CN109432414A - 新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法，包括如下步骤：（1）、采集发病鸡场病死鸡的内脏器官，置于‑20℃冰箱冷冻，冻硬后取出融化，待完全融化后再次冷冻，如此反复循环3次；（2）、取1g组织混合物置于无菌研钵中研磨，加入1000mL的生理盐水，研磨至匀浆状后8000rpm离心，取上清液；（3）、将上清液使用PCR方法鉴定，确定为新城疫病毒；（4）、将上清液使用0.22μm的滤膜过滤后，分别接种于营养琼脂和鲜血琼脂检测其是否含有细菌。将免疫液接种于孵化至12日龄的受精蛋中，这样孵化出的鸡就具有更高的抗体水平，提升其对新城疫病毒的免疫力。

Description

新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法
技术领域
本发明属于禽类疫苗制备领域，具体为一种新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法。
背景技术
新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。发病鸡和隐性感染鸡是本病的主要传染源，病鸡可以通过口、鼻分泌物和粪便将病毒排出。病毒在病鸡所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。病毒可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。病毒能够感染多种禽类，鸡最易感。本病一年四季均可发生，但以冬春天气寒冷季节发病较多。鸡场的鸡群一旦感染发病后，可于4～5d波及全群。具有较高的发病率和病死率，是当前危害养鸡业的一种主要传染病之一。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类疫病。我国列入重大传染病，也是禽类重点防控的传染病之一。新城疫主要是通过疫苗接种来防控，通常是雏鸡在出壳后一周进行疫苗的接种，接种后再过20d后才能产生抗体，也就是在1月龄雏鸡体内的免疫力主要依靠母源抗体。如果母源抗体水平较低，则雏鸡就得不到有效的保护。随着病原的变异，新城疫病毒的毒力在不断的增强，这就要求雏鸡能有足够高的抗体水平来抵御强毒的感染。
基于上述情况，申请人研究出新城疫鸡胚接种免疫液进行超前免疫，可以给雏鸡提供足够的免疫力。
发明内容
针对新城疫鸡胚接种免疫液进行超前免疫，本发明目的是提供一种新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法，包括如下步骤：
（1）、采集发病鸡场病死鸡的内脏器官，置于-20℃冰箱冷冻，冻硬后取出融化，待完全融化后再次冷冻，如此反复循环3次；
（2）、 取1g组织混合物置于无菌研钵中研磨，加入1000mL的生理盐水，研磨至匀浆状后8000rpm离心，取上清液；
（3）、将上清液使用PCR方法鉴定，确定为新城疫病毒；
（4）、将上清液使用0.22μm的滤膜过滤后，分别接种于营养琼脂和鲜血琼脂检测其是否含有细菌；
（5）、取无菌的上清液注射于10日龄的SPF鸡胚尿囊腔中，于37℃孵化器内孵化；
（6）、将在孵化器中培养120h未死亡的鸡胚取出，用灭菌注射器吸出尿囊液，通过血凝试验检测尿囊液中的含毒量；当病毒效价低于24时，则需要使用透析袋对尿囊液进行浓缩；当病毒效价高于24时，使用灭菌生理盐水对其进行稀释；将病毒效价为24的病毒尿囊液吸入灭菌容器里，-20℃冻存备用；
（7）、将病毒效价调至为24的尿囊液接种于1日龄SPF鸡脑内，观察8日内的发病和死亡情况，如没有发病和死亡，或在最后一天内出现个别发病和死亡，则尿囊液符合要求，否则弃去；
（8）、将病毒效价为24的尿囊液进行稀释，将尿囊液病毒效价稀释为22时尿囊液即为免疫液，置于-20℃保存，备用。
本发明的具体方法分为两部分：1、病原的采集：通过在鸡场无菌采集发病鸡的咽肛拭子，病死鸡采集其内脏器官。将病料反复冻融三次后，取1g组织混合物研磨。使用PCR方法鉴定，确定其为新城疫病毒。2、免疫液的制备：将分离鉴定后的NDV接种于10日龄的鸡胚尿囊液中，在鸡胚尿囊液中培养120h后收获，将收获后的尿囊液通过血凝试验进行检测，观察其病毒含量的多少。将病毒液浓缩或稀释，当病毒凝集价位24即可，将病毒液接种于1日龄的SPF鸡，脑内接种，观察鸡的发病和死亡情况，观察8天后如果没有出现死亡或者在第8日出现少于2只鸡死亡，则可确定病毒为弱毒，可以使用。将病毒液浓缩或稀释（具体需要根据病毒效价高低），当病毒凝集价位22即可，将病毒液通过使用0.22μm的滤膜过滤后，置于-20℃保存，此时的病毒液即为免疫液。
将本发明方法制备的免疫液接种于孵化至12日龄的受精蛋中，这样孵化出的鸡就具有更高的抗体水平，提升其对新城疫病毒的免疫力，具有很好的实际应用及推广价值。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
一种新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法，包括如下步骤：
（1）、采集发病鸡场病死鸡的肝脏、肺脏、脾脏等内脏器官，置于-20℃冰箱冷冻，冻硬后取出融化，待完全融化后再次冷冻，如此反复循环3次。
（2）、取1g组织混合物置于无菌研钵中研磨，加入1000mL的生理盐水，研磨至匀浆状后8000rpm离心，取上清液。
（3）、将上清液使用PCR方法鉴定，确定为新城疫病毒。
（4）、将上清液使用0.22μm的滤膜过滤后，接种于营养琼脂和鲜血琼脂检测其是否含有细菌。
营养琼脂，将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2~7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，分装烧瓶，122℃高压灭菌15min。成分为：蛋白胨10g，牛肉膏3g ，氯化钠5g，琼脂15~20g，蒸馏水1000mL。
鲜血琼脂，成分：pH7.4~7.6的豆粉琼脂00mL，脱纤维羊血(或兔血) 5~10mL。制法：加热溶化琼脂，冷却至50℃，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。亦可分装灭菌试管，置成斜面。亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂。
（5）、取无菌的上清液注射于10日龄的SPF鸡胚尿囊腔中，具体方法为：将孵化至10日龄的受精蛋取出，使用碘酊消毒，而后使用酒精脱碘处理，将蛋横放在蛋托上，在气室下方1mm的位置打孔。将打孔后的受精蛋平躺置于蛋托上，孔朝上，使用灭菌注射器抽取上清液0.2mL，竖直向下注入孔内。使用融化的石蜡封口后置于37℃孵化器内继续孵化。
（6）、将在孵化器中培养120h未死亡的鸡胚取出，用灭菌注射器吸出尿囊液，通过血凝试验检测尿囊液中的含毒量。当病毒效价低于24时，则需要使用透析袋对尿囊液进行浓缩。浓缩方法为：先将透析袋置于开水中煮沸10min，取出后将一头用专用夹子夹住，将50mL尿囊液注入透吸袋里，入口处也用专用夹子夹住。取500g蔗糖（分析纯）平铺入手术盘里，将装有50 mL尿囊液的透析袋置于蔗糖上面，当透析袋里的尿囊液减少至10-15 mL即可停止浓缩；当病毒效价高于24时，可使用灭菌生理盐水对其进行适当稀释。用无菌吸头将病毒尿囊液吸入灭菌容器里，-20℃冻存备用。
（7）、将病毒效价调至为24的尿囊液接种于1日龄SPF鸡脑内，方法是将孵出12~24h的雏鸡头顶正上方消毒，用灭菌注射器抽取0.1mL的尿囊液，在头顶处45°角斜刺入雏鸡脑内，将尿囊液注入脑内。观察8日内的发病和死亡情况，如没有发病和死亡，或在最后一天内出现个别发病和死亡。则尿囊液符合要求，否则弃去。
（8）、对病毒效价为24的尿囊液进行稀释，尿囊液病毒效价稀释为22时尿囊液即为免疫液，置于-20℃保存，备用。
免疫接种方法如下：将孵化至12日龄的受精蛋取出，在气室下方约1mm的地方打孔，打孔要避开血管。将打孔后的受精蛋平躺置于蛋托上，孔朝上，使用1mL注射器抽取免疫液0.2mL，竖直向下注入孔内。后使用融化的石蜡封口后置于孵化器内继续孵化。这样孵化出的鸡就具有更高的抗体水平，提升其对新城疫病毒的免疫力。
应当指出，对于本技术领域的一般技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和应用，这些改进和应用也视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、采集发病鸡场病死鸡的内脏器官，置于-20℃冰箱冷冻，冻硬后取出融化，待完全融化后再次冷冻，如此反复循环3次；
（2）、 取1g组织混合物置于无菌研钵中研磨，加入1000mL的生理盐水，研磨至匀浆状后8000rpm离心，取上清液；
（3）、将上清液使用PCR方法鉴定，确定为新城疫病毒；
（4）、将上清液使用0.22μm的滤膜过滤后，分别接种于营养琼脂和鲜血琼脂检测其是否含有细菌；
（5）、取无菌的上清液注射于10日龄的SPF鸡胚尿囊腔中，于37℃孵化器内孵化；
（6）、将在孵化器中培养120h未死亡的鸡胚取出，用灭菌注射器吸出尿囊液，通过血凝试验检测尿囊液中的含毒量；当病毒效价低于24时，则需要使用透析袋对尿囊液进行浓缩；当病毒效价高于24时，使用灭菌生理盐水对其进行稀释；将病毒效价为24的病毒尿囊液吸入灭菌容器里，-20℃冻存备用；
（7）、将病毒效价调至为24的尿囊液接种于1日龄SPF鸡脑内，观察8日内的发病和死亡情况，如没有发病和死亡，或在最后一天内出现个别发病和死亡，则尿囊液符合要求，否则弃去；
（8）、将病毒效价为24的尿囊液进行稀释，将尿囊液病毒效价稀释为22时尿囊液即为免疫液，置于-20℃保存，备用。
2.根据权利要求1所述的新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法，其特征在于：步骤（5）的具体方法为：将孵化至10日龄的受精蛋取出，使用碘酊消毒，而后使用酒精脱碘处理，将蛋横放在蛋托上，在气室下方1mm的位置打孔，将打孔后的受精蛋平躺置于蛋托上，孔朝上，使用灭菌注射器抽取上清液0.2mL，竖直向下注入孔内，用融化的石蜡封口后置于37℃孵化器内继续孵化。
3.根据权利要求1所述的新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，浓缩方法为：先将透析袋置于开水中煮沸10min，取出后将一头用专用夹子夹住，将50mL尿囊液注入透吸袋里，入口处也用专用夹子夹住；取500g蔗糖平铺入手术盘里，将装有50mL尿囊液的透析袋置于蔗糖上面，当透析袋里的尿囊液减少至10-15mL即可停止浓缩；用无菌吸头将透析袋里的病毒尿囊液吸入灭菌容器里，-20℃冻存备用。
4.根据权利要求1所述的新城疫鸡胚接种免疫液的制备方法，其特征在于：步骤（7）中，将病毒效价调至为24的尿囊液接种于1日龄SPF鸡脑内，方法是将孵出12~24h的雏鸡头顶正上方消毒，用灭菌注射器抽取0.1mL的尿囊液，在头顶处45°角斜刺入雏鸡脑内，将尿囊液注入脑内。
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