CN106563125B - 鸭甲肝病毒ⅲ型复合物活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗及其制备方法。本发明首先公开了一种鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,包括:由鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体制备的抗原抗体复合物和药学上可接受的冻干保护剂。本发明进一步公开了一种鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗的制备方法,包括:将由鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体制备的抗原抗体复合物和冻干保护剂混合,冷冻真空干燥,即得。本发明制备方法的抗体获得途径简单,生产成本低,所制备的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗能够突破母源抗体干扰,产生高的中和抗体效价,提高对雏鸭的保护率。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,还涉及一种鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗的制备方法,属于鸭甲肝病毒Ⅲ型抗原-抗体复合物疫苗的制备领域。
背景技术
鸭甲肝病毒(DHAV),属小RNA病毒科,禽肝炎病毒属。目前DHAV分为3个血清型,即:血清I型,血清Ⅱ型和血清Ⅲ型。其中血清I型为传统鸭肝炎病毒,血清Ⅱ型和血清Ⅲ型为近几年发现的新型病毒株,分别对应台湾新型和韩国新型,3个血清型之间无交叉反应。
鸭病毒性肝炎是由鸭甲肝病毒引起雏鸭的一种急性接触传染病,主要危害3周龄以内的雏鸭,死亡率高达90%。中国是世界上鸭饲养量最大的国家,尤其近几年养鸭业发展迅猛,鸭病毒性肝炎的危害日趋严重,给养鸭生产造成了很大的经济损失。随着DHAV I型鸡胚化弱毒疫苗、高免卵黄抗体的研制成功及临床应用,使本病在很大程度上得到很好的控制。但近几年,在中国山东、河北、广东等地免疫接种过DHAV I型弱毒疫苗或注射过DHAV I型高免卵黄抗体的鸭群中仍发生鸭肝炎,死亡率为20%-80%。经病毒分离鉴定为血清Ⅲ型,即韩国新型。因此,亟待研制一种能够有效预防鸭甲肝病毒Ⅲ型的活疫苗。由于该病毒主要危害3周龄以内的雏鸭,因此疫苗能否快速产生抗体及抗体效价达到保护水平是控制该疫病的关键。
抗原-抗体复合物疫苗(Antigen-Antibody Complex Vaccine,AACV),又称免疫复合物疫苗(Immune Complex Vaccine,ICV),是20世纪90年代新兴起的疫苗之一。它是指由特异性高免血清或抗体按照恰当的比例与相应抗原(如传染性病毒)混合而成,从某种程度上讲,这类疫苗兼有药物的治疗作用,因而又称之为治疗性疫苗。由于该种疫苗不但能抵抗病原微生物引起的持续性感染,而且还能突破母源抗体干扰,是目前为数不多的,可以在孵化期内接种的安全活苗,因而在动物疫病防控中备受关注。抗原抗体复合物疫苗中,抗体主要起着延缓病毒释放的作用,疫苗注射后,免疫复合物会被存在于脾脏的一种称为树突状淋巴细胞所捕获,继而抗原会缓慢释放。当母源抗体下降到疫苗可以突破的水平时,此时释放的疫苗抗原即可在靶器官定植,从而诱导免疫力。其优点在于安全性高,免疫效果比常规疫苗好;可突破母源抗体干扰,使用该类疫苗对其他疫苗免疫无干扰作用。
传统抗原抗体复合物疫苗的制作方法是将高免血清与病毒结合,该方法制备疫苗所需大量高免血清抗体,需通过屠杀大量动物获得,费时费力,同时生产成本较高,导致疫苗价格较昂贵。
卵黄抗体(egg yolk antibodies,IgY)的研究始于19世纪末20世纪初。1889年,Klemperer发现了卵黄中富含抗体;1934年,Jukes的实验证明了母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中,从而为雏鸡提供被动免疫保护。禽类卵黄中的抗体主要是卵黄免疫球蛋白,与血清抗体相比,卵黄抗体具有许多独特的优点:(1)无需采血,只需收集免疫种禽产下的蛋即可纯化得到卵黄抗体,符合现代动物保护规则。欧洲替代方法验证中心(ECVAM)建议以IgY代替哺乳动物IgG作为实验和生产抗体的来源;(2)有良好的稳定性,且耐热耐酸,常温下仍能保持一定的活性,鸡蛋贮存在4℃条件下6个月,IgY活性损失很小;(3)安全、无残留、温和环保;(4)在生产上还具有无可比拟的优越性:首先,产生有效免疫反应所需抗原量小,尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性;其次,每个蛋大约含100mg以上的IgY,一个月可达3g,相当于动物的10-20倍;卵黄中没有其他的Ig,易于提纯。
因此,开发一种由鸭甲肝病毒Ⅲ型病毒与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体制备的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,达到突破母源抗体干扰,产生更高的中和抗体效价,提高对雏鸭的保护率,对养鸭业将具有重要的意义和应用价值。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,该复合物活疫苗能够突破母源抗体干扰,产生高的中和抗体效价,提高对雏鸭的保护率;
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种所述鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗的制备方法,该方法操作简单,生产成本低。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:
本发明首先公开了一种鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,包括:由鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体制备的抗原抗体复合物和药学上可接受的冻干保护剂。
其中,所述抗原抗体复合物与冻干保护剂的体积比为1-3:1-3,优选为1:1。所述冻干保护剂由甘氨酸、明胶和水组成;优选的,按g/ml计,甘氨酸的终浓度为6%,明胶的终浓度为1.5%,余量为水。
本发明所述抗原抗体复合物的制备包括:将鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体进行混合、吸附,即得。其中所述混合的比例为:鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的体积比为1-3:1-3,优选为1:1;所述吸附的条件包括:37℃感作1小时。
作为本发明的优选技术方案,每毫升所述鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液中病毒含量≥107.0ELD50;所述鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的中和效价≥1:10240,优选为1:10240。
本发明所述鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株的微生物保藏编号为:CGMCCNo.9708(中国发明专利申请公布号CN 104498441 A);分类命名为:鸭甲肝病毒Ⅲ型。保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏时间是2014年09月28日;保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
本发明所述鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液的制备包括:培养鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株,收获病毒液,即得;优选的,将鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株接种9日龄SPF鸡胚,选择在孵育24-96小时之间死亡的鸡胚,取尿囊液和胚体进行研磨、冻融,然后离心取上清,即得。
本发明所述鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的制备包括:(1)用鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株免疫接种产蛋鸭,收集鸭蛋,分离卵黄;(2)将卵黄进行巴氏灭活,酸化萃取,然后过滤、浓缩,即得;优选的,步骤(1)当鸭蛋中鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体中和效价≥1:1024时,收集鸭蛋;步骤(2)所述巴氏灭活包括:将卵黄搅拌呈膏状,加入等体积醋酸缓冲液,搅拌均匀,65℃灭活30分钟;步骤(2)所述酸化萃取包括:取步骤(1)分离的卵黄体积6倍量的醋酸缓冲液,降温至1-4℃,加入经巴氏灭活后的卵黄液,搅拌至膏状,调pH值为5.2,2-8℃静置5-15小时,然后取上清液,加入辛酸至终浓度为0.3%(体积比),2-8℃静置6-20小时,取上清液,过滤,将滤液调pH值为7.2;其中,所述醋酸缓冲液的浓度为0.12mol/L,pH5.0。
本发明进一步公开了一种所述鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗的制备方法,包括以下步骤:将由鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体制备的抗原抗体复合物和冻干保护剂混合,冷冻真空干燥,即得。
免疫复合物产生的免疫刺激和免疫抑制与复合物配比过程中的抗原与抗体之比有关。本发明对鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的配比比例进行了筛选试验,卵黄抗体分别通过浓缩调试为1:2560、1:5120、1:10240、1:20480及1:40960五种不同中和效价,与病毒液按照体积比1:1混合制备5组抗原抗体复合物。检测结果显示,5组抗原抗体复合物的抗补体结合试验均为阳性,但其强度不同;其中抗体中和效价为1:10240、1:20480和1:40960三组的补体阳性反应最强;抗体中和效价为1:2560组复合物的病毒过量,1:20480和1:40960两组复合物的抗体过量。本发明进一步对上述5组抗原抗体复合物进行免疫筛选试验的结果表明,抗体中和效价为1:10240组免疫后14天的中和效价为1:159.8,明显高于其他组,而且攻毒保护率达到100%。因此,本发明确定复合物抗原抗体最佳配比为1:1,鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液病毒含量为107.0ELD50/ml,鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的中和效价为1:10240。
本发明所制备的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗对雏鸭的免疫保护率达到100%。一次单剂量试验证明,本发明鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗安全性良好;单剂量重复试验表明接种鸭只不会出现接种变态反应;超大剂量注射试验表明,本发明鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗的安全范围比较宽。本发明鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗与常规鸭甲肝病毒Ⅲ型活疫苗的比较试验表明,本发明复合物活疫苗免疫雏鸭14日后中和效价几何平均值达到1:162,常规疫苗为1:99。对于鸭肝炎病毒,中和抗体效价不低于1:64即可获得良好的保护,而本发明复合物活疫苗组的中和抗体效价几何平均值显著高于常规疫苗组。免疫攻毒试验结果表明,本发明复合物活疫苗对鸭甲肝病毒Ⅲ型具有良好的预防作用,保护率为100%。
本发明技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
本发明将鸡胚弱化毒DHAV-JS57株与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体按比例混合制备抗原抗体复合物活疫苗,能够有效预防Ⅲ型鸭病毒性肝炎病,对雏鸭的保护率达100%。与常规活疫苗比较,在相同免疫剂量的条件下,本发明鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗产生中和抗体效价几何平均值显著高于常规疫苗组,能够对雏鸭提供更好的保护作用。另外,本发明制备的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,安全性良好,安全范围较宽。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义,否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物,其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡,并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分,包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体,或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体,或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗,或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的,不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 病毒与卵黄抗体配比筛选及检测试验
1、病毒原液制备
1.1 接种
用灭菌生理盐水将鸭甲肝病毒Ⅲ型JS57株(微生物保藏编号为:CGMCC No.9708)作1000倍稀释,9日龄SPF鸡胚每胚尿囊腔接种0.2ml,接种后封闭针孔,置37℃继续孵育,不必翻蛋。
1.2 孵育和观察
接种24小时后,每4小时照蛋1次,直到96小时。取24~96小时死亡的鸡胚,置2~8℃冷却。
1.3 收获
将冷却4~24小时的鸡胚,用无菌手术取绒毛尿囊膜、胎儿、胚液及羊水,每若干个混为一组,置于灭菌瓶中。在收获的同时,应逐个检查鸡胚,如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。
2、鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的制备
2.1 产蛋鸭的免疫
2.1.1 基础免疫接种
将产蛋鸭肌肉多点注射鸭甲肝病毒Ⅲ型JS57株油佐剂免疫原(简称免疫原),2.0ml/只。
2.1.2 加强免疫接种
在基础免疫后21日进行第2次接种,肌肉多点注射免疫原,2.0ml/只。
2.1.3 强化免疫接种
在加强免疫后21日进行第3次接种,肌肉多点注射免疫原,2.0ml/只。
2.1.4 维持免疫接种
在强化免疫接种后根据抗体效价,每隔2~3个月再肌肉多点注射免疫原,2.0ml/只。
2.2 高免蛋收集
产蛋鸭强化免疫接种结束后第10日开始,每隔5日抽样测定卵黄中的抗体中和效价。当鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体效价不低于1:1024时,收集鸭蛋,置2~8℃贮存,贮藏时间应不超过10日。
2.3 鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体制备
2.3.1 蛋壳消毒
将鸭蛋浸入1‰二氯异氰尿酸钠水溶液中消毒15分钟。
2.3.2 分离卵黄
采用手工或机械打蛋,打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带,收集卵黄。
2.3.3 巴氏灭活
充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状,加入等体积醋酸缓冲液(0.12mol/L,pH5.0),搅拌均匀后,65℃加热灭活30分钟。
2.3.4 酸化萃取
在酸化罐中加入原蛋黄体积6倍量的醋酸缓冲液(0.12mol/L,pH5.0),降温至1~4℃,再加入巴氏灭活后的蛋黄液,充分搅拌,使其呈均匀膏状。调至pH值5.2,2~8℃静置5~15小时。吸取上清液,缓慢加入辛酸至终浓度为0.3%(体积比),2~8℃静置6~20小时。取上清液过滤,滤液调至pH值7.2。
2.3.5 过滤、浓缩
取萃取的卵黄液用孔径为1μm和0.45μm的筒式滤芯过滤澄清,再经截留分子量为100kDa超滤膜包浓缩。再经孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。
3、抗原抗体复合物制备
卵黄抗体分别通过浓缩调试为5种不同中和效价,分别为1:2560、1:5120、1:10240、1:20480及1:40960,将制备好的病毒原液和不同效价的卵黄抗体按照体积比1:1混合,以方阵法进行复合。复合物于37℃水浴感作1小时后生成抗原抗体复合物。
4、配比筛选
4.1 抗原抗体复合物检测试验
将上述制备的5组抗原抗体复合物以复合前的抗原或抗体作对照进行复合物的ELD50、中和效价及抗补体结合试验等检测。检测结果(表1)显示,5组复合物的抗补体结合试验均为阳性,但其强度不同,其中第3组、第4组及第5组的补体阳性反应最强;第1组复合物病毒含量为101.17ELD50/ml,表明第1组复合物病毒过量,其余4组复合物病毒含量为阴性;第4组和第5组复合物的中和效价分别为1:245.2及1:12260,表明第4组和第5组复合物的抗体过量,其余3组复合物中和效价为阴性。
表1 抗原抗体复合物检测试验结果
注:表中“-”表示检测结果为阴性;“+”表示检测结果为阳性。
4.2 免疫筛选试验
将上述配制的5组抗原抗体复合物进行免疫筛选试验。取3~5日龄雏鸭60只,随机均分6组,每组10只。将5个配比组合复合物各免疫一组,另设l组攻毒对照。免疫后第14天,各组抽样采血分离血清后,雏鸭颈部皮下注射鸭甲型肝炎病毒检验用强毒株,每只0.5ml(含100LD50)。观察10天,记录结果。血清做中和试验,中和效价的检测方法采用固定病毒稀释血清法(B法),实验结果用Reed-Muench法统计计算,测定被检血清的50%中和效价(PD50)。结果见表2。
表2 抗原抗体复合物检测试验结果
注:表中“-”表示检测结果为阴性。
免疫复合物产生的免疫刺激和免疫抑制与复合物配比过程中的抗原与抗体之比有关。抗原抗体复合物能使B淋巴细胞、T淋巴细胞明显增加,抗体反应也加强。免疫复合物中抗原量稍过剩或抗原与抗体等量时,可以看到免疫增强或出现快速免疫反应。等量比例时是因为接种后病毒能复制;不等量时则由于结合的抗原比单个的抗原对免疫系统细胞的作用更有效。抗体过量时,则会发生淋巴细胞的免疫刺激受阻,造成免疫抑制。根据抗原抗体复合物检测试验及免疫试验,确定本发明复合物抗原抗体最佳配比为体积比1:1,病毒含量107.0ELD50/ml,抗体中和效价1:10240。
实施例2 鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗的制备
1、病毒原液制备
1.1、生产用毒种制备
取9日龄SPF鸡胚,接种基础毒种(即鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株(微生物保藏编号为:CGMCC No.9708)),37℃孵育,每天照胚2~4次,观察4d,弃去24h以内死亡鸡胚,将96h以内死亡的鸡胚,取尿囊液及胚体保存和作无菌检验,并观察胎儿病变。反复冻融3次,4,000rpm离心30min,吸取上清,定量分装于玻瓶内,置-80℃冰箱内保存,按生产种子批指定的检验标准进行检验,即得生产毒种。毒种继代应不超过2代。
1.2、制苗用毒液的制备
1.2.1 接种
用灭菌生理盐水将生产用毒种作1000倍稀释,9日龄SPF鸡胚每胚尿囊腔接种0.2ml,接种后封闭针孔,置37℃继续孵育,不必翻蛋。
1.2.2 孵育和观察
接种24小时后,每4小时照蛋1次,直到96小时。取24~96小时死亡的鸡胚,置2~8℃冷却。
1.2.3 收获
将冷却4~24小时的鸡胚,用无菌手术取绒毛尿囊膜、胎儿、胚液及羊水,每若干个混为一组,置于灭菌瓶中。在收获的同时,应逐个检查鸡胚,如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。
1.3、半成品检验
1.3.1 无菌检验
将收获的半成品分组取样,按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长。
1.3.2 病毒含量测定
将收获的混合病毒液用灭菌生理盐水作10-5、10-6、10-7、10-8稀释,每个稀释度用5个鸡胚,每胚尿囊腔接种0.2ml。观察和记录24~96小时鸡胚病变及死亡情况。每毫升病毒含量应≥107.0ELD50。
2、鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的制备
2.1 产蛋鸭的免疫
2.1.1 基础免疫接种
将产蛋鸭肌肉多点注射鸭甲肝病毒Ⅲ型JS57株油佐剂免疫原(简称免疫原),2.0ml/只。
2.1.2 加强免疫接种
在基础免疫后21日进行第2次接种,肌肉多点注射免疫原,2.0ml/只。
2.1.3 强化免疫接种
在加强免疫后21日进行第3次接种,肌肉多点注射免疫原,2.0ml/只。
2.1.4 维持免疫接种
在强化免疫接种后根据抗体效价,每隔2~3个月再肌肉多点注射免疫原,2.0ml/只。
2.2 高免蛋收集
产蛋鸭强化免疫接种结束后第10日开始,每隔5日抽样测定卵黄中的抗体中和效价。当鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体效价不低于1:1024时,收集鸭蛋,置2~8℃贮存,贮藏时间应不超过10日。
2.3鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄制备
2.3.1 蛋壳消毒
将鸭蛋浸入1‰二氯异氰尿酸钠水溶液中消毒15分钟。
2.3.2 分离卵黄
采用手工或机械打蛋,打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带,收集卵黄。
2.3.3 巴氏灭活
充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状,加入等体积醋酸缓冲液(0.12mol/L,pH5.0),搅拌均匀后,65℃加热灭活30分钟。
2.3.4 酸化萃取
在酸化罐中加入原蛋黄体积6倍量的醋酸缓冲液(0.12mol/L,pH5.0),降温至1~4℃,再加入巴氏灭活后的蛋黄液,充分搅拌,使其呈均匀膏状。调至pH值5.2,2~8℃静置5~15小时。吸取上清液,缓慢加入辛酸至终浓度为0.3%(V/V),2~8℃静置6~20小时。取上清液过滤,滤液调至pH值7.2。
2.3.5 过滤、浓缩
取萃取的卵黄液用孔径为1μm和0.45μm的筒式滤芯过滤澄清,再经截留分子量为100kDa超滤膜包浓缩。再经孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。
2.4 半成品检验
2.4.1 无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长。
2.4.2 效价测定
按中和试验方法进行抗体效价测定。鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体中和效价应不低于1:10240。
3、抗原抗体复合物制备
将制备好的病毒原液和鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体按照体积比1:1混合,复合物于37℃水浴感作1小时后生成抗原抗体复合物。
4、配苗与分装
保护剂的制备:甘氨酸12g加入纯水定容至100ml,0.22μl滤器过滤除菌;明胶3g加入纯水定容至100ml,116℃高压25min,两者混合即为冻干保护剂。
将抗原抗体复合物中加入等量体积的冻干保护剂,充分混合,定量分装。每羽份含DHAV≥104.0ELD50。
5、冻干
分装后立即进行冷冻真空干燥,按2000版《规程》附录437页进行。实施例3鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗成品检验
检验本发明实施例2制备的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗成品。
1、物理性状
呈淡红色海绵状疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后迅速溶解。
2、无菌检验
按《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长。
3、支原体检验
按《中国兽药典》附录进行检验,应无支原体生长。
4、外源病毒检验
按《中国兽药典》附录进行检验,应无外源病毒污染。
5、安全性检验
用1日龄健康易感鸭5只,每只肌肉注射0.1ml(含10个使用剂量),无临床反应,观察10日,5/5鸭健活,疫苗判为合格。
6、效力检验
用1~3日龄健康易感鸭10只,其中5只肌肉注射0.1ml(含1个使用剂量),14日后,10只鸭采血、分离血清,进行抗DHAVⅢ型中和抗体测定,免疫鸭抗DHAVⅢ型中和抗体均不低于1:64,对照鸭5只抗DHV中和抗体均为阴性,疫苗效力检验判为合格。
7、剩余水分测定
按《中国兽药典》附录进行检验,应符合规定。
8、真空度测定
按《中国兽药典》附录进行检验,应符合规定。
实施例4鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗的应用
使用按照实施例2方法制备的三批活疫苗进行免疫试验,批号:201501、201502、201503。
1、不同批次的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗对雏鸭免疫试验
使用三批鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,按1羽份/只接种1日龄易感雏鸭,免疫组30只/组;同时设攻毒对照10只。接种后14日攻击检验用强毒DHAV-JS株(微生物保藏编号为:CGMCC No.6852),每只0.5ml(含100LD50),观察10日,结果见表3。结果显示,本发明制备的活疫苗对鸭甲肝病毒Ⅲ型具有良好的预防作用,三批疫苗的免疫试验能保护90/90,保护率为100%。
表3 不同批次疫苗的免疫试验结果
注:分母为试验数,分子为存活数。
2、鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗安全性试验
2.1 一次单剂量注射的安全试验
使用三批鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,各颈部皮下一次性接种1日龄鸭1羽份/只,10只/组;同时设对照10只。观察10天,接种鸭是否发病,每组随机解剖2只,记录肉眼病理变化和肝脏的病理组织学变化。结果见表4。结果显示:雏鸭均健活,剖解无异常症状出现、无肉眼病理变化和肝脏的病理组织学损伤。一次单剂量试验说明,本发明制备的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗安全性良好。
表4 一次单剂量注射的安全试验结果
2.2 单剂量重复注射安全试验
使用三批鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,1日龄鸭颈部皮下注射,1羽份/只,10只/组;同时设对照10只。14天后再次注射1羽份/只,观察10天,接种鸭是否发病,每组随机解剖2只,记录肉眼病理变化和肝脏的病理组织学变化。结果见表5。结果显示:1日龄鸭初次免疫,14天后加强免疫,接种鸭均健活,剖解无异常症状出现、无肉眼病理变化和肝脏的病理组织学损伤;单剂量重复试验说明接种鸭只不会出现接种变态反应。
表5 单剂量重复注射安全试验结果
2.3 一次超剂量注射的安全试验
使用三批鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,各颈部皮下一次性接种1日龄鸭100羽份/只,10只/组;同时设对照10只。观察10天,接种鸭是否发病,每组随机解剖2只,记录肉眼病理变化和肝脏的病理组织学变化。结果见表6。结果显示:100羽份/只超大剂量注射,1日龄30只接种鸭均健活,剖解无异常症状出现、无肉眼病理变化和肝脏的病理组织学损伤。一次性超剂量试验说明本发明制备的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗安全范围比较宽。
表6 大剂量注射安全试验结果
3、鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗与常规鸭甲肝病毒Ⅲ型活疫苗的比较试验
取3~5日龄易感雏鸭30只,随机分组,10只/组。第一组为复合物疫苗组,颈部皮下注射接种鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗0.1ml/只(含1羽份);第二组为常规疫苗组(按中国发明专利申请公布号CN 104498441A制备的鸭甲肝病毒Ⅲ型活疫苗,哈药集团生物疫苗有限公司制备),颈部皮下接种常规鸭甲肝病毒Ⅲ型活疫苗0.1ml/只(含1羽份);第三组为空白对照组。免疫后14天各组采血,分离血清,测定中和效价。采血后各组攻击检验用强毒DHAV-JS株(微生物保藏编号为:CGMCC No.6852),每只0.5ml(含100LD50),观察10日,结果见表7。结果显示,本发明制备的复合物疫苗免疫雏鸭14日后中和效价几何平均值达到1:162,常规疫苗为1:99,对于鸭肝炎病毒,中和抗体效价不低于1:64即可获得良好的保护,两种疫苗免疫后14日中和抗体效价几何平均值均高于1:64,复合物疫苗组中和抗体效价几何平均值显著高于常规疫苗组;免疫攻毒试验结果表明,复合物疫苗对鸭甲肝病毒Ⅲ型具有良好的预防作用,30/30保护,保护率为100%;常规疫苗对鸭甲肝病毒Ⅲ型同样具有良好的预防作用,29/30保护,保护率为96.7%,略低于复合物疫苗。
表7 复合物疫苗与常规疫苗效力比较试验结果
