CN102205118B - 一种生物制品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物制品及其制备方法，该生物制品是由鸡胚接种单链RNA病毒之后，收取的尿囊液经过超滤浓缩后，再进行纯化，得到纯化的单链RNA病毒液；浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤，得到膜下有效成分；将纯化后单链RNA病毒和膜下有效成分混合、除菌过滤后获得该生物制品；所述生物制品病毒纯度高，而病毒中卵清蛋白等杂蛋白少，大大减小了该制剂对人体的副作用；同时单链RNA病毒和膜下有效成分具有协同抗癌效果，从而大大提高了该生物制品的抗肿瘤作用；所述制备方法有效提高病毒纯度，减少病毒中卵清蛋白等杂蛋白，制备方法简单，大大降低了生产成本，适合规模化工业生产的需要。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种生物制品及其制备方法。
背景技术
单链RNA病毒(如鸡新城疫病毒NDV、仙台病毒等)能改变肿瘤细胞的免疫原性，增强免疫细胞识别肿瘤细胞和杀伤肿瘤细胞的能力，提高机体免疫监视功能，促进机体的排斥肿瘤反应，在人类肿瘤性疾病生物防控中具有较高的研究和应用价值。到目前为止，用鸡新城疫病毒治疗的肿瘤包括全身多种恶性肿瘤，其中人类肿瘤有消化道肿瘤(包括胃癌、结、直肠癌等)、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、神经纤维瘤、纤维肉瘤、鼻咽癌、前列腺癌、膀胱移行细胞癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、肝癌等。鸡新城疫病毒抗肿瘤、抗病毒作用机制的研究较多，主要有如下几个方面：1.鸡新城疫病毒对肿瘤细胞的直接、特异性杀伤作用；2.鸡新城疫病毒的非特异性免疫刺激作用，NDV感染肿瘤细胞后，诱导机体产生的细胞因子、趋化因子和其它基因产物可达12种以上；3.鸡新城疫病毒可诱导肿瘤细胞凋亡。
仙台病毒的抗肿瘤、抗病毒机制有如下三种：1.仙台病毒对肿瘤细胞的直接毒性作用，现已发现很多病毒能直接杀死肿瘤细胞，生物学家正努力寻找特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞投有‘毒性”的病毒，而分裂异常旺盛的肿瘤细胞是仙台病毒的理想宿主；2.免疫性溶解肿瘤细胞的作用，仙台病毒能使细胞表面病毒粒子发芽引起肿瘤细胞膜免疫原性增加，这样机体产生的免疫反应不仅针对病毒而且包括病毒所寄生的肿瘤细胞，这一机制在病毒抗肿瘤、抗病毒中起重要作用；3.干扰作用，人类的许多肿瘤发生与病毒的感染有密切联系，当机体或肿瘤细胞感染仙台病毒时，就会产生IFN(干扰素)，干扰肿瘤病毒，并抑制肿瘤细胞的生长。
因此，通过提高病毒纯度，减少病毒中卵清蛋白等杂蛋白，制备出对人体副作用少而抗癌作用显著的制剂，具有非常重要的应用价值和经济价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种生物制品。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生物制品的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种生物制品，是由下述方法得到的：鸡胚接种单链RNA病毒之后，收取的尿囊液经过超滤浓缩后，再进行纯化，得到纯化的单链RNA病毒液；浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤，得到膜下有效成分；将纯化后单链RNA病毒和膜下有效成分混合、除菌过滤后获得该生物制品。
优选的，上述生物制品，是由下述方法得到的：
(1)病毒接种：
画出气室和接种部位，无菌条件下在鸡胚的接种部位打个小孔，取单链RNA病毒液0.2ml注入鸡胚内并用石蜡封口，于37℃培养96～130小时；
(2)收获尿囊液：
无菌条件下对步骤(1)培养后的鸡胚进行消毒后敲碎蛋壳，扒开囊膜后用无菌吸管吸取尿囊液，并将收获完的尿囊液进行收集、测效价；
(3)首次超滤浓缩：
无菌环境下通过超滤系统对步骤(2)的尿囊液超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为300Kd；
(4)纯化：
无菌条件下取步骤(3)收集超滤后的尿囊液，将膜上的尿囊液打入层析柱中进行纯化，得到单链RNA病毒；
(5)第二次浓缩超滤：
取步骤(3)收集超滤后的尿囊液，其中将膜下的尿囊液再经过超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分；将步骤(4)中纯化尿囊液后所得单链RNA病毒和该膜下有效成分混合、除菌过滤后，获得该生物制品。
其中第二次超滤是对首次超滤浓缩后超滤膜膜下尿囊液再浓缩超滤，第二次超滤的膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分。
优选的，上述生物制品，所述步骤(1)中单链RNA病毒是鸡新城疫病毒或仙台病毒。
优选的，上述生物制品，所述步骤(1)中鸡胚是由受精鸡蛋于37℃～40℃孵化9～11天，检出除去死胚和寡蛋后得到的。
优选的，上述生物制品，所述步骤(1)中鸡胚是9日龄鸡胚。
优选的，上述生物制品，所述步骤(4)中层析柱为凝胶层析柱。
一种生物制品的制备方法，所述方法为鸡胚接种单链RNA病毒之后，收取的尿囊液，经过超滤浓缩后，再进行纯化尿囊液所得单链RNA病毒；浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤，得到膜下有效成分；将纯化后单链RNA病毒和膜下有效成分混合、除菌过滤后得到，具体步骤为：
(1)病毒接种：
画出气室和接种部位，无菌条件下在鸡胚的接种部位打个小孔，取单链RNA病毒液0.2ml注入鸡胚内并用石蜡封口，于37℃培养96～130小时；
(2)收获尿囊液：
无菌条件下对步骤(1)培养后的鸡胚进行消毒后敲碎蛋壳，扒开囊膜后用无菌吸管吸取尿囊液，并将收获完的尿囊液进行收集、测效价；
(3)首次超滤浓缩：
无菌环境下通过超滤系统对步骤(2)的尿囊液超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为300Kd；
(4)纯化：
无菌条件下取步骤(3)收集超滤后的尿囊液，将膜上的尿囊液打入层析柱中进行纯化，得到单链RNA病毒；
(5)第二次浓缩超滤：
取步骤(3)收集超滤后的尿囊液，其中将膜下的尿囊液再经过超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分；将步骤(4)中纯化尿囊液后所得单链RNA病毒和该膜下有效成分混合、除菌过滤后，即得。
其中第二次超滤是对首次超滤浓缩后超滤膜膜下尿囊液再浓缩超滤，第二次超滤的膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分。
优选的，上述生物制品的制备方法，所述步骤(1)中单链RNA病毒是鸡新城疫病毒或仙台病毒。
优选的，上述生物制品的制备方法，所述步骤(1)中鸡胚是由受精鸡蛋于37℃～40℃孵化9～11天左右，检出除去死胚和寡蛋后得到的。
优选的，上述生物制品的制备方法，所述步骤(1)中鸡胚是9日龄鸡胚。
优选的，上述生物制品的制备方法，所述步骤(4)中层析柱为凝胶层析柱。
本发明的有益效果是：
本发明所述生物制品病毒纯度高，而病毒中卵清蛋白等杂蛋白少，大大减小了该制剂对人体的副作用；同时单链RNA病毒和膜下有效成分具有协同抗癌效果，从而大大提高了该生物制品的抗肿瘤、抗病毒作用；所述制备方法有效提高病毒纯度，减少病毒中卵清蛋白等杂蛋白，制备方法简单，大大降低了生产成本，适合规模化工业生产的需要。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋于38℃孵化9天，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、仙台病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取仙台病毒的病毒液0.2ml，注入鸡胚内，用石蜡封口；
4、于37℃培养96小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养四天的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤系统对1500ml尿囊液超滤浓缩至原来的5倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后超滤膜膜上300ml尿囊液拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化，获得纯化后仙台病毒900ml。
六、第二次浓缩超滤：
浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤至原来的5倍，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分240ml。
将纯化后仙台病毒900ml和膜下有效成分240ml混合、除菌过滤后获得生物制品1140ml。
实施例2
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放37℃孵化9天，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、鸡新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取鸡新城疫病毒的病毒液0.3ml，注入鸡胚内，用石蜡封口；
4、于37℃培养130小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养后的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤系统对320ml尿囊液超滤浓缩至原来的8倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后超滤膜膜上尿囊液40ml拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化，获得纯化后鸡新城疫病毒120ml；
六、第二次浓缩超滤：
浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分240ml；
将纯化后鸡新城疫病毒120ml和膜下有效成分240ml混合、除菌过滤后获得生物制品360ml。
实施例3
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放38.4℃孵化9天，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、仙台病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取仙台病毒的病毒液0.1ml，注入鸡胚内，用石蜡封口；
4、于37℃培养115小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养后的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤系统对800ml尿囊液超滤浓缩至原来的8倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.5m2；
五、纯化：
将浓缩后超滤膜膜上尿囊液100ml拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，使用层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化，获得纯化后仙台病毒300ml。
六、第二次浓缩超滤：
浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分600ml；
将纯化后仙台病毒300ml和膜下有效成分600ml混合、除菌过滤后获得生物制品900ml。
实施例4
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋于38℃孵化11天，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、鸡新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取鸡新城疫病毒的病毒液0.2ml，注入鸡胚内，用石蜡封口；
4、于37℃培养130小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养后的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤系统对1200ml尿囊液超滤浓缩至原来的4倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后超滤膜膜上300ml尿囊液拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化，获得纯化后鸡新城疫病毒870ml。
六、第二次浓缩超滤：
浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤至原来的4倍，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分210ml。
将纯化后鸡新城疫病毒870ml和膜下有效成分210ml混合、除菌过滤后获得生物制品1080ml。
实施例5
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放40℃孵化9天，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、鸡新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取鸡新城疫病毒的病毒液0.3ml，注入鸡胚内，用石蜡封口；
4、于37℃培养115小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养后的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤系统对2100ml尿囊液超滤浓缩至原来的7倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后超滤膜膜上尿囊液300ml拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化，获得纯化后鸡新城疫病毒1000ml；
六、第二次浓缩超滤：
浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分450ml；
将纯化后鸡新城疫病毒1000m1和膜下有效成分450ml混合、除菌过滤后获得生物制品1450ml。
实施例6
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放39℃孵化10天，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、仙台病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取仙台病毒的病毒液0.1ml，注入鸡胚内，用石蜡封口；
4、于37℃培养105小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养后的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤系统对600ml尿囊液超滤浓缩至原来的6倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.5m2；
五、纯化：
将浓缩后超滤膜膜上尿囊液100ml拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，使用层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化，获得纯化后仙台病毒300ml。
六、第二次浓缩超滤：
浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分350ml；
将纯化后仙台病毒300ml和膜下有效成分350ml混合、除菌过滤后获得生物制品650ml。
其中，上述实施例1～6中步骤四超滤浓缩时尿囊液超滤浓缩至原来的4～8倍，是指尿囊液中病毒浓度为原来的4～8倍。
实施例7
应用小白鼠做抗肿瘤实验，试验共分为3组，每组8只小鼠，小鼠腋下接种S180肉瘤细胞，制作鼠源肉瘤模型。各试验药物均瘤内注射，每只0.1毫升，每天一次，用药疗程为7天，试验结果见表1。
表1
| 组别 | 药品 | 小鼠(只) | 用药方案 | 用药次数 | 抑瘤率(％) |
| 1 | 生理盐水 | 8 | 1次/天 | 7次 | |
| 2 | 环磷酰胺 | 8 | 1次/天 | 7次 | 91.6 |
| 3※ | 实施例1所述生物制品 | 8 | 1次/天 | 7次 | 89.4 |
上述参照实施例对该一种生物制品及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种生物制品，其特征在于：是由下述方法得到的：鸡胚接种仙台病毒之后，收取的尿囊液经过超滤浓缩后，再进行纯化，得到纯化的仙台病毒；浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤，得到膜下有效成分；将纯化后仙台病毒和膜下有效成分混合、除菌过滤后获得该生物制品，具体步骤为：
（1）病毒接种：
画出气室和接种部位，无菌条件下在鸡胚的接种部位打个小孔，取仙台病毒的病毒液0.2ml注入鸡胚内并用石蜡封口，于37℃培养96～130小时；
（2）收获尿囊液：
无菌条件下对步骤（1）培养后的鸡胚进行消毒后敲碎蛋壳，扒开囊膜后用无菌吸管吸取尿囊液，并将收获完的尿囊液进行收集、测效价；
（3）首次超滤浓缩：
无菌环境下通过超滤系统对步骤（2）的尿囊液超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为300Kd；
（4）纯化：
无菌条件下取步骤（3）收集超滤后的尿囊液，将膜上的尿囊液打入层析柱中进行纯化，得到仙台病毒；
（5）第二次浓缩超滤：
取步骤（3）收集超滤后的尿囊液，其中将膜下的尿囊液再经过超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分；将步骤（4）中纯化尿囊液后所得仙台病毒和该膜下有效成分混合、除菌过滤后，获得该生物制品。
2.根据权利要求1所述的生物制品，其特征在于：所述步骤（1）中鸡胚是由受精鸡蛋于37℃～40℃孵化9～11天，检出除去死胚和寡蛋后得到的。
3.根据权利要求1或2所述的生物制品，其特征在于：所述步骤（1）中鸡胚是9日龄鸡胚。
4.根据权利要求1所述的生物制品，其特征在于：所述步骤（4）中层析柱为凝胶层析柱。
5.一种权利要求1所述生物制品的制备方法，其特征在于：所述方法为鸡胚接种仙台病毒之后，收取的尿囊液，经过超滤浓缩后，再进行纯化尿囊液所得仙台病毒；浓缩后超滤膜膜下尿囊液再经过浓缩超滤，得到膜下有效成分；将纯化后仙台病毒和膜下有效成分混合、除菌过滤后得到，具体步骤为：
（1）病毒接种：
画出气室和接种部位，无菌条件下在鸡胚的接种部位打个小孔，取仙台病毒的病毒液0.2ml注入鸡胚内并用石蜡封口，于37℃培养96～130小时；
（2）收获尿囊液：
无菌条件下对步骤（1）培养后的鸡胚进行消毒后敲碎蛋壳，扒开囊膜后用无菌吸管吸取尿囊液，并将收获完的尿囊液进行收集、测效价；
（3）首次超滤浓缩：
无菌环境下通过超滤系统对步骤（2）的尿囊液超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为300Kd；
（4）纯化：
无菌条件下取步骤（3）收集超滤后的尿囊液，将膜上的尿囊液打入层析柱中进行纯化，得到仙台病毒；
（5）第二次浓缩超滤：
取步骤（3）收集超滤后的尿囊液，其中将膜下的尿囊液再经过超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为100Kd，得到膜下有效成分；将步骤（4）中纯化尿囊液后所得仙台病毒和该膜下有效成分混合、除菌过滤后，即得。
6.根据权利要求5所述的生物制品的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中鸡胚是由受精鸡蛋于37℃～40℃孵化9～11天，检出除去死胚和寡蛋后得到的。
7.根据权利要求5或6所述的生物制品的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中鸡胚是9日龄鸡胚。
8.根据权利要求5所述的生物制品的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中层析柱为凝胶层析柱。
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