CN101508977B - 一种鸡源h9n2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株分离鉴定和纯化方法及其生物学特性，以及其在生物学上的应用，其保藏号为CCTCC NO：V200811，从分子水平阐明了本病毒与其他分离毒株的差异，并证明该病毒株可以用作禽流感疫苗的候选株以及H9亚型AIV血凝和血凝抑制实验(HA-HI)的抗原。该毒株对了解中国鸡源H9N2禽流感病毒的分子进化及抗原性变异具有重要意义。

Description

一种鸡源H9N2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其生物学特性，以及其在生物学上的应用。

背景技术

禽流感病毒(AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，基因组分为8个节段。核酸总长度约为13.6kb，编码至少11个病毒蛋白。由于AIV负链、分节段的RNA病毒性质，病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。AIV据其致病性可分为高致病性AIV(Highly Pathogenic Avian Influenza virus，HPAlV)和低致病性AIV(LowPathogenic Avian Influenza virus，LPAIV)，感染家禽的HPAIV和LPAIV分别以H5和H9亚型为主。

自1966年首次在北美的火鸡体内分离到H9N2亚型AIV以来，该亚型的病毒不断传播，目前已在全世界范围的禽群中广泛存在。我国也于1992年首次报道了鸡群中H9N2亚型AIV的感染。H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV的主要亚型，占禽流感总发病率90％以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30％)，但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。AI不仅对我国的养殖业造成了严重损失，而且对人类健康也构成了威胁。我国在禽流感的防控中采取了疫苗免疫和扑杀的政策，实践证明该政策对控制禽流感的大规模流行起到了重要作用。积极开展流行病学调查，密切追踪AIV的分子进化和抗原变异，选择免疫保护性好的H9N2流感病毒疫苗株，才能保证疫苗良好的免疫效果。

世界范围内的H9N2 AIV可分为北美谱系和欧亚谱系。而欧亚谱系又可分为：A/chicken/beijing/1/1994-like(BJ 94)分支、A/quail/Hongkong/G1/1997-like(G1 97)分支、A/duck/Hongkong/Y439/1997-like(Y43997)分支以及国内近年来出现的A/shanghai/F/1998(F 98)分支。鸡群是中国国内数量最大的禽群，也是人类最常接触到的禽类。所以对鸡群进行长期的AIV分子流行病学监测，密切观注其传播和进化情况，具有重要的公共卫生学的意义。

发明内容

本发明的发明人提供了一种重组的鸡源的A/Chicken/Henan/L2/2008(H9N2)禽流感病毒毒株，并提供了该毒株的全基因组序列，阐明其8个基因片段与国内经典的H9N2病毒株在系统进化上的差异，从而为H9N2病毒的分子进化和流行病学研究提供资料，同时提供了该毒株的分离、鉴定和纯化的方法以及该毒株的部分生物学性质，以明确其作为H9N2流感疫苗侯选毒株和HA-HI实验抗原的可行性。

发明人对该毒株进行了生物保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：V200811。

该病毒的全基因序列如说明书中所示，其中其HA、NA、NS和PB1基因隶属于BJ 94分支，NP和PB2基因隶属于F 98分支，M基因属于G1 97分支，而PA基因属于Y439 97分支，因此，这是一株重组毒株。

针对该病毒的特性，发明人采用的分离及鉴定方法如下：

取发病鸡的内脏器官(肝、肾、脾等)加入适量的灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rpm)离心10分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体。加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，再次8000转/分钟离心10分钟，取上清经尿囊腔接种11日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养72小时。每天观察两次，弃除24小时内的污染胚，收取死亡胚的尿囊液。通过血凝试验检测尿囊液的HA效价，并据此制备4单位病毒，用标准的H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒阳性血清进行HI试验，鉴定病毒为H9亚型禽流感病毒鉴定病毒为H9亚型AIV与NDV混合感染。

为了得到纯化的病毒，发明人采用的纯化方法如下：

首先使用ND阳性血清中和法进行初步纯化，然后再用有限稀释法进一步纯化。最终收获的含毒尿囊液再次通过H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行HI试验，鉴定表明获得了纯化的H9亚型AIV。

通过上述方法得到的纯化的H9亚型AIV，可以进行下述的各种操作，其确定其各种性质：

1.病毒在鸡胚中的生长特性该病毒在鸡胚中可高滴度生长，血凝素效价稳定在2¹⁰左右。

2.毒株EID₅₀的测定将毒株10倍系列稀释后，各取0.2ml接种11日龄SPF鸡胚。收集96小时内死亡的鸡胚尿囊液，测定HA效价，确定鸡胚感染情况。计算EID₅₀，确定毒株对鸡胚的毒力。该病毒对鸡胚的半数感染量(EID₅₀)为10^-5.75/0.2ml。

3.病毒的交叉血凝抑制实验及HA抗原相关性分析分别制备11株AIV分离毒株的油乳剂灭活苗，免疫SPF鸡，在隔离饲养器内制备单因子血清，用于交叉HI试验，检测该H9N2病毒的HA抗原是否广谱。结果该病毒与其余10株H9N2病毒的HA抗原相关性均大于0.85，表明这株病毒与其余毒株的HA抗原相关性好，可用做H9N2禽流感疫苗的候选毒株。

4.病毒的全基因组序列测定参考已发表的H9亚型AIV序列资料，设计并合成了AIV基因组8个基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS)的RT-PCR引物。优化不同基因片段的RT-PCR反应体系和循环参数，分别扩增H9亚型AIV各基因片段。RT-PCR产物进行胶回收，与pEASY-T1载体连接，转化DH5α感受态细胞。挑取白色菌落扩增后提取质粒，酶切鉴定为阳性者进行测序。为了保证测序结果的准确性，每个基因片段各测3个阳性克隆的序列，该病毒的全基因组序列测定表明，这是一株重组毒株。该病毒的全基因组序列测定表明，这是一株重组毒株，其HA、NA、NS和PB1基因隶属于BJ 94分支，NP和PB2基因隶属于F 98分支，M基因属于G1 97分支，而PA基因属于Y439 97分支。其具体的基因组序列如说明书中所示，说明书中序列表按照PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M，NS的顺序顺次排列为1-8。

通过该毒株生物学性质的测定可知A/Chicken/Henan/L2/2008(H9N2)可在鸡胚中高滴度增殖，而且其血凝素蛋白(HA)抗原性好，因此可以作为H9N2流感疫苗侯选毒株，用于灭活疫苗或基因工程疫苗的研发，可采用现有的疫苗加工方法；也可以用作HA-HI实验抗原，检测待检血清中是否存在针对H9亚型血凝素抗原的抗体。

保藏时间：2008年12月8日

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心 CCTCC

保藏编号：CCTCC NO：V200811

保藏单位地址：中国武汉大学

分类命名：H9N2流感病毒CK HN L2 08

A/Chicken/Henan/L2/2008

具体实施方式

实施例1

病毒的分离和鉴定

一株重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株A/Chicken/Henan/L2/2008(H9N2)，该病毒的分离和鉴定方法如下：

1.病料的处理与鸡胚尿囊腔接种

取发病鸡的内脏器官(肝、肾、脾等)加入灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rpm)离心10分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体。加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，再次8000转/分钟离心10分钟，取上清经尿囊腔接种11日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养72小时。每天观察两次，弃除24小时内的污染胚，收取其余鸡胚的尿囊液。

2.病毒的鉴定

制备1％浓度的鸡红血球，通过血凝试验(HA)检测尿囊液的HA效价，对于HA效价大于4者，制备4单位病毒。以4单位病毒为待检抗原，与标准的H5和H9亚型禽流感病毒阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行血凝抑制试验(HI)，鉴定病毒的类型。

实验结果

收获的鸡胚尿囊液HA效价为8-10，据此制备的4单位病毒对标准NDV、H5和H9阳性血清的HI效价分别为：6，0，7.该实验结果表明，该鸡胚尿囊液中含有H9亚型AIV和NDV，而没有H5亚型AIV。

该病毒的纯化方法如下：

1.ND阳性血清中和法初步纯化使用ND阳性血清去除上述混合感染了两种病毒的鸡胚尿囊液中的NDV：将上述含有混合毒的尿囊液与等体积的ND无菌阳性血清混合，37℃作用1小时，然后接种11日龄的SPF鸡胚。收获24-96小时内的鸡胚尿囊液，重复上述的中和步骤，鸡胚传代1次。收获的含毒尿囊液用于下述的纯化。

