CN109134624A - 禽流感病毒血凝素抗原及其制备方法、应用和禽流感疫苗 - Google Patents

禽流感病毒血凝素抗原及其制备方法、应用和禽流感疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种禽流感病毒血凝素抗原及其制备方法、应用和禽流感疫苗，涉及生物技术领域。该禽流感病毒血凝素抗原为具有如SEQ ID NO.1所示序列表达的血凝素蛋白，同时为哺乳动物表达系统表达的蛋白，兼具广谱性和良好的免疫原性，免疫禽类后可产生较高滴度的抗体并且预防多种亚型的禽流感。该禽流感病毒血凝素抗原的制备方法可以获得具有广谱性和抗原免疫原性好的血凝素蛋白，并且该方法操作简单，适合规模化生产。包含该禽流感病毒血凝素抗原的疫苗生产成本低，免疫效力高，免疫3‑4周龄SPF鸡后，14日即可检测到H5亚型抗原测定HI抗体几何平均滴度(GMT)均不低于1:64，优于常规疫苗。

Description

禽流感病毒血凝素抗原及其制备方法、应用和禽流感疫苗
技术领域
本发明涉及生物术领域，尤其是涉及一种禽流感病毒血凝素抗原及其制备方法、应用和禽流感疫苗。
背景技术
禽流感病毒(AIV)为单股负链病毒，呈球形或丝状，球形直径80-120nm。基因组分为8个节段，共编码10种蛋白，其中HA、NA和M位于病毒的囊膜表面，是AIV的主要保护性抗原。位于病毒双层脂包膜下是基质蛋白M，它是病毒颗粒中含量最多的蛋白，其构成了病毒包膜的框架。在脂质双层膜上则镶嵌了两种由病毒基因编码的糖蛋白刺突，即血凝素(Hemagglutinnin，HA)与神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)，两者是划分流感病毒亚型的依据，且其抗原性极易变异，一旦形成新的亚型，极易导致禽流感的爆发。
HA是构成病毒囊膜纤突的主要成分，属于Ⅰ型糖蛋白。HA以三聚体的形式存在。HA在病毒吸附、穿模以及决定病毒与细胞融合等方面均起关键作用。它能否被裂解为HA1和HA2两部分是病毒致病力高低的重要因素。AIV感染后可以产生抗HA抗体，HA抗体是主要的保护性抗体，在防止病毒感染中起重要作用。HA蛋白是禽流感流感病毒的主要保护性抗原之一。它不仅可以刺激机体产生保护性抗体，而且可以诱导机体产生细胞毒性作用，对同一亚型病毒的共计产生良好的保护力。
2003年初至今，H5N1亚型高致病性禽流感在欧洲、非洲、美洲和亚洲的禽类中，发生过大面积流行并造成了重大的经济损失。目前禽流感灭活疫苗应用鸡胚或MDCK全悬浮细胞生产，应用鸡胚生产疫苗工艺复杂，使用的鸡胚可能存在外源病毒的污染，需要将毒液接种鸡胚、收取尿囊液、灭活，收取尿囊素液鸡胚废弃物需要高压处理，产生较多的生产废物，给环境保护带来压力。MDCK全悬浮细胞生产禽流感疫苗需要驯化种毒适应细胞的过程，需要周期长，而且有时达不到预期的毒价，其培养成本和生产工艺较为复杂。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种禽流感病毒血凝素抗原，该抗原兼具具广谱性和良好的免疫原性，免疫禽类后可产生较高滴度的抗体并且预防多种亚型的禽流感。
本发明的第二目的在于提供一种上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种上述禽流感病毒血凝素抗原或上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法制备得到的禽流感病毒血凝素抗原的应用。
本发明的第四目的在于提供一种禽流感疫苗，所述疫苗包含上述禽流感病毒血凝素抗原。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
一种禽流感病毒血凝素抗原，所述禽流感病毒血凝素抗原为具有如SEQ ID NO.1所示序列表达的血凝素蛋白；所述血凝素蛋白为哺乳动物表达系统表达的蛋白。
优选地，所述哺乳动物表达系统中，以HEK 293-F细胞作为宿主细胞。
本发明还提供了一种上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法，包括：在哺乳动物表达系统中，表达所述禽流感病毒血凝素抗原的基因。
优选地，在HEK 293-F细胞表达系统中表达所述禽流感病毒血凝素抗原的基因。
优选地，提供包含表达所述禽流感病毒血凝素抗原的基因的表达载体，将所述表达载体导入宿主细胞中，然后对宿主细胞进行加压筛选，使宿主细胞表达所述禽流感病毒血凝素抗原；
优选地，对加压筛选后的宿主细胞进行单克隆筛选。
优选地，使用遗传霉素筛选系统筛选表达所述禽流感病毒血凝素抗原的宿主细胞；
优选地，所述遗传霉素筛选系统中使用的表达载体为pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13。
优选地，所述宿主细胞表达所述禽流感病毒血凝素抗原的表达量不低于1mg/ml。
本发明还提供了一种上述禽流感病毒血凝素抗原，或上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法制备得到的禽流感病毒血凝素抗原的应用，包括如下(a)-(d)中的至少一种：
(a)制备禽流感病毒疫苗；
(b)制备禽流感病毒的抗体；
(c)制备检测禽流感病毒抗体的试剂盒；
(d)制备禽流感病毒诊断抗原。
本发明还提供了一种包含上述禽流感病毒血凝素抗原的禽流感疫苗。
优选地，所述禽流感疫苗中禽流感病毒血凝素抗原的用量为1-3μg/羽份；
