CN105770892A - 一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法 - Google Patents

一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法 Download PDF

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CN105770892A CN201610076644.8A CN201610076644A CN105770892A CN 105770892 A CN105770892 A CN 105770892A CN 201610076644 A CN201610076644 A CN 201610076644A CN 105770892 A CN105770892 A CN 105770892A
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Abstract

本发明涉及生物兽药技术领域，尤其是一种防治鸡心包积液‑肝炎综合征生物兽药的制备方法，其制作步骤是抗原的制备、抗原EID50的测定、制备灭活疫苗、产蛋鸡的免疫、高免蛋的收集和提取抗鸡心包积液‑肝炎综合征卵黄抗体，本发明提供一种治疗鸡心包积液‑肝炎综合征卵黄抗体生物兽药，通过用鸡心包积液‑肝炎综合征患病鸡的肝组织匀浆液接种鸡胚增殖病毒，并制得灭活疫苗免疫产蛋鸡，然后从蛋黄中提取的一种蛋白质。将该蛋白质用于防治鸡心包积液‑肝炎综合征，来解决目前没有合适的治疗鸡心包积液‑肝炎综合征针对性兽用药物、现有流行的治疗方案成本高、效果差的问题。

Description

一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法
技术领域
本发明涉及生物兽药技术领域，尤其是一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法。
背景技术
心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome,鸡心包积液-肝炎综合征）,典型症状是3-6周龄肉鸡突发发病，并伴有典型的心包积液和肝炎症状，也可见于肉种鸡和蛋鸡。研究认为，血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，FAV4）是引起的本病的病原之一，发现患病鸡肝细胞内有嗜碱性核内包涵体，并且肝脏匀浆经无菌处理后，可以复制出相同的病症。在电子显微镜下从病鸡肝中观察到呈二十面体的病毒，并且分离到血清型不同的多株腺病毒。但有研究指出，除了FAV4外，有其他因子与本病有关，这些因子必须与FAV4共同作用才能复制出典型症状。
2005年12月1日，农业部发布“关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知”， 金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛韦、吗啉(双)胍(病毒灵)、利巴韦林等及其盐、酯的单、复方制剂等将不能再作为兽用抗病毒药物使用。
目前，我国养殖业对于病毒病的控制，主要以疫苗免疫接种为主。比如新城疫、禽流感、传染性支气管炎等病毒病，均是采取一定的免疫程序来预防该类疾病的发生。而一旦因为免疫抑制或毒株变异等原因导致免疫失败，从而发生此类疫病流行的话，则会造成极大的经济损失。鸡心包积液-肝炎综合征，是我国各地新近流行的一种以FAV4为主要致病原的“老病”，该病最早在1987年在巴基斯坦流行过。相对于禽流感、新城疫等一类疫病来说，鸡心包积液-肝炎综合征这些年的发病情况并不严重，因此，目前也没有该病的商品疫苗销售，更没有特异性兽用药能够防治鸡心包积液-肝炎综合征。然而，从去年3月份山东、江苏、辽宁、河南等地陆续在肉食鸡群中流行，部分蛋鸡群散发。发病肉鸡群多于3周龄开始死亡，4～5周龄达高峰，高峰持续期4～8天，5～6周龄死亡减少。病程8～15天，死亡率达20～80%，一般在30%左右。目前临床治疗方案是具有我国特色的保守疗法：中兽药制剂（抗病毒）、保肝护肾及抗生素（控制继发感染）疗法。然而，从临床效果及成本来看，现有的治疗方案不仅治疗成本高昂（0.4-0.6元/羽），而且因为这种治疗方案的中兽药抗病毒制剂（比如黄芪多糖制剂）对鸡心包积液-肝炎综合征不具有针对性，其治疗成本高、效果差。
发明内容
为了克服现有防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药技术存在的不足，本发明提供了一种防治鸡心包积液-肝炎综合征的生物兽药的制备方法，解决目前没有合适的治疗鸡心包积液-肝炎综合征针对性兽用药物、现有流行的治疗方案成本高、效果差的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其步骤是：
（1）抗原的制备
A:组织匀浆液的制备：收集病患鸡的肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥除表面的结缔组织的脂肪。剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加1：1-10重量比的冷生理盐水，用组织捣碎机10000-15000r/min上下研磨15-30分钟，制成组织匀浆液；
所述病患鸡是指剖检可见典型鸡心包积液-肝炎综合征症状的鸡，尤其是指同时可见心包积液和肝炎症状的鸡；
所述病患鸡的肝脏可以是淋巴组织；
B、冻融、过滤、除菌：组织匀浆液反复冻融3次后，离心后收集上清液，0.22μm微孔过滤除菌；
C、增殖：将步骤B所得上清液做5-15倍稀释，接种10日龄鸡胚尿囊腔内，每枚鸡胚接种0.2ml，37℃孵化4d后收获尿囊液；
上述B、C步骤可以是组织匀浆液反复冻融3次后，加入1倍生理盐水稀释混匀，再加入青链霉素双抗溶液，终浓度为200IU/ml；
可以进一步对第（1）步骤的抗原进行纯化，方法是：将收获尿囊液，盲传3代，收集尿囊液，即为纯化的病毒抗原；
（2）抗原EID50的测定
将所制得的抗原，一次做10倍稀释，进行鸡胚尿囊腔接种，每个稀释度接种0.1ml，做9个重复，同时设正常胚对照。置于37℃孵化48小时，弃掉24h内死亡胚，收获24h后死亡胚及48h活胚的尿囊液，进行HA价的测定。按照Reed-muench方法计算EID50；
（3）制备灭活疫苗
将所制得尿囊液，用生理盐水稀释至10-5-10-10EID50/0.1ml，用终浓度为0.3的甲醛在37℃下灭活24h，即为制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳剂灭活疫苗，并进行灭活疫苗的安全检验；
所述乳化是指先分别制备油相和水相，再按照体积比1-3混合乳化。其中,油相制备：取94份的10号柏油，6份司本-80，2份硬脂酸铝，先将硬脂酸铝与20-30份的柏油混合加热至70-80℃，再加入剩余的柏油和司本-80，充分搅拌混匀后分装，而后于121℃下灭菌30分钟，冷却后备用；水相制备，取96份抗原液，4份的吐温-80，混合均匀备用；乳化，按照3份油相、1份水相混合配制，先将油相加入乳化罐中50-60rpm搅拌，缓慢加入水相，然后调节转速至180-200rpm，搅拌5分钟，最后加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%；
所述安全检验是指，用灭活的尿囊毒接种鸡胚，盲传3代，各代尿囊液均无血凝性，用大剂量灭活疫苗接种产蛋鸡，不影响产蛋率，试验鸡精神、食欲正常，接种局部未见溃烂；
（4）产蛋鸡的免疫
选取30周龄的健康产蛋鸡，用安全检验合格的灭活疫苗进行免疫，免疫程序为：
第一次免疫：每只鸡颈部皮下注射0.2ml；
第二次免疫：2周后，每只鸡颈部皮下注射0.4ml；
第三次免疫：2周后，每只鸡颈部皮下注射1ml；
（5）高免蛋的收集
产蛋鸡第三次免疫后10-14天，开始抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体效价，蛋黄与1.8%浓度的盐水按照体积比1：1稀释，然后按照体积比1：1加入6-8%的PEG6000溶液，保证溶液的盐浓度为0.9%、PEG6000浓度为3-4%，搅拌均匀后，常温放置1-2小时，然后3000rpm离线15-20分钟，取清液，测定HI效价，HI效价≥6即为合格，之后收集鸡蛋；
所述产蛋鸡应为符合以下条件的商品蛋鸡：禽流感、新城疫感染为阴性；产蛋率90％以上的180日龄-400日龄蛋鸡；心包积液-肝炎综合征抗体检测阴性；
（6）提取抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体
A、鸡蛋消毒：将鸡蛋清洗干净，然后，浸入37-40℃的消毒液中消毒15-20分钟，取出晾干备用；
所述消毒液可以是0.1%金保康溶液。
B、分离蛋黄：将已消毒晾干的鸡蛋打破后，充分去除蛋清、系带，收集蛋黄；
C、提取抗体：将蛋黄液与同体积PBS溶液混合后搅拌均匀，然后用6-8%的PEG6000溶液对混合液进行体积比1：1的混合均匀，然后静置2-3小时，然后3000rpm离心15-20分钟，收集上清液；
D、加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度体积比为0.05%加入甲醛，充分搅拌混合，密封1-2小时后加入终浓度重量比0.02%的稳定剂吐温-20，混合均匀；
E、过滤除菌：用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得到抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体生物制剂药物，主要成分为卵黄抗体；
F、安全检验，形成产品：用3只20g的小白鼠做安全性检验，每只小白鼠腹腔注射0.5ml步骤E所得抗体液，观察7天，无任何异常反应为合格。
本发明的有益效果是，一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，通过用鸡心包积液-肝炎综合征患病鸡的肝组织匀浆液接种鸡胚增殖病毒，并制得灭活疫苗免疫产蛋鸡，然后从蛋黄中提取的一种蛋白质。将该蛋白质用于防治鸡心包积液-肝炎综合征，来解决目前没有合适的治疗鸡心包积液-肝炎综合征针对性兽用药物、现有流行的治疗方案成本高、效果差的问题。
另外，用鸡心包积液-肝炎综合征患病鸡的肝组织匀浆液接种鸡胚增殖病毒，并制得灭活疫苗免疫产蛋鸡，然后从蛋黄中提取的一种蛋白质，它对鸡鸡心包积液-肝炎综合征具有特异性的防治作用，并且不存在耐药性风险。病患鸡用本发明生物兽药治疗后，体内不会有药物残留，且该生物制剂药物有效期长，可达7-10天，患病鸡群用药一次即可治愈，治疗成本低，0.05-0.1元/只。因此，本发明的生物兽药在鸡心包积液-肝炎综合征的防治中具有特效，不产生耐药性，药效长，无药残，成本低的特点，是一种理想的生物兽药，在兽医公共卫生安全方面有重要意义。
本发明经实验证明取得显著成功，完全达到了发明的目的，不仅不产生耐药性，在体内不存在药物残留，该药物药效期长，使用成本低，治愈率高，存活量高，具有显著的技术效果。
下面是用本发明生物兽药对鸡心包积液-肝炎综合征的预防和治疗的试验情况说明：
试验一：300只20日龄AA白羽肉鸡，用不含药物的饲料饲喂，随机分成2组，每组150只。试验组，每只鸡颈部皮下注射1ml治疗鸡心包积液-肝炎综合征的生物兽药，对照组注射1ml生理盐水。于给药后的24小时、48小时、72小时、120小时和168小时从各组中随机抽取30只试验鸡用于攻毒试验，结果表明，实验组鸡在攻毒后均不发病。对照组鸡在攻毒后3-5天出现发病症状并开始出现死亡。
由上表可见，本生物兽药可以对鸡心包积液-肝炎综合征起到预防作用，而且效果显著。
试验二:
500只20日龄AA白羽肉鸡，用不含药物的饲料饲喂，随机分成5组，每组100只，人工攻毒，每只鸡肌肉注射0.2ml尿囊毒造人工感染。第1、2、3、4组，分别在感染的12小时、24小时、36小时、48小时给每只鸡肌肉注射治疗鸡心包积液-肝炎综合征的生物兽药0.5ml，第5组为空白对照。结果显示，第1、2、3、4组的存活率分别为97%（97/100）、92%（92/100）、86%（86/100）、81%（81/100），第5组发病率100%，存活率45%（15天）。
由上表可见，本生物兽药可以对鸡心包积液-肝炎综合征起到治疗作用，而且效果显著。
具体实施方式
下面对本发明的一个较佳实施例进行详细介绍：
实施例1
所述一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法制作步骤是：
1.抗原
用于制造鸡心包积液-肝炎综合征的生物兽药的抗原是心包积液-肝炎综合征病鸡的肝组织匀浆液接种鸡胚后收获的尿囊液毒。
2.治疗鸡心包积液-肝炎综合征抗体lgY的制造和检验
2.1：抗原的制备
2.1.1将冷冻保存的肝脏，解冻后用用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥除表面的结缔组织的脂肪。剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加1：5重量比的冷生理盐水，用组织捣碎机12000r/min上下研磨20分钟，制成肝组织匀浆液。反复冻融3次，10000rpm离心5分钟，收集上清液，0.22μm滤膜过滤除菌。将所得上清液用生理盐水做10倍稀释，接种10日龄鸡胚尿囊腔内，每枚0.2ml，37℃孵化4d后收获尿囊液。
2.1.2 EID50测定
将所制得的抗原，依次做10倍稀释，进行鸡胚尿囊腔接种，每个稀释度接种0.1ml，做9个重复，同时设正常胚对照。置于37℃孵化48小时，弃掉24h内死亡胚，收获24h后死亡胚及48h活胚的尿囊液，进行HA价的测定。按照Reed-muench方法计算EID50。
2.2 制备灭活疫苗
2.2.1将所述步骤2.1所制得的抗原，用生理盐水稀释至10-8EID50/0.1ml，用终浓度为0.3的甲醛在37℃下灭活24h，即为制苗用抗原。
2.2.2乳化
制备油相：取94份的10号柏油，6份司本-80，2份硬脂酸铝，先将硬脂酸铝与20-30份的柏油混合加热至70-80℃，再加入剩余的柏油和司本-80，充分搅拌混匀后分装，而后于121℃下灭菌30分钟，冷却后备用；
制备水相：取96份抗原液，4份的吐温-80，混合均匀备用；
乳化：按照3份油相、1份水相混合配制，先将油相加入乳化罐中50-60rpm搅拌，缓慢加入水相，然后调节转速至180-200rpm，搅拌5分钟，最后加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。
2.2.3 检验
2.2.3.1粘度测定 1ml吸管在室温下吸满制备的油剂疫苗，垂直放出0.4ml所需的时间为7-10秒钟，适宜注射。
2.2.3.2稳定性测定 将制备的疫苗置于半径为10cm的离心机中，以3000rpm离心15分钟，油剂疫苗水相和油相不分层。
2.2.3.3无菌检验 将制备的疫苗分别接种到3种培养基（马丁琼脂斜面、普通肉汤和厌气肉肝汤各1管）上，37℃培养7天，培养后未见有细菌生长。
2.2.3.4安全检验 将制备的疫苗接种20-30日龄健康鸡30只，每只颈部皮下注射3ml，设对照组，相同条件下饲养，观察15天，实验组鸡无异常。
2.3：免疫程序
30周龄产蛋高峰期健康鸡，用制备的疫苗第一次免疫，接种剂量为0.5ml/只，接种途径为颈部皮下注射，以后每隔10天，颈部皮下注射1.0ml进行加强免疫，共免疫3次。
2.4：收集高免蛋
第3次免疫后10天，开始抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体效价，蛋黄与1.8%浓度的盐水按照体积比1：1稀释，然后按照体积比1：1加入6%的PEG6000溶液，保证溶液的盐浓度为0.9%、PEG6000浓度为3-4%，搅拌均匀后，常温放置2小时，然后3000rpm离线15分钟，取清液，测定HI效价，HI效价≥8即为合格，之后收集鸡蛋。
2.5：抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体生物兽药的制造
2.5.1消毒：将鸡蛋清洗干净，然后浸入37-40℃的消毒液中消毒15-20分钟，取出晾干备用；
2.5.2分离蛋黄：将已消毒晾干的鸡蛋打破后，充分去除蛋清、系带，收集蛋黄；
2.5.3提取：将蛋黄液与同体积PBS溶液混合后搅拌均匀，然后用6%的PEG6000溶液对混合液进行体积比1：1的混合均匀，然后静置2-3小时，然后3000rpm离心20分钟，收集上清液；
2.5.4加入稳定剂：上清液加入终浓度（重量比）0.02%的稳定剂吐温-20，混合均匀；
2.5.5除菌：用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得到抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体生物兽药，主要成分为卵黄抗体。
2.5.6成品检验：
无菌检验：将2.5.5制备的生物兽药分别接种到3种培养基（马丁琼脂斜面、普通肉汤和厌气肉肝汤各1管）上，37℃培养7天，培养后未见有细菌生长；
效价测定：测定2.5.5制备的生物兽药HI效价不低于6；
安全检验：将2.5.5制备的生物兽药注射20-30日龄健康鸡30只，每只颈部皮下注射3ml，设对照组，相同条件下饲养，观察15天，实验组鸡无异常。

Claims (9)

1.一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，按如下步骤制得：
（1）抗原的制备
A:组织匀浆液的制备：收集病患鸡的肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥除表面的结缔组织的脂肪，剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加1：1-10重量比的冷生理盐水，用组织捣碎机10000-15000r/min上下研磨15-30分钟，制成组织匀浆液；
B、冻融、过滤、除菌：组织匀浆液反复冻融3次后，离心后收集上清液，0.22μm微孔过滤除菌；
C、增殖：将步骤B所得上清液做5-15倍稀释，接种10日龄鸡胚尿囊腔内，每枚鸡胚接种0.2ml，37℃孵化4d后收获尿囊液；
（2）抗原EID50的测定
将所制得的抗原，一次做10倍稀释，进行鸡胚尿囊腔接种，每个稀释度接种0.1ml，做9个重复，同时设正常胚对照，置于37℃孵化48小时，弃掉24h内死亡胚，收获24h后死亡胚及48h活胚的尿囊液，进行HA价的测定，按照Reed-muench方法计算EID50；
（3）制备灭活疫苗
将所制得尿囊液，用生理盐水稀释至10-5-10-10EID50/0.1ml，用终浓度为0.3的甲醛在37℃下灭活24h，即为制苗用抗原，把抗原乳化制成油乳剂灭活疫苗，并进行灭活疫苗的安全检验；
（4）产蛋鸡的免疫
选取30周龄的健康产蛋鸡，用安全检验合格的灭活疫苗进行免疫，免疫程序为：
第一次免疫：每只鸡颈部皮下注射0.2ml；
第二次免疫：2周后，每只鸡颈部皮下注射0.4ml；
第三次免疫：2周后，每只鸡颈部皮下注射1ml；
（5）高免蛋的收集
产蛋鸡第三次免疫后10-14天，开始抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体效价，蛋黄与1.8%浓度的盐水按照体积比1：1稀释，然后按照体积比1：1加入6-8%的PEG6000溶液，保证溶液的盐浓度为0.9%、PEG6000浓度为3-4%，搅拌均匀后，常温放置1-2小时，然后3000rpm离线15-20分钟，取清液，测定HI效价，HI效价≥6即为合格，之后收集鸡蛋；
（6）提取抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体
A、鸡蛋消毒：将鸡蛋清洗干净，然后，浸入37-40℃的消毒液中消毒15-20分钟，取出晾干备用；
B、分离蛋黄：将已消毒晾干的鸡蛋打破后，充分去除蛋清、系带，收集蛋黄；
C、提取抗体：将蛋黄液与同体积PBS溶液混合后搅拌均匀，然后用6-8%的PEG6000溶液对混合液进行体积比1：1的混合均匀，然后静置2-3小时，然后3000rpm离心15-20分钟，收集上清液；
D、加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度体积比为0.05%加入甲醛，充分搅拌混合，密封1-2小时后加入终浓度重量比0.02%的稳定剂吐温-20，混合均匀；
E、过滤除菌：用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得到抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体生物制剂药物，主要成分为卵黄抗体；
F、安全检验，形成产品：用3只20g的小白鼠做安全性检验，每只小白鼠腹腔注射0.5ml步骤E所得抗体液，观察7天，无任何异常反应为合格。
2.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，所述病患鸡的肝脏可以是淋巴组织。
3.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，所述病患鸡是指剖检可见典型鸡心包积液-肝炎综合征症状的鸡，尤其是指同时可见心包积液和肝炎症状的鸡。
4.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，第（1）步骤中的B、C步骤可以是组织匀浆液反复冻融3次后，加入1倍生理盐水稀释混匀，再加入青链霉素双抗溶液，终浓度为200IU/ml。
5.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，进一步对第（1）步骤的抗原进行纯化，方法是：将收获尿囊液，盲传3代，收集尿囊液，即为纯化的病毒抗原。
6.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，所述第（3）步骤中的所述乳化是指先分别制备油相和水相，再按照体积比1-3混合乳化，其中,油相制备：取94份的10号柏油，6份司本-80，2份硬脂酸铝，先将硬脂酸铝与20-30份的柏油混合加热至70-80℃，再加入剩余的柏油和司本-80，充分搅拌混匀后分装，而后于121℃下灭菌30分钟，冷却后备用；水相制备，取96份抗原液，4份的吐温-80，混合均匀备用；乳化，按照3份油相、1份水相混合配制，先将油相加入乳化罐中50-60rpm搅拌，缓慢加入水相，然后调节转速至180-200rpm，搅拌5分钟，最后加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。
7.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，第（3）步骤中所述安全检验是指，用灭活的尿囊毒接种鸡胚，盲传3代，各代尿囊液均无血凝性，用大剂量灭活疫苗接种产蛋鸡，不影响产蛋率，试验鸡精神、食欲正常，接种局部未见溃烂。
8.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，第（5）步骤中所述产蛋鸡应为符合以下条件的商品蛋鸡：禽流感、新城疫感染为阴性；产蛋率90％以上的180日龄-400日龄蛋鸡；心包积液-肝炎综合征抗体检测阴性。
9.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，第（6）步骤中A步骤的消毒液可以是0.1%金保康溶液。
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