2.有限稀释法进一步纯化经中和法纯化得到的鸡胚尿囊液做10^-4-10^-9倍的倍比稀释，取各稀释度的尿囊液分别接种11日龄的SPF鸡胚尿囊腔。收获的病毒通过HA和HI实验检测是否含有H9亚型AIV。

取稀释倍数最低的含毒尿囊液同上法连续传代2次进行纯化。最终收获的含毒尿囊液再次通过H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行HI试验，鉴定纯化效果。结果表明，已完全除去了混合感染毒中的NDV，获得了H9亚型AIV的纯化毒株。

实施例2

病毒HA抗原性分析

实验方法：

1.H9单因子血清的制备

将H9N2亚型AIV分离毒株11株以及本发明涉及的A/Chicken/Henan/L2/2008，分别制备油乳剂灭活苗。以上述疫苗分别免疫1月龄的SPF鸡，在隔离饲养器内饲养制备单因子血清。共免疫两次，之间间隔2周，第二次免疫14天收集血液，分别制备阳性血清。

2.交叉HI试验

以上述12株病毒为抗原，分别制备其4单位病毒，与上述12种单因子血清进行交叉HI试验，检测这些H9N2病毒的HA抗原的反应性。实验重复三次。取三次实验的平均值用于R值分析，从而确定上述H9N2病毒HA抗原之间的相关性。抗原相关性的判定标准如下：

抗原间的相关性R＝√(r1×r2)，

R一2株病毒间的抗原性差异

r1一甲病毒对乙血清的HI滴度/甲病毒对甲血清的HI滴度

r2一乙病毒对甲血清的HI滴度/乙病毒对乙血清的HI滴度

如果R＝1，表明两个毒株间抗原性相同；如果0.67≤R≤1.5，表明两个毒株间抗原性无明显差异；如果0.5≤R＜0.67，表明两个毒株间抗原性有小的差异；如果R＜0.5，表明两个毒株间抗原性的明显差异；R值越小，抗原性差异越大。结果如下：

表1-1不同H9N2亚型AIV毒株间的HI交叉试验结果

表1-2不同H9N2AIV毒株间的HA抗原相关性

不同H9N2亚型AIV毒株间的HI交叉试验结果以及HA抗原相关性分析结果分别见表1-1和表1-2.由表1-2可见，A/Chicken/Henan/L2/2008(HN L2 08)与其余11株H9N2病毒的HA抗原相关性均大于0.85，表明该病毒与其余毒株的HA抗原相关性好，可作为H9N2亚型禽流感疫苗的候选毒株。

实施例3

该病毒全基因组序列的测定

实验方法：

1.RT-PCR引物的合成

参考已发表的H9亚型AIV序列资料，设计并合成了AIV基因组8个基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS)的RT-PCR引物(见表2)。

表2禽流感病毒各基因片段扩增用引物序列

2.病毒RNA的提取

以含毒的鸡胚尿囊液为RNA提取的材料，按照Trizol试剂盒(Invitragen)说明书进行操作。

3.各基因的RT-PCR

使用TAKARA公司的PrimeScript^TMOne Step RT-PCR Kit，反应体系为50ul：RNase FreedH₂O 30.5μl，10×Buffer 5μl，Enhancer Solution 1μl，dNTP Mixture 2μl，RNaseInhibitor 1μl，PrimeScript^TMRTase 0.5μl，EX Taq^TMHS 1μl，RNA样品6μl，上下游引物各1.5μl。RT-PCR反应条件为：先用50℃ 30min进行反转录，94℃ 5min预变性，然后94℃ 50s变性，退火A(见表3)1min，72℃延伸1-3min(见表3)进行5个循环；然后退火B(见表3)1min，72℃延伸1-3min(见表3)进行25个循环。最后72℃延伸10min，4℃结束反应。

表3各基因片段的PCR扩增长度和PCR反应参数

4.扩增产物的回收纯化

RT-PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，按Gel Extraction kit的说明回收和纯化核酸。