注:表中“-”表示检测结果为阴性。
Claims (12)
1.一种鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,包括:由鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体制备的抗原抗体复合物和药学上可接受的冻干保护剂;鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的体积比为1:1,每毫升所述鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液中病毒含量=107.0ELD50;所述鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的中和效价为1:10240。
2.按照权利要求1所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,所述抗原抗体复合物与冻干保护剂的体积比为1-3:1-3。
3.按照权利要求2所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,所述抗原抗体复合物与冻干保护剂的体积比为1:1。
4.按照权利要求1所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,所述抗原抗体复合物的制备包括:将鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体进行混合、吸附,即得。
5.按照权利要求4所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,所述吸附的条件包括:37℃感作1小时。
6.按照权利要求1所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,所述鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株的微生物保藏编号为:CGMCC No.9708。
7.按照权利要求1或2所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于:所述冻干保护剂由甘氨酸、明胶和水组成;按g/ml计,甘氨酸的终浓度为6%,明胶的终浓度为1.5%,余量为水。
8.按照权利要求1或4所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,所述鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液的制备包括:培养鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株,收获病毒液,即得。
9.按照权利要求8所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,
将鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株接种9日龄SPF鸡胚,选择在孵育24-96小时之间死亡的鸡胚,取尿囊液和胚体进行研磨、冻融,然后离心取上清,即得。
10.按照权利要求1或4所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,所述鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体的制备包括:(1)用鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株免疫产蛋鸭,收集鸭蛋,分离卵黄;(2)将卵黄进行巴氏灭活,酸化萃取,然后过滤、浓缩,即得。
11.按照权利要求10所述的鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗,其特征在于,步骤(1)当鸭蛋中鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体中和效价≥1:1024时,收集鸭蛋;
步骤(2)所述巴氏灭活包括:将卵黄搅拌呈膏状,加入等体积醋酸缓冲液,搅拌均匀,65℃灭活30分钟;
步骤(2)所述酸化萃取包括:取步骤(1)分离的卵黄体积6倍量的醋酸缓冲液,降温至1-4℃,加入经巴氏灭活后的卵黄液,搅拌至膏状,调pH值为5.2,2-8℃静置5-15小时,然后取上清液,加入辛酸至终浓度为0.3%,2-8℃静置6-20小时,取上清液,过滤,将滤液调pH值为7.2;
其中,所述醋酸缓冲液的浓度为0.12mol/L,pH 5.0。
12.一种权利要求1所述鸭甲肝病毒Ⅲ型复合物活疫苗的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将由鸭甲肝病毒Ⅲ型鸡胚弱化毒株JS57株病毒液与鸭抗鸭甲肝病毒Ⅲ型卵黄抗体制备的抗原抗体复合物和冻干保护剂混合,冷冻真空干燥,即得。
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