KR100979025B1 - 바이러스, 바이러스 단리물 및 백신의 생산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포를 포함하고 그로 인하여 바이러스 입자를 생산하는, 바이러스 입자를 생산하기 위한 수단, 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 관점은 번역후 변형 단백질을 암호화하는 핵산을 제공하고 그로 인하여 비-조작된 세포와 비교된 세포에 의해 생산된(되는) 바이러스의 하나 이상의 특성을 변경하는 세포를 이용하는 것이다.

Description

바이러스, 바이러스 단리물 및 백신의 생산{PRODUCTION OF VIRUSES, VIRAL ISOLATES AND VACCINES}
본 발명은 약제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 감염에 대한 보호를 제공하는 백신에 관한 것이고, 이들을 얻기 위한 방법 및 수단에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 고대로부터 인간을 괴롭혀 온 고도의 접촉 전염성 호흡기성 질병인, 유행성 감기의 병인학적인 동인이다. 상기 바이러스는 1933년에 처음으로 발견되었지만, 거의 확실하게 인플루엔자에 의한 수많은 유행은 수 백년동안 여러 번 보고되었다(Potter 1998). 지난 세기에서 인플루엔자의 발병은 세 개의 주요한 사례가 있었다. 1918년 소위 '스페인 유행성감기'는 특히 심하였다. 전세계적으로 어림잡아 2 내지 4천만 명을 죽게 하여, 역사상 알려진 인간의 질환 중 가장 심한 발병으로 기록되었다. 1957년에 '아시아 유행성감기'는 어림잡아 1백만 명을 죽게 하고, 1968년에 '홍콩 유행성감기'는 700,000명이상에게 치명적이었다. 과학자들의 노력에도 불구하고, 인플루엔자 바이러스에 의한 감염은 경제적인 결과뿐만 아니라 질환 및 죽음 등으로 매년 무거운 대가를 요구하고 있다. 최근의 성과는 특정 인플루엔자의 독특한 독성이 과거에서 주요한 세계적 유행병을 야기한다는 것을 설명하게 한다(Gibbs et al. 2001; Hatta et al. 2001). 하지만, 기본적인 병리학적인 메카니즘의 이해가 불충분하므로, 질환의 효과적인 예방 및 처리는 제한적이다.
모든 세대군을 포함하는 추정에 따르면, 미국에서만 매년 4천8백만 명의 인간이 유행성감기로 고통받는다. 이들 유행은 매년 병원에서의 치료를 필요로 하는 최고 약 4백만 명의 환자당 약 20,000명의 사망을 초래한다(CDC 통계). 유아, 어린이 및 노인층은 특히 인플루엔자 감염에 걸리기 쉽다. 하지만, 높은 병원성 및 감염성 능력을 갖는 신규한 바이러스 변이체의 출현은 모든 단일체에게 주요한 위험으로 남아 있다. 이것은 홍콩에서 동정된 바이러스가 임상학적으로 진단된 18명 중 1/3이 사망한 1997년의 사례로 입증되었다(Claas et al. 1998; Subbarao et al. 1998).
새는 인플루엔자 바이러스의 주요한 저장소로 나타난다. 특히, 인플루엔자 A 바이러스의 알려진 모든 서브타입(인간에게서 유행성감기의 가장 일반적인 사례인 서브타입 B로 함께)은 야생형뿐만 아니라 가축용 새로부터 단리되고 있다. 하지만, 조류 인플루엔자 A 바이러스는 일반적으로 새에서 인간으로 직접 전파되지는 않는다. 이러한 관점에서, 지금까지 기록된 하나의 예외는 상기한 1997년의 홍콩 바이러스이다. 몇몇의 바이러스 단백질은 숙주 특이성을 주는 데에 역할을 하는 것으로 생각되지만, 가장 중요한 요소는 헤마글루티닌(HA) 막 단백질이다.
HA 유전자는 처음 동정되고 서열화된 인플루엔자 바이러스의 유전자 중 하나이다. 그것은 직접적으로 숙주세포로의 침투 및 부착을 포함하는 막횡단 단백질(transmembrane protein)을 코드한다. HA는 숙주세포 표면에 존재하는 당단백질 및 신경절 세포에 존재하는 말단 시알릴-과당류 수용체 결정인자에 결합하여 감염을 일으킨다. 천연의 시알릴-당단백질 및 신경절 세포의 말단 시알산 잔기는 결합의 최소 결정인자인 것으로 알려져 있다. 하지만, 결합은 또한 전종단(penultimate) 갈락토스에의 시알산 연결의 형태 및 시알릴-글리코콘주게이트(glycoconjugate)의 더욱 먼 거리 부분의 구조에 의존한다.
인간 인플루엔자 바이러스는 우선적으로 시알산 알파-2,6-갈락토스(SAalpha2, 6Gal) 연결을 함유하는 수용체에 결합하는 반면에, 조류 바이러스는 SAalpha2, 3Gal 연결을 사용한다(Suzuki 1994에서 검토됨). 이 결합 특이성은 또한 숙주 안의 바이러스의 세포 향성을 결정한다. 인간 인플루엔자 바이러스 감염(및 복제)은 호흡기관으로 제한적이지만, 조류 인플루엔자 바이러스는 새의 허파뿐만 아니라 장관 내막의 세포에서 주로 발견된다. 시알산-갈락토스 연결 특이 렉틴을 사용하여, SAalpha2,3Gal이 아니라 알파-2,6 연결에 의해 갈락토스에 연결된 시알산 잔기가 인간 기관의 상피 세포의 표면에 존재하는 것을 보여준다(Baum and Paulson 1990). 더구나, 호흡기관의 점액소에서 풍부한 SAalpha2,3Gal 모이어티(moiety)는 또한 HA의 인간 인플루엔자의 SAalpha2,6Gal-특이 표현형을 유지하는 데에 기여한다(Baum and Paulson 1990; Couceiro et al. 1993).
대부분의 실험실에서, 일차 단리물은 배아된 계란의 융모요막낭에서 수행된다. 이것은 역사적인 이유에서 뿐만 아니라, 적절한 대체 성장 배지가 없음에 기인한다. 이것은 또한 현재, 백신 조제물에서 사용되는 바이러스의 대량 생산을 위해 선택되는 시스템이다. 하지만, 수정란은 백신 생산을 위한 숙주 시스템으로서 중대한 한계를 갖는다. 예를 들어, 양질의 알의 확실한 연중 공급의 결여 뿐만 아니라, 수정란의 제한된 이용가능성은 일반적으로 신규한 인플루엔자 서브타입의 갑작스런 발병의 경우에 백신 생산을 방해할 수 있다. 이 생산 시스템의 다른 불이익은 융통성의 결핍, 독성 존재의 위험 및 우발적인 바이러스, 특히 레트로바이러스의 위험이고, 살균에 관한 것이다.
이러한 제한 이외에, 알에서 바이러스를 배양하는 것은 매우 중요한 부가적인 문제를 일으키고, 백신 목적에 특히 중요하다: 현재, 알 배양이 바이러스의 기질-특이 적응을 이끈다는 풍부한 증거가 있다. 사실상, 알의 요막낭에서의 아주 적은 회수의 계대배양도 일차 인간 단리물이 SAalpha2,3Gal 결합 표현형에 적응하기에는 풍부하다(Rogers et al. 1985). 이것은 닭의 배아 융모요막의 막 표면의 내막된(lining) 세포에서 SAalpha2,6Gal 잔기가 아니라 SAalpha2,3Gal의 존재에 기인한다. SAalpha2,6Gal 잔기와 특이적으로 상호작용할 수 있는 일차 단리물에서 존재하는 바이러스 변이체는 SAalpha2,6Gal 잔기에 더욱 특이적으로 상호작용하는 바이러스 변이체보다 복제상 유리하다. 그러므로, SAalpha2,3Gal-특이 바이러스 변이체는 수정란에서 선별된다(Gambaryan et al. 1999; Gambaryan et al. 1997). 알-적응은 SAalpha2,3Gal에 대한 친화성을 증가시킬 뿐만 아니라, SAalpha2,6Gal에 대하여 친화성을 감소시킨다. 사실상, HA는 매우 동등하게 유사체의 양쪽 유형을 수용하고, 다중 돌연변이는 이 변경된 결합 특이성을 수여하는 것으로 동정되고 있다(Daneils et al. 1987; Gambaryan et al. 1999; Ito et al. 1997; Suzuki et al. 1989). 특이적 면역 반응을 이끌어내는 데에서 HA의 중요성이 주어진다면, 이들 돌연변이는 그것의 항원 특성의 주요한 변경을 일으킨다(Ilobi et al. 1994; Robertson et al. 1994). 따라서, 알-유도 돌연변이를 갖는 HA 분자를 함유하는 백신으로의 면역화는 성취된 보호의 수준을 희생시켜 야생형 인플루엔자 균주에 덜 중성화된 항체를 유도한다(Newman et al. 1993)
발명의 요약
본 발명은 바람직하게는 감염된 개체(subject)로부터 얻어진 바이러스 단리물에 존재하는 인플루엔자 바이러스 입자와 같은 바이러스 입자를 생산하고 그리고/또는 증식하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 세포를 바이러스 입자와 접촉시키는 단계, 및 상기 바이러스 입자의 증식에 공헌하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 여기서, 상기 세포는 alpha2,6 또는 alpha2,3 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 과발현한다. 본 발명은 또한 인플루엔자 단리물에 존재하는 인플루엔자 바이러스 입자와 같은 바이러스 입자 세트의 선별적인 증식을 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 바이러스 입자의 세트는 특이적 당화(glycosylation) 잔기를 포함하는 수용체에 대한 친화성을 갖고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 상기 바이러스 입자의 증식에 공헌하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포 및/또는 상기 배양 배지로부터 생산된 바이러스 입자를 수확하는 단계.
본 발명은 또한 신규한 백신 및 이러한 백신을 만들기 위한 방법을 제공하 고, 여기서, 상기 방법은 바람직하게는 하기 단계를 포함한다: 항원성 부분을 얻기 위하여 생산된 바이러스 입자를 처리하는 단계; 및 인플루엔자 바이러스 유래의 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제와 같은 하나 이상의 항원성 부분을 수확하는 단계. 본 발명은 또한 예를 들어, 인플루엔자 감염에 대한 백신과 같은 백신의 생산은 당화를 포함하는 특정 단백질을 과발현하는, 세포 및 세포주 및 그것의 용도를 제공한다. 본 발명의 세포는 바람직하게는 인간이고 PER.C6 세포 또는 그것의 유도체와 같은, 아데노바이러스 E1에 의해 형질변환된다.
상세한 설명
본 발명은 바이러스 입자를 생산하고 그리고/또는 증식하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 바이러스 입자에 의한 세포의 감염에 공헌하는 조건하에서의 배양 배지에서 상기 세포를 상기 바이러스 입자와 접촉시키는 단계; 및 상기 바이러스 입자의 증식에 공헌하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 여기서, 상기 세포는 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 또는 그것의 기능적인 등가물(functional equivalent)을 암호화하는 핵산을 과발현한다. 상기 핵산은 래트 및 인간과 같은 다른 원천(source)에서 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제를 암호화할 수 있다. 바람직하게는 상기 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제는 인간 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제이다. 본 발명은 또한 바이러스 입자를 생산하고 그리고/또는 증식하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 바이러스 입자에 의한 세포의 감염에 공헌하는 조건하에서의 배양 배지에서 상기 세포를 상기 바이러스 입자와 접촉시키는 단계; 및 상기 바이러스 입자의 증식에 공헌하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 여기서, 상기 세포는 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 또는 그것의 기능적인 등가물을 암호화하는 핵산을 과발현한다. 상기 핵산은 래트 및 인간과 같은 다른 원천으로부터 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제를 암호화할 수 있다. 바람직하게는 상기 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제는 인간 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 바이러스 입자는 인플루엔자 바이러스 입자이다. 본 발명의 방법을 사용하여 생산되고 그리고/또는 증식될 수 있는 바이러스 입자의 다른 비제한적인 예는 파라인플루엔자 바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV) 또는 폴리오마바이러스(poliomavirus)이다. 알파2,3 및 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제에 의해 유도되는 당화 구조를 이용하는 바이러스는 본 발명의 방법을 사용하여 생산되고 그리고/또는 증식될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 입자를 증식시키기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 인플루엔자 바이러스 입자는 인플루엔자 단리물에 존재한다. 상기 인플루엔자 단리물이 하나 이상의 인플루엔자-감염된 포유동물 개체로부터 얻어지는 방법이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 인플루엔자-감염된 포유동물 개체가 인간 또는 돼지인, 인플루엔자 바이러스 입자를 증식시키기 위한 방법 더욱 바람직하다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하고 그리고/또는 증식하기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 인플루엔자 단리물은 하나 이상의 인플루엔자-감염된 새로부터 얻어진다. 여기서 사용된 단리물은 인플루엔자 바이러스로 감염된 개체로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 배치(batch)로 간주한다. 이들 개체는 인간, 새, 돼지 및 말과 같은, 인플루엔자 바이러스에 감염되기 쉬운 모든 종일 수 있다. 인간은 다른 방법으로 인플루엔자에 감염될 수 있다: 다른 인간에게 직접 감염되는 방법 또는 돼지 및 새와 같은 동물 개체로부터 직접 감염되는 방법. 백신 제조에 사용되는 증식된 바이러스는 원래는 하나 이상의 개체로부터 유도될 수 있다(하나 이상의 인간 단일체 또는 하나 이상의 새, 돼지 등). 새로부터 인간에게로의 인플루엔자 바이러스 전파가 인간에게 직접 질환을 일으키는 1997년 홍콩에서와 같은 경우(상기 참조)에는, 백신 제조를 위하여 직접적으로 새 단리물에서 존재하는 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하고 그리고/또는 증식할 수 있는 것이 유용할 것이다. 본 발명은, 세포 표면 단백질의 당화를 포함하고 그리고 과당류 사슬에서 소위 SAalpha2,3Gal 및 SAalpha2,6Gal 연결을 생성하는 시알릴트랜스퍼라제 단백질을 과발현하는 것으로 새, 돼지, 말 및 인간과 같은 종으로부터 얻어지는 단리물에서 존재하는 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하고 그리고/또는 증식시키기 위한 방법을 제공한다. 여기서 사용된 단리물은 바람직하게는 임상적인 단리물(즉, 감염된 환자로부터 얻은 단리물)로 간주한다. 이러한 임상적인 단리물은 또한 일차 단리물로 간주된다. 일차 단리물은 예를 들어 인플루엔자 바이러스로 감염된 인간 또는 동물의 코, 점액 및/또는 대소변으로부터 직접 얻어지는 인플루엔자 단리물일 수 있다. 하지만, 알에서 또는 세포에서 또는 다른 시스템에서 증식되고 있는 단리물은 추가로 본 발명의 방법으로 생산되고 그리고/또는 증식될 수도 있다. 그러므로, 본 발명을 사용하여 생산되고 그리고/또는 증식된 바이러스 입자는 계대배양된 배치에 존재할 수 있지만, 임상적인 단리물과 같은, 일차 배치에서 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 입자의 생산 및/또는 증식은 배양 배지에서 세포를 사용하는 것으로 수행되고, 여기서, 상기 세포는 아데노바이러스 유래의 E1으로 형질변환된다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포는 인간 세포이다. 가장 바람직하게는, 본 발명은 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 입자를 증식하기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 인간 세포는 PER.C6 또는 그것의 유도체이다.
PER.C6 세포가 로타바이러스 및 인플루엔자 바이러스와 같은 바이러스의 다른 종의 증식에 유용하다는 것을 발견하였다(WO 01/38362 참조). PER.C6 세포는 아데노바이러스 혈청형 5의 E1 영역으로 배아의 망막으로부터 얻어진 형질변환된 세포에 의해 처음 생성되었다. 알파2,3 및 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제 단백질 모두는 PER.C6 세포에 존재하고 활동적이다(Pau et al. 2001). 그러므로, 2,3 유형뿐만 아니라 2,6 유형(각각 SAalpha2,3Gal 및 SAalpha2,6Gal)의 시알산-갈락토스 연결과 특이적으로 상호작용하는 바이러스 입자는 PER.C6 세포에서 성장할 수 있었다. 이들 시알릴트랜스퍼라제 단백질 중 하나의 과발현이 SAalpha2,3Gal 잔기 또는 SAalpha2,6Gal 잔기 중 하나를 선호하는 인플루엔자 바이러스 세트의 특이적인 증식을 이끄는 것은 본 발명의 중요한 관점이다. 이것은 최적의 보호를 위한 최고의 함량을 갖는 백신 생산을 위한 바이러스 배치를 생산하는 것을 가능하게 한다. 이 함량은 매우 다양하다. 상기와 같이, 바이러스 퍼짐의 일부는 주로 인간-인간 접촉으로 발생하지만, 다른 경우(1997년 홍콩의 사례와 같은)에, 직접적인 새-인간 접촉은 인간에게 극적인 영향을 주기에 충분하다. 이것에서 역할을 하는 인플루엔자 바이러스의 유형 및 독성에 의존하여, 단리물에서 바이러스 입자의 세트가 최종 백신이 생산되도록 증식되는 것으로 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하고 그리고/또는 증식하기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 상기 핵산은 상기 세포에 이종성이다. 바람직하게는, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 상기 핵산은 상기 세포의 게놈으로 통합된다. 여기서 사용된 바와 이종성이란 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자가 조작이 없는 경우보다 더 많은 단백질을 발현하도록 핵산이 조작된다는 것을 의미한다. 이종성은 또한 핵산이 세포가 유도되는 종과는 다른 종에서 유래된 것일 수도 있지만 같은 종에서 유래된 것일 수도 있다는 것을 의미한다. 세포가 그 세포에 전형적인 것보다 많은 시알릴트랜스퍼라제를 발현하는 경우에, 세포는 시알릴트랜스퍼라제를 과발현한다고 말하여진다. 시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 세포는 또한 상기 세포의 게놈을 조작하는 것으로 단백질을 과발현하게 하여, 상기 세포의 게놈에 존재하는 유전자가, 조작 전의 상기 세포가 발현하던 것보다 많은 단백질을 발현한다. 과발현은 일반적으로 단백질의 발현을 제한하는 억제자(suppressor)의 제거 또는 억제에 의하여, 또는 화학적 수단에 의하여, 다른 또는 더욱 활성인 프로모터의 통합과 같은 외부 수단에 의하여 유도될 수 있다. 과발현은 또한 선별될 수 있다. 세포가 하나 이상의 시알릴트랜스퍼라제의 현저한 과발현을 위하여 선별된다면, 그것들은 본 발명에 따른 방법을 위하여 사용될 수 있다. 그러므로, 이러한 세포 및 이러한 세포의 사용은 또한 본 발명의 일부분이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 백신을 만들기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 본 발명의 방법에 따른 바이러스 입자를 생산하고 그리고/또는 증식시키기 위한 단계; 및 그렇게 생산된 바이러스 입자를 비활성화하는 단계. 바람직하게는, 백신을 생산하기 위한 상기 방법은 또한 하기의 단계를 포함한다: 이와 같이 생산된 상기 바이러스 입자를 처리하여 항원성 부분을 제공하는 단계; 및 바람직하게는, 상기 하나 이상의 부분에 대하여 정제 및/또는 농축의 수단을 통하여 하나 이상의 상기 항원성 부분을 얻는 단계. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 얻어진 항원성 부분을 포함하는 정제된 및/또는 농축된 조성물은 상기 처리된 바이러스 입자의 다른 항원성 부분을 포함하지 않는다. 더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명은 백신을 만들기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 항원성 부분은 인플루엔자 바이러스 유래의 헤마글루티닌 단백질 또는 그것의 일부, 및/또는 뉴라미니다제 단백질 또는 그것의 일부를 포함한다. 뉴라미니다제(NA) 및 헤마글루티닌(HA) 단백질은 인플루엔자 바이러스 입자의 가장 두드러진 항원성 부분이고, 다른 증식 단계 중에 달라지기 쉽다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라서 얻을 수 있는 백신을 제공하고, 본 발명에 따라서 얻을 수 있는 백신을 포함하는 약제학적인 조성물을 제공한다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 세포는 인플루엔자 바이러스 입자를 포함하는 일차, 임상적인 단리물의 증식에 매우 유용하고, 상기 세포는 또한 당단백질상에 존재하는 특이적 당화 잔기를 인식하는 인플루엔자 바이러스 입자의 선별을 얻기 위하여, 수정란에서 또는 다른 시스템에서 이미 계대배양되고 있는 단리물을 증식하는 데에 적용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 바이러스 입자의 증식을 위해 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제 또는 그것의 기능성 부분(functional part)을 과발현하는 세포의 용도 및 바이러스 입자의 증식을 위한 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 또는 그것의 기능성 부분을 과발현하는 세포주의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 바이러스 입자는 인플루엔자 바이러스 입자이다. 더욱 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스 입자는 하나 이상의 인플루엔자-감염된 포유동물 개체로부터 얻어지는 인플루엔자 단리물에 존재한다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 세포주의 사용이고, 여기서, 상기 인플루엔자-감염된 포유동물 개체는 인간 또는 돼지이지만, 상기 인플루엔자 바이러스 입자가 하나 이상의 인플루엔자-감염된 새로부터 얻어지는 인플루엔자 단리물에 존재하는 것도 바람직하다.
본 발명은 추가로 단리물에 존재하는 예비 결정된 바이러스 입자 세트의 선별적인 생산 및/또는 증식 방법을 제공하고, 여기서, 상기 예비 결정된 바이러스 입자 세트는 수용체에 존재하는 특이적 당화 모이어티를 선호하고, 여기서, 상기 단리물은 상기 세트에 더하여, 상기 선호도를 갖지 않는 바이러스 입자도 포함하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 상기 세트에 존재하는 하나 이상의 바이러스 입자에 의한 상기 세트의 감염에 공헌하는 조건하에서의 배양 배지에서 상기 단리물으로, 상기 특이적 당화 모이어티를 포함하는 상기 수용체를 발현하고 드러낼 수 있는 세포를 인큐베이션하는 단계; 상기 바이러스 입자의 증식에 공헌하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포 세포 및/또는 상기 배양 배지로부터 이와 같이 얻어진 바이러스 입자를 수확하는 단계. 여기서 사용된 바와 같이, 당화 모이어티는 감염을 위해 바이러스 입자에 의하여 인식되는 당단백질에서의 과당류 사슬에 존재하는 당 유형의 특정 종류의 잔기, 연결 및/또는 군으로 간주한다. 바람직하게는, 상기 당화 모이어티는 SAalpha2,6Gal 잔기 또는 SAalpha2,3Gal 잔기를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 예비 결정된 바이러스 입자 세트는 예비 결정된 인플루엔자 바이러스 입자 세트이다. SAalpha2,6Gal 잔기 및 SAalpha2,3Gal 잔기는 인플루엔자인 경우에, 바이러스 입자의 HA 단백질에 의해 특이적으로 인식된다. 어느 하나의 잔기와의 상호작용에 있어서 특이성이 있는가는 HA 단백질에 의존한다. 일반적으로, 인플루엔자 단리물은 SAalpha2,6Gal 잔기와 특이적으로 상호작용하는 바이러스뿐만 아니라 SAalpha2,3Gal 잔기와 특이적으로 상호작용하는 바이러스를 포함한다. 본 발명에 의해서, 임상적인, 일차 및/또는 계대배양된 단리물로부터의 어느 하나의 바이러스 세트를 선별적으로 증식하여, 인간에게 유용한, 인플루엔자 백신의 생산에 유용한 바이러스의 증식된 세트를 얻는 것은 현재 가능하다. 백신이 인간을 위해 생산될 수 있다는 사실에 더하여, 본 발명의 방법 및 수단을 사용하는 것으로, 바이러스를 예를 들어, 돼지 또는 말 개체군을 통해 인플루엔자 바이러스의 퍼짐을 막기 위한 수의학적인 적용물의 제조를 위하여 선별적으로 증식하는 것도 또한 가능하다. 바람직하게는, 상기 인플루엔자 단리물은 하나 이상의 인플루엔자-감염된 인간, 돼지 또는 새로부터 얻어진다. 상기 세포가 인간 세포이고 아데노바이러스 유래의 E1으로 형질변환되는 것 또한 바람직하다. 세포가 PER.C6 세포 또는 그것의 유도체인 것도 매우 바람직하다. 상기한 바와 같은 유도체는 최초의 PER.C6 세포의 변형된 별형(version)으로 간주하고, 여기서, 예를 들어, 다른 이종성 핵산이 녹아웃(knock-out)되거나 또는 다른 방법으로 변형된다. PER.C6 유도체의 비제한적인 예는 아데노바이러스 E2A의 온도-민감한 돌연변이체를 안정하게 발현하거나, 또는 E4와 같은 다른 아데노바이러스 핵산을 발현하는 PER.C6 세포이다. PER.C6 세포에서의 특정 핵산이 화학적 처리 또는 녹아웃 기술과 같은 다른 수단으로 스위치를 넣거나 또는 빼고 있다면, 이들 세포 역시 PER.C6 유도체로 남는다. 제공된 실시예가 에리트로포이에틴(EPO) 단백질을 과발현하는 세포의 용도를 기재할지라도, 본 발명의 세포에서 EPO의 과발현을 갖는 것은 본 발명의 일부분이 아니라는 것을 명심해야 한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 단리물에 존재하는 바이러스 입자 세트의 선별적인 증식을 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 세포는 상기 세포에 이종성인 시일릴트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법으로, 여기서, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 상기 핵산이 상기 세포의 게놈으로 통합된다. 이러한 통합된 핵산은 바람직하게는 하이그로마이신 및 네오마이신 내성 유전자와 같은 선별 마커의 사용을 통해 안정하게 통합된다.
본 발명은 또한 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 또는 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 이종성 핵산을 포함하는 인간 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 핵산은 상기 인간 세포의 게놈으로 통합된다. 본 발명은 또한 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 입자인, 바이러스 입자의 선별적인 증식을 위한 이러한 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 인간 인플루엔자 바이러스의 일차 단리물의 증식을 위한 공정의 최적화를 제공한다. 또한, 본 발명은 세포 표면 당단백질에 존재하는 SAalpha2,6Gal 또는 SAalpha2,3Gal(또는 모두의) 당화 모이어티를 사용하여 인플루엔자 바이러스의 일차 단리물 뿐만 아니라 실험용 단리물을 증식시키기 위한 공정의 최적화를 제공한다. 일반적으로, 인간 인플루엔자 바이러스는 SAalpha2,6Gal 모이어티를 인식하지만, 새 인플루엔자 바이러스는 SAalpha2,3Gal 모이어티를 인식한다. 돼지 인플루엔자 바이러스는 일반적으로 양쪽 잔기를 사용한다. 본 발명은 특정 바이러스의 증식을 위한 공정의 최적화를 제공하고, 여기서 바이러스의 복제는 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제 및/또는 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제의 활성에, 또는 더욱 일반적으로, SAalpha2,3Gal 또는 SAalpha2,6Gal 잔기의 존재에 의존한다. 본 발명의 방법은 배양 배지에서 세포의 용도를 포함한다. 이러한 공정의 예로서, 인간 세포는 인플루엔자 바이러스의 효율적인 복제 및 생산을 지원하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 세포는 인플루엔자 바이러스의 증식에만 유용한 것이 아니다. 아데노-연관 바이러스(AAV), 인간 폴리오마바이러스 및 파라인플루엔자와 같은 다른 바이러스가 감염을 위한 당단백질에서의 알파2,3 및 알파2,6 연결을 활용한다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다(Liu et al. 1998; Suzuki et al. 2001; Walters et al. 2001). 그러므로, 본 발명은 또한 표적 세포의 감염 및 인식을 위하여 이들 당화 구조를 사용하는 다른 바이러스의 (선별적인) 생산 및/또는 증식을 위한 방법을 제공한다. 더구나, 본 발명은, 적절하다면, 인플루엔자 이외의 바이러스 생산을 위한 및 이러한 바이러스에 대한 백신의 생산을 위한 방법 및 수단 및 본 발명의 세포의 용도를 제공한다. 그러므로, 본 발명은 또한 세포의 인식 및 감염성을 위해 SAalpha2,3Gal 및 SAalpha2,6 잔기를 활용하는 바이러스에 대한 백신을 제공한다.
PER.C6™ 세포(ECACC 수탁번호 96022940)가 인플루엔자 바이러스의 증식을 위한 이상적인 기질을 대표하고 PER.C6로부터의 생산 수준이 백신 목적에 적합한 높은 역가의 증식을 일으킨다는 것이 이미 예증되어 있다(WO 01/38362). 'PER.C6-alpha2,6ST'로 명명된, 본 발명에 의하여 제공된 신규의 세포주는 하기 공정을 통하여 PER.C6로부터 유도된다: 강한 CMV 프로모터의 조절 하에서 인간 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 내재하는 플라스미드는 PER.C6 세포로 트랜스펙션되었고, 이어서 세포는 플라스미드의 안정한 통합을 위하여 선별되었다. PER.C6-알파2,6ST 세포는 최초의 PER.C6 세포에서 SAalpha2,6Gal 잔기를 수행하는 수용체의 수와 비교하여, SAalpha2,6Gal-함유 수용체의 고도의 발현으로 특징되어진다. 이것은 이러한 모이어티를 수행하는 단백질이 과발현된다는 것을 직접적으로 암시하는 것이 아니라 SAalpha2,6Gal 잔기를 수행하는 단백질의 퍼센트가 PER.C6 세포에서의 이러한 단백질의 퍼센트보다 더 높다는 것을 암시한다. PER.C6 세포는 세포 표면 당단백질에서 SAalpha2,3Gal 및 SAalpha2,6Gal 잔기 모두를 이미 발현할 수 있는 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제의 과발현이 없다. 하지만, SAalpha2,3Gal 잔기를 수행하는 단백질의 퍼센트에 비하여 SAalpha2,6Gal 잔기를 수행하는 단백질의 퍼센트를 증가시키는 것은 본 발명의 중요한 관점이다. 세포내 당화 장치에서 기질 경합을 이끄는 것에 기인하여, SAalpha2,3Gal 유형의 수용체는 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 단백질을 과발현하는 세포의 세포 표면에 과소하게 나타낸다. 이들 결합된 특성은 이 신규한 세포주가 야생형 개체군에서 선별 압력을 유도하는 것 없이 1차 인플루엔자 바이러스 단리물을 증식하기 위한 이상적인 배지이도록 한다. 본 발명의 세포에서 이러한 단리물의 증식은 백신 생산에 매우 유용한, 변경되지 않은 HA 특이성 및 면역원성을 갖는 큰 바이러스 군체(stock)의 효율적인 생산을 일으킨다. PER.C6-alpha2,6ST에서 생산된 바이러스가 SAalpha2,3Gal 수용체에 대한 적응에 의한 돌연변이를 나타내지 않으므로(수정란의 경우와 같이), 이 바이러스의 면역원의 특성은 천연적으로 순환하는 인플루엔자 바이러스의 것과 가장 비교할 만 하다. 따라서, PER.C6-alpha2,6ST에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 백신 조제물은 순환하는 야생형 인플루엔자 바이러스에 대한 보호성 감응을 유도하기에 이상적으로 적합하다. 인간 인플루엔자 바이러스가 SAalpha2,6Gal 연결을 인식하는 유형에 속하는 것이 당업자들에게 잘 알려져 있으므로, 인간에서 더욱 보호성 면역 감응을 구별하기 위하여 이들 바이러스로부터 단백질을 포함하는 백신을 얻기에 바람직하다는 것이 당업자에게 잘 알려져 있다(Newman et al. 1993).
인간 인플루엔자 바이러스가 배아된 달걀을 통해서 증식된다면, SAalpha2,3Gal에 특이적으로 결합할 수 있는 바이러스 변이체는 선별될 것이고, SAalpha2,6Gal을 인식하는 바이러스는 선별 제거할 것이다. PER.C6 세포는 그것의 표면에서 SAalpha2,6Gal 및 SAalpha2,3Gal 모두를 함유하는 수용체를 갖는다. SAalpha2,6Gal을 인식하는 바이러스의 바람직한 증식을 위하여, 상기와 같이, 이 요소를 내재하는 수용체의 과발현을 갖는 것이 바람직하다. 반대편, 즉 인간 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제의 과발현의 영향을 결정하기 위하여, 본 발명은 또한 'PER.C6-alpha2,3ST'로 명명된 또 다른 신규한 세포주를 생성하기 위한 수단 및 방법을 제공한다. 이들 세포는 PER.C6-alpha2,6ST 세포에 대하여 상기한 바와 같은 유사한 방법으로, 플라스미드의 안정한 통합을 수행하는 세포를 선별한 후, 강한 CMV 프로모터의 조절 하에서 인간 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 내재하는 플라스미드의 트랜스펙션에 의하여, alpha2,6ST로부터 유도된다. PER.C6-alpha2,3ST 세포는 SAalpha2,3Gal-함유 수용체의 고도의 발현에 의해 특성화된다.
알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 및 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제 모두를 과발현하는 세포는 SAalpha2,6Gal 잔기를 바람직하게 인식하는 인플루엔자 바이러스의 증식을 위하여 사용될 수 있는 반면에, 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 세포는 바람직하게는 SAalpha2,3Gal 잔기를 인식하는 인플루엔자 바이러스의 증식을 위해 사용될 수 있다. 바이러스의 감염 및 퍼짐은 주로 인간-인간 접촉을 통해서 발생하고, 바이러스는 SAalpha2,6Gal잔기를 통한 감염 경로에 더욱 적응하게 되어, 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 세포주에 적용하는 것이 바람직하다. 다른 한편으로는, 감염성이 SAalpha2,3Gal 잔기를 내재하는 당단백질을 갖지 않는 새로부터 인간에게 직접 발생하는 경우에는 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 세포를 적용하는 것이 바람직하다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제 또는 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제는 개별적인 트랜스퍼라제로 간주하고, 또한 상기 트랜스퍼라제의 등가물로 간주한다. 여기서, 상기 등가물은 본질적으로 동일한 트랜스퍼라제 활성을 포함하지만, 트랜스퍼라제와 동등한 양을 필요로 하지는 않는다. 적합한 등가물은 당업자들에 의해 생성될 수 있다. 상기 트랜스퍼라제의 일부분은, 그것이 반드시 동등한 양일 필요없이 본질적으로 동일한 트랜스퍼라제 활성을 포함한다면, 적합한 등가물이다. 다른 적합한 등가물은 트랜스퍼라제의 등가물로서 반드시 동등한 양일 필요없이 본질적으로 동일한 트랜스퍼라제 활성을 포함하는 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제 또는 알파 2,3 시알릴트랜스퍼라제의 유도체 및/또는 유사체이다. 이러한 유도체는 보존성 아미노산 치환 또는 그 밖의 방법을 통해 생성될 수 있다. 유도체는 또한 개별적인 트랜스퍼라제의 일부분으로부터 만들어질 수 있다.
여기서 사용된 인플루엔자 바이러스 입자는 인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 유사 입자일 수 있다. 인플루엔자 바이러스 입자의 등가물은, 인플루엔자 바이러스 입자가 반드시 동등한 양일 필요는 없지만 본질적으로 동일한 감염성 특성을 포함하는 바이러스 (유사) 입자이다. 이러한 등가물은 예를 들어, 재조합 수단으로 생성될 수 있다. 이러한 등가물은 인플루엔자 전형적으로 바이러스에 존재하지 않는 분자를 포함할 수 있다.
도 1은 pAlpha2,6ST2000/Hygro를 도식적으로 나타내는 도이다.
도 2는 (A) pAlpha2,6STcDNA2000/Neo 및 (B) pAlpha2,6STcDNA2000/Hygro를 도식적으로 나타내는 도이다.
도 3은 (A) pAlpha2,3STcDNA2000/Neo 및 (B) pAlpha2,3STcDNA2000/Hygro를 도식적으로 나타내는 도이다.
도 4는 FACS 분석에 의한 PER.C6 및 PER.C6/alpha2,6ST에서의 (A) SAalpha2,6Gal 및 (B) SAalpha2,3Gal의 탐지를 나타내는 도이다.
도 5는 형광에 의해 결정된, PER.C6 및 PER.C6/alpha2,6ST에서 (동일한 일차 단리물로부터의) 알-계대배양된 인플루엔자 배치(batch) 및 일차 임상적인 인플루엔자 단리물의 증식을 나타내는 도이다. 감염성은 HA-면역형광성 염색에 양성인 세포의 퍼센트로 표현하였다.
도 6은 플라크 평가법(plaque assay)에 결정된, PER.C6 및 PER.C6/alpha2,6ST에서 (동일한 일차 단리물로부터의) 알-계대배양된 인플루엔자 배치 및 일차 임상적인 인플루엔자 단리물의 증식을 나타내는 도이다. 감염성은 ㎖당 플라크-형성 단위(pfu's)로 표현하였다.
도 7은 인플루엔자 적정 평가법을 도식적으로 나타내는 도이다. 첫 번째 세포는 바이러스 입자로 감염되고, 그 다음, 세포는 항혈청으로 인큐베이션되고, FACS 분석에서 사용되었다. 여기서, 감염된 세포는 세포의 전체 개체군에서 분리되고 산정될 수 있다.
도 8은 희석 요소에 대한 감염된 세포의 분획(%)의 도표를 나타내는 도이다.
실시예 1. pAlpha2,6ST2000/Hygro의 구성
alpha2,6 시알릴트랜스퍼라제를 코드화하는 서열을 함유하는 단편은 플라스 미드 pGST-Gal(암스테르담, 프리유니버시티의 I.van Die 박사로부터 받음; 플라스미드는 래트 alpha2,6 시알릴트랜스퍼라제를 코드화하는 전체 cDNA 서열을 함유하는 pBR322 골격(backbone)으로 이루어진다: GenBank 수탁번호. M18769)의 EcoRI 소화에 의하여 얻었다. 단편은 표준 공정에 따른 T4 DNA 폴리머라제에 의해 블런트-말단화(blent-ended)된다. 젤 정제후, 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 단편이 pcDNA2000/Hygro(이것은 또한 WO 00/63403에 기재되어 있는 플라스미드 pcDNA2000/Hyg(-)로도 알려져 있다)로 결찰되었고, 이것은 표준 실험공정에 따라 PmeI로 선형화되고, 탈인화(dephosphorylate)되고 그리고 젤 정제된다. 생성된 플라스미드를 pAlpha2,6ST2000/Hygro로 명명하였다(도 1).
실시예 2. PER.C6-EPO에서 pAlpha2,6ST2000/Hygro의 트랜스펙션 및 과발현 유전자의 선별.
PER.C-EPO는 초기에 다른 목적, 즉 에리트로포이에틴(EPO)의 당화에 초점을 둔 실험을 위해 생성되었다. EPO는 에리트로포에시스(erythropoiesis)의 자극에 관여하는 단백질이며 그의 활성은 인 비보 기능성에 대한 그것의 시알산 함량에 크게 의존한다. PER.C6-EPO 세포주는 PER.C6의 유도체이고 인간 EPO 단백질을 과별현시킨다(세포는 WO 00/63403에 기재되어 있다). 이 세포주가 EPO를 생성한다는 사실이 본 발명에 결정적인 것이라고는 믿어지지 않는다. PER.C6-EPO 세포를 배양하였고, 하기와 같이 pAlpha2,6ST2000/Hygro로 트랜스펙션하였다.
PER.C6 세포를 조직 배양 접시(직경 10㎝)에 약 2~3,000,000 세포수/접시로 접종하고 37℃, 10% CO2에서 밤새도록 유지시켰다. 다음 날, 세포들을 제조지침에 따라 리포펙타민(Lipofectamine)(Gibco)을 사용하여 트랜스펙션하였다. 20개의 접시를 당업자들에게 알려진 표준 지침에 따라 각각 pAlpha2,6ST2000/Hygro 2㎍으로 트랜스펙션시켰다. 다른 6개의 접시는 하이그로마이신 사멸과 트랜스펙션 효율에 대한 음성 대조군으로 작용하였다. 다음 날, 하이그로마이신을 접시에, FBS를 함유하는 DMEM 배지에 녹여, 50㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 세포를 3~4주의 기간동안 인큐베이션하고, 그 동안 세포를 하이그로마이신이 공급된 신선한 배지로 규칙적으로 세척하였다. 세포를, 하이그로마이신 선별 마커를 내재하는 플라스미드를 받지 않은 음성 대조와 비교하여, 사멸에 대하여 관찰하였다. 생장한 콜로니를 선별하고 WO 00/63403에서 에리트로포이에틴 및 항체-과발현에 대해 기재된 바와 같이 2차 배양하였다. 이어서 약 25개의 선별된 항생물질-내성 콜로니들을 하이그로마이신 없이 24-웰, 6-웰 플레이트 및 T25 플라스크에서 성장시켰다. 세포가 T75 조직 배양 플라스크에서 성장에 도달했을 때, 각 클론의 하나 이상의 바이알을 예비물로서 냉동시키고 저장하였다. 클론을 Govorkova et al.(1999)에 의해 이미 기재된 방법을 사용하여 순차적으로 alpha2,6ST 활성을 FACsort 장치(Becton Dickinson)에서 FACS 분석으로 시험하였다. 이것을 위해, SAalpha2,6Gal-특이 Sambucus nigra 응집소 (DIG Glycan 분화 키트, Roche)를 하기 공급자의 지침에 따라 사용하였다. 이들 클론을 두달 간격으로 2차 배양하고, 그 동안 세포 표면에서의 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제의 발현을 관찰하기 위해 정기적으로 FACS 분석 실험을 실시하였다. SAalpha2,6Gal의 증가된 발현은 안정하였다. 세포 표면에서 SAalpha2,6Gal의 최고 밀도를 평가한 바와 같이, 최고의 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제-발현 클론은 클론 25-3.10이었다. 이 클론을 'PER.C6-alpha2,6ST'로 명명하였다. 도 4A의 결과는 선별과정의 마지막에 PER.C6-alpha2,6 ST에 대한 FACS 분석을 나타낸다. pAlpha2,6ST2000/Hygro의 안정한 트랜스펙션이 모계 PER.C6 세포주와 비교하여 세포 표면에 SAalpha2,6Gal 잔기를 현저하게 증가시킨다는 것을 증명한다. 흥미있게는, alpha2,3Gal-특이 Maackia amurensis 응집소를 사용하여 FACS으로 검출한 바와 같이, 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제의 과발현은 SAalpha2,3Gal 잔기의 양을 낮추는 것으로 보인다(도 4). 이 효과는 동일한 당단백질 기질에 대한 내인성 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제와 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제의 경쟁 때문인 것으로 보인다.
실시예 3. 알파2,6- 및 알파2,3-시알릴트랜스퍼라제 cDNA 발현 벡터의 생성
인간 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제(유전자 은행 수탁번호: 14735135)의 전장 cDNA를 함유하는 PCR 단편을 당업자에게 잘 알려진 방법으로 인간 cDNA 라이브러리에서 폴리머라제 사슬반응(PCR)으로 얻었다. 증폭에 사용된 프라이머(센스: 5'-TTT TTT GGA TCC ATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA AAG-3', 안티센스: 5'-TTT TTT CTT AAG TTA GCA GTG AAT GGT CCG GAA GC-3')는 추가의 5'-테일을 함유하며, 이것은 각각 센스 프라이머 중의 BamHI 및 안티센스 프라이머 중의 AflⅡ에 의해 소화된다. PCR 생성물은 아가로스 젤 전기영동을 통해 정제되고 BamHI 및 AflⅡ에 의해 소화되며 그 이후 pcDNA2000/Hygro(WO 00/63403에서 pcDAN2000/Hyg(-)로 기재된)로 및 pcDNA2000/Neo(이 벡터는 기본적으로 WO 00/63403에 기재된 바와 같이 pcDNA2000/DHFR로부터의 pcDNA2000/Hyg(-)와 동일한 방법으로 구성되었다)으로 클론화된다. 이것을 위해, pcDNA2000/Hygro 및 pcDNA2000/Neo는 또한 BamHI 및 AflⅡ 제한 효소로 소화되었다. 서열 및 타당한 클로닝은 분자생물학 분야의 당업자들에게 알려진 표준 과정에 따라 이중 나선 서열화로 확인되었다. 생성된 플라스미드는 pAlpha2,6STcDNA2000/Hygro(도 2A), pAlpha2,6STcDNA2000/Neo(도 2B)로 명명된다. 이들은 연장된 CMV 프로모터의 조절 하에서 인간 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 포함한다(WO 00/63403 참조). 더욱이, 상기 플라스미드는 각각 네오마이신과 하이그로마이신에 대한 내성을 제공하며, 안정한 방법으로 플라스미드를 그들의 게놈으로 통합하는 클론을 선별하는데 사용된다.
인간 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제(GenBank 수탁번호. L23767)의 cDNA를 얻었고, 인간 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 유전자에 대한 상기 기재와 같이 클론화하였다. PCR 반응에 사용된 프라이머는 다음과 같다: 센스 5'-TTT TTT GGA TCC ATG TGT CCT GCA GGC TGG AAG CTC-3' 및 안티센스:5'-TTT TTT CTT AAG TCA GAA GGA CGT GAG GTT CTT GAT AG-3'. 생성된 플라스미드는 pAlpha2,3STcDNA2000/Hygro(도 3A) 및 pAlpha2,3STcDNA2000/Neo(도 3B)이다.
실시예 4. 인간 알파2,6- 또는 인간 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 안정한 PER.C6 세포의 발생.
PER.C6 세포주의 세포를 40개의 조직 배양 접시(직경 10㎝)에 약 2~3,000,000 세포수/접시로 접종하고 37℃ 10% CO2에서 밤새도록 유지하였다. 다음 날, 세포를 리포펙타민(Gibco)을 사용하여 제조사의 지침 및 당업자에게 알려진 표준 배양 과정에 따라 트랜스펙션하였다. 20개의 접시를 각각 pAlpha2,6STcDNA/Neo 5㎍으로 트랜스펙션하였다. 또 다른 20개의 비-트랜스펙션된 접시는 네오마이신 사멸과 트랜스펙션 효율성에 대한 음성 대조로서 작용한다. 그 다음 날, 네오마이신(0.5㎎/㎖)을, FBS를 함유하는 배지에 용해시켜, 적절한 접시에 첨가한다. 세포는 4~5주의 기간동안, 세포를 선별 시약이 보충되는 새로운 배지로, 정규적으로 세척하면서 인큐베이션한다. 세포를, 네오마이신과 하이그로마이신 선별 마커를 내재하는 플라스미드를 받지 않은 음성 대조와 비교하여, 사멸에 대해 관찰하였다. 생장된 콜로니를 선별하고 WO 00/63403에서 에리트로포이에틴- 및 항체-과발현하는 세포주에 대해 기재된 바와 같이 2차 배양하였다.
각 세포주로부터, 약 50개의 선별된 네오마이신-내성 콜로니들을 그 후에 하이그로마이신을 함유하는 96-웰, 24-웰, 6-웰 플레이트 및 T25 플라스크에서 성장시켰다. 세포가 T25 조직 배양 플라스크에서 성장에 도달했을 때, 각 클론의 하나 이상의 바이알을 예비물로서 냉동시키고 저장하였다. 클론을 Govorkova et al. (1999)에 의해 이미 기재된 방법과 같이 SAalpha2,6Gal-특이 Sambucus nigra 응집소를 사용하는 FACS 분석으로 재조합 인간 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제의 생산을 시험하였다. 이후의 양호한 생산자 클론의 선별은 발현, 배양 반응 및 생존능력을 기준으로 한다. 장기간의 생존능력, 연장된 기간동안 롤러 병과 생체반응기에서의 현탁 성장을 허용하기 위해, 실행이 우수한 클론의 더 많은 바이알이 냉동되고, 추가 조사를 위해 선별한다. 이들 클론들은 두달 동안 2차 배양된다. 그 동안, 세포 표면상의 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제의 발현을 관찰하기 위해 정규적으로 FACS 분석 실험을 실시하였다. 가장 우수한 안정한 생산자를 선별하고 세포 저축(banking)을 위해 사용된다. 이 클론은 PER.C6-H-alpha2,6ST로 명명된 세포주를 생성하도록 확장된다.
인간 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제 단백질을 과발현하는 세포주는 일반적으로 인간 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 과발현 PER.C6세포에 대한 상기의 방법과 동일한 방법으로 생성된다. 이 경우에, 플라스미드 pAlpha2,3STcDNA2000/Neo가 사용된다. 생성된 세포주는 PER.C6-H-alpha2,3ST로 명명된다.
실시예 5. 세포 배양 및 PER.C6 세포 및 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제-과발현 PER.C6 세포에서 일차 및 적응된 인플루엔자 바이러스 분리물에 의한 감염.
PER.C6의 감염에 대한 감수성을 PER.C-alpha2,6ST와 비교하는 실험을 실시하였다. PER.C6와 PER.C-alpha2,6ST의 현탁배양물을, 490㎠ 조직 배양 회전병에서 1 rpm으로 연속회전하는 동안, 37℃ 및 10% CO2에서, 4mM L-글루타민이 공급된 무혈청 ExCell 525 배지(JRH Biosciences)에서 배양하였다. 하기 과정은 보고된 모든 인플루엔자 감염에 적용되었다. 감염일에 세포를, Pen/Strep(Gibco) 2㎎/㎖, Fungizone (Gibco) 200ng/㎖ 및 트립신-EDTA(Gibco) 3㎍/㎖를 함유하는 무혈청 배지에서, 최종 부피 2㎖에서 1x106 세포/㎖의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 일차 분리물의 바이러스 접종물로 및 (일차 분리물에서 유도되고 PER.C6세포에서 1 계대접종을 위해 계대접종된) PER.C6-적응된 배치로 감염시켰다. 사용된 일차 분리물은 A/네덜란드/002/01(H1N1, A/New Caledonia 등, 암스테르담 대학의 Dr. A. Osterhaus로부터 받음)이다. 두 개의 배치를 10-2v/v 희석으로 사용하였다. 감염된 세포를 6일 동안 35℃, 10% CO2에서 정적 배양물에서 유지시켰다. 바이러스성 상징액을 실험 전체에 걸쳐 회수하고 이후 정화시켰다. 정화는 미세원심분리기에서 5000rpm으로 5분동안 실온에서 세포를 펠렛화하여 실시하였다. 세포 펠렛을 하기와 같이 직접 면역형광 조사로 분석하였다. 상징액을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고, 액체 질소 중에서 재빨리 냉동시키고 플라크 조사에 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 6. 면역형광 시험
인플루엔자 바이러스 감염의 검출에 대해 IMAGEN™ 인플루엔자 바이러스 A 및 B 키트(Dako)를 사용하여 공급자의 지침에 따라 감염된 세포에서 직접 면역형광(I.F.) 조사를 실시하였다. 간략하게는, 감염된 세포를 5분동안 원심분리하였다. 상징액을 제거하고 펠렛을 PBS에 재현탁시켰다. 이것을 두번 반복하여 세포를 완전히 세척하였다. 세척된 세포 펠렛을 PBS에 현탁시키고 세포 현탁물 20㎕를 I.F. 슬라이드의 두 웰에 각각 첨가하였다. 이것을 실온에서 건조시켰다. 세포를 각 웰에 20㎕씩의 아세톤을 첨가하여 고정시키고 대기중 건조시켰다. 각 웰에 알맞는 IMAGEN 인플루엔자 시약(즉, 표지화된 항체 특이 인플루엔자 A 또는 B) 20㎕를 첨가하였다. 그리고 나서, 슬라이드를 37℃에서 15분동안 축축한 티슈 위에서 인큐베이션시켰다. 과량의 시약을 PBS로 씻어내고 5분동안 PBS에서 헹구었다. 슬라이드를 실온에서 공기 건조시켰다. 각 웰에 IMAGEN 고정 유체를 한방울씩 첨가하고 슬라이드 위에 커버 슬립을 놓았다(이것을 소량의 매니큐어로 위치고정시켰다). 샘플을 에피형광조사를 사용하여 현미경으로 관찰하였다. 감염된 세포는 밝은 황록색(apple green)형광으로 특징된다. 음성(붉은색)세포와 비교하여 양성(형광 녹색)을 나타내는 세포의 대략적인 백분율을 기록하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. PER.C6-alpha2,6ST가 임상 분리물의 복제(흰색 막대)를 효과적으로 지지한다는 것은 분명하다.
실시예 7. 플라크 조사
PER.C6와 PER.C6-alpha2,6ST에서의 바이러스 생산을 바이러스 상징액으로 접종시킨 MDCK(Madin Darbin Canine Kidney) 세포에서 플라크 형성에 대하여 점수화하여 조사하였다. MDCK 세포는 특히 이러한 플라크 조사 실험에 유용하다. 실시예 5에 따른 PER.C6 및 PER.C6-alpha2,6ST에서 증식시킨 일차 및 PER.C6-계대배양된 인플루엔자 바이러스 둘 다의 10배 희석시킨 바이러스성 상징액의 총 1㎖를 2mM L-글루타민이 보충된 DMEM 중의 6-웰 플레이트에 95% 합류(confluence)까지 성장시킨 MDCK에 접종시켰다. 37℃에서 1시간 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 아가로스 혼합물(2.5% 아가로스 1.2㎖, 2x MEM 1.5㎖, 200mM L-글루타민 30㎕, 트립신-EDTA 24㎕, PBS 250㎕) 3㎖를 과적하였다. 그리고 나서 세포를 습한, 10% CO2 대기에서 37℃에서 약 3일동안 인큐베이션하고 바이러스성 플라크를 시각적으로 점수화하고 그 수를 세었다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 인플루엔자 바이러스(흰색 막대)와 PER.C6-계대배양된 바이러스(회색 막대)의 임상적 분리물은 매우 효과적이며(우측 구획), 반면 PER.C6세포(좌측 구획)은 일차 임상 분리물에 의한 감염에 매우 민감하지 않다. 이것은 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 세포는 특히 일차 바이러스 분리물을 증식시키는데 유용하며 이들 세포는 예를 들면 인플루엔자 감염에 대한 백신의 생산에 대한 빠르고 안전한 방법에 특히 유용하다는 것을 나타낸다.
실시예 8. FACS에서 PER.C6 세포를 사용한 인플루엔자 바이러스 입자의 적정.
신규한 FACS-기저 방법은 상징액에서 인플루엔자 바이러스의 적정을 측정하는 데 이용되었다. 방법은 첫번째 라운드(round)의 바이러스 복제 안에서 생산적으로 감염된 세포의 단편을 탐지하는 것으로 복제-가능한 바이러스의 정량화를 수반한다. PER.C6의 현탁액 배양 및 0.01 내지 1의 감염 모이어티를 사용하여, 몇 시간 안에서 매우 정확한 값을 얻는 것이 가능하다. 현재에 당업자들에 의해 사용되는 인플루엔자 바이러스 적정을 위한 표준적인 평가법인, MDCK 세포로 플라크 평가법에 의한 동일한 적정은 훨씬 더 긴 시간(일반적으로 거의 2주), 요구되는 노동력, 및 특히 덜 재생산적이다. 다음은 사용된 재료 및 방법의 기술적인 설명이다. 여기서는, 현탁액 세포가 FACS 분석을 사용하는 상징액에서 인플루엔자 바이러스 입자의 적정을 위해 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
무혈청 AEM 배지(Gibco)에서의 상징액에서 성장된 PER.C6 세포를 24웰 플레이트에 플레이트하였다(1×106세포/㎖에서 웰당 1㎖ 세포). 트립신-EDTA(Gibco)를 최종 농도 3㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 세포는 인플루엔자 바이러스 A 상징액(X- 127, A/Beijing/262/95의 재분류제(reassortant)) 및 X-31(National Institute for Biological Standards and Control로부터 얻어진)에서 감염되었다. 바이러스 상징액 200㎕을 희석되지 않은 바이러스 군체로 시작하여, 3배 희석 단계에서 세포에 첨가되었다. 모의-감염된(mock-infected) 세포의 대조군은 포함되었다. 바이러스의 첨가에 이어서, 세포를 35℃에서 5시간동안 보관하였다.
감염된 세포는 에펜도르프 튜브 1.5㎖에서 샘플화되었다(각 350㎕). 냉온된 PBS를 1㎖까지 첨가하고, 튜브를 에펜도르프 벤치 원심분리기에서 5000rpm에서 약 5분동안 원심분리하였다. 상징액은 버리고, 세포는 냉온된 Cytoperm/Cytofix 투과성화 용액(Pharmingen) 100㎕에서 완만하게 재현탁하였다. 4℃에서 20분 후, 냉온된 PBS(900㎕)를 첨가하고 세포를 상기와 같이 다시 펠렛화하였다. 펠렛화된 세포는 FITC로 표지화(Imagen Kit, Dako)된 인플루엔자 A 핵단백질-특이 항체 5㎕를 함유하는 냉온된 염색 배지(PBS, 1% BSA, 0.1% Na Azide) 350㎕에서 재현탁하였다. 세포를 4℃에서 15분 내지 30분동안 인큐베이션한 다음, 냉온된 PBS 1㎖에서 한번 그리고 1×Cellfix 고정 용액(Becton Dickinson)에서 한번 세척하였다. 그 다음, 세포를 FACS로 분석하거나 또는 4℃에서의 암실에서 최대 1주일까지 저장한 후 FACS 분석하였다.
염색된 세포는 FACsort 장치(Bacton Dickinson)에서 분석되었다. 인플루엔자/FITC 양성 세포는 FL1 채널에서 탐지되고, 상위 오른쪽 사분면에서 표시되었다(도 7). 도의 낮은 영역에서는 비감염된 세포 및 감염 5시간 후에서의 세포에 대한 FACS 분석의 결과를 구성한다. 그래프의 상위 오른쪽 사분면 및 상위 왼쪽 사분면은 FITC-양성/감염된 및 FITC-음성/비감염된 세포를 각각 나타낸다.
그 다음, 감염된 세포는 X-축에서의 그것들을 감염하기 위하여 사용된 상징액의 희석 대 Y-축에서의 퍼센트로 좌표화되었다(도 8). 감염된 세포의 50%에 상응하는 값은 상징액의 TCID50을 나타낸다. 1,000,000 개의 세포가 이 최초 감염을 위해 사용되었다는 사실로, 1/6로 희석된 상징액 100㎕이 1.5×107 감염성 입자/㎖의 적정에 상응하는, 500,000개의 감염성 입자를 함유한다는 것을 유도하였다. 동일한 상징액이 당업자들에게 알려진 표준 방법을 사용하여 MDCK 세포로 표준 플라크 평가법에서 정량한 경우에, +/- 50%의 변수를 갖는, 1.7×107의 값이 얻어졌다.
바이러스 상징액의 다른 용량 및 희석이 상기 평가법의 민감도를 다양화하도록 PER.C6의 다른 양과 함께 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백한 것이다. 유사하게, X-127을 제외한 인플루엔자 바이러스의 적정은 적합한 항체가 염색에 사용된다는 것이 제공되어 측정될 수 있다.
참고문헌
Figure 112004024063384-pct00001
Figure 112004024063384-pct00002
Figure 112004024063384-pct00003
Figure 112004024063384-pct00004

Claims (41)

  1. 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은:
    - 배양 배지에서 세포를 인플루엔자 바이러스 입자와 접촉시켜 상기 인플루엔자 바이러스 입자에 의하여 상기 세포를 감염시키고; 그리고
    - 상기 세포를 배양하여 상기 인플루엔자 바이러스 입자를 증식시키는 단계를 포함하고,
    상기 세포는 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 또는 그것의 기능적 등가물을 암호화하는 핵산을 과발현하는 것인 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제는 인간 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제인 방법.
  3. 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은:
    - 배양 배지에서 세포를 인플루엔자 바이러스 입자와 접촉시켜 상기 인플루엔자 바이러스 입자에 의하여 상기 세포를 감염시키고; 그리고
    - 상기 세포를 배양하여 상기 인플루엔자 바이러스 입자를 증식시키는 단계를 포함하고,
    상기 세포는 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제 또는 그것의 기능적 등가물을 암호화하는 핵산을 과발현하는 것인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제는 인간 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제인 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 입자는 인플루엔자 단리물(isolate)에 존재하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 인플루엔자 단리물은 하나 이상의 인플루엔자-감염된 포유동물 개체로부터 얻어지는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 인플루엔자-감염된 포유동물 개체는 인간 또는 돼지인 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 인플루엔자 단리물은 하나 이상의 인플루엔자-감염된 새로부터 얻어지는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 아데노바이러스 유래의 E1으로 형질전환되는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 인간 세포는 PER.C6 또는 그것의 유도체인 방법.
  13. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 상기 핵산은 상기 세포에 이종성인 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라제 또는 그것의 기능적 등가물을 암호화하는 상기 핵산은 상기 세포의 게놈으로 통합되는 방법.
  15. 백신을 제조하는 방법으로, 상기 방법은:
    - 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하는 단계; 및
    - 생산된 인플루엔자 바이러스 입자를 비활성화하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 방법은 추가로:
    - 항원성 부분을 제공하기 위하여 생산된 상기 인플루엔자 바이러스 입자를 처리하는 단계; 및
    - 하나 이상의 항원성 부분을 얻는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 항원성 부분은 헤마글루티닌 단백질 또는 그것의 일부, 또는 뉴라미니다제 단백질 또는 그것의 일부, 또는 헤마글루티닌 단백질과 뉴라미니다제 단백질 또는 그것들의 일부를 포함하는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 또는 그것의 기능성 부분을 과발현하는 세포를 사용하여 인플루엔자 바이러스 입자를 증식하는 방법.
  21. 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제 또는 그것의 기능성 부분을 과발현하는 세포를 사용하여 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하는 방법.
  22. 삭제
  23. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 입자는 하나 이상의 인플루엔자-감염된 포유동물 개체로부터 얻어진 인플루엔자 단리물에 존재하는 것인 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 인플루엔자-감염된 포유동물 개체는 인간 또는 돼지인 방법.
  25. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 입자는 하나 이상의 인플루엔자-감염된 새로부터 얻어진 인플루엔자 단리물에 존재하는 것인 방법.
  26. 삭제
  27. 인플루엔자 단리물에 존재하는 예비결정된 인플루엔자 바이러스 입자 세트의 선별적인 증식 방법으로, 상기 예비결정된 인플루엔자 바이러스 입자 세트는 수용체에 존재하는 특이적 당화 모이어티(moiety)에 친화성을 가지고, 상기 인플루엔자 단리물은 상기 세트에 더하여 예비결정된 특이성을 갖지 않는 인플루엔자 바이러스 입자를 추가로 포함하고, 상기 방법은:
    - 상기 세트에 존재하는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 입자에 의하여 상기 세포를 감염시키기 위하여, 배양 배지에서 상기 인플루엔자 단리물과 함께, 상기 특이적 당화 모이어티를 포함하는 상기 수용체를 발현하고 노출할 수 있는 세포를 인큐베이션하는 단계;
    - 상기 인플루엔자 바이러스 입자를 증식시키기 위하여 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    - 상기 세포, 또는 상기 배양 배지, 또는 상기 세포와 상기 배양 배지로부터 생산된 바이러스 입자를 수확하는 단계를 포함하고,
    상기 당화 모이어티는 SAalpha2,6Gal 잔기를 포함하고, 상기 세포는 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 것인 방법.
  28. 인플루엔자 단리물에 존재하는 예비결정된 인플루엔자 바이러스 입자 세트의 선별적인 증식 방법으로, 상기 예비결정된 인플루엔자 바이러스 입자 세트는 수용체에 존재하는 특이적 당화 모이어티(moiety)에 친화성을 가지고, 상기 인플루엔자 단리물은 상기 세트에 더하여 예비결정된 특이성을 갖지 않는 인플루엔자 바이러스 입자를 추가로 포함하고, 상기 방법은:
    - 상기 세트에 존재하는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 입자에 의하여 상기 세포를 감염시키기 위하여, 배양 배지에서 상기 인플루엔자 단리물과 함께, 상기 특이적 당화 모이어티를 포함하는 상기 수용체를 발현하고 노출할 수 있는 세포를 인큐베이션하는 단계;
    - 상기 인플루엔자 바이러스 입자를 증식시키기 위하여 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    - 상기 세포, 또는 상기 배양 배지, 또는 상기 세포와 상기 배양 배지로부터 생산된 바이러스 입자를 수확하는 단계를 포함하고,
    상기 당화 모이어티는 SAalpha2,3Gal 잔기를 포함하고, 상기 세포는 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 것인 방법.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 상기 인플루엔자 단리물은 하나 이상의 인플루엔자-감염된 인간, 돼지 또는 새로부터 얻어지는 방법.
  32. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 상기 세포는 아데노바이러스 유래의 E1으로 형질전환되는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 인간 세포는 PER.C6 또는 그것의 유도체인 방법.
  35. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 상기 세포는 상기 세포에 이종성인 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 포함하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 상기 핵산은 상기 세포의 게놈으로 통합되는 방법.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 알파2,6 시알릴트랜스퍼라제 또는 알파2,3 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 이종성 핵산을 포함하는 단리된 인간 세포를 사용하여 인플루엔자 바이러스 입자를 선별적으로 증식하는 방법.
  41. 삭제
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