CN104372023B - 一种拯救流感病毒的方法 - Google Patents

一种拯救流感病毒的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104372023B
CN104372023B CN201410643862.6A CN201410643862A CN104372023B CN 104372023 B CN104372023 B CN 104372023B CN 201410643862 A CN201410643862 A CN 201410643862A CN 104372023 B CN104372023 B CN 104372023B
Authority
CN
China
Prior art keywords
influenza virus
coding
strain
cdna molecule
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410643862.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104372023A (zh
Inventor
孙怡朋
刘金华
沈晔
蒲娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201410643862.6A priority Critical patent/CN104372023B/zh
Publication of CN104372023A publication Critical patent/CN104372023A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104372023B publication Critical patent/CN104372023B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种拯救重组流感病毒的方法。该方法包括：1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2、PB1、PA、NP、NA、M1和M2、NS1和NS2的cDNA分子以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和M2、NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体。2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。从该拯救重组流感病毒的方法中得到的重组流感病毒疫苗株在鸡胚中具有高复制力，比传统疫苗在鸡胚中的生长滴度也要高，通过对疫苗种子毒进行抗原性检测发现，疫苗种子毒的抗原性与亲本病毒没有明显差异。

Description

一种拯救流感病毒的方法
技术领域
本发明涉及病毒疫苗生产领域中一种拯救流感病毒的方法，特别涉及在鸡胚中具有高繁殖力的流感病毒疫苗株的制备方法。
背景技术
H9N2亚型禽流感病毒是一种低致病性禽流感病毒，主要感染鸡、鸭、鹅、候鸟等禽类，但可造成蛋鸡的产蛋量严重下降，肉鸡和青年鸡的复合型呼吸道疾病和死淘率升高，造成严重的经济损失，目前H9N2亚型禽流感病毒已经成为流行于我国鸡群中的主要流感病毒亚型。值得注意的是，H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽类，而且无需经过中间宿主即可突破种间屏障感染哺乳动物和人，自1998年全球首次发现人感染H9N2亚型禽流感病毒病例后，人感染H9N2亚型禽流感病毒病例时有发生，凸显出其公共卫生学意义。因此，对禽流感病毒进行连续的分子病毒学监测，分析禽流感病毒变异规律，筛选出合适的疫苗株，研制出高效、安全、工艺简单、价格低廉的禽流感病毒疫苗是急需的。
全病毒灭活苗是人们主要使用的禽流感疫苗，多用鸡胚制备而成。因此，一个理想的疫苗株首先应该在鸡胚中生长良好而且安全，然而，绝大多数流感病毒自然株对鸡胚有致病性，而且病毒的生长滴度也较低，这为大批量生产禽流感疫苗带来了诸多不便。为了克服这一缺点，目前多用遗传重组方法制备高繁殖力的预备疫苗株。
H9N2亚型禽流感病毒为A型流感病毒，A型流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，共有8个独立的RNA片段组成，编码10种蛋白质。片段1-3编码RNA依赖的RNA聚合酶，片段1编码聚合酶亚基PB2，片段2编码聚合酶亚基PB1，片段3编码聚合酶亚基PA；片段4编码血凝素HA，是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白；片段5编码核蛋白NP，是病毒RNA的主要结构部分；片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜糖蛋白；片段7编码两种基质蛋白M1和M2，是非糖基化的结构蛋白；片段8编码两种非结构蛋白NS1和NS2。血凝素HA和神经氨酸酶NA经常发生抗原漂移和转换，是导致流感暴发的主要原因。
人H1N1流感病毒A/PR/8/34(简称PR8)是一株鸡胚适应病毒株，能在鸡胚中有效地复制。因此，疫苗研制中常常将PR8的6个内部基因与流行毒株的HA和NA基因重组(6+2模式)构建8质粒拯救系统，将重组病毒作为疫苗株来提高病毒滴度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备出在鸡胚中繁殖力高于传统6+2模式得到的重组病毒毒株。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了8+7模式拯救流感病毒的方法，该方法将流感病毒鸡胚适应株的7个基因片段(HA除外)与待拯救流感病毒毒株的8个基因片段共转染包装细胞，使除待拯救流感病毒毒株的编码HA的RNA片段外的14个RNA片段自由组合，进行病毒拯救，得到重组流感病毒。
本发明所提供的拯救流感病毒的方法(也就是构建重组流感病毒的方法)，包括以下步骤：
1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子和编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子，以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子和编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体，所述15个重组表达载体为下述a1-a15中的重组表达载体：a1、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB2基因表达载体；a2、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB1基因表达载体；a3、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PA基因表达载体；a4、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NP基因表达载体；a5、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NA基因表达载体；a6、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株M基因表达载体；a7、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NS基因表达载体；a8、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB2基因表达载体；a9、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB1基因表达载体；a10、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PA基因表达载体；a11、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株HA基因表达载体；a12、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NP基因表达载体；a13、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NA基因表达载体；a14、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株M基因表达载体；a15、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NS基因表达载体；
2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。
上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒可为A型流感病毒。
上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒鸡胚适应株可为A/PR/8/34，所述待拯救流感病毒毒株可为A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)。
上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒鸡胚适应株中PB2是SEQ ID No.9的第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.9由2280个核苷酸组成，其编码序列是第1-2280位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中PB1是SEQ ID No.15的第1-2274位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.15由2274个核苷酸组成，其编码序列是第1-2274位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中PA是SEQ ID No.14的第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ IDNo.14由2151个核苷酸组成，其编码序列是第1-2151位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中NP是SEQ ID No.12的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.12由1497个核苷酸组成，其编码序列是第1-1497位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中NA是SEQ ID No.11的第1-1365位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.11由1365个核苷酸组成，其编码序列是第1-1365位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中M1是SEQ ID No.10的第1-759位核苷酸序列编码的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中M2的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示，所述流感病毒鸡胚适应株中M2是SEQ ID No.10的第1-26位和第715-982位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.10由982个核苷酸组成，其编码序列是第1-982位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中NS1是SEQ ID No.13的第1-693位核苷酸序列编码的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，所述流感病毒鸡胚适应株中NS2是SEQ IDNo.13的第1-30位和第503-838位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.13由838个核苷酸组成，其编码序列是第1-838位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中PB2是SEQ ID No.3的第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.3由2280个核苷酸组成，其编码序列是第1-2280位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中PB1是SEQ ID No.4的第1-2274位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.4由2274个核苷酸组成，其编码序列是第1-2274位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中PA是SEQ ID No.5的第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ IDNo.5由2151个核苷酸组成，其编码序列是第1-2151位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中HA是SEQ ID No.1的第1-1683位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.1由1683个核苷酸组成，其编码序列是第1-1683位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中NP是SEQ ID No.6的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.6由1497个核苷酸组成，其编码序列是第1-1497位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中NA是SEQ ID No.2的第1-1401位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.2由1401个核苷酸组成，其编码序列是第1-1401位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中M1是SEQ ID No.7的第1-759位核苷酸序列编码的蛋白质，所述待拯救流感病毒毒株中M2的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，所述待拯救流感病毒毒株中M2是SEQ ID No.7的第1-26位和第715-982位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.7由982个核苷酸组成，其编码序列是第1-982位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中NS1是SEQ ID No.8的第1-654位核苷酸序列编码的蛋白质，所述待拯救流感病毒毒株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，所述待拯救流感病毒毒株中NS2是SEQ ID No.8的第1-30位和第503-838位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No.8由838个核苷酸组成，其编码序列是第1-838位核苷酸。
编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子是CPB21、CPB22、CPB23或CPB24的cDNA分子：CPB21、其编码序列是序列表中SEQ ID No.9的第1-2280位核苷酸的cDNA分子；CPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.9的cDNA分子；CPB23、在严格条件下与所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PB2亚基的cDNA分子；CPB24、与所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述RNA聚合酶PB2亚基的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子是CPB11、CPB12、CPB13或CPB14的cDNA分子：CPB11、其编码序列是序列表中SEQ ID No.15的第1-2274位核苷酸的cDNA分子；CPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.15的cDNA分子；CPB13、在严格条件下与所述CPB11或所述CPB12限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PB1亚基的cDNA分子；CPB14、与所述CPB11或所述CPB12限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述RNA聚合酶PB1亚基的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子是CPA1、CPA2、CPA3或CPA4的cDNA分子：CPA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.14的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；CPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.14的cDNA分子；CPA3、在严格条件下与所述CPA1或所述CPA2限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PA亚基的cDNA分子；CPA4、与所述CPA1或所述CPA2限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述RNA聚合酶PA亚基的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子是CNP1、CNP2、CNP3或CNP4的cDNA分子：CNP1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.12的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；CNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.12的cDNA分子；CNP3、在严格条件下与所述CNP1或所述CNP2限定的cDNA分子杂交且编码核蛋白NP的cDNA分子；CNP4、与所述CNP1或所述CNP2限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述核蛋白NP的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子是CNA1、CNA2、CNA3或CNA4的cDNA分子：CNA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.11的第1-1365位核苷酸的cDNA分子；CNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.11的cDNA分子；CNA3、在严格条件下与所述CNA1或所述CNA2限定的cDNA分子杂交且编码神经氨酸酶NA的cDNA分子；CNA4、与所述CNA1或所述CNA2限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述神经氨酸酶NA的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子是CM1、CM2或CM3的cDNA分子：CM1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.10的cDNA分子；CM2、在严格条件下与所述CM1限定的cDNA分子杂交且编码基质蛋白M1和M2的cDNA分子；CM3、与所述CM1限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述基质蛋白M1和M2的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子是CNS1、CNS2或CNS3的cDNA分子：CNS1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.13的cDNA分子；CNS2、在严格条件下与所述CNS1限定的cDNA分子杂交且编码非结构蛋白NS1和NS2的cDNA分子；CNS3、与所述CNS1限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述非结构蛋白NS1和NS2的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子是RPB21、RPB22、RPB23或RPB24的cDNA分子：RPB21、其编码序列是序列表中SEQ ID No.3的第1-2280位核苷酸的cDNA分子；RPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的cDNA分子；RPB23、在严格条件下与所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PB2亚基的cDNA分子；RPB24、与所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述RNA聚合酶PB2亚基的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子是RPB11、RPB12、RPB13或RPB14的cDNA分子：RPB11、其编码序列是序列表中SEQ ID