CN106190991B - 一种禽脑脊髓炎病毒、灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种禽脑脊髓炎病毒、灭活疫苗及其制备方法，涉及生物工程领域。本发明提供禽脑脊髓炎病毒HM08株及其灭活疫苗。本发明还提供制备禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液的方法及灭活疫苗的制备方法。本发明禽脑脊髓炎病毒HM08株，在SPF鸡胚中增殖，0.2ml病毒液中病毒含量大于10^7.0ELD₅₀，且具有优良的免疫原性，交叉保护性好，含有灭活的所述禽脑脊髓炎病毒HM08株的灭活疫苗，免疫后抗体水平高、持续时间长，保护率高，交叉保护性好，能较好地控制禽脑脊髓炎疾病的发生与流行。

Description

一种禽脑脊髓炎病毒、灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种禽脑脊髓炎病毒、灭活疫苗及其制备方法。

背景研究

禽脑脊髓炎(AE)是由禽脑脊髓炎病毒(AEV)引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病，表现为运动失调、头颈震颤和后趾麻痹等神经症状，特别是头和颈部的震颤。4周龄以下雏鸡感染AEV后，发病率一般为20％～60％，死亡率平均为25％，也可超过50％；成年鸡感染不表现神经症状，但可引起一过性产蛋下降，下降幅度为16％～43％，有的高达60％以上，但不出现神经症状，约两周后产蛋可恢复正常。但此时期所产的种蛋高度带毒，在孵化时呈现两种趋势：一部分鸡胚在孵化后期死亡；另一部分虽可孵化出壳，但在出壳时或出壳后数天内即能表现症状，这些雏鸡的粪便中带有大量病毒，能造成其他雏鸡的感染。禽脑脊髓炎在全世界均有发生，易感鸡群在一年四季均可发病，冬春发生较多。目前，本病在我国流行日趋严重。控制本病有效的方法就是给鸡群免疫接种，通过母源抗体给仔鸡获得保护。AE疫苗有活疫苗和灭活疫苗，虽然活疫苗经济、省力，对控制AE能够起到一定作用。然而，由于AEV本身不仅能垂直传播还能水平传播的特点，活毒很容易造成雏鸡和种蛋鸡一过性发病，也会人为造成环境污染，给养禽业带来严重后果。为了避免活疫苗所带来的问题，国内外学者作了大量灭活疫苗相关研究工作，研制成功AE灭活疫苗。但是，现有AE灭活疫苗，抗原增殖滴度不高(10^6.0EID₅₀/0.2ml左右)，且分离年代早，对流行毒株交叉保护力下降，免疫持续期短，对当前养殖生产中AE防疫效果不理想。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种禽脑脊髓炎病毒HM08株，保藏号为：CGMCCNO.7759，该毒株在SPF鸡胚中增殖，0.2ml病毒液中病毒含量大于10^7.0ELD₅₀，且具有优良的免疫原性，交叉保护性好。

本发明的另一目的是提供禽脑脊髓炎病毒HM08株的制备方法，该方法简单、安全、高效，抗原增殖滴度较高。

本发明的再一目的是提供一种禽脑脊髓炎灭活疫苗，含有灭活的所述禽脑脊髓炎病毒HM08株，该毒株在SPF鸡胚中增殖，病毒含量大于10^7.0EID₅₀/0.2ml，上述禽脑脊髓炎灭活疫苗免疫后抗体水平高、持续时间长，保护率高，交叉保护性好，能较好地控制禽脑脊髓炎疾病的发生与流行。

本发明还提供所述禽脑脊髓炎灭活疫苗的制备方法，该方法简单，安全，成本低。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

本发明提供一种禽脑脊髓炎病毒HM08株，保藏号为：CGMCCNO.7759。

本发明还提供一种禽脑脊髓炎灭活疫苗，含有灭活的所述禽脑脊髓炎病毒HM08株。

优选的技术方案中，所述灭活疫苗为油乳剂灭活疫苗。

本发明还提供制备禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液的方法，采用SPF鸡胚增殖所述禽脑脊髓炎病毒HM08株，得到禽脑脊髓炎病毒HM08株毒液。

优选的技术方案中，将所述禽脑脊髓炎病毒HM08株接种SPF鸡胚，收获病变鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜和胚体，匀浆，破碎细胞，离心取上清液，得到禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液。

本发明还提供一种所述禽脑脊髓炎灭活疫苗的制备方法，包括：

(1)采用甲醛灭活禽脑脊髓炎病毒HM08株毒液；

(2)将注射用白油和司本-80按照体积比94：6混合混匀，作为油相溶液；

(3)将灭活的禽脑脊髓炎病毒HM08株毒液和吐温-80按照体积比96：4混合均匀，作为水相溶液；

(4)乳化：将油相溶液和水相溶液按照体积比2～4:1混和均匀、乳化，即获得所述禽脑脊髓炎灭活疫苗。

优选的技术方案中，所述灭活疫苗中甲醛的体积百分浓度为0.15％-0.25％。

优选的技术方案中，0.2ml禽脑脊髓炎病毒HM08株毒液中禽脑脊髓炎病毒HM08株的含量≥10^7.0EID₅₀。

有益效果：本发明禽脑脊髓炎病毒HM08株在鸡胚上培养，毒价高，0.2ml病毒液中病毒含量≥10^7.0EID₅₀,免疫原性好，交叉保护性好，对鸡和环境均安全。本发明禽脑脊髓炎灭活疫苗，免疫后抗体水平高、持续时间长，保护率高，交叉保护性好，能较好地控制禽脑脊髓炎疾病的发生与流行，显著提高养禽生产的经济效益。

附图说明

图1RT-PCR扩增电泳结果，1是Marker DL 2000,2是VP1基因扩增产物,3是VP2基因扩增产物。

具体实施方式

实施例1禽脑脊髓炎HM08株的筛选与鉴定

1.病毒的分离

将具有禽脑脊髓炎病理特征的病雏处死，无菌采集病、死雏鸡脑组织后混合，反复冻融3次后在无菌容器中研磨，用PBS缓冲液制成1∶3的悬液，按1000IU/ml加入青霉素、链霉素，经3000r/min离心20分钟后，取上清液，经卵黄囊接种6日龄的SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育。孵化至18日龄，观察鸡胚病变，如接种后12日内未出现明显病变，将胚脑取出，匀浆，用同批尿囊液或PBS缓冲液按1∶3制成悬液，置灭菌的容器中冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，进行下一代传代培养。若出现鸡胚病变后，收获典型病变鸡胚的脑组织混合，匀浆，用同批尿囊液或PBS缓冲液按1∶3(体积比)制成悬液，置灭菌的容器中冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，-20保存备用。

2.禽脑脊髓炎病毒有限稀释法纯化

将本实施例标题1中病变鸡胚脑组织处理后得到的上清液，按1∶10、1∶100、1∶1000倍稀释，分别经卵黄囊接种6日龄的SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育。孵化至18日龄，观察鸡胚病变。弃去72小时以内的死亡鸡胚。收获72小时以后的、具有发育迟缓、矮小、脑部水肿、肌肉进行性萎缩、脚趾变形和槟榔肝等AE特征性病变的鸡胚。选取接种最高稀释倍数的上清液、且在12日内出现典型禽脑脊髓炎病变的鸡胚脑组织，混合、匀浆，用同批尿囊液按体积比为1∶3混合制成悬液，置灭菌的容器中反复冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，再次同上法处理，卵黄囊接种6日龄的SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育，孵化至18日龄，观察鸡胚病变。收获典型病变鸡胚的脑组织混合，匀浆，与2倍体积的同批尿囊液混合，制成悬液，置灭菌的容器中冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，用于病毒进一步纯化，直至同批脑组织悬液不同稀释度接种鸡胚后发病率均达到100％，得到E1代种毒。

3.E1代种毒对鸡胚的毒力

将E1代种毒作1∶100倍稀释，经卵黄囊途径接种6日龄的SPF鸡胚20枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃继续孵育。定时照蛋，及时取出死亡胚。观察接种12天后出现鸡胚活性减弱、发育不良、矮小、肌肉萎缩、脚趾变形和槟榔肝等AE特征性病变。结果如表1。20枚胚中24小时死亡胚有3枚；至接种12天后，有8枚死亡，9枚活胚，且均出现发育不良、矮小、肌肉萎缩、脚趾变形、槟榔肝等AE特征性病变，病变率达100％。

表1 E1代种毒对鸡胚的毒力测定结果

4.种毒对雏鸡的毒力

用不同含量的E1代种毒病毒液，脑内分别接种1日龄、7周龄的SPF鸡，每只鸡接种后观察21天统计AE典型症状的发病率，结果表明：攻毒剂量为200EID₅₀、500EID₅₀、1000EID₅₀/0.03ml/只，对1日龄的SPF鸡，接种后7～14天出现精神沉郁、站立不稳、喜卧、瘫痪和共济失调等AE典型的神经症状，AE典型症状的发病率分别可以达到10/10、10/10、10/10；对7周龄的SPF鸡，攻毒剂量为200EID₅₀、500EID₅₀、1000EID₅₀/0.03ml/只，接种后7～19天出现精神沉郁、站立不稳、喜卧、瘫痪和共济失调等AE典型的神经症状，AE典型症状的发病率分别达到8/10、10/10、10/10。

5.毒种的传代

将E1代种毒病毒液进行1∶100倍稀释后，经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚10枚，每胚接种0.2ml。接种后，置37℃继续孵化，每8小时照蛋一次，及时取出死亡胚，弃去72小时以内的死亡鸡胚，收获72小时以后的死亡鸡胚或具有AE特征性病变的鸡胚：鸡胚发育迟缓、矮小、脑部水肿、肌肉进行性萎缩、脚趾变形和槟榔肝。从72小时以后的死亡鸡胚和具有AE特征性病变的鸡胚中收集脑组织混合，用同批尿囊液按体积比为1∶3混合制成悬液，匀浆，置灭菌的容器中反复冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，分装，标记为E2代种毒。病毒如此反复传到E15代。

6.种毒病毒含量测定

测量各代次种毒的病毒含量。用灭菌生理盐水将种毒作10倍稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6这4个稀释度，每个稀释度经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚5枚，每胚接种0.2ml。接种后，置37℃继续孵化，每8小时照蛋一次，及时取出死亡胚，弃去72小时以内的死亡鸡胚，视72小时以后的死亡鸡胚或具有下列症状之一：鸡胚发育迟缓、矮小、脑部水肿、肌肉进行性萎缩、脚趾变形和槟榔肝为AE病变。根据鸡胚死亡及病变个数，按Reed—Muench法计算病毒含量。各代次种毒的病毒含量见表2。

表2各代次种毒病毒含量测定结果

7.E15代种毒特异性试验

用生理盐水将E15代种毒稀释为10⁴EID₅₀/0.2ml，与等量抗AE特异性血清和阴性血清分别混合，37℃作用60分钟，经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚各5枚，同时设病毒对照组、阳性血清对照组、阴性血清对照组和生理盐水对照组，同条件观察12天，判定结果。

特异性试验分组及结果如表3所示，接种后连续观察12天，病毒中和组、阴、阳性血清对照组、空白对照组一致，鸡胚均活，未出现鸡胚病变；病毒对照组和阴性血清中和组鸡胚AE典型症状的病变率均达100％。特异性试验结果说明E15代种毒是禽脑脊髓炎病毒。

表3 E15种毒代特异性检测

8.无菌检验按照现行《中国兽药典》附录进行检验。E15代种毒分别接种TG小瓶，37℃培养3天，无菌生长。转种的TG小管、GP小管、GA斜面培养5天后均无菌生长。接种支原体液体培养基、再转接固体培养基，观察结束均阴性。鸡胚外源性病毒检测，特异性血清中和后接种鸡胚无一死亡，尿囊腔、尿囊膜HA价均为零。细胞外源性病毒检测，禽网状内皮组织增生症病毒、禽白血病病毒、红细胞吸附试验均为阴性。

9.E15代种毒的PCR检测

根据GenBank上公布的AEV病毒基因序列，针对保守基因VP1和VP2分别设计了1组引物。针对基因VP1的上游引物：GGACAAGGAACCACAGGGAC，下游引物：

TCCAGTGGCGTGTAGAAAGG。针对基因VP2的上游引物：

ACGGTAGACCAGAGTTCAGTTAG，下游引物：ATGGCACCTTCATCCTTACA。

将E15代种毒用0.1mol/L PBS(pH 7.2)缓冲液按1：3稀释,反复冻融3次,5000r/min离心20分钟,取上清。用Trizol试剂(Gibco公司产品)从上清液中抽提RNA。提取出的RNA用经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水溶解,用于合成第一条cDNA链。

用5μl RNA作为模板,使用延长反转录试剂盒合成cDNA第一条链。分别用基因VP1或VP2引物进行PCR扩增。PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳,用DNA分子质量标准确定产物的大小。

扩增的片段送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。采用DNAStar软件对测得的VP1基因的核苷酸序列和VP2基因序列进行分析,并分别与GenBank中AEV毒株的相应序列进行比较。图1可见，VP1扩增片段约510bp，VP2扩增片段约420bp，与目的片段大小吻合。VP1扩增片段与GenBank中AY275539.1、AY466473.1、AY517471.1、JN986828.1的同源性分别为94.2％、99.8％、99.8％、94％。VP2扩增片段与GenBank中EU327593.1、AY275539.1、AY517471.1的同源性分别为81％、98.6％、100％。因此，PCR检测结果也证明E15代种毒是禽脑脊髓炎病毒。

10.红细胞凝集价测定：用灭菌生理盐水将E15代种毒作2倍梯度稀释，进行红细胞凝集价测定.结果均为阴性。

11.免疫原性：以E15代种毒制备疫苗，将疫苗以不同免疫剂量颈部皮下注射21日龄SPF鸡10只，设同日龄SPF鸡5只对照，免疫3周后用AEV同源毒株脑内接种攻毒(每只鸡剂量为1000个EID₅₀)，观察14～21天，结果免疫鸡全部保护，对照鸡全部发病。结果说明此病毒的免疫原性好。

将E15代种毒命名为禽脑脊髓炎病毒HM08株。

保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

分类命名：禽脑脊髓炎病毒。

参椐的生物材料：HM08株。

保藏号：CGMCC NO.7759。

保藏日期：2013年6月20日。

实施例2禽脑脊髓炎灭活疫苗的制备

1.制苗用材料的选择 选择发育良好的5-6日龄SPF鸡胚作为制苗用材料。

2.制苗用病毒液的制备

2.1接种 取禽脑脊髓炎病毒HM08株，用灭菌PBS缓冲液稀释，卵黄囊接种5～6日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml(1000EID₅₀)，置37℃孵育，不必翻蛋。

2.2.孵育和观察 前3日内，每天照蛋一次，弃去死亡胚；3日后，每8个小时照蛋一次，及时取出死亡胚，置2-8℃。

2.3收获 孵化致16日龄，将鸡胚全部取出，置2-8℃过夜。用强力碘消毒蛋壳气室部位经75％酒精二次消毒后，以无菌方法去除蛋壳，分别收集具有AE特征性病变鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜(CAM)和胚体。将绒毛尿囊膜(CAM)和胚体用组织捣碎机匀浆，用收获的鸡胚尿囊液与无菌PBS或生理盐水作为稀释液，按体积比1:2(组织1份，稀释液2份)制成悬液，冻融3次后，置灭菌容器中，3000转离心20分钟，取上清作为禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液，置-25℃备用。

其中，AE特征性病变鸡胚是指：72小时以后的死亡鸡胚或具有下列症状之一的鸡胚：鸡胚发育迟缓、矮小、脑部水肿、肌肉进行性萎缩、脚趾变形和槟榔肝。

2.4病毒含量测定 取禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液少许，按实例1病毒含量测定方法进行测定，0.2ml病毒液中病毒含量≥10^7.0EID₅₀。

2.5灭活向检验合格(病毒含量≥10^6.0EID₅₀/ml为合格)的病毒液中，加入体积百分浓度为10％的甲醛溶液，使甲醛终浓度为0.2％(体积百分浓度)，置37℃恒温摇床中摇振灭活24小时(以瓶内的温度到达37℃开始计时)，灭活后的病毒液置2-8℃保存。

3.半成品检验

3.1无菌检验 参照实例1的无菌检验进行。

3.2灭活检验 取5-6日龄SPF鸡胚10个，每胚卵黄囊接种灭活后的病毒液0.2ml，继续孵化至18日龄，剖检，应无AE病变。取上述鸡胚的脑，按1:3(体积比)制成悬液，再接种5-6日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml，孵化至18日龄，剖检，应无AE病变。

4.油佐剂灭活疫苗的制备

4.1油相制备 94体积份注射用白油、6体积份司本-80，加入油相罐中，加热搅拌混匀，经121℃灭菌30分钟，冷却至室温，得到油相。

4.2水相制备 取96体积份灭活后的禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液，加入4体积份吐温-80，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，得到水相。

4.3乳化 将3体积份油相放入乳化罐内，启动乳化罐搅拌机搅拌，同时徐徐加入1体积份水相，加完后继续搅拌10～15min，打开均质机进出口开关，启动均质机，使乳化液经均质机进入另一罐，如此反复乳化数次(一般6～8次)，得到禽脑脊髓炎灭活疫苗。取10ml灭活疫苗，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层现象。

该禽脑脊髓炎灭活疫苗，每羽份(0.3ml)的抗原含量应≥10^5.0EID₅₀。实际生产过程中，根据病毒液实际病毒含量，可以采用生理盐水对病毒液进行适当的稀释，只要保证最终的灭活疫苗中，每羽份(0.3ml)的抗原含量≥10^5.0EID₅₀即可。

5.作用与用途 禽脑脊髓炎灭活疫苗用于预防禽脑脊髓炎。7日龄以上鸡均可免疫接种，接种后14日产生免疫力，免疫期为10个月。

6.用法与用量 每只鸡颈部皮下注射0.3ml。

实例3禽脑脊髓炎灭活疫苗免疫效力试验

按实施例2中方法制备禽脑脊髓炎灭活疫苗(批号：20120501、20130201、20140401)并按下列方法进行成品的效力检验。各批号灭活疫苗中HM08株的病毒含量均为10^5.0EID₅₀/羽。

1.血清学效力检验：每批苗取1月龄SPF鸡15只，其中10只作为免疫组，每只SPF鸡颈部皮下注射0.3ml灭活疫苗；另5只作为对照组，不免疫。免疫后21天采血，分离血清，参照现行《中国兽药典》方法测定AE抗体中和指数。三批次灭活疫苗免疫后21天，AE抗体中和指数分别为10^1.63、10^2.02、10^3.36，均不低于10^1.1的标准，达到合格标准，具体见表4。

表4三批次灭活疫苗免疫后AE抗体中和指数测定结果

批号	AE抗体中和指数
		20120501	10<sup>1.63</sup>
20130201	10<sup>2.02</sup>
		20140401	10<sup>3.36</sup>

2.禽脑脊髓炎灭活疫苗免疫攻毒保护效力检验：取本实施标题1中免疫21天后的免疫组SPF鸡和对照SPF鸡，用病毒含量为10^4.76EID₅₀/0.2ml的禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液进行脑部接种攻毒，攻毒剂量为1000EID₅₀/0.03ml/只。攻毒后，观察至21天，对照组全部发病，具有禽脑脊髓炎的典型症状，免疫组全部正常。结果表明：免疫组攻毒后保护率达到100％，对照组发病率为100％，具体见表5。

表5三批次禽脑脊髓炎攻毒保护效力试验结果

实施例4禽脑脊髓炎灭活疫苗双倍剂量接种安全试验

按实施例2中方法制备3批次禽脑脊髓炎灭活疫苗(批号：20120501、2013020120140401，各批病毒含量如实施例3)。

考察对象为7日龄SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物有限公司)和7日龄三黄肉鸡(购自南京石佛寺养鸡场)。各批鸡购回后，适应数天，核实鸡的全身状况和临床疾病情况，剔除弱鸡，选择健康鸡进入试验。对SPF鸡分别双倍剂量(0.6ml/只)颈部皮下注射三批禽脑脊髓炎灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照；对三黄肉鸡分别双倍剂量(0.6ml/只)颈部皮下注射三批禽脑脊髓炎灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照。接种后观察14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应，接种后14天、28天各组随机抽取试验鸡5～10只，剖检注射部位，检查疫苗的吸收情况。

结果：接种后14日内，未观察到临床异常，采食、饮水正常，健康情况良好，未发现由疫苗引起的任何局部和全身反应，具体见表6。接种后14天，各组取5～10只鸡剖检注射部位，80％以上肉眼可见少量粟粒样大小颗粒未吸收完全；注射后28天剖检，70％以上疫苗已基本吸收，注射部位未见由疫苗接种引起的异常反应，具体见表7。因此，禽脑脊髓炎灭活疫苗双倍剂量接种是安全的。

表6双倍剂量接种禽脑脊髓炎灭活疫苗后14天内临床观察结果

表7双倍剂量接种禽脑脊髓炎灭活疫苗的吸收检验结果

实施例5禽脑脊髓炎灭活疫苗与同类产品比较试验

为了对比本发明禽脑脊髓炎灭活疫苗与目前市场销售的其他同类产品的免疫效果，按实施例2中方法制备禽脑脊髓炎灭活疫苗(批号：20120501，20130201，病毒含量同实施例3)。

购买北京兽医生物药品厂的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性脑脊髓炎四联灭活疫苗产品(生产批号：127303、127304；产品批准文号：兽药生字(2008)010322042；)作为同类制品对照疫苗，该产品含有禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株，颈部皮下或肌肉注射。

为了与同类制品相区分，下述实验中，将实施例2中方法制备的禽脑脊髓炎灭活疫苗简称为自制疫苗。

将SPF鸡设为自制疫苗组、同类制品组和对照组，自制疫苗组和同类制品组分别有20只鸡，对照组10只鸡。接种方法：自制疫苗组与同类制品组均采用颈部皮下注射，按照自制苗剂量0.3ml/只接种，同类制品按照0.5ml/只接种疫苗，对照组不接种。通过测定免疫后抗体产生期及交叉攻毒情况对比两种疫苗的免疫效果。接种后不同时间，自制疫苗组、同类制品组分别随机抽取10只鸡采血，测定AE抗体中和指数。AE抗体中和指数大于等于10^1.1，达到合格标准。免疫后21天，用禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液0.03ml(含1000EID₅₀)和禽脑脊髓炎病毒强毒株LC-95株(购于山东省农业科学院家禽研究所)病毒液0.03ml(含1000EID₅₀)分别脑内接种免疫组(自制疫苗组与同类制品组)10鸡，对照组5只鸡。观察21日，对照组鸡应至少4只发病，免疫组鸡应至少保护8只。

禽脑脊髓炎病毒抗体产生期测定结果见表8。两种疫苗按照1羽份(自制苗0.3ml、同类制品0.5ml)免疫3周龄SPF鸡后，禽脑脊髓炎病毒抗体在免疫后7～14天产生，抗体产生期比较试验的结果表明：采用自制苗免疫SPF鸡后7天、14天、21天，AE抗体中和指数均高于同类苗免疫相同时间后产生的抗体水平；自制苗免疫SPF鸡后第14天，AE抗体中和指数达到合格；同类制品免疫后第21天，AE抗体中和指数才达到合格。上述结果说明，自制苗显著缩短了免疫窗口期。

免疫后21天，各组用HM08株和LC-95株分别攻毒的结果如表9，2批次自制苗免疫后28天，分别用HM08株和LC-95株攻毒均获得100％保护。而同类制品的2批次疫苗用HM08株攻毒的保护率仅为60～70％；用LC-95株攻毒的保护率为90～100％。

表8 SPF鸡禽脑脊髓炎抗体产生期比较结果

表9交叉攻毒保护结果

实施例6禽脑脊髓炎灭活疫苗对蛋鸡及其子代的免疫效力

检测实施例2制备的禽脑脊髓炎灭活疫苗(自制灭活疫苗)对蛋鸡及其子代的免疫效力，灭活疫苗批号为20130201，病毒含量见实施例3。

将自制灭活疫苗与同类制品：鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性脑脊髓炎四联灭活疫苗(购自北京兽医生物药品厂，该产品含有禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株)分别免疫18周龄海兰蛋种鸡20只，按照自制苗剂量0.3ml/只接种，同类制品按照0.5ml/只接种，另20只不免疫作对照。免疫后7天、14天、21天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月采血，测定AE抗体中和指数。并收集免疫后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月前后3天的鸡蛋各30枚；孵化至5-6日龄时，各取10个鸡胚，按照现行《中国兽药典》进行禽脑脊髓炎鸡胚敏感性试验，以检测自制灭活疫苗免疫蛋鸡后对子代的保护率及保护时间。结果见表10、11。自制苗0.3ml免疫18周龄海兰蛋鸡后，7天开始产生抗体，免疫持续期可10个月，且抗体水平远高于同类制品。自制苗免疫蛋鸡后可以对子代提供3个月的保护，保护率高于同类制品。

表10禽脑脊髓炎病毒对蛋鸡抗体持续期比较结果

表11禽脑脊髓炎灭活疫苗对鸡胚的敏感性试验

Claims (8)

1.一种禽脑脊髓炎病毒HM08株，保藏号为：CGMCC NO.7759。

2.一种禽脑脊髓炎灭活疫苗，其特征在于：该禽脑脊髓炎灭活疫苗含有灭活的权利要求1所述禽脑脊髓炎病毒HM08株。

3.根据权利要求2所述禽脑脊髓炎灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗为油乳剂灭活疫苗。

4.制备禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液的方法，其特征在于采用SPF鸡胚增殖权利要求1所述禽脑脊髓炎病毒HM08株，得到禽脑脊髓炎病毒HM08株毒液。

5.根据权利要求4所述制备禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液的方法，其特征在于权利要求1所述禽脑脊髓炎病毒HM08株接种SPF鸡胚，收获病变鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜和胚体，匀浆，破碎细胞，离心取上清液，得到禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液。

6.一种权利要求2或3所述禽脑脊髓炎灭活疫苗的制备方法，包括：

（1）采用甲醛灭活禽脑脊髓炎病毒HM08株毒液；

（2）将注射用白油和司本-80按照体积比94：6混合混匀，作为油相溶液；

（3）将灭活的禽脑脊髓炎病毒HM08株毒液和吐温-80按照体积比96：4混合均匀，作为水相溶液；

（4）乳化：将油相溶液和水相溶液按照体积比2～4:1混和均匀、乳化，即获得所述禽脑脊髓炎灭活疫苗。

7.根据权利要求6所述禽脑脊髓炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述灭活疫苗中甲醛的体积百分浓度为0.15%-0.25%。

8.根据权利要求7所述禽脑脊髓炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：0.2ml禽脑脊髓炎病毒HM08株毒液中禽脑脊髓炎病毒HM08株的含量≥10^7.0EID₅₀。