5.基因的克隆及酶切鉴定

RT-PCR产物经回收纯化后与pEasy-T1载体(TransGen公司)连接并转化到DH5α感受态细胞(自备)。挑取在Amp+的LB培养基上生长的白色菌落，37℃摇震过夜培养，按PlasmidMini kit I(OMEGA公司)的说明提质粒。提取的质粒通过电泳与空质粒的大小相比较，初步鉴定为阳性者进行双酶切鉴定(限制性内切酶HindIII、Xba I购自Fermentas公司)。酶切体系为20μl，其中待鉴定质粒8μl，DEPC水8μl，10×buffer Tango 2μl，HindIII和Xba I各1μl。

6.AIV分离株8个基因片段的序列测定及分析

每个片段取三个经质粒酶切鉴定为阳性的克隆菌，送公司测序(北京博尚，北京华大，北京迪安百泰公司)。对于分段扩增的片段(HA和PB1)，对测序结果进行拼接。使用DNAstar的Lasergene v7.1软件包进行序列的分析。用其中的Seqman程序进行试验毒株和参考毒株序列的编辑及推定的氨基酸的翻译；用MegAlign程序中的Jotun Hein方法比较序列的同源性并绘制系统进化树。各结果如下：

1.各基因的长度、蛋白编码情况以及系统进化分析所使用的核酸范围见表4。

表4各基因片段概况及系统进化分析所使用的序列区域

实验毒株全基因的进化树

图1为HA基因的系统进化树；

图2为NA基因的系统进化树；

图3为M基因的系统进化树；

图4为NS基因的系统进化树；

图5为NP基因的系统进化树；

图6为PA基因的系统进化树；

图7为PB1基因的系统进化树；

图8为PB2基因的系统进化树。

表3详细列出了本毒株与参考毒株的全基因的基因型。

表3实验毒株与参考毒株的全基因组的基因型

附1 各个数字所代表的基因类型：1为BJ 1 94，2为SH F 98，3为HK G1 97，4为Y439分支，5为CK HK G9 97。

实施例4该病毒用于HA-HI实验用抗原的制备方法和实验方法

1.抗原的制备方法：以HN L2 08为种毒，接种10-11日龄SPF鸡胚，弃去24h内死亡鸡胚，无菌收取24-120h内死亡、存活鸡胚尿囊液，加入0.2％甲醛溶液37℃灭活24h，同时加入0.02％叠氮钠作为防腐剂，4℃冰箱内保存。

2.抗原HA效价测定：取96孔血凝板，于前两排每孔加入0.01MPBS缓冲液25ul，每排第一孔加入25ul抗原，以2倍倍比稀释至12孔，加入1％鸡红细胞悬液，混匀后置室温(20-25℃)作用30min，判定HA效价，两排测定的HA效价应一致，否则重新检测。同时设0.01MPBS缓冲液作为阴性对照。

3.HI试验的方法：取96孔血凝板，每孔加入0.01MPBS缓冲液25ul，每排第一孔加入25ul待捡血清，以2倍倍比稀释至11孔。根据抗原HA效价配制4单位抗原，每孔加入4单位抗原25ul，混匀后置室温作用30min。然后加入1％鸡红细胞悬液混匀后置室温作用30min，判定血清样品的HI效价。

<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所

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<213>Avian Influenza virus

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agcaaaagca ggtactgatc caaaatggaa gactttgtgc gacaatgctt taatccaatg    60

attgtcgagc ttgcggaaaa ggcaatgaaa gaatatgggg aagacccgaa aatcgagacg    120

aacaaatttg ctgcaatatg cacacacttt caagtctgtt tcatgtattc agattttcac    180

tttattgatg aacggggtga atcaataatt gtagaatctg gagatccaaa tgcattattg    240

aaacaccgat ttgaaataat tgaaggaaga gacagaacga tggcctggac agtggtgaat    300

agtatttgca ataccacagg agtcgagaaa cctaaatttc tcccagattt atatgactat    360

aaagagaacc gattcattga aattggagtg acacggagag aagttcacat atattatctg    420

gagaaagcca acaagataaa atccgaaaag acacacatcc acatattctc attcattggg    480

gaagagatgg ccaccaaagc agactacacc cttgatgaag agagcagggc aagaattaaa    540

accaggctgt tcaccataag gcaagaaatg gccagtaggg gtctatggga ttcctttcgt    600

caatccgaga gaggcgaaga gacaattgaa gaaagatttg aaatcacagg aaccatgcgc    660

aggcttgccg accaaagtct cccaccgaac ttctccagcc ttgaaaactt tagagcctat    720

gtggatggat tcgaaccgaa cggctgcatt gagggcaagc tttctcaaat gtcaaaagaa    780

gtgaacgcca gaattgagcc attttcaaag acaacgccgc gccctctcag gttacctgat    840

gggcctcctt gctctcaacg gtcgaagttc ttgctgatgg atgcccttaa attgagcatc    900

gaagacccga gtcatgaggg tgaggggata ccactatatg atgcaatcaa atgcatgaag    960

acatttttcg gctggaaaga gcctaacatc gtaaaaccac atgaaaaggg tataaacccc    1020

aattacctcc tggcctggaa gcaggtactg gcagaactcc aagatattga aaatgaagag    1080

aaaaccccga aaacaaagaa tatgaagaaa acaagccaat tgaaatgggc actcggtgag    1140

aatatggcac cggagaaagt ggactttgag gactgcaaag atgttagcga cctaagacag    1200

tatgacagtg atgagcctga gtctagatcg ctagcaagct ggattcagag tgagttcaac    1260

aaggcatgcg aattgacaga ttcaagttgg attgaacttg atgaaatagg agaggacgtt    1320

gctccaattg agcacattgc aagcatgaga aggaactatt tcacagcaga agtatcccac    1380

tgcagggcta ccgaatacat aatgaaggga gtatacataa acacagccct gttgaattca    1440

tcctgtgcag ccatggatga ttttcaactg atcccaatga taagcaaatg cagaaccaaa    1500

gaaggaagac ggaagactaa tctgtatgga ttcattataa aaggaagatc ccacttgagg    1560

aatgataccg atgtggtaaa ctttgtgagt atggaattct ctcttactga tccgaggctg    1620

gagctacaca agtgggaaaa gtactgtgtc ctcgagatag gagacatgct cctacggact    1680

gcaataggcc aagtgtcaag gcccatgttc ctgtatgtga gaaccaatgg aacctccaaa    1740

atcaaaatga aatggggcat ggaaatgagg cgatgccttc ttcagtcact tcaacaaatt    1800

gagagcatga ttgaagcaga gtcttctgtc aaagagaagg atatgaccaa agaattcttt    1860

gaaaacaagt cagaaacatg gccgattgga gagtcaccca aaggagtgga ggatggctcc    1920

atcgggaagg tgtgcagaac cttgttggcg aagtctgtgt tcaacagttt atatgcatct    1980

ccgcaactag aggggttttc agctgaatca agaaaattgt ttctcattgt tcaggcactt    2040

agggacaacc tggaacctgg gaccttcgat ctcggagggc tatatgaagc aattgaggag    2100

tgcctgatta acgatccctg ggttttgctt aatgcatctt ggttcaactc cttcctcaca    2160

catgcactga gatagttgta gcaatgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta    2220

ccttgtttct act                                                       2233

<210>4

<211>1094

<212>DNA

<213>Avian Influenza virus

<400>4

agcaaaagca ggggaatttc acaaccactc aagatggaag tagtatcact aataactatt    60

ctactagtga caacagtaag caatgcagat aagatctgca tcggatacca atcaacaaac    120

tccacagaaa ctgtagacac tctaacagaa aacaatgttc ctgtgacaca tgccaaagaa    180

ttgctccaca cagggcacaa tgggatgcta tgtgcaacaa atctgggaca tcctcttatt    240

ctagacacct gtaccattga gggactaatc tatggcaatc cttcctgtga tctattattg    300

ggagggagag aatggtccta catcgtcgag aggccatcgg ctgttaatgg attgtgttac    360

cccgggaatg tagaaaacct agaagaacta aggtcacttt ttagctctgc tagttcttac    420

caaagaatcc aaatctttcc agacacaata tggaatgtgt cttacagtgg aacaagcaaa    480

gcatgttcag attcattcta caggagcatg agatggttga ctcaaaagaa caacacttac    540

cctattcaag acgcccaata cacaaataac agagggaaga acattctttt catgtggggt    600

ataagtcacc cacccactga tactgtgcag acaaatctgt acacaaggac tgacacaaca    660

acaagtgtgg cgacagaaga tataaataga accttcaaac cattgatagg gccaaggcct    720

tttgtcaatg gtcaacaagg aagaattgat tattattggt cgatattgaa accaggtcaa    780

acactgcgag taagatccaa tgggaatcta atcgctccat ggtatggaca cattctttca    840

ggagagagcc acggaagaat actgaagact gatttaaaca atggtaactg tgtagtgcaa    900

tgtcagacag aaaaaggtgg cttaaatact actttgccat ttcaaaatgt aagcaagtat    960

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aggaatgtgc ctgctagatc aagcagagga ctattcgggg ccatagctgg attcatagag    1080

ggaggttggt cagg                                                      1094

<210>5

<211>1564

<212>DNA

<213>Avian Influenza virus

<400>5

agcaaaagca gggtagataa tcactcaccg agtgacatca acatcatggc gtctcaaggc    60

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gaactcaaac tcagtgacta tgaagggagg ctgatccaga acagcataac aatagagaga    240

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gggaaagacc caaagaaaac tggaggtcca atttatcgga ggagagacgg gaaatgggtg    360

agagagctga ttctgtatga caaagaagag atcaggagga tttggcgtca agcgaacaat    420

ggagaagacg caactgctgg tcttacccac ctgatgatct ggcattccaa cttaaacgat    480

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gtagggacaa tggtgatgga gctaattcga atgataaaac gagggatcaa cgaccggaat    660

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ctcaaaggga aactccaaac agcagcacaa agagcaatgg tggatcaagt gagggagagc    780

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gcttcaaatg agaacatgga agcaatggac tccaacactc ttgaactgag aagtagatat    1200

tgggctatca gaaccagaag cggaggaaac accaatcaac agagggcatc tgcaggacag    1260

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atggcagcat ttacaggaaa tactgaaggc agaacgtctg acatgaggac tgaaatcata    1380

agaatgatgg aaagtgccag aacagaagat gtgtcattcc aggggcgggg agtcttcgag    1440

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ctac                                                                 1564

<210>6

<211>1459

<212>DNA

<213>Avian Influenza virus

<400>6

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tcataggaca cttttaatga atgagttggg tgttccgttt catttggtga ccaaacaagt    540

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<210>7

<211>1027

<212>DNA

<213>Avian Influenza virus

<400>7

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<213>Avian Influenza virus

<400>8

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tctttggcat gtccgcaaac gatttgcaga ccaagaactg ggtgatgccc catttctaga    120

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cagaaccgca actcgtgaag ggaaacatat agtggaacga attctggagg gagaatcaga    240

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cctttgcatt aggatggacc aagcaacaat ggataaaacc atcacattaa aagctaactt    420

cagtgtgatt ttcaatcgat tggaagctct aatactactt agagctttta cagacgaagg    480

agcaatagta ggcgaaatct caccattacc ttctcttcca ggacatactg atgaggatgt    540

caaaaatgcg attggggtcc tcatcggagg atttgaatgg aatgataaca cagttcgagt    600

ctctgaaaat ctacagagat tcgcttggag aaacagcgat gaggatggga gacctccact    660

ctctccaaag tagaaacggg gaatggaggg aacaattggg ccagaagttc gaagaaataa    720

gatggttgat tgaagaggtg cgacatagat taaaaattac agagaatagc tttgaacaaa    780

taacatttat gcaagcctta caactattgc ttgaagtgga gcaagagata agaactttct    840

cgtttcagct tatttaatga taaaaaacac ccttgtttct act                      883

Claims (2)

1.一种鸡源H9N2禽流感病毒毒株，其保藏编号为：CCTCC NO：V200811。

2.如权利要求1所述的鸡源H9N2禽流感病毒毒株，其用作H9N2亚型AIV血凝和血凝抑制实验(HA-HI)用抗原。

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