtgag cgctgcctgc ccataccagg gtgtggcctc cttcttccgc 480

aacgttgttt ggctgaccaa gaaaaacgac gcctacccta caatcaagat gtcatacaac 540

aacactaaca aggaggacct cctgatcttg tggggaatcc accactccaa ctccgctgaa 600

gaacagacta acctgtacaa gaaccctacc acctacgtga gcgtgggtac ctctaccctg 660

aaccaacgtc tggtgcctaa gatcgccact cgtagccaag tcaacggaca gaggggccgt 720

atggacttct tctggacaat cctccgccct aacgacgcca tccacttcga gtccaacggt 780

aacttcatcg ctcctgaata cgcctacaag atcatcaaga caggagacag cactatcatg 840

aagagcgaaa tcgaatacgg taactgtaac actaagtgcc agactcccat cggcgctatc 900

aactcatcca tgcctttcca caacatccac ccactcacta tcggtgaatg ccctaagtac 960

gtgaagagca acaagctggt gctggccaca ggcctgcgta actcccctct gcgtgaaaag 1020

aggggcctgt tcggtgctat cgctggcttc atcgagggcg gctggcaggg aatggttgac 1080

ggctggtacg gctaccacca ctctaacgag cagggtagcg gttacgctgc tgaccgtgag 1140

tccacacaga aggctatcga cggtgtgaca aacaaggtga actccatcat cgataagatg 1200

aacacccagt tcgaagccgt gggccgtgag ttcaactccc tcgaacgtcg catcgagaac 1260

ctcaacaaga agatggaaga cggtttcctc gacgtgtgga cctacaacgc cgaactgttg 1320

gtgctcatgg aaaacgagcg cactctggac ttccacgaca gcaacgtgaa gaacctgtac 1380

gacaaggtgc gtttgcagct ccgcgacaac gctaaggagt tgggaaacgg ttgtttcgag 1440

ttctaccaca agtgtgacaa cgaatgtatg gagtcagtgc gcaacggtac atacgactac 1500

cctcaatact ctgaagaggc ccgtctcaag cgtgaggaaa tctctggagt taagctggag 1560

tctatcggta cctaccagat cctgtccatc tactccacag ttgcttcctc cttggtcttg 1620

gctatcatcg tcgccggcct cagcctctgg atgtgttcca acggttccct ccagtgtcgc 1680

atctgcatct aa 1692

<210> 2

<211> 1380

<212> DNA

<213> H5亚型禽流感病毒

<400> 2

atgaacccta accagaagat cacctgtatc agcgctacag gtgttacatt gagcgttgta 60

agcctgctga tcggtatcgc caacctgggt ctgaacatcg gactgcacta caaggtttct 120

gattctacca caatcaacat ccctaagact aacgaaacta acccaacaac cactaacatc 180

acaaacatca tcgttaacaa gaacgaggaa aagacattcc tgaagttgac taagcctctg 240

tgtgaagtga actcatggca catcttgtct aaggacaacg ccatccgtat cggcgaagac 300

gctcacatcc tcgttacacg cgaaccatac ctgagctgtg acccccaggg ttgccgtatg 360

ttcgccctga gccaaggcac caccctccgt ggccagcacg ctaacggtac tatccacgac 420

cgtagcccat tccgcgctct catcagttgg gaaatgggtc aggctccttc cccttacaac 480

acccgtgtgg aatgcatcgg ctggtcctcc acaagctgtc acgacggcat cagccgcatg 540

agcatctgta tctcaggtcc gaacaacaac gcttccgccg tggtctggta ccgtggtcgt 600

cctgtgaccg agatccctag ctgggccggc aacatcctgc gtacacacga gtccgagtgc 660

gtgtgccata agggcatctg ccccgtggtt atgactgacg gccccgccaa caacaaggcc 720

gctaccaaga tcatctactt caaggagggc atgatccaga aggctgaaga actgcagggt 780

aacgcccagc acatcgaaga atgctcctgt tacggtgctg cccgcatgat caagtgtgtg 840

tgccgtgaca actggaaggg cgctaaccgc cccgtgatca tcatcgaccc agagatgatg 900

actcacactt ccaagtacct gtgttccaag atcctgaccg acacttcccg ccctaacgac 960

ccaaccaacg gcaactgcga cgcccccatc accggtggca gcccagaccc aggtgtgaag 1020

ggcttcgctt tcctggacgg tgagaactcc tggctgggcc gtaccatctc taaggacagc 1080

cgttccggct acgagatgct gaaggtgcct aacgctgaga tcgacactca gtccggtcct 1140

atcagctacc agctgatcgt gaacaaccag aactggagcg gttactccgg cgccttcatc 1200

gactactggg ccaacaagga gtgcttcaac ccctgcttct acgttgaact gatccgtggt 1260

cgccctaagg aatccggcgt gctgtggacc agcaacagca tggtggccct gtgtggtagc 1320

cgtgagcgtc tcggttcctg gagctggcac gacggcgctg agatcatcta cttcaagtaa 1380

<210> 3

<211> 759

<212> DNA

<213> H5亚型禽流感病毒

<400> 3

atgagcctgc tgaccgaagt tgaaacttac gttctgtcaa tcatccctag cggtcctctg 60

aaggctgaaa tcgctcagaa gctcgaagac gttttcgccg gaaagaacgc tgatctggag 120

gctttgatgg aatggctgaa gacccgccct atcctgtccc ctctgactaa gggcatcctg 180

ggtttcgtgt tcaccctgac cgtgcctagc gaacgcggcc tgcagcgtcg ccgcttcgtg 240

cagaacgccc tgaacggtaa cggtgaccct aacaacatgg accgcgctgt gaagctgtat 300

aagaagctga agcgtgagat caccttccac ggtgctaagg aggtggccct gagctacagc 360

accggtgctc tggcttcctg tatgggtctg atctacaacc gtatgggcac cgtgaccact 420

gaggtggctt tcggcctggt gtgtgccact tgtgaacaga tcgctgactc ccagcaccgt 480

agccaccgcc agatggctac catcaccaac cctctgatcc gtcacgaaaa ccgtatggtg 540

ctggcctcca ccaccgctaa ggccatggaa cagatggccg gttcctccga acaggctgct 600

gaagctatgg aggtcgctaa ccaagctagg cagatggtgc aggctatgag gactatcgga 660

actcacccta actcatccac aggactccgt gataaccttc tcgaaaacct ccaggcttac 720

caaaagcgta tgggtgttca aatgcaacgt ttcaagtaa 759

<210> 4

<211> 1695

<212> DNA

<213> H5亚型禽流感病毒

<400> 4

atggagaaga tcgtcctgtt cttcgctaca atcagcctgg ttaagtccga ccacatctgt 60

atcggttacc acgctaacaa ctctacagag caggtggaca ccatcatgga gaagaacgtt 120

acagtcaccc acgctaagga catcctggaa aagactcaca acggcaagct gtgtgacctg 180

aacggtgtga agcccctcat cctgaaggac tgcagcgtgg ctggttggct gctcggtaac 240

ccactgtgtg acgagttcac caacgttccc gagtggtcct acatcgttga gaaggctaac 300

cctgctaacg acctgtgcta ccccggaaac ttcaacgact acgaagagct gaagcacctg 360

ctgtcccgca tcaaccactt cgaaaagatc cagatcatcc ccaaggacag ctggagcgac 420

cacgaagcct ccctcggcgt gtctgctgct tgtagctacc agggcaactc ctcattcttc 480

cgcaacgtgg tgtggctgat caagaaggac aacgcttacc ctacaatcaa gaagtcctac 540

aacaacacta acagggaaga tttgctgatc ctgtggggca tccaccaccc taacgacgaa 600

gccgagcaga caaagctcta ccagaaccct acaacttaca tctcaatcgg tacatccact 660

ctgaaccagc gtctcgtgcc aaagatcgcc actcgttcta agatcaacgg ccagtcagga 720

cgcatcgact tcttctggac aatcctcaag cccaacgacg ccatccactt cgaatcaaac 780

ggcaacttca tcgcccctga atacgcttac aagatcgtta agaagggtga ctccactatc 840

atgcgttcag aggttgaata cggtaactgc aacactcgct gccaaacccc tatcggcgcc 900

atcaacagct ctatgccttt ccacaacatc cacccattga caatcggaga atgtcctaag 960

tacgttaagt ctaacaagtt ggttctggcc acaggtctgc gcaacagccc cctccgcgaa 1020

aagcgcggcc tgttcggagc catcgctggt ttcatcgagg gtggctggca gggtatggtt 1080

gacggctggt acggttacca ccactccaac gagcaaggct ccggatacgc cgctgataag 1140

gagagcaccc agaaggccat cgatggagtg actaacaagg tgaactccat catcgacaag 1200

atgaacaccc agttcgaagc cgtgggccgt gagttcaaca acctggaacg tcgcatcgag 1260

aacctgaaca agaagatgga agacggtttc ctggacgtct ggacttacaa cgctgaactc 1320

ctggtcctga tggaaaacga acgcaccctg gacttccacg actccaacgt gaagaacctg 1380

tacgacaagg tccgtctcca actgaaggac aacgctaagg aactgggaaa cggttgcttc 1440

gagttctacc acaagtgtaa caacgaatgt atggagagcg tgaagaacgg tacctacgac 1500

taccctcagt acagcgaaga agctcgcctg aagcgtgaag aaatctccgg cgtgaagctg 1560

gagtctatcg gcatctacca gatcctgtct atctacagca cagtggcttc cagcctcgtg 1620

ctggccatca tgatggccgg tctgagcctc tggatgtgta gcaacggttc cctgcagtgt 1680

cgcatctgta tctaa 1695

<210> 5

<211> 1350

<212> DNA

<213> H5亚型禽流感病毒

<400> 5

atgaacccta accagaagat cgtgaccatc ggtagcatct gcatggtcat cggtatcatc 60

agcctgatgc tgcagatcgg caacatcatc tccatctggg tgagccactc tatccaaact 120

ggcaaccagc accaaaccga accaatccgt aacactaact tcctgactga gaacacagtc 180

gcttctgtta cactggccgg aaactcttct ttgtgcccca tcaagggctg ggctgtgcac 240

tccaaggaca acagcatccg catcggttcc aagggcgacg tgttcgtgat ccgtgagccc 300

ttcatctctt gtagccacct ggagtgtcgc acattcttcc tgacccaggg tgccctcctg 360

aacgacaagc actccaacgg tactgttaag gaccgcagcc cacaccgcac actcatgagc 420

tgccctatcg gcgaggctcc cagcccatac aacagcaagt tcgaatcggt ggcctggtcc 480

gccagcgctt gtcacgacgg cacctcatgg ctcgtgatcg gtatcagcgg ccctgacaac 540

ggtgccgtgg ctgtgctgaa gtacaacggt atcatcaccg acactatcaa gtcttggcgt 600

aacaacatcc tgcgcaccca ggaaagcgag tgtgcctgcg tgaacggctc ctgcttcact 660

gtgatgactg acggtccttc caacggccag gcctcctaca agatcttcaa gatcgaaaag 720

ggcaaggtgg tgaagtccgt cgagctgaac gctcctaact accactacga ggagtgcagc 780

tgctaccctg aagccggcga agtgatgtgc gtgtgccgcg acaactggca cggtagcaac 840

cgcccttggg tgagcttcaa ccagaacctg gagtaccaga tcggttacat ctgtagcggt 900

gtgttcggcg acaacccccg tcctaacgac ggcacaggtt cctgtggtcc tatgagcagc 960

aacggcgctt acggcgtcaa gggcttctcc ttcaagtacg gtaacggtgt gtggatcgga 1020

cgtactaagt ccacccacag ccgtagcgga ttcgaaatga tctgggaccc taacggctgg 1080

accggaaccg actccgagtt cagcatgaag caggacatcg tcgctatcac agactggagc 1140

ggttacagcg gttccttcgt gcagcaccca gagctgaccg gtctggactg tatccgccct 1200

tgtttctggg ttgaactgat ccgtggccaa cctaaggagt ccacaatctg gactagcggt 1260

agtagcatta gcttctgtgg cgttaatagt gacaccgtta gctggtcctg gcctgacggc 1320

gctgaactgc cctttaccat tgataagtaa 1350

<210> 6

<211> 759

<212> DNA

<213> H5亚型禽流感病毒

<400> 6

atgtctctgc tgactgaggt tgaaacctac gttttatcta ttatccccag cggaccactc 60

aaggctgaaa tcgctcagaa gctcgaagac gtcttcgctg gcaagaacac cgacctcgaa 120

gccctgatgg agtggctgaa gacccgtcca atcctgagcc cactgactaa gggcatcctg 180

ggattcgtct tcactctgac cgtccctagc gagcgcggcc tgcaacgccg ccgcttcgtg 240

cagaacgctc tgaacggtaa cggagaccca aacaacatgg accgcgccgt gaaactgtac 300

aaaaagctca agcgcgaaat cacattccac ggagccaagg aggtggccct gtcctattct 360

actggcgcct tggccagctg catgggactc atttacaatc gtatgggcac cgttacaact 420

gaagtggctt tcggtctggt gtgcgctaca tgtgagcaaa tcgccgactc acagcaccgt 480

tcccaccgcc agatggccac catcaccaac cctctgatcc gtcacgaaaa ccgcatggtg 540

ctggccagca ccaccgctaa ggccatggaa cagatggctg gtagctccga gcaggccgct 600

gaagctatgg aagtggctaa ccaggcccgt cagatggtgc aggctatgcg taccatcggc 660

acccacccta actcctccgc tggtctgcgt gacaacctgc tggaaaacct gcaggcttac 720

cagaagcgta tgggtgtgca gatgcagcgt ttcaagtaa 759

<210> 7

<211> 1683

<212> DNA

<213> H7亚型禽流感病毒

<400> 7

atgaacaccc agatcctggt gttcgccctg atcgccatca tccctactaa cgctgacaag 60

atctgtctcg gccaccacgc tgtgagcaac ggtaccaagg tgaacaccct gaccgagaag 120

ggtgtggaag ttgtgaacgc caccgagacc gtggaacgca ctaacacccc ccgcatctgc 180

tctaagggca agcgcaccgt ggacctgggc cagtgcggct tgctgggcac tatcaccggt 240

ccccctcagt gcgaccagtt cctggagttc agcgctgacc tgatcatcga gcgccgtgag 300

ggcagcgacg tgtgttaccc tggcaagttc gtgaacgaag aggctctccg tcagatcctg 360

cgtgagtccg gtggcatcga caaggaacct atgggcttca cttacaacgg tatccgtacc 420

aacggtgtga cttccgcctg ccgtaggtcc ggtagcagct tctacgctga gatgaagtgg 480

ctgctgagca acaccgacaa cgccgccttc cctcagatga ctaagtctta caagaacacc 540

cgtgagtccc ctgctatcgt cgtgtggggt atccaccaca gcgtgagcac tgctgaacag 600

actaagctct acggtagcgg taacaagctg gtgactgtgg gttctagcaa ctaccagcag 660

tccttcgttc cttcacctgg cgcccgccct caggtcaacg gtcagtccgg ccgcatcgac 720

ttccactggc tgatcctcaa cccaaacgac accgtcacct tctccttcaa cggcgccttc 780

atcgcccctg accgcgctag cttcctgcgt ggcaagagca tgggcatcca gtccggagtc 840

caggtggacg ccaactgtga aggtgactgt taccactccg gcggcaccat catcagcaac 900

ctgcctttcc agaacatcga cagccgtgct gtgggcaagt gtcctcgcta cgtgaagcag 960

cgctccctgc tgctggccac cggtatgaag aacgtgcctg aggtgcctaa ggcccgtggc 1020

ctgttcggcg ctatcgccgg tttcatcgaa aacggctggg agggtctgat cgacggctgg 1080

tacggtttcc gccaccaaaa cgcccagggt gaaggtaccg ctgctgacta caagagcaca 1140

cagtccgcca tcgaccaaat caccggcaag ctgaaccgcc tgatcgccaa gacaaaccag 1200

cagttcaagc tgatcgacaa cgaattcaac gaggtggaaa agcagatcgg taacgtgatc 1260

aactggacac gcgacagcat caccgaggtg tggtcctaca acgctgaact gctggtggct 1320

atggaaaacc agcacaccat cgacctcgct gacagcgaaa tggacaagct ctacgaacgc 1380

gttaagcgtc agctgcgcga aaacgccgaa gaagacggta caggttgttt cgaaatcttc 1440

cacaagtgtg acgacgactg catggcctcc atccgcaaca acacttacga ccaccgtaag 1500

taccgtgagg aagccatgca gaaccgtatc cagatcgacc ctgtgaagct gagcagcggt 1560

tacaaggacg tgatcctgtg gttcagcttc ggtgctagct gcttcatcct gctggccatc 1620

gtgatgggcc tggtgttcat ctgtgtgaag aacggtaaca tgaggtgtac catctgcatc 1680

taa 1683

<210> 8

<211> 1398

<212> DNA

<213> H7亚型禽流感病毒

<400> 8

atgaacccta accagaagat cctgtgtact agcgctactg ctatcacaat cggcgctatc 60

accgtgctga tcggcatcgc taacatcggt ctgaacatcg gtctgcacct caagtccggc 120

tgtaactgta gccgtagcca gcctgagacc actaacacta gccagactat catcaacaac 180

tactacaacg agactaacat caccaacatc cagatgggag aacgcacctc ccgtaacttc 240

aacaacctga ccaagggcct gtgcactatc aactcctggc acatctacgg taaagacaac 300

gccgtgcgta tcggtgagtc ctctgacgtt ctggtgactc gtgagcctta cgtgtcctgc 360

gacccagacg agtgtaagtt ctacgccctg tcccagggca ctaccatccg tggcaagcac 420

agcaacggca ctatccacga ccgctcccag taccgcgccc tgatctcctg gccactgtcc 480

tcaccaccaa cagtctacaa cagccgcgtt gagtgcatcg gttggtcatc caccagctgc 540

cacgacggca agagccgcat gagcatctgt atctccggtc ctaacaacaa cgcctccgcc 600

gtgatctggt acaaccgtcg ccctgtcgct gaaatcaaca catgggctcg taacatcctc 660

cgtacacagg agagcgaatg tgtgtgccac aacggtgtgt gtcctgtcgt gttcaccgac 720

ggcccagcta ccggccccgc cgacacacgt atctactact tcaaggaagg caagatcctg 780

aagtgggaaa gcctgaccgg caccgctaag cacatcgagg agtgctcctg ctacggcaag 840

cgcaccggaa tcacctgcac ctgtcgcgac aactggcagg gctccaaccg tcccgtgatc 900

cagatcgacc ctgtggccat gacccacaca tcccagtaca tctgttcccc tgtgctcaca 960

gacagccccc gtcctaacga cccaaacatc ggcaagtgca acgaccccta ccctggtaac 1020

aacaacaacg gcgtgaaggg attctcctac ttggacggtg acaacacctg gctcggtcgc 1080

accatctcca ctgctagccg tagcggctac gaaatgctga aggtgcccaa cgccctgacc 1140

gacgaccgca gcaagcctat ccagggtcag accatcgttc tcaacgctga ctggtccggc 1200

tacagcggtt ccttcatgga ctactgggcc gagggtgact gctaccgcgc ttgtttctac 1260

gtggaactga tccgtggcaa gcccaaggag gacaaggtgt ggtggacctc caacagcatc 1320

gtgtccatgt gtagctccac cgaattcctg ggccagtgga actggcctga cggtgctaag 1380

atcgagtact tcctgtaa 1398

<210> 9

<211> 759

<212> DNA

<213> H7亚型禽流感病毒

<400> 9

atgagcctgc tgaccgaagt ggaaacctac gtgctgagca tcatccctag cggtcctctg 60

aaggctgaaa tcgctcagcg tctggaagac gtgttcgctg gcaagaacgc tgacctggag 120

gctctgatgg aatggatcaa gacccgtcct atcctgagcc cactgactaa gggtatcctg 180

ggtttcgtgt tcaccctgac cgtgcctagc gagcgcggcc tgcagcgccg tcgtttcgtg 240

cagaacgctc tgaacggtaa cggtgaccct aacaacatgg acaaggccgt gaagctgtac 300

aagaagctga agcgtgagat gacattccac ggcgctaagg aagtggctct gagctactcc 360

accggtgctc tggcctcctg catgggcctg atctacaacc gtatgggtac cgtgaccgct 420

gaaggcgctc tgggtctggt gtgtgctaca tgtgagcaga tcgctgacgc ccagcaccgc 480

agccaccgcc agatggctac taccaccaac cctctgatcc gccacgagaa ccgcatggtg 540

ctggctagca ccactgctaa ggccatggaa cagatggccg gtagcagcga gcaggctgct 600

gaagccatgg aagtcgctag ccaggctcgt cagatggtgc aggctatgcg caccgtgggt 660

acccacccta actcctccac cggtctgaag gacgacctga tcgagaacct gcaggcttac 720

cagaaccgta tgggtgtgca gctgcagcgt ttcaagtaa 759

Claims (16)

1.一种H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原，其中，所述H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原由H5亚型禽流感病毒HA、NA和M1抗原蛋白组装而成，所述H5亚型禽流感病毒HA、NA和M1抗原蛋白分别如Seq ID No.1、2、3所示核苷酸序列编码或如Seq ID No.4、5、6所示核苷酸序列编码。

2.一种禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗包括免疫量的权利要求1所述的H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价≥6log2。

4.根据权利要求2所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2。

5.根据权利要求2所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)矿物油，铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。

7.根据权利要求5所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V。

8.根据权利要求5所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述佐剂的浓度范围是从30％到70％V/V。

9.根据权利要求5所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述佐剂的浓度是66％V/V。

10.根据权利要求2所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述禽流感病毒样颗粒疫苗还包括免疫量的H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原，所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原由H7亚型禽流感病毒HA、NA和M1抗原蛋白组装而成。

11.根据权利要求10所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H7亚型禽流感病毒HA、NA和M1抗原蛋白分别如Seq ID No.7、8、9所示核苷酸序列编码。

12.根据权利要求10所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价≥6log2。

13.根据权利要求10所述禽流感病毒样颗粒疫苗，其中，所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2。

14.一种制备权利要求2所述的禽流感病毒样颗粒疫苗的方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)将所述禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因克隆到同一载体；

步骤(2)将所述步骤(1)获得的载体经转化或转导重组获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒；

步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述含有HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9，串联表达所述HA、NA、M1抗原蛋白；以及

步骤(4)分离在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中的由所述HA、NA、M1抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒抗原，加入佐剂，混匀得到疫苗组合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤(1)中载体为pFastBac I；所述步骤(2)中所述的杆状病毒质粒为Bacmid。

16.根据权利要求2～11任一项所述的禽流感病毒样颗粒疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用；所述禽流感病毒为H5亚型和/或H7亚型禽流感病毒。