CN108329379A

CN108329379A - H7亚型流感病毒h7n9的普通型/嵌合型病毒样颗粒及制备方法、应用和疫苗

Info

Publication number: CN108329379A
Application number: CN201810310076.2A
Authority: CN
Inventors: 许雁; 诺曼·吉利卡; 李改
Original assignee: NOVARTIS BIOTECHNOLOGY (WUHAN) CO Ltd
Current assignee: NOVARTIS BIOTECHNOLOGY (WUHAN) CO Ltd
Priority date: 2018-04-08
Filing date: 2018-04-08
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2038-04-08
Also published as: CN108329379B

Abstract

本发明提供了H7亚型流感病毒H7N9的普通型/嵌合型病毒样颗粒及制备方法、应用和疫苗，属于生物工程及病毒疫苗技术领域。本发明通过提供甲型流感病毒H7亚型的普通型或嵌合型病毒样颗粒用于制备疫苗，较好的解决了现有疫苗存在安全性的问题；且制备得到的疫苗抗体效价高，效果明显；适用范围广，具有较好的实际应用价值。

Description

H7亚型流感病毒H7N9的普通型/嵌合型病毒样颗粒及制备方法、应用和疫苗

技术领域

本发明涉及生物工程及病毒疫苗技术领域，具体而言，涉及H7亚型流感病毒H7N9的普通型/嵌合型病毒样颗粒及制备方法、应用和疫苗。

背景技术

在自然界中，甲型流感病毒因其两种主要的病毒表面蛋白的抗原性而具有巨大的多样性。病毒在自然宿主水鸟中通常无症状。而家禽感染了病毒后可引起一系列临床疾病，从轻微感染称为低致病性禽流感(LPAI)，到严重的多系统致命感染称为高致病性禽流感(HPAI)。H7N9(Influenza A virus subtype H7N9)是甲型流感病毒H7亚型中的一个毒株。H7N9原本属于低致病性流感病毒，仅在禽间发现。2006年美国卫生部美国国家生物技术信息中心公开了在1988年发生于美国明尼苏达州的火鸡身上的第一次此病毒记录。2013年3月下旬开始，人类感染甲型流感H7N9病毒的病例陆续在中国长江三角洲一带的城市被报道，这是该病毒在全球首次感染人类的报道。自此以后，H7N9疫情在中国每年都出现。在5波疫情中，共造成包括612例死亡病例在内的1624例确证病例，致死率高达39％。2017年的第五次疫情是最严重的，人感染病例比前四次疫情更多。

最为令人担忧的是，2017年从广东分离的病毒株中发现，原本对家禽而言属于低致病性的H7N9病毒现已经发生基因重大突变，其血凝素基因裂解位点插入了突变片段，成为引起鸟类大批死亡的高致病性H7N9禽流感病毒。此突变病毒在哺乳动物雪貂体内只需复制一代，就能获得适应哺乳动物致病的关键突变。突变毒株对小鼠的致病力增加万倍以上，可引起雪貂严重发病死亡，并在雪貂之间通过呼吸道飞沫传播。而这种高致病性H7N9突变株病毒也能在人体呼吸道上皮细胞内有效复制，极易获得像雪貂感染后出现的那样病毒突变形式。因为涉及重大动物疫病防控和公共卫生安全，卫生系统据此加强和细化了人感染H7N9病毒的筛查和鉴别诊断，及时发现了人感染高致病性H7N9流感病毒病例。农业部对H7N9病毒防控作出重要部署，制定了切实可行的综合防控策略。在2017年3月到8月之间扑杀和销毁100多万只鸡，控制了多起H7N9高致病性禽流感疫情。农业部亦在2017年秋批准使用H5N1+H7N9二价灭活疫苗，旨在阻止H7N9病毒在家禽中的传播，减少环境污染，争取从源头上阻断H7N9病毒对人类的侵染，严防H7N9疫情大爆发。

商品化H7N9灭活疫苗，采用反向遗传学方法制备。疫苗的抗原依然是具备遗传活性的活病毒，需要在受精鸡蛋的鸡胚尿囊液中大量繁殖收获后，再经过甲醛等化学处理进行灭活。在生产制备抗原活病毒时，要严格防止病毒泄漏。收获含有活病毒的鸡胚尿囊液后，剩余废物需严格处理控制，保证环境安全。可以看出，目前的H7N9灭活疫苗，存在一定的安全风险和环境风险，需要开发一种更安全的疫苗。

发明内容

本发明的第一目的在于提供H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒，具有甲型流感病毒的蛋白，具有抗原性，安全稳定，能大量制备。

本发明的第二目的在于提供H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒，选用逆转录病毒的Gag前体蛋白取代甲型流感病毒的基质蛋白M1，能达到更好的效果。

本发明的第三目的在于提供上述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或上述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种疫苗，该疫苗包括上述的普通型病毒样颗粒或嵌合型病毒样颗粒。

本发明的第五目的在于提供制备上述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或上述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒的方法，通过构建表达载体，表达得到普通型病毒样颗粒或嵌合型病毒样颗粒。

本发明的第六目的在于提供上述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或上述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒在制备H7N9病毒抗体检测制剂或H7N9病毒疫病监测制剂中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种H7亚型流感病毒H7N9普通型病毒样颗粒，病毒样颗粒包含甲型流感病毒基质蛋白M1，H7亚型流感病毒H7N9血凝素蛋白HA，H7亚型流感病毒H7N9神经氨酸酶蛋白NA。

一种H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒，嵌合型病毒样颗粒包含逆转录病毒的Gag前体蛋白，H7N9流感病毒血凝素蛋白HA和H7N9流感病毒神经氨酸酶蛋白NA。

上述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或上述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。

一种疫苗，疫苗包含上述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或上述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒。

制备上述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或上述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒的方法，用表达病毒样颗粒的HA-NA-M1重组载体或表达嵌合型病毒样颗粒的HA-NA-Gag重组载体，转染细胞，得到细胞培养液，回收并纯化细胞培养液，获得普通型病毒样颗粒或嵌合型病毒样颗粒。

上述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或上述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒在制备H7N9病毒抗体检测制剂或H7N9病毒疫病监测制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过重组载体表达得到前体蛋白Gag或基质蛋白M1、血凝素蛋白HA和神经氨酸酶蛋白NA，然后基质蛋白M1、血凝素蛋白HA和神经氨酸酶蛋白NA自组装成普通型病毒样颗粒；前体蛋白Gag、血凝素蛋白HA和神经氨酸酶蛋白NA自组装成嵌合型病毒样颗粒；将病毒样颗粒用于制备疫苗，较好的解决了现有疫苗存在安全性的问题；且制备得到的疫苗抗体效价高，效果明显；适用范围广，具有较好的实际应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的HA-NA-M1重组质粒的结构示意图；

图2为本发明实施例1提供的HA-NA-ALVGag重组质粒结果示意图；

图3为本发明实施例1提供的HA-NA-HIVGag重组质粒的结构示意图；

图4为本发明实施例1提供的电泳检测结果图；

图5为本发明实验例1提供的电泳检测结果图；

图6为本发明实验例1提供的电泳检测结果图；

图7为本发明实施例2提供的血凝素蛋白HA检测结果图；

图8为本发明实验例2提供的蛋白检测结果图；

图9为本发明实验例3提供的鸡红细胞血凝效价检测结果；

图10为本发明实验例3提供的血凝效价检测结果示意图；

图11为本发明实验例4提供的离心纯化的病毒样颗粒结果图；

图12为本发明实验例4提供的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒电镜图；

图13为本发明实验例4提供的HA-NA-M1病毒样颗粒电镜图；

图14为本发明实验例5提供的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗鸡只抗体效价结果；

图15为本发明实验例5提供的HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗鸡只抗体效价图；

图16为本发明实验例5提供的两种疫苗的血清抗体效价比较示意图；

图17为本发明实验例6提供的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗小鼠抗体效价结果图；

图18为本发明实验例6提供的HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗小鼠抗体效价图；

图19为本发明实验例6提供的两种疫苗的血清抗体效价比较示意图；

图20为本发明实验例6提供的两种疫苗的血清抗体滴度示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

病毒样颗粒(Virus Like Particles，VLPs)是指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，称为病毒样颗粒。VLPs保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，免疫性强，能激发体液免疫和细胞免疫应答。由于VLPs只是一个纯粹的大分子蛋白聚合颗粒，不含病毒遗传物质，不能自主复制，因此使用时非常安全。在制备过程中采用细胞发酵罐进行动物细胞大规模悬浮培养，保证了批次间的均一性，不会造成环境污染。病毒样颗粒疫苗作为一种新型疫苗，不仅克服了传统疫苗的不足，也弥补了其它基因工程疫苗的缺憾，是目前最有发展前景、最安全的候选疫苗。

病毒样颗粒(VLPs)疫苗属基因工程苗，可选用重组杆状病毒作为载体来表达制备。由于重组昆虫杆状病毒表达系统易于筛选，安全性好，产物成本低，表达水平高，表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可使蛋白产物保持天然结构、生物活性和免疫活性，且易于大规模生产外源蛋白，因此被认为是表达VLPs的最佳表达系统。

有研究报道，逆转录病毒的Gag前体蛋白可在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中表达。Gag前体蛋白的一个显著特点是能与一些不同病毒结构蛋白相组合，稳定地共表达，因而具有很好的应用价值。

下面对本发明实施例的H7亚型流感病毒H7N9的普通型/嵌合型病毒样颗粒及制备方法、应用和疫苗进行具体说明。

H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒，普通型病毒样颗粒包含甲型流感病毒基质蛋白M1，H7亚型流感病毒H7N9血凝素蛋白HA，H7亚型流感病毒H7N9神经氨酸酶蛋白NA。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，病毒基质蛋白M1为甲型流感病毒亚型株的基质蛋白M1中的一种，优选地，H7亚型流感病毒H7N9普通型病毒样颗粒的基质蛋白M1为甲型流感病毒H5亚型株的基质蛋白M1。

甲型流感病毒亚型株有多种，因此甲型流感病毒亚型株的基质蛋白M1也有多种。

H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒，嵌合型病毒样颗粒包含逆转录病毒的Gag前体蛋白，H7N9流感病毒血凝素蛋白HA和H7N9流感病毒神经氨酸酶蛋白NA。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，逆转录病毒的Gag前体蛋白为鸡白血病病毒前体蛋白ALV-Gag或人免疫缺陷病毒前体蛋白HIV-Gag。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，疫苗还包含佐剂，佐剂选自白油佐剂，角鲨烯佐剂，植物油佐剂或弗氏佐剂。

制备上述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或上述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒的方法，用表达普通型病毒样颗粒的HA-NA-M1重组载体或表达嵌合型病毒样颗粒的HA-NA-Gag重组载体，转染细胞，得到细胞培养液，回收并纯化细胞培养液，获得普通型病毒样颗粒或嵌合型病毒样颗粒。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，细胞为昆虫细胞，重组载体为杆状病毒重组载体。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述的H7亚型流感病毒H7N9普通型病毒样颗粒或上述的H7亚型流感病毒H7N9嵌合型病毒样颗粒在制备H7N9病毒抗体检测制剂或H7N9病毒疫病监测制剂中的应用，制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒和H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒的表达载体的构建及检测；普通型病毒样颗粒包含甲型流感病毒基质蛋白M1，H7亚型流感病毒H7N9血凝素蛋白HA，H7亚型流感病毒H7N9神经氨酸酶蛋白NA。

嵌合型病毒样颗粒包含Gag前体蛋白，H7N9流感病毒血凝素蛋白HA和H7N9流感病毒神经氨酸酶蛋白NA；逆转录病毒的Gag前体蛋白为鸡白血病病毒前体蛋白ALV-Gag或人免疫缺陷病毒前体蛋白HIV-Gag。

血凝素蛋白HA和神经氨酸酶蛋白NA的基因序列根据A/Guangdong/17SF003/2017报道而来。基质蛋白M1的基因序列来自于H5N1亚型病毒株A/Indonesia/5/2005(H5N1)

血凝素蛋白HA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，神经氨酸酶蛋白NA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基质蛋白M1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，ALV-Gag蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，HIV-Gag蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

根据H7N9病毒表面的抗原分析并结合密码子优化，得到血凝素蛋白HA、神经氨酸酶蛋白NA、基质蛋白M1、ALV-Gag蛋白和HIV-Gag蛋白的编码序列；编码血凝素蛋白HA的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，编码神经氨酸酶蛋白NA的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，编码基质蛋白M1的碱基序列如SEQ ID NO.8所示，编码ALV-Gag蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.9所示，编码HIV-Gag蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.10所示。

当然，由于氨基酸密码子的简并性，一个确定的蛋白氨基酸序列，可以有成千上万种表达序列，因此，表达血凝素蛋白HA、神经氨酸酶蛋白NA、基质蛋白M1、ALV-Gag蛋白和HIV-Gag蛋白的碱基序列并不唯一，本实施例中优选为如SEQ ID NO.6-10所示的编码序列。

构建表达H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒的表达载体HA-NA-M1重组质粒，表达H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒的表达载体HA-NA-ALV-Gag重组质粒或HA-NA-HIV-Gag重组质粒。

本实施例以表达载体HA-NA-M1重组质粒的构建为例进行说明，用PCR扩增人工合成的HA基因DNA片段，过柱抽提纯化后，用限制性内切酶37℃两小时水解。跑凝胶电泳及再次过柱抽提纯化，备用。昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac经同样限制性内切酶37℃两小时水解后，用上述同样方法纯化处理。在T4DNA连接酶作用下，将上述处理好的HA基因DNA片段连接到经处理后的pFastBac质粒载体上；将所得的重组质粒转化DH5α感受态细胞，采用菌落蓝白斑筛选法，挑选白色菌落进行PCR反应；37C°摇床培养所选PCR验证阳性的白色菌落细菌，进行DNA质粒抽提，获得重组质粒pFastBac-HA；重复上述实验步骤，将NA基因片段和M1基因片段克隆到pFastBac-HA载体上，得到HA-NA-M1重组质粒。用同样的方法，得到HA-NA-ALV-Gag重组质粒和HA-NA-HIV-Gag重组质粒。三个重组载体质粒的示意图见图1到图3。

在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9，分别用获得的重组杆状病毒质粒HA-NA-M1、HA-NA-ALV-Gag和HA-NA-HIV-Gag做细胞转染，六天后分别收获含有对应的重组杆状病毒的细胞培养上清液。加入含有SDS的裂解液至细胞上清液中裂解重组杆状病毒，用氯仿抽提、乙醇沉淀获得各重组杆状病毒DNA；分别以各DNA做模板，加入对应的PCR引物，分别进行PCR扩增反应，扩增结果如图4到图6所示，从图中可以看出，扩增的目的条带与目的基因的大小一致，说明载体构建正确。

实施例2

本实施例提供表达制备普通型病毒样颗粒和嵌合型病毒样颗粒的方法。

在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9，采用脂质法将重组杆状病毒质粒HA-NA-M1、HA-NA-ALV-Gag和HA-NA-HIV-Gag进行转染，六天后收取细胞上清液，获得第一代重组杆状病毒毒种，称为P1代。用P1代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得第二代重组杆状病毒毒种，称为P2代。再用P2代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得P3代。以P3代作为生产毒种，制备H7N9常规型病毒样颗粒。简言之，将生长状态良好的Sf-9细胞接种到摇瓶中悬浮培养，待细胞成长至对数生长期时，稀释细胞浓度至每毫升3.0×106个细胞。将P3代毒种按MOI为0.1比率，接种病毒到细胞摇瓶中，3到4天后收获细胞上清液，检测H7N9普通型病毒样颗粒的生成。

采用Western Blot的方法分别检测离心沉淀的细胞裂解物和收获的细胞上清液中是否含有HA蛋白，本实施例以普通型病毒样颗粒的检测为例进行说明。

操作方法如下：分别向10μL的细胞裂解液和10μL细胞上清液中加入10μL电泳上样液混合，进行SDS-PAGE电泳，然后做Western Blot的印膜转印。用抗H7N9的血凝素蛋白HA兔源多抗作为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ECL化学发光试剂曝光胶片，显影后可见胶片上清晰的HA蛋白条带；检测结果如图7所示，说明普通型病毒样颗粒成功表达出HA蛋白，同样的方法检测嵌合型病毒样颗粒HA-NA-ALV-Gag和HA-NA-HIV-Gag，结果图7所示，均能成功的检测出HA蛋白，说明均成功表达出HA蛋白。

同样采用Western Blot的方法分别检测收获的细胞上清液中的基质蛋白M1、鸡白血病病毒前体蛋白ALV-Gag和人免疫缺陷病毒前体蛋白HIV-Gag；用抗H5N1病毒基质蛋白M1兔源多抗为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ECL化学发光试剂曝光胶片，显影后可见胶片上清晰的基质蛋白M1条带；用抗HIV Gag p24兔源多抗，或用抗ALV Gag p26兔源多抗作为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ECL化学发光试剂曝光胶片，显影后可见胶片上清晰的Gag前体蛋白条带.

检测结果如图8所示，图中H7N9-ALV-Gag表示HA-NA-ALVGag病毒样颗粒，H7N9-HIV-Gag表示HA-NA-HIVGag病毒样颗粒，H7N9-M1表示HA-NA-M1病毒样颗粒；从细胞上清液中均成功检测到目的蛋白，说明表达成功。

表达得到H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒，因此可以用于制备疫苗。

本实施例还提供一种疫苗，疫苗包括H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒。

还可以将H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒在制备H7N9病毒抗体检测制剂或H7N9病毒疫病监测制剂中应用，制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒。

实施例3

本实施例比较H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒(HA-NA-M1病毒样颗粒)和H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒(HA-NA-HIVGag病毒样颗粒和HA-NA-ALVGag病毒样颗粒)在相同的条件下的产量。

禽流感病毒表面有两种膜蛋白，即血凝素HA蛋白及神经氨酸酶NA蛋白。血凝素HA蛋白能与红细胞表面的受体结合，形成红细胞分散不沉淀现象，这一特性可作为血凝效价检测的判断指标。因此可以用鸡红细胞凝集反应来检测细胞上清液中H7N9病毒样颗粒的含量。为了比较H7N9普通型病毒样颗粒和H7N9嵌合型病毒样颗粒的产量差别，在严格控制三种病毒样颗粒生产条件使其尽量保持一致的情况下，进行了多次病毒样颗粒的制备和血凝效价的检测。血凝效价检测的结果如图9和图10所示；图9中，A行表示用鸡白血病病毒ALV的Gag前体蛋白基因制备的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒样品的血凝效价为8；B行表示用人免疫缺陷病毒HIV的Gag前体蛋白基因制备的HA-NA-HIVGag病毒样颗粒样品的血凝效价为8；C行表示用M1基质蛋白基因制备的HA-NA-M1病毒样颗粒样品的血凝效价为6.5。图10表示三种蛋白颗粒血凝效价的示意图。

结果表明，ALV-Gag前体蛋白和HIV-Gag前体蛋白分别制备的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-HIVGag病毒样颗粒，在细胞上清液中效价都达到了8log2的水平。而用基质蛋白M1制备的HA-NA-M1病毒样颗粒，在细胞上清液中的血凝效价为6.5log2。说明Gag前体蛋白更易与H7N9膜蛋白一起，自组装成H7N9嵌合型病毒样颗粒，以出芽法的形式释放到细胞上清液中。每次产生的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-HIVGag病毒样颗粒产量都高于HA-NA-M1病毒样颗粒产量，而且重复性好，易于制备。

实施例4

本实施例3表达的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-M1病毒样颗粒进行纯化和电镜观察。

采用蔗糖不连续密度梯度超速离心纯化HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-M1病毒样颗粒；具体操作简述如下：分别取20mL细胞上清液各加入到离心机的管子里，用角转超速离心机4℃，100000xg，离心1个小时，弃掉离心的上清，保留沉淀物。加入5mL PBS至离心管内，悬浮沉淀溶解过夜。配制蔗糖溶液，重量百分比浓度分别配成20％、45％及60％，小心装入超速离心管中制成蔗糖不连续密度梯度。在顶层加入过夜溶解的5mlPBS悬浮液，用水平转头进行超速离心，4℃，100000xg，时间1小时。在20％与45％交界处以及45％及60％交界处各有一条带，而位于20％与45％交界处的条带更为符合流感病毒样颗粒蔗糖不连续密度梯度离心的条带密度位置。收集此处的条带，其内含有纯化的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒或HA-NA-M1病毒样颗粒；离心纯化结果如图11所示。

电镜拍片实验操作如下：将少量纯化浓缩后的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-M1病毒样颗粒样品分别固定处理后，置于铜网上，加2％磷钨酸钠溶液进行负染。电子显微镜下观察并拍片。图12为HA-NA-ALVGag病毒样颗粒电镜图；图13所示为HA-NA-M1病毒样颗粒电镜图。两图显示HA-NA-M1病毒样颗粒及HA-NA-ALVGag病毒样颗粒均呈椭圆形，有囊膜，囊膜上有一圈明显的密集且呈放射状纤突，即为表达的H7N9病毒膜表面的血凝素蛋白HA和神经氨酸酶蛋白NA。

实施例5

本实施例验证获得的病毒颗粒是否能刺激家禽体内产生抗体以及检测产生的抗体效价。

为了检测HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗是否能有效刺激机体产生免疫应答，本实施例分别用含有HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-M1病毒样颗粒的细胞上清液与市面上出售的商用白油佐剂混合，乳化制备了家禽用HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗。疫苗乳化方法简介如下：分别向96mL含有HA-NA-ALVGag病毒样颗粒或HA-NA-M1病毒样颗粒的细胞上清液中各加入4mL吐温-80，使其完全溶解。将两份9mL司本-80分别与两份141mL进口白油混合，制备成两份混合白油。在一玻璃容器里，将含有病毒样颗粒的混合细胞上清液与混合白油佐剂按1:1.5的体积比率混匀，置于小型电动乳化仪转头下进行乳化。取1mL乳化完毕的乳液放于一个小型台式离心机的EP小管中，转速5000rpm，室温下离心15min。检查管内离心液，没有出现水、乳分层现象，表明乳化完全，疫苗制备合格。

使用上述制备的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗做鸡只免疫效力试验。将26只21日龄SPF鸡分为3组，第一组为实验组，11只鸡，每只鸡颈部皮下接种0.3mLHA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗；第二组为实验组，11只鸡，每只鸡颈部皮下接种0.3mLHA-NA-M1病毒样颗粒疫苗；第三组为空白对照组，4只鸡，不免疫。一免后第23天，每只鸡翅静脉采血1mL，4℃条件下，8800rpm离心20min后，取上面的血清保存。分别用纯化的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-M1病毒样颗粒作为抗原，进行血清抗体效价检测。检测方法采用常规的血凝抑制法，观察红细胞凝集抑制结果。

结果如图14、图15和图16所示，图14表示HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗免疫鸡只后产生的个体血清抗体效价，图15表示HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗免疫鸡只后产生的个体血清抗体效价，图16表示两组疫苗效价比较结果；表1和表2列出了全部鸡只的个体血清抗体效价滴度。

表1HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗HI抗体效价

表2HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗HI抗体效价

通过图14、图15和图16，以及表1和表2，可以看出，HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗免疫SPF鸡只所产生的抗体效价显著的高于HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗免疫SPF鸡只所产生的抗体效价。

实施例6

本实施例采用HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗和HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗分别免疫小鼠，检验免疫后小鼠是否能产生抗体。

小鼠的免疫试验如下：将24只6-8周雄性昆明小鼠分为3组，第一实验组10只，每只背部皮下分3个部位接种0.3mL HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗。第二实验组10只，每只背部皮下分3个部位接种0.3mLHA-NA-M1病毒样颗粒疫苗。第三组4只，作为空白对照组，不免疫注射。一免后的第23天进行二免，两个实验组每只小鼠分别注射相对应的疫苗0.3mL。二免后第28天分别用毛细血管眼球采血1mL，4℃条件下，8800rpm离心20min，取上面的血清保存。分别用纯化后的HA-NA-ALVGag病毒样颗粒和HA-NA-M1病毒样颗粒作为抗原，测定实验小鼠体内的抗体水平。

采用常规的血凝抑制法检测HI效价：结果见图17、图18和图19，图17表示HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后血清HI效价结果，图18表示HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后的血清HI效价结果；图19表示两组疫苗免疫小鼠后的血清HI效价比较示意图。结果证明，HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗和HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗均能刺激小鼠机体产生免疫应答；同样HA-NA-HIVGag病毒样颗粒疫苗也能刺激小鼠产生免疫应答，因此HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗、HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗和HA-NA-HIVGag病毒样颗粒疫苗可以用来预防H7N9流感病毒的侵染。酶联免疫吸附(ELISA)法检测抗体水平结果见图20；表3是根据读数而确定的各免疫小鼠血清抗体稀释倍数即抗体滴度。

表3两组疫苗的ELISA抗体滴度数据

图20所示结果表明，全部实验小鼠都表现出对HA-NA-ALVGag病毒样颗粒疫苗或HA-NA-M1病毒样颗粒疫苗的免疫应答，获得了明显的抗体保护水平。

综上所述，本发明提供的甲型流感病毒H7亚型的病毒样颗粒能用于制备成疫苗，且均能使鸡只和小鼠产生免疫应答并产生相应的抗体，因此可以将甲型流感病毒H7亚型的病毒样颗粒在制备疫苗中应用，同时可以在制备H7N9病毒抗体检测试剂或H7N9病毒疫病监测制剂中应用。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 诺华生物科技（武汉）有限责任公司、许雁

<120> H7亚型流感病毒H7N9的普通型/嵌合型病毒样颗粒及制备方法、应用和疫苗

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 564

<212> PRT

<213> Influenza A virus

<400> 1

Met Asn Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Ile Ala Ile Ile Pro Thr

1 5 10 15

Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr

20 25 30

Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr

35 40 45

Glu Thr Val Glu Arg Thr Asn Thr Pro Arg Ile Cys Ser Lys Gly Lys

50 55 60

Arg Thr Val Asp Leu Gly Gln Cys Gly Leu Leu Gly Thr Ile Thr Gly

65 70 75 80

Pro Pro Gln Cys Asp Gln Phe Leu Glu Phe Ser Ala Asp Leu Ile Ile

85 90 95

Glu Arg Arg Glu Gly Ser Asp Val Cys Tyr Pro Gly Lys Phe Val Asn

100 105 110

Glu Glu Ala Leu Arg Gln Ile Leu Arg Glu Ser Gly Gly Ile Asp Lys

115 120 125

Glu Pro Met Gly Phe Thr Tyr Asn Gly Ile Arg Thr Asn Gly Val Thr

130 135 140

Ser Ala Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ala Phe Pro Gln Met Thr Lys Ser

165 170 175

Tyr Lys Asn Thr Lys Glu Ser Pro Ala Ile Ile Val Trp Gly Ile His

180 185 190

His Ser Val Ser Thr Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn

195 200 205

Lys Leu Val Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr Gln Gln Ser Phe Val Pro

210 215 220

Ser Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Ile Asp

225 230 235 240

Phe His Trp Leu Ile Leu Asn Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe

245 250 255

Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys

260 265 270

Ser Met Gly Ile Gln Ser Arg Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly

275 280 285

Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln

290 295 300

Asn Ile Asp Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln

305 310 315 320

Arg Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Val Pro

325 330 335

Lys Arg Lys Arg Thr Ala Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

340 345 350

Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg

355 360 365

His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr

370 375 380

Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Ala

385 390 395 400

Lys Thr Asn Gln Gln Phe Lys Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val

405 410 415

Glu Lys Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr

420 425 430

Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln

435 440 445

His Thr Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg

450 455 460

Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys

465 470 475 480

Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg

485 490 495

Asn Asn Thr Tyr Asp His Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn

500 505 510

Arg Ile Gln Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val

515 520 525

Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe Ile Leu Leu Ala Ile

530 535 540

Val Met Gly Leu Val Phe Ile Cys Val Lys Asn Gly Asn Met Arg Cys

545 550 555 560

Thr Ile Cys Ile

<210> 2

<211> 465

<212> PRT

<213> Influenza A virus

<400> 2

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Leu Cys Thr Ser Ala Thr Ala Ile Thr

1 5 10 15

Ile Gly Ala Ile Thr Val Leu Ile Gly Ile Ala Asn Ile Gly Leu Asn

20 25 30

Ile Gly Leu His Leu Lys Ser Gly Cys Asn Cys Ser Arg Ser Gln Pro

35 40 45

Glu Thr Thr Asn Pro Ser Gln Thr Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Asn Glu

50 55 60

Thr Asn Ile Thr Asn Ile Gln Met Gly Glu Arg Thr Ser Arg Asn Phe

65 70 75 80

Asn Asn Leu Thr Lys Gly Leu Cys Thr Ile Asn Ser Trp His Ile Tyr

85 90 95

Gly Lys Asp Asn Ala Val Arg Ile Gly Glu Ser Ser Asp Val Leu Val

100 105 110

Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Glu Cys Arg Phe Tyr

115 120 125

Ala Leu Ser Gln Gly Thr Thr Ile Arg Gly Lys His Ser Asn Gly Thr

130 135 140

Ile His Asp Arg Ser Gln Tyr Arg Ala Leu Ile Ser Trp Pro Leu Ser

145 150 155 160

Ser Pro Pro Thr Val Tyr Asn Ser Arg Val Glu Cys Ile Gly Trp Ser

165 170 175

Ser Thr Ser Cys His Asp Gly Lys Ser Arg Met Ser Ile Cys Ile Ser

180 185 190

Gly Pro Asn Asn Asn Ala Ser Ala Val Ile Trp Tyr Asn Arg Arg Pro

195 200 205

Val Ala Glu Ile Asn Thr Trp Ala Arg Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu

210 215 220

Ser Glu Cys Val Cys His Asn Gly Val Cys Pro Val Val Phe Thr Asp

225 230 235 240

Gly Pro Ala Thr Gly Pro Ala Asp Thr Arg Ile Tyr Tyr Phe Lys Glu

245 250 255

Gly Lys Ile Leu Lys Trp Glu Ser Leu Thr Gly Thr Ala Lys His Ile

260 265 270

Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Gly Lys Arg Thr Gly Ile Thr Cys Thr Cys

275 280 285

Lys Asp Asn Trp Gln Gly Ser Asn Arg Pro Val Ile Gln Ile Asp Pro

290 295 300

Val Ala Met Thr His Thr Ser Gln Tyr Ile Cys Ser Pro Val Leu Thr

305 310 315 320

Asp Ser Pro Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ile Gly Lys Cys Asn Asp Pro

325 330 335

Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Leu Asp

340 345 350

Gly Asp Asn Thr Trp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Thr Ala Ser Arg Ser

355 360 365

Gly Tyr Glu Met Leu Lys Val Pro Asn Ala Leu Thr Asp Asp Arg Ser

370 375 380

Lys Pro Ile Gln Gly Gln Thr Ile Val Leu Asn Ala Asp Trp Ser Gly

385 390 395 400

Tyr Ser Gly Ser Phe Met Asp Tyr Trp Ala Glu Gly Asp Cys Tyr Arg

405 410 415

Ala Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Lys Pro Lys Glu Asp Lys

420 425 430

Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Ser Met Cys Ser Ser Thr Glu

435 440 445

Phe Leu Gly Gln Trp Asn Trp Pro Asp Gly Ala Lys Ile Glu Tyr Phe

450 455 460

Leu

465

<210> 3

<211> 252

<212> PRT

<213> Influenza A virus

<400> 3

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro

1 5 10 15

Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Lys Leu Glu Asp Val Phe

20 25 30

Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr

35 40 45

Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe

50 55 60

Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val

65 70 75 80

Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala

85 90 95

Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala

100 105 110

Lys Glu Val Ser Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met

115 120 125

Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe

130 135 140

Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg

145 150 155 160

Ser His Arg Gln Met Ala Thr Ile Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu

165 170 175

Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met

180 185 190

Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Asn Gln

195 200 205

Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Asn

210 215 220

Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asn Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr

225 230 235 240

Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys

245 250

<210> 4

<211> 577

<212> PRT

<213> Avian Leukosis virus

<400> 4

Met Glu Ala Val Ile Lys Val Ile Ser Ser Ala Cys Lys Thr Tyr Cys

1 5 10 15

Gly Lys Thr Ser Pro Ser Lys Lys Glu Ile Gly Ala Met Leu Ser Leu

20 25 30

Leu Gln Lys Glu Gly Leu Leu Met Ser Pro Ser Asp Leu Tyr Ser Pro

35 40 45

Gly Ser Trp Asp Pro Ile Thr Ala Ala Leu Ser Gln Arg Ala Met Ile

50 55 60

Leu Gly Lys Ser Gly Glu Leu Lys Thr Trp Gly Leu Val Leu Gly Ala

65 70 75 80

Leu Lys Ala Ala Arg Glu Glu Gln Val Thr Ser Glu Gln Ala Lys Phe

85 90 95

Trp Leu Gly Leu Gly Gly Gly Arg Val Ser Pro Pro Gly Pro Glu Cys

100 105 110

Ile Glu Lys Pro Ala Thr Glu Arg Arg Ile Asp Lys Gly Glu Glu Val

115 120 125

Gly Glu Thr Thr Val Gln Arg Asp Ala Lys Met Ala Pro Glu Glu Thr

130 135 140

Ala Thr Pro Lys Thr Val Gly Thr Ser Cys Tyr His Cys Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ile Gly Cys Asn Cys Ala Thr Ala Ser Ala Pro Pro Pro Pro Tyr Val

165 170 175

Gly Ser Gly Leu Tyr Pro Ser Leu Ala Gly Val Gly Glu Gln Gln Gly

180 185 190

Gln Gly Gly Asp Thr Pro Pro Gly Ala Glu Gln Ser Arg Ala Glu Pro

195 200 205

Gly His Ala Gly Gln Ala Pro Gly Pro Ala Leu Thr Asp Trp Ala Arg

210 215 220

Val Arg Glu Glu Leu Ala Ser Thr Gly Pro Pro Val Val Ala Met Pro

225 230 235 240

Val Val Ile Lys Thr Glu Gly Pro Ala Trp Thr Pro Leu Glu Pro Lys

245 250 255

Leu Ile Thr Arg Leu Ala Asp Thr Val Arg Thr Lys Gly Leu Arg Ser

260 265 270

Pro Ile Thr Met Ala Glu Val Glu Ala Leu Met Ser Ser Pro Leu Leu

275 280 285

Pro His Asp Val Thr Asn Leu Met Arg Val Ile Leu Gly Pro Ala Pro

290 295 300

Tyr Ala Leu Trp Met Asp Ala Trp Gly Val Gln Leu Gln Thr Val Ile

305 310 315 320

Ala Ala Ala Thr Arg Asp Pro Arg His Pro Ala Asn Gly Gln Gly Arg

325 330 335

Gly Glu Arg Thr Asn Leu Asn Arg Leu Lys Gly Leu Ala Asp Gly Met

340 345 350

Val Gly Asn Pro Gln Gly Gln Ala Ala Leu Leu Arg Pro Gly Glu Leu

355 360 365

Val Ala Ile Thr Ala Ser Ala Leu Gln Ala Phe Arg Glu Val Ala Arg

370 375 380

Leu Ala Glu Pro Ala Gly Pro Trp Ala Asp Ile Met Gln Gly Pro Ser

385 390 395 400

Glu Ser Phe Val Asp Phe Ala Asn Arg Leu Ile Lys Ala Val Glu Gly

405 410 415

Ser Asp Leu Pro Pro Ser Ala Arg Ala Pro Val Ile Ile Asp Cys Phe

420 425 430

Arg Gln Lys Ser Gln Pro Asp Ile Gln Gln Leu Ile Arg Thr Ala Pro

435 440 445

Ser Thr Leu Thr Thr Pro Gly Glu Ile Ile Lys Tyr Val Leu Asp Arg

450 455 460

Gln Lys Thr Ala Pro Leu Thr Asp Gln Gly Ile Ala Ala Ala Met Ser

465 470 475 480

Ser Ala Ile Gln Pro Leu Ile Met Ala Val Val Asn Arg Glu Arg Asp

485 490 495

Gly Gln Thr Gly Ser Gly Gly Arg Ala Arg Gly Leu Cys Tyr Thr Cys

500 505 510

Gly Ser Pro Gly His Tyr Gln Ala Gln Cys Pro Lys Lys Arg Lys Ser

515 520 525

Gly Asn Ser Arg Glu Arg Cys Gln Leu Cys Asn Gly Met Gly His Asn

530 535 540

Ala Lys Gln Cys Arg Lys Arg Asp Gly Asn Gln Gly Gln Arg Pro Gly

545 550 555 560

Lys Gly Leu Ser Ser Gly Pro Trp Pro Gly Pro Glu Pro Pro Ala Val

565 570 575

Ser

<210> 5

<211> 500

<212> PRT

<213> Human Immunodeficiency Virus

<400> 5

Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp

1 5 10 15

Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys

20 25 30

His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro

35 40 45

Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu

50 55 60

Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn

65 70 75 80

Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp

85 90 95

Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys

100 105 110

Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val

115 120 125

Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His

130 135 140

Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu

145 150 155 160

Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser

165 170 175

Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly

180 185 190

Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu

195 200 205

Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala

210 215 220

Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr

225 230 235 240

Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile

245 250 255

Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys

260 265 270

Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly

275 280 285

Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu

290 295 300

Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr

305 310 315 320

Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly

340 345 350

Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser

355 360 365

Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg

370 375 380

Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His

385 390 395 400

Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys

405 410 415

Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn

420 425 430

Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe

435 440 445

Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg

450 455 460

Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp

465 470 475 480

Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ser Asp

485 490 495

Pro Ser Ser Gln

500

<210> 6

<211> 1695

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60

atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120

ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacacccc caggatctgc 180

tcaaaaggga aaaggacagt tgacctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240

ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcggccgatt taattattga gaggcgagaa 300

ggaagtgatg tctgttatcc tggaaaattc gtgaatgaag aagctttgag gcaaattctc 360

agagaatcag gcggaattga caaggaaccc atgggattca catacaatgg aataagaact 420

aatggggtga ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480

ctcctgtcaa acacagataa tgctgcattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca 540

aaagaaagcc cagctataat agtatggggg atccatcatt ccgtttcaac tgcagagcaa 600

accaagctat atgggagtgg aaacaagctg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660

tctttcgtac cgagtccagg agcaagacca caagttaatg gtcaatctgg aagaattgac 720

tttcattggc taatactaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780

atagctccag accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtagagta 840

caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatagtg gagggacaat aataagtaac 900

ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960

aggagtcttc tgctggcaac agggatgaag aatgttcctg aggttccaaa gagaaaacgg 1020

actgcgagag gcctatttgg tgctatagcg ggtttcattg aaaatggatg ggaaggccta 1080

attgatggtt ggtatggttt cagacaccag aatgcacagg gagagggaac tgctgcagat 1140

tacaaaagca ctcaatcggc aattgatcaa ataacaggga aattaaaccg gcttatagca 1200

aaaaccaacc aacaatttaa gttgatagac aatgagttta atgaggtaga gaagcaaatc 1260

ggtaatgtga taaattggac cagagattct ataacagaag tatggtcata caatgctgaa 1320

ctcttggtgg caatggagaa ccagcataca attgatctgg ctgattcaga aatggacaaa 1380

ctgtacgaac gagtgaaaag acagctgaga gagaatgctg aagaagacgg cacgggttgc 1440

tttgaaatat ttcacaagtg tgatgatgac tgtatggcca gtattagaaa taacacctat 1500

gatcacagaa aatacagaga agaggcaatg caaaatagaa tacagattga cccagtcaaa 1560

ctaagcagcg gctacaaaga tgtgatactt tggtttagct tcggggcatc atgtttcata 1620

cttctagcca ttgtaatggg ccttgtcttc atatgtgtga agaatggaaa catgcggtgc 1680

actatttgta tataa 1695

<210> 7

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atgaatccaa accagaagat tctatgcact tcagccactg ctatcacaat aggcgcaatc 60

acagtactca ttggaatagc aaacatagga ttgaacatag gactgcatct aaaatcgggc 120

tgcaattgct cacgctcaca acctgaaaca accaacccaa gccaaacaat aataaacaac 180

tattataatg aaacaaacat caccaacatc caaatgggag aaagaacaag caggaatttc 240

aataacttaa ctaaagggct ctgtactata aattcatggc acatatatgg gaaagacaac 300

gcagtaagaa ttggagaaag ctcggatgtt ttagtcacaa gagaacccta tgtttcatgc 360

gacccagatg aatgcaggtt ctatgctctc agccaaggaa caacaatcag agggaaacac 420

tcaaacggaa caatacacga taggtcccag tatcgcgccc tgataagctg gccactatca 480

tcaccgccca cagtgtacaa cagcagggtg gaatgcatcg ggtggtcaag tactagttgc 540

catgatggca aatccagaat gtcaatatgt atatcaggac caaacaacaa tgcatctgca 600

gtaatatggt acaacagaag gcctgttgca gaaattaaca catgggcccg aaacatacta 660

agaacacagg aatctgaatg tgtatgccac aacggcgtat gcccagtagt gttcaccgat 720

gggcctgcca caggacctgc agacacaaga atatactatt ttaaagaggg gaaaatattg 780

aaatgggagt ctctgactgg aactgctaag catattgaag aatgctcatg ttacgggaaa 840

cgaacaggga ttacctgcac atgcaaggac aattggcagg gctcaaatag accagtgatt 900

cagatagacc cagtagcaat gacacacact agtcaatata tatgcagtcc tgtccttaca 960

gacagtcccc gaccgaatga cccaaacata ggtaagtgta atgaccctta tccaggtaat 1020

aataacaatg gagtcaaggg attctcatac ctggatgggg ataacacttg gctagggagg 1080

acaataagca cagcctcgag gtctggatac gagatgttaa aagtgccaaa tgcattgaca 1140

gatgatagat caaagcccat tcaaggtcag acaattgtat taaacgctga ctggagtggt 1200

tacagtgggt ctttcatgga ctattgggct gaaggggact gctatcgagc gtgtttttat 1260

gtggagctga tacgtgggaa acccaaggag gataaagtgt ggtggaccag caatagtata 1320

gtatcgatgt gttccagtac agaattcctg ggacaatgga actggcctga cggggctaaa 1380

atagagtact tcctctaa 1398

<210> 8

<211> 776

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

agatctccac catgtcactc cttactgagg ttgagaccta cgttctttcc attatacctt 60

caggtccctt gaaagcagaa atagctcaga aactcgagga cgtgtttgcc ggtaagaaca 120

cagacctaga ggctttgatg gagtggctta aaacacgtcc tatcctttca cctttgacta 180

aaggaatact cggtttcgtc tttaccctca ccgtcccaag tgagcgcggc ttgcaaagac 240

gcaggttcgt ccagaacgct ctcaacggta acggcgaccc taacaacatg gacagggctg 300

tgaagctcta caagaaactt aaacgtgaaa tcacgttcca tggcgccaag gaagttgcac 360

tttcatatag taccggcgct ctagcttcat gtatgggtct tatctacaac aggatgggca 420

cggtgaccac tgaagtggca ttcggtctgg tgtgtgctac ctgtgaacag attgctgatt 480

cacaacaccg ctcacaccgt caaatggcga ctatcaccaa tcctctgatt cgtcacgaga 540

atcgtatggt tctagcttca accaccgcta aggctatgga acaaatggca ggtagcagcg 600

agcaggctgc ggaagcaatg gaagttgcca accaagctcg tcaaatggtc caagctatga 660

ggaccatcgg tacccacccg aactcatccg ctggcttgag agacaacctc ttggagaatt 720

tgcaggctta ccagaaacgt atgggcgtgc aaatgcagcg tttcaagtag gctagc 776

<210> 9

<211> 1734

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atggaagctg tgatcaaggt catctcctcc gcttgcaaga cctactgcgg caagacctcc 60

ccctccaaga aagaaatcgg tgctatgctg tccctgctgc agaaagaggg cctgctgatg 120

tccccctccg acctgtactc ccccggttcc tgggacccta tcaccgctgc tctgtcccag 180

cgtgctatga tcctgggcaa gtccggcgaa ctcaagacct ggggcctggt gctgggtgct 240

ctgaaggctg ctcgcgagga acaagtgacc tccgagcagg ctaagttctg gctgggtctg 300

ggtggtggtc gtgtgtcccc ccctggtccc gagtgcatcg agaagcccgc taccgagcgt 360

cgtatcgaca agggcgagga agtgggcgag actaccgtgc agcgtgacgc taagatggct 420

cccgaggaaa ccgctacccc caagaccgtg ggcacctcct gctaccactg cggcaccgct 480

atcggttgca actgcgctac cgcttccgct cccccccctc cttacgtggg ctccggcctg 540

tacccttccc tggctggtgt cggcgagcag caaggacagg gtggagacac ccctcccggt 600

gctgaacagt cccgtgccga gcctggtcac gctggtcaag ctcccggtcc cgctctgact 660

gactgggctc gtgtgcgtga ggaactggct tccaccggtc cccctgtggt ggctatgccc 720

gtggtcatca agaccgaggg tcccgcttgg acccccctgg aacccaagct gatcacccgt 780

ctggctgaca ccgtgcgtac caagggcctg cgttccccaa tcaccatggc tgaggtggag 840

gctctgatgt cctcccccct gctgcctcac gacgtgacca acctgatgcg tgtgatcctg 900

ggtcccgctc cctacgctct gtggatggac gcttggggcg tgcagctgca gaccgtgatc 960

gctgctgcta cccgtgaccc ccgtcaccct gctaacggac agggtcgtgg cgagcgtacc 1020

aacctgaacc gtctgaaggg cctggctgac ggcatggtcg gcaaccctca gggacaggct 1080

gctctgctgc gtcctggcga gctggtcgct atcaccgcca gcgctctgca ggctttccgt 1140

gaggtggccc gtttggccga accagctggt ccctgggctg acatcatgca gggcccctcc 1200

gagtccttcg tggacttcgc taaccgtctg atcaaggctg tggagggctc cgacctccct 1260

ccttccgctc gtgctcccgt gatcatcgac tgcttccgtc agaagtccca gcccgacatc 1320

cagcagctga tccgtaccgc tccctccacc ctgactaccc ctggcgagat catcaagtac 1380

gtgctggacc gtcaaaagac cgctcccctg accgaccaag gtatcgctgc cgctatgtcc 1440

tccgctatcc agcccctgat catggctgtc gtgaaccgcg agagggacgg acagaccggt 1500

tccggtggtc gtgctcgtgg cctgtgctac acttgcggtt cccccggtca ctaccaggct 1560

cagtgcccca agaagcgcaa gtccggaaac tcccgcgagc gctgccagct ctgcaacggc 1620

atgggtcaca acgccaagca gtgccgcaag cgcgacggaa accagggcca gcgtcccgga 1680

aagggactgt cctccggtcc ttggcctggt cctgagcccc ctgctgtgtc ctaa 1734

<210> 10

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60

ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120

ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180

ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240

acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300

ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360

gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420

caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480

gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540

ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600

ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660

gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720

agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780

atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840

agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900

tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960

ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagga 1020

gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080

agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaatccag ctaccataat gatacagaaa 1140

ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200

atagccaaaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260

caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320

cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380

gagagcttca ggtttgggga agagacaaca actccctctc agaagcagga gccgatagac 1440

aaggaactgt atcctttagc ttccctcaga tcactctttg gcagcgaccc ctcgtcacaa 1500

taa 1503

Claims

1.H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒，其特征在于，所述普通型病毒样颗粒包含甲型流感病毒基质蛋白M1，H7亚型流感病毒H7N9血凝素蛋白HA，H7亚型流感病毒H7N9神经氨酸酶蛋白NA。

2.根据权利要求1所述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒基质蛋白M1为甲型流感病毒亚型株的基质蛋白M1中的一种，优选地，所述H7亚型流感病毒H7N9病毒样颗粒的所述基质蛋白M1为所述甲型流感病毒H5亚型株基质蛋白M1。

3.H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒，其特征在于，所述嵌合型病毒样颗粒包含逆转录病毒的Gag前体蛋白，H7N9流感病毒血凝素蛋白HA和H7N9流感病毒神经氨酸酶蛋白NA。

4.根据权利要求3所述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒，其特征在于，所述逆转录病毒的Gag前体蛋白为鸡白血病病毒前体蛋白ALV-Gag或人免疫缺陷病毒前体蛋白HIV-Gag。

5.如权利要求1所述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或权利要求3所述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。

6.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含如权利要求1所述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或权利要求3所述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含佐剂，所述佐剂选自白油佐剂，角鲨烯佐剂，植物油佐剂或弗氏佐剂。

8.制备权利要求1所述的H7亚型流感病毒H7N9的普通型病毒样颗粒或权利要求3所述的H7亚型流感病毒H7N9的嵌合型病毒样颗粒的方法，其特征在于，用表达所述普通型病毒样颗粒的HA-NA-M1重组载体或表达所述嵌合型病毒样颗粒的HA-NA-Gag重组载体，转染细胞，得到细胞培养液，回收并纯化所述细胞培养液，获得所述普通型病毒样颗粒或所述嵌合型病毒样颗粒。

9.根据权利要求8所述的制备权利要求1所述的H7亚型流感病毒H7N9普通型病毒样颗粒或权利要求3所述的H7亚型流感病毒H7N9嵌合型病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述细胞为昆虫细胞，所述重组载体为杆状病毒重组载体。

10.如权利要求1所述的H7亚型流感病毒H7N9普通型病毒样颗粒或权利要求3所述的H7亚型流感病毒H7N9嵌合型病毒样颗粒在制备H7N9病毒抗体检测制剂或H7N9病毒疫病监测制剂中的应用，其特征在于，所述制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒。