JP6352974B2 - ワクチンのための高力価組み換えインフルエンザ・ウィルス - Google Patents
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Description
本出願は、2006年3月31日付けで出願された米国特許出願第60/787,766号明細書の出願日の優先権を主張し、前記明細書の開示内容を参考のため本明細書中に引用する。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)からの認可番号AI044386のもとで政府の支援によって行われた。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
マイナス−センスRNAウィルスは、一般的なヒト病原体、例えば呼吸器合胞体ウィルス、インフルエンザ・ウィルス、麻疹ウィルス、及びエボラ・ウィルス、並びに家禽及び畜牛産業に大きな経済的打撃を与える動物ウィルス(例えばニューカッスル病ウィルス及び牛疫ウィルス)を含む7つの科(Rhabdoviridae、Paramyxoviridae、Filoviridae、Bornaviridae、Orthomyxoviridae、Bunyaviridae、及びArenaviridae)に分類される。最初の4つの科は、非セグメント・ゲノムによって特徴付けられるのに対して、後者の3つの科は、それぞれ6〜8つ、3つ、又は2つのマイナス−センスRNAセグメントから成るゲノムを有する。マイナス−センスRNAウィルスの共通の特徴は、これらのRNAゲノムの負の極性である。すなわちウィルスRNA(vRNA)は、mRNAに対して相補であり、従ってそれ自体は感染性でない。ウィルス転写及び複製を開始するために、vRNAは、ウィルス・ポリメラーゼ複合体及び核タンパク質によって、それぞれプラス−センスmRNA又はcRNAに転写されなければならず、インフルエンザA型ウィルスの場合、ウィルス・ポリメラーゼ複合体は、3種のポリメラーゼタンパク質PB2、PB1、及びPAから成っている。ウィルス複製中、cRNAが、新しいvRNA分子の合成のための鋳型として役立つ。全てのマイナス鎖RNAウィルスに関して、vRNA及びcRNAの5’及び3’の両末端における非コード領域が、ウィルス・ゲノムの転写及び複製にとって重要である。細胞又はウィルスmRNA転写産物とは異なり、cRNA及びvRNAは5’末端でキャップされることはなく、また、真の3’末端でポリアデニル化されることもない。
本発明は、本発明の複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクター、例えば7:1再構築体、6:1:1再構築体、5:1:2再構築体、5:1:1:1再構築体を含む再構築体ウィルスを調製するのに有用なインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物を提供する。本発明の1実施態様の場合、組成物は、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB1 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB2 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスHA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNP cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNS cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、から選択されたvRNA生成のためのベクターを含む。組成物はまた、インフルエンザ・ウィルスPAをコードするベクター、インフルエンザ・ウィルスPB1をコードするベクター、インフルエンザ・ウィルスPB2をコードするベクター、及びインフルエンザ・ウィルスNPをコードするベクター、及び任意には、インフルエンザ・ウィルスNP、NS、M、例えばM1及びM2、HA又はNAをコードする1種又は2種以上のベクター、から選択されたウィルス・タンパク質生成のためのベクターを含む。好ましくは、ウィルス・タンパク質をコードするベクターはさらに、転写終結配列を含んでなる。
定義
本明細書中に使用される「単離及び/又は精製された」という用語は、本発明のベクター、プラスミド、又はウィルスのin vitroの調製、単離、及び/又は精製を意味し、この場合これはin vivo物質とは関連せず、実質的にin vitro物質から調製が行われる。単離ウィルスの調製は、一般にin vitroの培養及び増殖によって、及び/又は卵内の継代を介して達成され、そして他の感染性物質は実質的に存在しない。
本明細書中に使用される「実質的に存在しない」は、特定の感染性物質に対する標準的な検出方法を用いたときに、その物質の検出レベルを下回ることを意味する。
インフルエンザA型ウィルスは、全部で10種のタンパク質をコードする8つの単鎖マイナス−センス・ウィルスRNA(vRNA)のゲノムを有する。インフルエンザ・ウィルス寿命サイクルは、宿主細胞の表面上のシアル酸含有受容体に対する血球凝集素(HA)の結合で始まり、これに、受容体媒介エンドサイトーシスが続く。後期エンドソームにおける低pHが、HA内のコンフォメーション・シフトを引き起こし、これにより、HA2サブユニット(いわゆる融合ペプチド)のN末端を露出させる。融合ペプチドは、ウィルス膜とエンドソーム膜との融合を開始し、そしてマトリックス・タンパク質(M1)及びRNPの複合体が細胞質内に放出される。RNPは、vRNAをカプシドで包む核タンパク質(NP)と、PA、PB1、及びPB2タンパク質によって形成されたウィルス・ポリメラーゼ複合体とから成る。RNPは核内に輸送され、この場所で転写及び複写が行われる。RNAポリメラーゼ複合体は、3つの異なる反応、すなわち:5’キャップ及び3’ポリA構造を有するmRNAの合成、完全長相補RNA(cRNA)の合成、及びcDNAを鋳型として使用したゲノムvRNAの合成を触媒する。次いで、新たに合成されたvRNA、NP、及びポリメラーゼ・タンパク質が集成されてRNPになり、核から搬出され、そして原形質膜に輸送され、この場所で子孫ウィルス粒子の発芽が発生する。ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去し、ひいては新たに集成されたビリオンを細胞表面から放出し、そしてウィルス粒子の自己会合を防止することにより、感染後期に重要な役割を演じる。ウィルス集成体はタンパク質−タンパク質、及びタンパク質−vRNAの相互作用に関与するが、これらの相互作用の性質はほとんど知られていない。
本発明によれば、インフルエンザ・ウィルスのための受容体である、低減又は減少したレベルの1種又は2種以上のシアル酸を発現させる突然変異細胞を含む、インフルエンザ・ウィルスの効率的な複製を支援する任意の細胞を採用することができる。本発明により得られたウィルスを再構築体ウィルスに形成することができる。
本発明のワクチンは、任意の病原体の糖タンパク質を含む免疫原性タンパク質、例えば1種又は2種以上のバクテリア、ウィルス、酵母、又は真菌に由来する免疫原性タンパク質を含んでよい。このように、1実施態様の場合、本発明のインフルエンザ・ウィルスは、インフルエンザ・ウィルス、又は一例としてはレンチウィルス、例えばHIV、B型肝炎、C型肝炎ウィルス、ヘルペス・ウィルス、例えばCMV又はHSV又は口蹄疫ウィルスを含むその他のウィルス病原体のためのワクチン・ベクターであってよい。
接種に適した、又は非経口又は経口投与に適した本発明の医薬組成物は、弱毒化又は不活性化されたインフルエンザ・ウィルスを含んでなり、任意にはさらに、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含んでなる。組成物はさらに、当業者によく知られた助剤又は賦形剤を含んでなる。例えばBerkow他、1987;Avery's Drug Treatment, 1987; Osol、1980;Katzung、1992を参照されたい。本発明の組成物は、一般に、個々の投与量(単位投与量)の形態で提供される。
組成物(又は組成物が誘発する抗血清)は、「予防」又は「治療」目的で投与されてよい。予防的に提供されるときには、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染の症状が明らかになる前に提供される。組成物の予防的投与は、後続の感染を防止又は軽減するのに役立つ。予防的に提供されるときには、本発明の遺伝子治療組成物は、疾患の症状が明らかになる前に提供される。組成物の予防的投与は、疾患と関連する1つ又は2つ以上の症状を防止又は軽減するのに役立つ。
本発明の組成物は、受動免疫法又は能動免疫法によって、1種又は2種以上の病原体、例えば1種又は2種以上のインフルエンザ・ウィルス株に対する耐性を与えることができる。能動免疫法の場合、不活性化又は弱毒化された生ワクチン組成物が宿主(例えば哺乳動物)に予防的に投与され、そしてこの投与に対する宿主の免疫応答が、感染及び/又は疾患に対する防御を行う。受動免疫法の場合、誘発された抗血清を回収し、そして少なくとも1種のインフルエンザ・ウィルス株によって引き起こされる感染を有することが疑われる受容者にこれを投与することができる。本発明の遺伝子治療は、能動免疫法によって予防的又は治療的レベルの所期遺伝子生成物を産出することができる。
下記非限定的な例によって本発明をさらに説明する。
インフルエンザA/Puerto Rico/8/34の逆遺伝技術系を開発するために、製造業者のプロトコルに従ってRNeasy Miniキット(Qiagen)を使用して、ウィルスRNAをA/Puerto Rico/8/34(H1N1)、Madison高成長変異形(PR8HG)の尿膜腔液から抽出した。MMLV-RTase(Promega)及びUni12プライマーを使用して、cDNAを合成した。下記のものを用いたPCRによってcDNAを一晩増幅した:
プライマー・セット
PCR生成物をゲル電気泳動によって分離し、そしてゲル抽出キット(Qiagen)を使用してアガロース・ゲルから抽出した。Takaraライゲーション・キットver.II(Takara)を使用して、抽出された遺伝子をpT7Blue平滑ベクター(Novagen)内にライゲートした。5時間後、ライゲートされた遺伝子がJM109(PB2、M、及びNS遺伝子)又はDH5アルファ(PA、PB1、及びNP)に形質転換された。各遺伝子毎に6つのコロニーを8時間にわたってTB中で培養した。バクテリア培地からプラスミドを抽出し、そして1遺伝子当たり4つのクローンを配列決定した。
インフルエンザ・ウィルスA/Hong Kong/213/2003(H5N1、HK213)は鶏において全身的に複製し、致死的な感染を引き起こす。さらに、このウィルスは、鶏胚にとって致死的である。このように、その表面タンパク質は現在循環している病原性鳥インフルエンザ・ウィルスに大きく関連してはいるが、HK213は、孵化鶏卵内でこれを成長させようという試みが低品質の尿膜腔液を生成することになるため、ワクチン株として使用することはできない。加えて、ワクチン生成におけるこのような高毒性ウィルスの使用は、ワクチン作業者にとって安全でない。マスター・ワクチン株としてA/PR/8/34を使用することの実現可能性を試験するために、HK213の血球凝集素(HA)遺伝子の切断部位(複数の塩基性アミノ酸を含有する)を、毒性表現型から無毒表現型へ(RERRRKKR(SEQ ID No:29)から----TETR(SEQ ID No:30)へ)突然変異させた。突然変異HA遺伝子を含有するウィルスは、鶏において非致死的な局在化感染をもたらした。加えて、突然変異ウィルスは、鶏胚に対して非致死的であった。このように、孵化卵内の突然変異ウィルスの成長は、高品質の尿膜腔液を産出し、そしてこの弱毒化形態において、ウィルスはワクチン製造者にとって安全である。
1997年香港において、高病原性H5N1鳥インフルエンザ・ウィルスが鳥からヒトへ直接伝染し、18件の感染が確認され、6名が死亡するに至った(Subbarao他、1998;Claas他、1998)。2004〜6年には、H5N1ウィルスの地理的分布はアジアにおいて拡大し、いくつかの隣接するヨーロッパの国々及びアフリカに広がった。全体で、ウィルスに感染した96名の人々がベトナム、タイ、カンボジア、インドネシア、中国、トルコ、及びイラクで死亡した(Li他、2004;WHO)。汎流行病のこのような致命的な発生及び持続する脅威が、ヒトに使用するためのH5N1ウィルス・ワクチンの開発をもたらした。しかし、病原性H5N1ウィルスは孵化鶏卵内ではよく成長せず、ワクチン製造者に対する深刻なバイオセーフティの懸念をもたらすので、ワクチン候補を生成するために、逆遺伝技術が利用されている(Subbarao他、2003;Webby他、2004;Stephanson他、2004;Wood & Robertson、2004)。
細胞及びウィルス
10%ウシ胎仔血清及び抗生物質を含むDulbecco変性イーグル最小必須培地(DMEM)中に、293Tヒト胚腎臓細胞を維持した。Madin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞を、5%新生ウシ血清及び抗生物質を含むMEM中で成長させた。ヒト・ワクチン製造に使用するためのバイオセーフティ試験(Sugawara他、2002)後に樹立されたアフリカミドリザルVero WCB細胞を、抗生物質を含む無血清VP−SFM培地(GIBCO−BRL)中に維持した。細胞を5%CO2中に37℃で維持した。ヒトから単離されたA/Vietnam/1194/2004及びA/Vietnam/1203/2004(H5N1;VN1194及びVN1203)株を、10日齢孵化鶏卵内で2日間にわたって37℃で増殖させ、その後、ウィルスを含有する尿膜腔液を収穫し、そして更なる試験のために使用した。これらのウィルスを用いた試験は、バイオセーフティ・レベル3の閉じ込め実験室内で行った。WHO推奨ワクチン種ウィルスNIBRG−14(VN1194/PR8 6:2再構築体ウィルス)は、英国National Institute for Biological Standards and ControlのJohn Wood及びJim Robertson両博士の厚意により贈呈された。
インフルエンザA型ウィルスの再構築体を生成するために、プラスミドに基づく逆遺伝技術(Neumann他、1999)を用いた。VN1194又はVN1203に由来するウィルスRNAを、商業的キット(ISOGEN LS, Nippon Gene)を使用することにより、尿膜腔液から抽出し、そして逆転写酵素(SuperScript III;GIBCO-BRL)、及びH5ウィルスのRNAセグメントの3’末端のコンセンサス配列を含有するプライマーを使用することにより、cDNAに変換した。次いで、完全長cDNAを、ProofStartポリメラーゼ(QIAGEN)及びH5サブタイプ特異的プライマー対でPCR増幅し、そしてヒト・ポリメラーゼIプロモーター及びマウスRNAポリメラーゼIターミネーター(PolIプラスミド)の制御下でプラスミド内にクローニングし、それぞれVN1194又はVN1203 HA遺伝子を含有するPolI−VN1194/HA又はPolI−VN1203/HA構造を生成した。Horimoto他(2006)に記載されているように、バック−トゥ−バック・プライマー対を使用した逆PCR法に続いてライゲーションを行うことによって、無毒型配列(RETR;SEQ ID No:31)を形成するために、野生型VN1194又はVN1203(RERRRKKR;SEQ ID No:29)ウィルスのHA切断部位配列を変更した。この文献の開示内容を参考のため本明細書中に引用する。N1特異的プライマーを有するRT−PCR処置(上記)によって、VN1203 NA遺伝子を含有するPolI−VN1203 NAを構成した。逆PCRによって、一連のpPolI NA突然変異プラスミドを調製した。PolI−VN1203 NAを鋳型として使用して、pPolI−NAfillを構成した。pPolI−NAfillは、A/goose/Guangdong/1/96(H5N1;GsGd96)NAから誘導された、48−Proと49−Ileとの間のNAストーク内への20アミノ酸(aa)(CNQSIITYENNTWVNQTYVN;SEQ ID No.32)挿入部を含有する突然変異体NAをコードする。各NAサブタイプのストーク領域から誘導されたN2(12aa)又はN2+N9(12+12aa)配列が、42−Asnと43−Glnとの間のNAストーク内に挿入されたpPolI−NAfill.N2及び−NAfill.N2N9を、Castrucci他(1993)に記載されているように構成した。これらの構造の全てを、望ましくない突然変異が存在しないことを保証するために配列決定した。
ウィルスを10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔内に接種し、48時間にわたって37℃でインキュベートした。0.5%鶏赤血球又は0.8%モルモット赤血球を使用した、又は卵内のHAアッセイによって尿膜腔液中のウィルスを滴定することにより、ウィルス1ml当たりのメディアン卵感染用量(EID50)を見極めた。いくつかのウィルスの場合、MDCK細胞及びTPCK−トリプシン(1μg/ml)を用いてプラーク滴定を実施した。104EID50のウィルスを接種した後、いくつかのウィルスの成長動態を卵内で評価した。
HA力価1:1024を含有するウィルスの2倍希釈液50μlを、0.5%鶏赤血球50μlと共に1時間にわたって4℃でマイクロタイター・プレート内でインキュベートした。プレートを次いで37℃で貯蔵し、HA力価の低減を定期的に記録した。6.8mM CaCl2を有するリン酸緩衝生理食塩水を希釈剤として使用した。
鶏卵におけるPR8の高成長特性の分子基盤
逆遺伝子学に基づくH5インフルエンザ・ワクチンを生成するための供与体ウィルスとして使用するために、PR8がWHOによって推奨されているが、その高成長特性の分子基盤は十分には理解されていない。M遺伝子は、卵内のPR8の強い成長に関与すると言われているが(Subbarao他、2003)、しかしこの主張は、発表されたオリジナル・データ(Kilbourne他、1969)には一見したところ見いだされない。従って卵内の成長が悪いWSN株を使用して、再構築体分析を行った。表3は、孵化鶏卵におけるウィルス成長に関して、PR8対WSN株のHAとNAとの適合性を示す。全ての再構築体試験ウィルスは、野生型WSNよりも良好に成長するが、しかし卵適応PR8よりも成長が良くない。このことは表面糖タンパク質及び内部タンパク質の両方が、PR8の高成長特性に関与していることを実証する。
以前の研究において、卵内のWSNの成長は、NA機能を増大させるためにNAストークを長くすることによって高められる、すなわちストークが長ければ長いほど、ウィルスの複製がより良好に行われることが示された(Castrucci他、1993)。この発見は、PR8バックグラウンドと共に突然変異又は異種N1を含んでなる一連のH5N1ワクチンの生成、及び卵内のこれらの成長の比較を促した。A/Vietnam/1203/2004(H5N1;VN1203)NAは、ストーク領域内に20アミノ酸(20−aa)末梢部を含有する(すなわち、ストーク内に24aa)。従って、前駆体ウィルスA/goose/Guangdong/1/96(H5N1)(Xu他、1999)と同様に44−aaストークを含有する突然変異体NA、VN1023fill、並びに他のNA突然変異体、すなわち、より長いストーク、58−及び72−aaをそれぞれ含有するVN1023fill.N2及びVN1023fill.N2N9を構成した(図2)。ストーク内に44−aaを含有するA/Hong Kong/213/03(H5N1;HK213)に由来する異種N1も試験した。H1N1株、例えば、全てストーク内に24aaを有するPR8、A/Kanagawa/173/2001(H1N1;Kanagawa)、及びWSNに由来するNAも試験した。これらのNA構造を使用して、全部で8種の再構築体ウィルス、すなわち、修飾無毒型VN1203HA及びPR8バックグランドを有する7種の6:2及び1種の7:1再構築体を生成した(表5)。修飾無毒型A/Vietnam/1194/2004(H5N1;VN1194)HAを有する別の一連の再構築体ウィルスを構成した。親VN1203 NAを含有する構造と比較することにより7:1再構築体ウィルス、及び修飾されたVN1194 HAとVN1203fill NAとの組み合わせを含有する6:2再構築体だけが、卵内の成長の向上を示した。
H5N1ワクチンの生成における候補種ウィルスの潜在能力の有効性を確認するために、これらの感染価を、同じ試験条件下でWHO提供のNIBRG−14ウィルスの感染価と比較した。VN1194又はNV120誘導型HA、及びPR8株に由来する全ての他の遺伝子を含有する7:1再構築体ウィルスは、EID50(表6)及びプラーク滴定(図6)によって評価して、卵内のNIBRG−14ウィルスよりも著しく高い力価(p<0.05、スチューデントt検定)を示した。興味深いことに、VN1194ウィルスに由来するHA及びNAの両方を含有する6:2再構築体ウィルスでさえ(またVN1194/PR8 6:2再構築体ウィルスも)、プラーク滴定(図5)によって測定して、NIBRG−14よりも著しく良好に(約7倍、p=0.047)成長した。同一のVN1194 HA及びNAを有する2種の6:2再構築体ウィルスの成長の差は、この研究で使用されるPR8株が、卵内のワクチン生成中の高いウィルス成長を支援するためのNIBRG−14を生成するために使用されるPR8株よりも優れていることを示す。
両方ともH5N1ヒト単離体から誘導された修飾無毒型HA及びNA遺伝子と、PR8株に由来する全ての残りの遺伝子とを有する組み換えウィルス(6:2再構築体)が生成されており、そして、ヒト臨床試験において今や試験されようとする不活性インフルエンザ・ワクチンのための種ウィルスとして使用されている(Wood & Robertson、2004)。このように使用される種株は、孵化卵内で良好に成長しなければならない。卵適応PR8はこの要件を満たすが、いくつかの6:2再構築体ウィルスは、PR8に由来する6種の内部遺伝子を含有しているにもかかわらず、卵内ではよく成長しない(表3及び5)。ここで、鶏卵内の卵適応PR8の成長が、HA及びNA表面糖タンパク質の機能バランスによって影響を受けることが実証される。
孵化鶏卵内のH5N1ワクチン種ウィルスの高い成長速度に関与する遺伝子を同定するために、孵化鶏卵内にPR8(UW)又はPR8(Cambridge)内部遺伝子を有する再構築体H5N1ウィルスの成長を評価した(図7)。再構築体ウィルス全てのHA及びNA遺伝子は、A/Vietnam/1194/2002から誘導された。全てのその他の遺伝子は、NIBRG−14ワクチン株の非HA及び非NA遺伝子をも提供するPR8(UW)又はPR8(Cambridge)から誘導された。内部遺伝子の大部分がPR8(UW)に由来するときには、より高い力価が得られた。
Claims (25)
- 再構築体インフルエンザ・ウィルスのための複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物であって、
a) 転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB1 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB2 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスHA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNP cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNS cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、ここで、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSのcDNAは、配列番号1〜6によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするPB1、PB2、PA、NP、M、及びNSの配列を有し、HAのcDNAは、異種インフルエンザAウィルスHAの配列を有し、ここで、NSのcDNAは、位置55にGluを有し、そしてNAのcDNAは、異種NAの配列を有するか又は配列番号8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードし;そしてPB2のcDNAは、位置360にTyrをコードする;並びに
b) インフルエンザ・ウィルスPAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスPB1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスPB2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、及びインフルエンザ・ウィルスNPをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、並びに任意には、インフルエンザ・ウィルスHAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスNAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスM1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスM2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、又はインフルエンザ・ウィルスNS2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、
を含んでなる、組成物。 - 前記プロモーターが、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T3プロモーター又はT7プロモーターである、請求項1に記載の組成物。
- 前記HAがH5である、請求項1に記載の組成物。
- 前記a)の複数のベクターが、RNAポリメラーゼIプロモーター、又はRNAポリメラーゼIIプロモーターを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記b)のベクターの全てが、RNAポリメラーゼIIプロモーターを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記a)の各ベクター又は前記b)の各ベクターが別個のプラスミド上にある、請求項1に記載の組成物。
- 前記NA又はHAがキメラNA又はHAである、請求項1に記載の組成物。
- 前記HAのcDNAは、配列番号7によってコードされるポリペプチドに対応するポリペプチドをコードしない、請求項1に記載の組成物。
- 前記NA内のストークが20超のアミノ酸長である、請求項1に記載の組成物。
- 前記HAが無毒形H5 HAである、請求項1に記載の組成物。
- 前記NAのcDNAは、配列番号8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項1に記載の組成物。
- 前記PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSのcDNAは、配列番号1〜6によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするPB1、PB2、PA、NP、M、及びNSの配列を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記NSのcDNAは、配列番号38によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項1に記載の組成物。
- 前記NAは、N1である、請求項1に記載の組成物。
- インフルエンザ・ウィルスの製造方法であって、細胞を、感染性インフルエンザ・ウィルスを産出するために有効な量の、
転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB1 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB2 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスHA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNP cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNS cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、ここで、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSのcDNAは、配列番号1〜6によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするPB1、PB2、PA、NP、M、及びNSの配列を有し、HAのcDNAは、異種インフルエンザAウィルスHAの配列を有し、ここで、NSのcDNAは、位置55にGluを有し、そしてNAのcDNAは、異種NAの配列を有するか又は配列番号8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードし、そしてPB2のcDNAは、位置360にTyrをコードする;並びに
インフルエンザ・ウィルスPAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスPB1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスPB2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、及びインフルエンザ・ウィルスNPをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、並びに任意には、インフルエンザ・ウィルスHAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスNAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスM1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスM2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、又はインフルエンザ・ウィルスNS2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、
と接触させることを含む、インフルエンザ・ウィルスの製造方法。 - 前記ウィルスを単離することをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 請求項15に記載の方法によって得られたウィルス。
- 配列番号1〜6によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの配列をもつPB1、PB2、PA、NP、NS、及びMのウィルス・セグメント、異種NAの配列を有するか又は配列番号8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの配列を有するNAのウィルス・セグメント、及び異種HAのウィルス・セグメントを含み、該NSのウィルス・セグメントは、NS1の位置55にGluを有するNS1をコードし、そして該該PB2のウィルス・セグメントは、位置360にTyrをもつPB2をコードする、単離された組み換えインフルエンザ・ウィルス。
- 前記PB1、PB2、PA、NP、NS、及びMのウィルス・セグメントが、配列番号1〜6によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの配列をもつ、請求項18に記載のウィルス。
- 前記PB1、PB2、PA、NP、及びMは、配列番号1〜5によりコードされる対応ポリペプチドに対し1又は2個の置換をもつ、請求項18に記載のウィルス。
- 前記PB1、PB2、PA、NP、及びMは、配列番号1〜5によりコードされる、請求項18に記載のウィルス。
- 前記HAのウィルス・セグメントは、H5のものである、請求項18に記載のウィルス。
- 医薬として使用するための請求項17〜22のいずれか1項に記載のウィルス。
- 不活性化インフルエンザ・ウィルス・ワクチンの製造における請求項17〜22のいずれか1項に記載のウィルスの使用。
- 該個体を免疫化するために有効な医薬の製造における請求項17〜22のいずれか1項に記載のウィルスの使用。
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