优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；
优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、卡波姆、蜂胶、MF59佐剂或ISA201，优选使用ISA201。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的禽流感病毒血凝素抗原，为具有如SEQ ID NO.1所示序列表达的血凝素蛋白，SEQ ID NO.1所示序列为选用近5年流行的禽流感血凝素基因进行比对分析后得到的序列，并将该序列进行密码子的优化和修饰，以达到进一步提高抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。并且该血凝素蛋白为哺乳动物表达系统表达的蛋白，避免了损失该抗原的构象型的抗原表位。因此，该抗原兼具具广谱性和良好的免疫原性，免疫禽类后可产生较高滴度的抗体并且预防多种亚型的禽流感。
本发明还提供了一种上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法，该制备方法可以获得具有广谱性和抗原免疫原性好的血凝素蛋白，并且该方法操作简单，适合规模化生产。
本发明还提供了一种上述禽流感病毒血凝素抗原或上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法制备得到的禽流感病毒血凝素抗原的应用，可以用以制备禽流感病毒疫苗和禽流感病毒的抗体。禽流感病毒的抗体和上述禽流感病毒血凝素抗原又可以应用于制备多种检测试剂和试剂盒，以用于检测禽流感病毒。例如使用含有禽流感病毒的抗体的ELISA试剂盒以检测禽流感病毒，或者使用含有该禽流感病毒血凝素抗原的胶体金免疫层析试纸检测待测血清样品中的禽流感病毒抗体。
本发明的第四目的在于提供一种禽流感疫苗，所述疫苗包含上述禽流感病毒血凝素抗原。该禽流感疫苗生产成本低，免疫效力高，免疫3-4周龄SPF鸡后，14日即可检测到H5亚型抗原测定HI抗体几何平均滴度(GMT)均不低于1:64，21日H5亚型抗原测定HI抗体几何平均滴度(GMT)均不低于1:256；而常规的灭活苗免疫后21日HI抗体几何平均滴度(GMT)才不低于1:64，因此该疫苗优于常规疫苗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3提供的重组阳性质粒酶切鉴定结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供的禽流感病毒血凝素抗原为具有如SEQ ID NO.1所示序列表达的血凝素蛋白；所述血凝素蛋白为哺乳动物表达系统表达的蛋白。
SEQ ID NO.1所示序列为选用近5年流行的禽流感血凝素基因进行比对分析后得到的序列，并将该序列进行密码子的优化和修饰，以达到进一步提高抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。并且该血凝素蛋白为哺乳动物表达系统表达的蛋白，优选使用HEK 293-F细胞作为宿主细胞，避免了损失该抗原的构象型的抗原表位。因此，该抗原兼具广谱性和良好的免疫原性，免疫禽类后可产生较高滴度的抗体并且预防多种亚型的禽流感。
本发明还提供了一种上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法。包括：在哺乳动物表达系统中，表达所述禽流感病毒血凝素抗原的基因。该制备方法可以获得具有广谱性和抗原免疫原性好的血凝素蛋白，并且该方法操作简单，适合规模化生产。本发明使用的宿主细胞，例如可以为但不限于为HEK 293-F细胞、HEK 293-E细胞、HEK 293-T细胞、CHO细胞或者COS细胞，优选使用HEK 293-F。
HEK293是经腺病毒Ad5转染人胚肾细胞之后得到的稳定细胞系，HEK293-F为HEK293的衍生细胞系，具有易转染、高表达、天然糖基化修饰、允许蛋白正确折叠和相关翻译后修饰等优点。
在一些优选的实施方式中，禽流感病毒血凝素抗原的制备方法包括：提供包含表达所述禽流感病毒血凝素抗原的基因的表达载体，将所述表达载体导入宿主细胞中，然后对宿主细胞进行加压筛选，使宿主细胞表达所述禽流感病毒血凝素抗原，更优选对加压筛选后的宿主细胞进行单克隆筛选，以提高宿主细胞的禽流感病毒血凝素抗原的表达量。所述宿主细胞表达所述禽流感病毒血凝素抗原的表达量优选不低于1mg/ml。
在一些优选的实施方式中，使用遗传霉素筛选系统筛选表达所述禽流感病毒血凝素抗原的宿主细胞，该筛选系统对细胞表达载体的选择标记为neo基因，所述遗传霉素筛选系统中使用的表达载体优选为pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13。
G遗传霉素(G-148)是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G-418遗传霉素的选择性培养基中生长。
本发明还提供了一种上述禽流感病毒血凝素抗原，或上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法制备得到的禽流感病毒血凝素抗原的应用，包括如下(a)-(d)中的至少一种：(a)制备禽流感病毒疫苗；(b)制备禽流感病毒的抗体；(c)制备检测禽流感病毒抗体的试剂盒；(d)制备禽流感病毒诊断抗原。
本发明还提供了一种上述禽流感病毒血凝素抗原或上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法制备得到的禽流感病毒血凝素抗原的应用，可以用以制备禽流感病毒疫苗和禽流感病毒的抗体。禽流感病毒的抗体和上述禽流感病毒血凝素抗原又可以应用于制备多种检测试剂和试剂盒，以用于检测禽流感病毒。例如使用含有禽流感病毒的抗体的ELISA试剂盒以检测禽流感病毒，或者使用含有该禽流感病毒血凝素抗原的胶体金免疫层析试纸检测待测血清样品中的禽流感病毒抗体。
本发明还提供了一种禽流感疫苗，所述疫苗包含上述禽流感病毒血凝素抗原。该禽流感疫苗生产成本低，免疫效力高，免疫3-4周龄SPF鸡后，14日即可检测到H5亚型抗原测定HI抗体几何平均滴度(GMT)均不低于1:64，21日H5亚型抗原测定HI抗体几何平均滴度(GMT)均不低于1:256；而常规的灭活苗免疫后21日HI抗体几何平均滴度(GMT)才不低于1:64，因此该疫苗优于常规疫苗。
在一些优选的实施方式中，所述禽流感疫苗中禽流感病毒血凝素抗原的用量为1-3μg/羽份；优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种。优选包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、卡波姆、蜂胶、MF59佐剂或ISA201，优选使用ISA201。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1一种表达血凝素蛋白的序列
从Genebank上下载当前流行、近5年流行的禽流感H5亚型HA基因序列进行比对分析，选择出优势表位作为疫苗抗原的成分，根据HEK 293-F细胞密码子的偏嗜性，将禽流感病毒HA基因的序列进行密码子的优化和修饰，得到具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，以提高目的蛋白表达HA蛋白的水平。设计酶切位点并人工合成HA基因全长。
实施例2一种表达血凝素蛋白的重组载体的构建
将上述合成的编码HA蛋白的氨基酸序列且C端具有His标签的片段通过Sal I和Xho I位点插入克隆到真核转移载体pcDNA3.1上。利用T4DNA连接酶在16℃过夜连接后获得连接产物，经大肠杆菌感受态DH5α转化后涂布于含有氨节青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落在含有氨节青霉素的LB培养基中培养，提取质粒。
实施例3表达血凝素蛋白的重组载体的的酶切鉴定
将制备质粒DNA，选择Sal I和Xho I位点限制性内切酶消化，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。其中，泳道M：DNA Marker，泳道1～3：酶切后质粒，泳道4：酶切前质粒。从图中可以看出有预期大小的目的出现，说明目的基因成功插入到载体中。
实施例4表达血凝素蛋白的重组载体的重组细胞加压筛选
将该质粒转染至生长良好全悬浮的HEK 293-F细胞，3日后进行细胞传代，并在培养基内加入800μg/ml的G418，加压至活率在30％左右时，停止加压，用常规的培养基培养，当细胞活率达到90％以上时，再加压筛选一次，同样细胞活率达到90％。
实施例5表达血凝素蛋白的重组载体细胞的单克隆筛选
阳性克隆挑选和检测：培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，利用贴壁培养基培养7天后，加入100μL悬浮培养基Freestyle HEK 293-F培养2天，孔板中培养基用于点杂交检测，将其中高表达克隆转至24孔板，利用贴壁培养基培养2天后换为Freestyle HEK 293-F培养，培养基用于蛋白质印迹法检测，根据实验结果最终得到高表达克隆株。所有细胞的培养条件为37℃，5％CO2。
实施例6表达血凝素蛋白的重组载体细胞的的培养
将经过筛选的HEK 293-F细胞在Freestyle HEK 293-F培养基中重悬细胞，细胞接种密度为0.3×106～0.5×106VC/ml，接种细胞于合适体积的细胞摇瓶，并置于36～38℃，含5％CO2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，继续传代扩增培养细胞。
根据需要进行逐级生物反应器培养发酵，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在36～38℃培养至第5日将温度降至31～33℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的Efficient Feed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当蛋细胞活率低于80％时，收获上清即为所需抗原。
通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了1.2mg/ml的HA蛋白表达。
实施例7一种禽流感疫苗
去细胞碎片将表达的定量后，与ISA201佐剂混合制备成疫苗。其中水相与油相乳化比例为1:1质量比)，先将油相导入烧杯中，慢速搅拌，缓慢加入水相，加完后10000r/min剪切乳化5min，在终止乳化前按总量加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌混匀。无菌定量分装，加盖密封，获得禽流感亚单位疫苗，置2～8℃保存。
免疫3～4周龄SPF鸡后，结果显示14日即可检测到H5亚型抗原测定HI抗体几何平均滴度(GMT)均不低于1:64，21日H5亚型抗原测定HI抗体几何平均滴度(GMT)均不低于1:256。
对比例1
将种毒接种至10～11日龄的鸡胚尿囊素液中，培养约72小时后，收取鸡胚尿囊素液，灭活，乳化，同时需要高压灭菌处理吸取尿囊液的鸡胚。免疫后21日HI抗体几何平均滴度(GMT)不低于1:64。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物股份有限公司
<120> 禽流感病毒血凝素抗原及其制备方法、应用和禽流感疫苗
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1707
<212> DNA
<213> 禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)
<400> 1
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agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080
cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac 1140
gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200
atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa 1260
aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacggat tcctagatgt ctggacttat 1320
aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380
gtcaagaacc tttacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440
aacggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaac 1500
ggaacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcaagac taaaaagaga ggaaataagt 1560
ggagtaaaat tggagtcaat aggaacttac caaatactgt caatttattc tacagtggcg 1620
agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatggg 1680
tcgttacaat gcagaatttg catttaa 1707

Claims (10)

1.一种禽流感病毒血凝素抗原，其特征在于，所述禽流感病毒血凝素抗原为具有如SEQID NO.1所示序列表达的血凝素蛋白；所述血凝素蛋白为哺乳动物表达系统表达的蛋白。
2.根据权利要求1所述的禽流感病毒血凝素抗原，其特征在于，所述哺乳动物表达系统中，以HEK 293-F细胞作为宿主细胞。
3.一种权利要求1或2所述的禽流感病毒血凝素抗原的制备方法，其特征在于，包括：在哺乳动物表达系统中，表达所述禽流感病毒血凝素抗原的基因。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在HEK 293-F细胞表达系统中表达所述禽流感病毒血凝素抗原的基因。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，提供包含表达所述禽流感病毒血凝素抗原的基因的表达载体，将所述表达载体导入宿主细胞中，然后对宿主细胞进行加压筛选，使宿主细胞表达所述禽流感病毒血凝素抗原；
优选地，对加压筛选后的宿主细胞进行单克隆筛选。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，使用遗传霉素筛选系统筛选表达所述禽流感病毒血凝素抗原的宿主细胞；
优选地，所述遗传霉素筛选系统中使用的表达载体为pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞表达所述禽流感病毒血凝素抗原的表达量不低于1mg/ml。
8.权利要求1或2所述的禽流感病毒血凝素抗原，或权利要求3-7中任一项所述的禽流感病毒血凝素抗原的制备方法制备得到的禽流感病毒血凝素抗原的应用，其特征在于，包括如下(a)-(d)中的至少一种：
(a)制备禽流感病毒疫苗；
(b)制备禽流感病毒的抗体；
(c)制备检测禽流感病毒抗体的试剂盒；
(d)制备禽流感病毒诊断抗原。
9.一种包含权利要求1或2所述的禽流感病毒血凝素抗原的禽流感疫苗。
10.根据权利要求9所述的禽流感疫苗，其特征在于，所述禽流感疫苗中禽流感病毒血凝素抗原的用量为1-3μg/羽份；
优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；
优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、卡波姆、蜂胶、MF59佐剂或ISA201，优选使用ISA201。
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