No.4的第1-2274位核苷酸的cDNA分子；RPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的cDNA分子；RPB13、在严格条件下与所述RPB11或所述RPB12限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PB1亚基的cDNA分子；RPB14、与所述RPB11或所述RPB12限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述RNA聚合酶PB1亚基的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子是RPA1、RPA2、RPA3或RPA4的cDNA分子：RPA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.5的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；RPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的cDNA分子；RPA3、在严格条件下与所述RPA1或所述RPA2限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PA亚基的cDNA分子；RPA4、与所述RPA1或所述RPA2限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述RNA聚合酶PA亚基的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子是RHA1、RHA2、RHA3或RHA4的cDNA分子：RHA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.1的第1-1683位核苷酸的cDNA分子；RHA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的cDNA分子；RHA3、在严格条件下与所述RHA1或所述RHA2限定的cDNA分子杂交且编码血凝素HA的cDNA分子；RHA4、与所述RHA1或所述RHA2限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述血凝素HA的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子是RNP1、RNP2、RNP3或RNP4的cDNA分子：RNP1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.6的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；RNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的cDNA分子；RNP3、在严格条件下与所述RNP1或所述RNP2限定的cDNA分子杂交且编码核蛋白NP的cDNA分子；RNP4、与所述RNP1或所述RNP2限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述核蛋白NP的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子是RNA1、RNA2、RNA3或RNA4的cDNA分子：RNA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子；RNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子；RNA3、在严格条件下与所述RNA1或所述RNA2限定的cDNA分子杂交且编码神经氨酸酶NA的cDNA分子；RNA4、与所述RNA1或所述RNA2限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述神经氨酸酶NA的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子是RM1、RM2或RM3的cDNA分子：RM1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的cDNA分子；RM2、在严格条件下与所述RM1限定的cDNA分子杂交且编码基质蛋白M1和M2的cDNA分子；RM3、与所述RM1限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述基质蛋白M1和M2的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子是RNS1、RNS2或RNS3的cDNA分子：RNS1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.8的cDNA分子；RNS2、在严格条件下与所述RNS1限定的cDNA分子杂交且编码非结构蛋白NS1和NS2的cDNA分子；RNS3、与所述RNS1限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述非结构蛋白NS1和NS2的cDNA分子。
上述拯救流感病毒的方法中，所述包装细胞可为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、WI-38、HL-8、HeLa细胞和Chang C/I/L/K细胞中的一种或两种以上。
上述拯救流感病毒的方法中，所述真核细胞表达载体可为pLLB-A或pLLB-G，所述15个重组表达载体可为如下15个重组表达载体：所述鸡胚适应株PB2基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应株PB1基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应株PA基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应株NP基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应株NA基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应株M基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应株NS基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株PB2基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株PB1基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中PA基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中HA基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中NP基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中NA基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中M基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中NS基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体。
上述拯救流感病毒的方法中，将所述15个重组表达载体按照等质量混合后导入所述包装细胞中，得到所述重组流感病毒。
由上述拯救流感病毒的方法制备的重组流感病毒也属于本发明的保护范围。
上述重组流感病毒中，所述重组流感病毒可为R1-R11中任一种重组流感病毒：
所述R1是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R2是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R3是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R4是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R5是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的RNA片段6、编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R6是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R7是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R8是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R9是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R10是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的RNA片段6、编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R11是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的RNA片段6、编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的RNA片段7、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的RNA片段8。
本发明还保护从上述拯救流感病毒的方法(本发明的8+7模式拯救流感病毒的方法)中获得流感病毒疫苗株的方法。
本发明获得流感病毒疫苗株的方法，包括从上述拯救流感病毒的方法制备的所述重组流感病毒中筛选得到流感病毒疫苗株的步骤。
由上述获得流感病毒疫苗株的方法制备的流感病毒疫苗株也属于本发明的保护范围。
上述流感病毒疫苗株中，所述流感病毒疫苗株具体可为上述R1或R2。
本发明还保护在鸡胚中繁殖上述重组流感病毒的方法。
本发明的实验证明，本发明的8+7模式将流感病毒鸡胚适应株的7个基因片段(HA除外)与待拯救流感病毒毒株的8个基因片段共转染包装细胞，使除HA的RNA片段外的14个RNA片段自由组合，增加了基因片段的组合方式，使疫苗株的选择范围更加广泛，具有操作简便、成本较低等优点。从本发明的8+7模式拯救流感病毒方法得到的重组流感病毒中能得到在鸡胚中具有高效复制力的疫苗株，如本发明的8+7模式得到的上述R1和R2疫苗株在鸡胚中的生长滴度比亲本毒株(即待拯救毒株)高出10倍之多，比传统6+2模式得到的疫苗株在鸡胚中的生长滴度也要高出10倍(R1和R2的生长滴度均为109.8EID50/mL，待拯救流感病毒毒株A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)的生长滴度为108.5EID50/mL，传统6+2模式得到的疫苗株R37的生长滴度为108.8EID50/mL)。通过对疫苗种子毒进行抗原性检测发现，本发明的8+7模式得到的疫苗种子毒的抗原性与亲本病毒没有明显差异。用本发明的8+7模式得到的疫苗种子毒免疫SPF鸡后HI抗体水平都达到28以上。本发明的8+7模式拯救流感病毒的方法可在拯救流感病毒和制备流感病毒疫苗中得到广泛的应用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的A/PR/8/34(Abt.M,deJongeJ,etal.Improvement ofH5N1influenza vaccine viruses:Influence of internal gene segments of avianand human origin on production and hemagglutinin content.Vaccine.2011,29:5153-5162)，公众可从中国农业大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)(GenBank:KC821269.1)公众可从中国农业大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的表达载体pLLB-A和pLLB-G(刘金华等，用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用，CN 101343636A)，公众可从中国农业大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下面以A/PR/8/34(简称PR8)作为流感病毒鸡胚适应株，以A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)(简称YT)作为待拯救流感病毒毒株，阐述本申请的拯救流感病毒的方法。
实施例1、利用本发明的反向遗传操作技术进行流感病毒的拯救
一、8+7模式构建重组流感病毒
本步骤采用8+7模式进行流感病毒的拯救，其方法如下：将编码PR8中PB2的cDNA分子、编码PR8中PB1的cDNA分子、编码PR8中PA的cDNA分子、编码PR8中NP的cDNA分子、编码PR8中NA的cDNA分子、编码PR8中M1和M2的cDNA分子和编码PR8中NS1和NS2的cDNA分子，以及编码YT中PB2的cDNA分子、编码YT中PB1的cDNA分子、编码YT中PA的cDNA分子、编码YT中HA的cDNA分子、编码YT中NP的cDNA分子、编码YT中NA的cDNA分子、编码YT中M1和M2的cDNA分子和编码YT中NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达质粒，所述15个重组表达质粒为下述a1-a15中的重组表达质粒：
a1、含有编码PR8中PB2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-PB2基因表达质粒；
a2、含有编码PR8中PB1的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-PB1基因表达质粒；
a3、含有编码PR8中PA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-PA基因表达质粒；
a4、含有编码PR8中NP的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-NP基因表达质粒；
a5、含有编码PR8中NA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-NA基因表达质粒；
a6、含有编码PR8中M1和M2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-M基因表达质粒；
a7、含有编码PR8中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称PR8-NS基因表达质粒；
a8、含有编码YT中PB2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-PB2基因表达质粒；
a9、含有编码YT中PB1的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-PB1基因表达质粒；
a10、含有编码YT中PA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-PA基因表达质粒；
a11、含有编码YT中HA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-HA基因表达质粒；
a12、含有编码YT中NP的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-NP基因表达质粒；
a13、含有编码YT中NA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-NA基因表达质粒；
a14、含有编码YT中M1和M2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-M基因表达质粒；
a15、含有编码YT中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-NS基因表达质粒；
将所述15个重组表达质粒导入包装细胞中，得到重组流感病毒。
其中，编码PR8中PB2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.9的第1-2280位核苷酸的cDNA分子；编码PR8中PB1的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.15的第1-2274位核苷酸的cDNA分子；编码PR8中PA的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.14的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；编码PR8中NP的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.12的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；编码PR8中NA的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.11的第1-1365位核苷酸的cDNA分子；编码PR8中M1和M2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.10的cDNA分子；编码PR8中NS1和NS2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.13的cDNA分子；编码YT中PB2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的第1-2280位核苷酸的cDNA分子；编码YT中PB1的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的第1-2274位核苷酸的cDNA分子；编码YT中PA的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；编码YT中HA的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第1-1683位核苷酸的cDNA分子；编码YT中NP的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；编码YT中NA的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子；编码YT中M1和M2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的cDNA分子；编码YT中NS1和NS2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.8的cDNA分子。
真核细胞表达载体为pLLB-G或pLLB-A，包装细胞为293T细胞。
具体方法如下：
1、制备15个重组表达质粒
制备PB2基因的重组表达质粒pLLB-PR8-PB2，pLLB-PR8-PB2是在pLLB-G的StuI切割位点间插入SEQ ID No.9所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备PB1基因的重组表达质粒pLLB-PR8-PB1，pLLB-PR8-PB1是在pLLB-G的StuI切割位点间插入SEQ ID No.15所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备PA基因的重组表达质粒pLLB-PR8-PA，pLLB-PR8-PA是在pLLB-G的StuI切割位点间插入SEQ ID No.14所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NP基因的重组表达质粒pLLB-PR8-NP，pLLB-PR8-NP是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No.12所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NA基因的重组表达质粒pLLB-PR8-NA，pLLB-PR8-NA是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No.11所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备M1和M2基因的重组表达质粒pLLB-PR8-M，pLLB-PR8-M是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No.10所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NS1和NS2基因的重组表达质粒pLLB-PR8-NS，pLLB-PR8-NS是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No.13所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备PB2基因的重组表达质粒pLLB-YT-PB2，pLLB-YT-PB2是在pLLB-G的StuI切割位点间插入SEQ ID No.3所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备PB1基因的重组表达质粒pLLB-YT-PB1，pLLB-YT-PB1是在pLLB-G的StuI切割位点间插入SEQ ID No.4所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备PA基因的重组表达质粒pLLB-YT-PA，pLLB-YT-PA是在pLLB-G的StuI切割位点间插入SEQ ID No.5所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备HA基因的重组表达质粒pLLB-YT-HA，pLLB-YT-HA是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No.1所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NP基因的重组表达质粒pLLB-YT-NP，pLLB-YT-NP是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No.6所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NA基因的重组表达质粒pLLB-YT-NA，pLLB-YT-NA是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No.2所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备M1和M2基因的重组表达质粒pLLB-YT-M，pLLB-YT-M是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No.7所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NS1和NS2基因的重组表达质粒pLLB-YT-NS，pLLB-YT-NS是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No.8所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒。
2、反向遗传操作技术制备重组流感病毒进行病毒的拯救
1)包装细胞的准备：将293T细胞和MDCK细胞按照2:1的比例铺于6孔细胞板，铺板后18-24h进行转染，此时细胞85％左右融合，进行转染前用PBS缓冲液轻轻洗两次细胞。
2)混合重组表达质粒：将步骤1中的15个重组表达质粒等质量混合(500ng)加入1.5mL离心管中。
3)转染：向已加入重组表达载体的1.5mL离心管中加入200μL Opti-MEM培养基(无血清、无抗生素)和10μL Lipofectmine 2000转染试剂，瞬时离心以混匀，室温放置45min后再加入700μL Opti-MEM培养基于离心管中。吸净6孔板中的细胞液，用PBS缓冲液洗两次后，吸净残余的PBS；将1.5mL离心管中的液体全部移入6孔板中，37℃培养6h，随后加入含有2μg/mL TPCK-胰酶的Opti-MEM培养基于6孔板中，1mL/孔，37℃培养48-72h后，置于-80℃保存备用。转染40块6孔板，共240个孔。
4)重组流感病毒毒株的增殖：将转染后冻存的细胞液从-80℃冰箱中取出，待其融化后吹打混匀细胞液，接种鸡胚，35℃孵化箱中培养48-72h后，将鸡胚置于4℃冰箱中冻过夜，收获尿囊液，测定其凝集红细胞的活性。若无血凝活性，则盲传一代，放弃仍无血凝活性的样本，得到重组流感病毒。
3、重组流感病毒的传代与鉴定
1)、重组流感病毒的传代
将步骤2的重组流感病毒在鸡胚上进行连续传代，将含重组流感病毒的尿囊液分别以10-2、10-3、10-4稀释度接种鸡胚，挑选出HA效价最高的重组流感病毒尿囊液再以相同的方式接种鸡胚，在鸡胚中连续传10代。
2)重组流感病毒的鉴定
在MDCK细胞长至90％时铺板，将传代的重组流感病毒尿囊液用含有1％双抗(青霉素和链霉素)的DMEM进行10倍倍比稀释。用PBS缓冲液洗两次后，每孔加入400-600μL重组流感病毒尿囊液，轻摇混匀，使重组流感病毒尿囊液均匀覆盖，置于CO2培养箱37℃孵育1h。在孵育终止前5-10min，将含有TPCK-胰酶的双抗DMEM与4％琼脂按照3:1比例混合，吹吸混匀，使覆盖液中TPCK-胰酶终浓度为2-5μg/mL。孵育终止后，将细胞板中重组流感病毒尿囊液弃掉，每孔加入3mL覆盖液，置于4℃冰箱15-20min使之凝固，之后移入CO2培养箱37℃培养，24h后开始观察空斑形成情况(每12h观察一次)。待出现空班后，用白枪头将斑挑下，置于含双抗DMEM的1.5mL离心管中，震荡混匀后接种鸡胚，收获尿囊液，对病毒进行全基因组序列测定。
测序结果表明按照上述8+7模式得到了36种重组流感病毒，其病毒名称分别为R1-R36，如表1所示：
R1的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R2的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R3的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码所述YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R4的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R5的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R6的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R7的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R8的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R9的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R10的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R11的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R12的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R13的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R14的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R15的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R16的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R17的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R18的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R19的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R20的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R21的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R22的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R23的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R24的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R25的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R26的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R27的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R28的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R29的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R30的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R31的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R32的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R33的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
R34的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码PR8中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码所述YT中NA的RNA片段6、编码所述PR8中M1和M2的RNA片段7、编码所述YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R35的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码YT中NS1和NS2的RNA片段8；
R36的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2的RNA片段1、编码YT中PB1的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中M1和M2的RNA片段7、编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8；
上述36种重组流感病毒中，编码PR8中PB2的RNA片段1的核苷酸序列均是将SEQ IDNo.9的第1-2280位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中PB1的RNA片段2的核苷酸序列均是将SEQ ID No.15的第1-2274位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中PA的RNA片段3的核苷酸序列均是将SEQ ID No.14的第1-2151位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中NP的RNA片段5的核苷酸序列均是将SEQ ID No.12的第1-1497位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中NA的RNA片段6的核苷酸序列均是将SEQ ID No.11的第1-1365位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中M1和M2的RNA片段7的核苷酸序列均是将SEQID No.10的第1-982位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中NS1和NS2的RNA片段8的核苷酸序列均是将SEQ ID No.13的第1-838位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中PB2的RNA片段1的核苷酸序列均是将SEQ ID No.3的第1-2280位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中PB1的RNA片段2的核苷酸序列均是将SEQ ID No.4的第1-2274位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中PA的RNA片段3的核苷酸序列均是将SEQ ID No.5的第1-2151位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中HA的RNA片段4的核苷酸序列均是将SEQ IDNo.1的第1-1683位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中NP的RNA片段5的核苷酸序列均是将SEQ ID No.6的第1-1497位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中NA的RNA片段6的核苷酸序列均是将SEQ ID No.2的第1-1401位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中M1和M2的RNA片段7的核苷酸序列均是将SEQ ID No.7的第1-982位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中NS1和NS2的RNA片段8的核苷酸序列均是将SEQ ID No.8的第1-838位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸。
二、6+2模式构建重组流感病毒
按照现有的6+2模式构建重组流感病毒，具体方法如下：将步骤一中的15个重组表达质粒替换为步骤一中的如下8个重组表达质粒制备重组流感病毒：pLLB-PR8-PB2、pLLB-PR8-PB1、pLLB-PR8-PA、pLLB-YT-HA、pLLB-PR8-NP、pLLB-YT-NA、pLLB-PR8-M和pLLB-PR8-NS。除了用上述8个重组表达质粒转染包装细胞外，其它操作与步骤一相同，得到的重组流感病毒只有一种，其名称为R37，其基因组RNA与R13完全相同。
三、重组流感病毒EID50/mL及红细胞凝集效价的测定
1、重组流感病毒EID50/mL的测定
1)鸡胚的选择与标记：将9-11d鸡胚置于暗室，用照蛋器观察，选择可自由晃动，血管清晰的健康鸡胚，剔除血管细、不清晰的弱鸡胚，标记出每个鸡胚的气室，避开大血管标记。
2)重组流感病毒液倍比稀释：试验前30min从-80℃冰箱中将冻存的重组流感病毒液取出，置于4℃冰箱中自然融化。准备10个1.5mL灭菌离心管，每管中加入900μL含双抗的PBS缓冲液。第一管中加入100μL重组流感病毒原液，充分混匀后吸出100μL至第二管，依次进行10倍倍比稀释至第十管，做好标记，倍比稀释后的重组流感病毒液置于冰上保存。
3)接种重组流感病毒：将标记好的鸡胚分别用碘酊和75％乙醇消毒，打孔器消毒后在气室上方和胚体标记处打孔。将1mL注射器沿胚体处小孔插入0.5cm，注入0.1mL接种物，每个稀释度重组流感病毒液接种3个鸡胚，做好标记。石蜡封口，置孵化箱中孵育，每天检查两次，及时将死亡鸡胚置于4℃冰箱中。
4)检测：接毒48-72h后将鸡胚置于4℃冰箱中过夜，冻死鸡胚，防止出血。将鸡胚表面用酒精消毒后，用镊子将气室打开，用移液枪吸取25μL重组流感病毒尿囊液至96孔血凝板，进行血凝实验。计算出36株重组流感病毒尿囊液的EID50/mL，挑选出重组流感病毒尿囊液EID50/mL较高的重组流感病毒作为疫苗候选株。重组病毒株尿囊液的EID50/mL值见表1。结果表明，采用8+7模式得到的重组流感病毒毒株R1-R11尿囊液的EID50/mL高于采用6+2模式得到的重组流感病毒毒株R37尿囊液的EID50/mL。
2、重组流感病毒红细胞凝集效价的测定
用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25μL，用微量移液器吸取抗原(待测重组流感病毒毒株的尿囊液)25μL于第1孔中并挤压6次混匀，吸出25μL至第2孔，依次进行2倍倍比稀释到第11孔，弃去25μL。向每孔中依次加入25μL 1％红细胞悬液置于微量振荡器上震荡1min，室温静置30min后观察实验结果。结果判定：将反应板倾斜45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或者不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝集成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原红细胞凝集效价(Hemagglutinin test,简称HA)，即沉淀的前一孔的稀释倍数为该抗原的效价。重组流感病毒毒株的尿囊液HA滴度见表1。结果表明，采用8+7模式得到的重组流感病毒R1-R11尿囊液的HA滴度高于采用6+2模式得到的重组流感病毒R37尿囊液。
表1、重组流感病毒毒株及YT原毒尿囊液的EID50/mL及HA滴度
实施例2、疫苗种子毒免疫原性及保护性检测
一、疫苗种子毒免疫原性检测
用鸡胚中繁殖力较高的编号为R1和R2的重组病毒以及6+2模式得到的重组病毒R37的灭活疫苗分别对10只SPF鸡进行免疫，剩余10只鸡注射等量的PBS缓冲液作为对照。
1、灭活疫苗制备步骤如下：
1)、向编号为R1、R2和R37的重组病毒液中加入终浓度为0.4％(体积百分含量)甲醛溶液，置于37℃摇床48h灭活。
2)、取灭活病毒液96ml，逐滴加入4ml吐温-80作为乳化剂，颠倒混匀。
3)、油相制备：取白油200ml于研磨钵中,向其中加入2％的硬脂酸铝粉末，用电炉加热，并不断搅拌，直到硬脂酸铝完全溶解，溶液清亮透明。再向上述溶液里加入6％的司班-80，混合均匀即为油相。
4)、油相高压灭菌：将油相放入小的注射用玻璃瓶中，瓶口用纱布塞紧，再外包报纸，橡皮筋固定，高压灭菌。
5)、待油相灭菌冷却后，再把病毒液和吐温-80混合物逐渐加入其中，充分乳化0.5h，两注射器来回推注乳化，待推力感明显增大时，即乳化基本可以。
6)、待病毒液和白油充分包容即为编号为R1、R2和R37的重组病毒的油乳剂灭活疫苗。
2、将40只21-28日龄的SPF鸡分为4个大组(A、B、C、D)，每大组10只鸡。A、B、C大组为实验组，A组的每只鸡分别经颈背侧皮下注射编号为R1的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗，注射剂量为0.3mL/只；B组的每只鸡分别经颈背侧皮下注射编号为R2的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗，注射剂量为0.3mL/只；C组的每只鸡分别经颈背侧皮下注射编号为R37的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗，注射剂量为0.3mL/只；D组的每只鸡分别经颈背侧皮下注射PBS缓冲液，注射剂量为0.3mL/只，作为空白对照组。R1的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗中R1重组流感病毒的含量、R2的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗中R2重组流感病毒的含量和R37的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗中R37重组流感病毒的含量相同。免疫后21天通过翅根采血，分离血清，得到待测血清，进行血清血凝抑制效价(HemagglutinationInhibition test，简称HI)测定。
3、4单位抗原的配制、抗原值校正以及血清血凝抑制(HI)效价的测定
1)疫苗种子毒HA测定：用微量移液器先加25μL生理盐水于各孔中，吸取待测抗原(待测重组流感病毒毒株的尿囊液)各25μL置于第1孔中并挤压6次，然后2倍进行倍比稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL。再吸取1％红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μL，置于微量振荡器上震荡1min，室温静置30min后观察结果。结果判定：将反应板倾斜45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或者不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝集成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原红细胞凝集效价(Hemagglutinin test,简称HA)，即沉淀的前一孔的稀释倍数为该抗原的效价。
2)4单位抗原的配置及抗原值校正：根据抗原效价结果配置相应比例的抗原稀释液，即4单位抗原。首先用微量移液器向反应孔的第2至第6孔加入生理盐水25μL，第1孔不加，再吸取25μL 4单位抗原分别加入第1孔、第2孔，从第2孔开始挤压混匀后2倍进行倍比稀释至第5孔，并将第5孔弃去25μL。吸取1％红细胞悬液依次加入1-6孔中，每孔25μL置于微量振荡器上震荡1min，室温静置30min后观察结果。结果观察：第1、2、3孔完全凝集，第4孔红细胞为50％沉淀，第5孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立；如不成立，则重新配置4单位抗原并重复上述步骤。
3)HI效价测定：用微量移液器先加25μL生理盐水于各孔中，吸取待测血清25μL置于第1孔中，然后2倍进行倍比稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL，第12孔只加入25μL生理盐水，为红细胞对照。吸取配制好的抗原液，每孔加入25μL，置于微量振荡器上震荡1min，混合均匀后室温静置20min。随后每孔加入25μL1％红细胞悬液，置于微量振荡器上震荡1min，混合均匀室温静置40min后观察结果。结果观察：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释倍数为该血清血凝抑制效价，以2的指数表示。候选疫苗株免疫鸡只产生的HI抗体水平(log2)见表2。结果表明，采用8+7模式得到的重组流感病毒R1和R2的HI抗体水平与采用6+2模式得到的重组流感病毒R37的HI抗体水平相似。
表2、候选疫苗株免疫鸡只产生的HI抗体水平(log2)
二、疫苗种子毒保护性检测
1、灭活疫苗制备
重组流感病毒的灭活疫苗的制备方法同步骤一，分别制得编号为R1的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗、R2的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗和R37的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗。
2、重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗保护性检测
1)、将40只21-28日龄的SPF鸡分为4个大组：A组、B组、C组和D组，每大组10只鸡。其中A组、B组和C组为实验组，对A组、B组和C组的每只鸡按照如下方法进行免疫：A组的每只鸡分别经颈背侧皮下注射步骤1制备的编号为R1的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗，注射剂量为0.3mL/只；B组的每只鸡分别经颈背侧皮下注射步骤1制备的编号为R2的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗，注射剂量为0.3mL/只；C组的每只鸡分别经颈背侧皮下注射步骤1制备的编号为R37的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗，注射剂量为0.3mL/只；D组的每只鸡分别经颈背侧皮下注射PBS缓冲液，注射剂量为0.3mL/只，作为空白对照组。R1的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗中R1重组流感病毒的含量、R2的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗中R2重组流感病毒的含量和R37的重组流感病毒的油乳剂灭活疫苗中R37重组流感病毒的含量相同。
2)、免疫14天后，每隔3天采集已免疫鸡只的血液，分离出血清，用相应血清进行HI效价测定；效价高于26后，进行攻毒。免疫后21-28天，每只鸡通过点眼和滴鼻分别接种100uL(106TCID50)H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)。
3)、攻毒后第5天采取每只鸡的泄殖腔拭子，经含双抗(青霉素和链霉素)PBS处理后，每只鸡的泄殖腔拭子接种3个鸡胚得到病毒的尿囊液，测定尿囊液血凝效价，如果血凝效价大于等于24则判定所测泄殖腔拭子病毒来源的鸡为阳性鸡，如果血凝效价低于24则判定所测泄殖腔拭子病毒来源的鸡为阴性鸡，具体步骤如实施例1中的红细胞凝集效价的测定。
免疫保护率计算方法：免疫保护率＝泄殖腔拭子病毒分离阴性鸡只数/总鸡只数×100％。候选疫苗株保护率数据见表3。结果表明，采用8+7模式得到的重组流感病毒R1和R2的疫苗株免疫保护率与采用6+2模式得到的重组流感病毒R37的疫苗保护率均为100％，采用8+7模式得到的重组流感病毒R1和R2的疫苗株免疫保护率与采用6+2模式得到的重组流感病毒R37的疫苗株免疫保护率相同。
表3、候选疫苗株保护率
疫苗编号 R1 R2 R37 对照
保护率 100％ 100％ 100％ 0％
上述实验证明本发明所采用的8+7模式构建重组流感病毒的方法挑选出的疫苗候选株可以在鸡胚中快速、高产、稳定的增殖，与传统制备疫苗的方法相比具有对鸡胚致病性弱、在鸡胚中繁殖力高等优点。

Claims (7)

1.拯救流感病毒的方法，包括以下步骤：
1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子和编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子，以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子和编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体，所述15个重组表达载体为下述a1-a15中的重组表达载体：
a1、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB2基因表达载体；
a2、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB1基因表达载体；
a3、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PA基因表达载体；
a4、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NP基因表达载体；
a5、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NA基因表达载体；
a6、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株M基因表达载体；
a7、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NS基因表达载体；
a8、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB2基因表达载体；
a9、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB1基因表达载体；
a10、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PA基因表达载体；
a11、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株HA基因表达载体；
a12、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NP基因表达载体；
a13、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NA基因表达载体；
a14、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株M基因表达载体；
a15、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NS基因表达载体；
2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒；
所述流感病毒鸡胚适应株为人H1N1流感病毒A/PR/8/34，所述待拯救流感病毒毒株为A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流感病毒鸡胚适应株中PB2是SEQ IDNo.9的第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中PB1是SEQ IDNo.15的第1-2274位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中PA是SEQ IDNo.14的第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中NP是SEQ IDNo.12的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中NA是SEQ IDNo.11的第1-1365位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中M1是SEQ IDNo.10的第1-759位核苷酸序列编码的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中M2的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示；所述流感病毒鸡胚适应株中NS1是SEQ ID No.13的第1-693位核苷酸序列编码的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示；所述待拯救流感病毒毒株中PB2是SEQ ID No.3的第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中PB1是SEQ ID No.4的第1-2274位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中PA是SEQ ID No.5的第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中HA是SEQ ID No.1的第1-1683位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中NP是SEQ ID No.6的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中NA是SEQ ID No.2的第1-1401位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中M1是SEQ ID No.7的第1-759位核苷酸序列编码的蛋白质，所述待拯救流感病毒毒株中M2的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；所述待拯救流感病毒毒株中NS1是SEQ IDNo.8的第1-654位核苷酸序列编码的蛋白质，所述待拯救流感病毒毒株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子是CPB21或CPB22的cDNA分子：
CPB21、其编码序列是序列表中SEQ ID No.9的第1-2280位核苷酸的cDNA分子；
CPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.9的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子是CPB11或CPB12的cDNA分子：
CPB11、其编码序列是序列表中SEQ ID No.15的第1-2274位核苷酸的cDNA分子；
CPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.15的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子是CPA1或CPA2的cDNA分子：
CPA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.14的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；
CPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.14的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子是CNP1或CNP2的cDNA分子：
CNP1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.12的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；
CNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.12的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子是CNA1或CNA2的cDNA分子：
CNA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.11的第1-1365位核苷酸的cDNA分子；
CNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.11的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子是核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.10的cDNA分子；
编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子是核苷酸序列是序列表中SEQID No.13的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子是RPB21或RPB22的cDNA分子：
RPB21、其编码序列是序列表中SEQ ID No.3的第1-2280位核苷酸的cDNA分子；
RPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子是RPB11或RPB12的cDNA分子：
RPB11、其编码序列是序列表中SEQ ID No.4的第1-2274位核苷酸的cDNA分子；
RPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子是RPA1或RPA2的cDNA分子：
RPA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.5的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；
RPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子是RHA1或RHA2的cDNA分子：
RHA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.1的第1-1683位核苷酸的cDNA分子；
RHA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子是RNP1或RNP2的cDNA分子：
RNP1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.6的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；
RNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子是RNA1或RNA2的cDNA分子：
RNA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No.2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子；
RNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子是核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.7的cDNA分子；
编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子是核苷酸序列是序列表中SEQID No.8的cDNA分子。
4.由权利要求1至3中任一所述的方法制备的重组流感病毒；所述重组流感病毒为R1或R2：
所述R1是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R2是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8。
5.获得流感病毒疫苗株的方法，包括按照权利要求1至3中任一所述的方法制备重组流感病毒，从所述重组流感病毒中筛选得到流感病毒疫苗株的步骤。
6.由权利要求5所述方法制备的流感病毒疫苗株；所述流感病毒疫苗株为下述R1或R2：
所述R1是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8；
所述R2是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的RNA片段7、编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8。
7.繁殖权利要求4所述重组流感病毒的方法，其特征在于：所述方法在鸡胚中繁殖权利要求4所述的重组流感病毒。
CN201410643862.6A 2014-11-10 2014-11-10 一种拯救流感病毒的方法 Active CN104372023B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410643862.6A CN104372023B (zh) 2014-11-10 2014-11-10 一种拯救流感病毒的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410643862.6A CN104372023B (zh) 2014-11-10 2014-11-10 一种拯救流感病毒的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104372023A CN104372023A (zh) 2015-02-25
CN104372023B true CN104372023B (zh) 2017-02-08

Family

ID=52551218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410643862.6A Active CN104372023B (zh) 2014-11-10 2014-11-10 一种拯救流感病毒的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104372023B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957550B (zh) * 2019-03-13 2020-10-20 浙江森卫生物医药发展有限公司 流感病毒的拯救方法及其组合物
CN111647610B (zh) * 2020-06-02 2021-09-03 扬州大学 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1546658A (zh) * 2003-12-02 2004-11-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 人工重组的h9n2亚型流感病毒及其应用
CN101343636A (zh) * 2008-09-05 2009-01-14 中国农业大学 用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用
CN101472941A (zh) * 2006-03-31 2009-07-01 沃弗-威斯康星校友研究基金会 用于疫苗的高滴度重组流感病毒
CN101914500A (zh) * 2009-09-28 2010-12-15 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 基因重组的h9n1亚型禽流感病毒及其应用
CN103614345A (zh) * 2013-11-19 2014-03-05 中国农业大学 一种流感病毒疫苗株

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1546658A (zh) * 2003-12-02 2004-11-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 人工重组的h9n2亚型流感病毒及其应用
CN101472941A (zh) * 2006-03-31 2009-07-01 沃弗-威斯康星校友研究基金会 用于疫苗的高滴度重组流感病毒
CN101343636A (zh) * 2008-09-05 2009-01-14 中国农业大学 用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用
CN101914500A (zh) * 2009-09-28 2010-12-15 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 基因重组的h9n1亚型禽流感病毒及其应用
CN103614345A (zh) * 2013-11-19 2014-03-05 中国农业大学 一种流感病毒疫苗株

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids;Erich Hoffmann et al.;《PNAS》;20000523;第97卷(第11期);全文 *
Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs;GABRIELE NEUMANN et al.;《Proc. Natl. Acad. Sci.》;19990831;第96卷;全文 *
Pathogenicity and immunogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus;Terrence M. Tumpey et al.;《PNAS》;20040302;第101卷(第9期);材料和方法部分以及表1 *
Recombinant Influenza Vaccines;E. S. Sedova et al.;《Acta naturae》;20121231;第4卷(第4期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104372023A (zh) 2015-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101514334B (zh) 鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用
CN104988124B (zh) 基因ⅶ型新城疫病毒标记疫苗株及其应用
CN101508977B (zh) 一种鸡源h9n2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用
CN104814985A (zh) 一种海藻多糖的应用
CN101508978B (zh) 一株鸡源h9n2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用
US11607448B2 (en) Whole avian-origin reverse genetic system and its use in producing H7N9 subtype avian influenza vaccine
CN104232594B (zh) 重组类禽型h1n1流感病毒灭活疫苗株(js40/pr8)及其制备方法和应用
CN106390112A (zh) 一种重组鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗的制备方法
US20220372081A1 (en) Whole avian-origin reverse genetic system and recombinant h5n2 subtype avian influenza virus, vaccine and uses thereof
CN104560890A (zh) 一种h9亚型禽流感病毒及其应用
CN104372023B (zh) 一种拯救流感病毒的方法
CN103525776A (zh) 一种重组狂犬病病毒口服疫苗株及其制备方法
CN103614345B (zh) 一种流感病毒疫苗株
CN103736088B (zh) 一种禽流感h9亚型灭活疫苗及其制备方法和应用
CN105950572A (zh) 表达h5亚型禽流感病毒截短ha蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法
CN104164410B (zh) 一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用
CN104164408B (zh) 抗鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物及制备
CN101730544B (zh) Pitman moore狂犬病病毒株对原代鸡胚成纤维细胞培养物的适应方法
CN102443571A (zh) 一株鸡源h9n2禽流感病毒毒株及其应用
CN104984337B (zh) 一种鸡新城疫、禽流感抗原抗体复合物灭活疫苗及其制备方法
CN114774373B (zh) 信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株及其制备方法和应用
CN102344913A (zh) 表达狂犬病病毒g蛋白重组犬瘟热病毒cdv/r-20/8疫苗株的构建
CN108498794A (zh) 一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法
CN108048476A (zh) 一种制备区分免疫和感染动物h9亚型禽流感疫苗株的方法及应用
CN101947317A (zh) 一种h5n1禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant