CN103710314A - 一种禽脑脊髓炎病毒弱毒疫苗株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种禽脑脊髓炎病毒YBF02株(禽脑脊髓炎病毒Avian Encephalomyelitis virus),该病毒株于2013年11月08日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.8505。本发明筛选的禽脑脊髓炎病毒弱毒疫苗株通过水平传播感染在鸡体连续传代,均未见毒力返强现象,遗传性稳定,符合禽脑脊髓炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准,制成的疫苗能够提供有效的免疫保护,具有很好的商品化开发前景。
Description
技术领域
本发明属于疫苗抗原选育技术领域,具体涉及一种禽脑脊髓炎病毒弱毒疫苗株。
背景技术
禽脑脊髓炎(AE)是由禽脑脊髓炎病毒(AEV)引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡,以侵害中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病,表现为运动失调、头颈震颤和后趾麻痹等神经症状,特别是头和颈部的震颤。因此,过去常称为“流行性震颤”。4周龄以下雏鸡感染AEV后,发病率一般为20%~60%,死亡率平均为25%,也可超过50%;成年鸡感染不表现神经症状,但可引起一过性产蛋下降,下降幅度为16%~43%,有的高达60%以上,但不出现神经症状,约两周后产蛋可恢复正常。但此时期所产的种蛋高度带毒,在孵化时呈现两种趋势:一部分鸡胚在孵化后期死亡;另一部分虽可孵化出壳,但在出壳时或出壳后数天内即能表现症状,这些雏鸡的粪便中带有大量病毒,能造成其他雏鸡的感染。禽脑脊髓炎在全世界均有发生,易感鸡群在一年四季均可发病,冬春发生较多。几乎所有鸡群最终都会被病毒感染,但临床发病率较低。
1930年,Jones首先在2周龄商品代洛岛红鸡发现AE,表现为震颤。1931年观察到两次暴发,发生在不同鸡场的1周龄和4周龄鸡群,这两个群源于同一种鸡群。在以后的两年间,在新英格兰地区多个州均发现了AE的暴发,因此又称为“新英格兰病”。1934年,Jones取自然发病鸡的脑组织滤液经脑内接种易感鸡复制出了本病。1938年,Van Roekel等指出:并不是总能观察到震颤,当出现震颤时随后会出现共济失调,因为此病有传染性和主要侵害中枢神经系统,所以提出称为“传染性禽脑脊髓炎”,后来缩为“禽脑脊髓炎”并于1939年被美国兽医协会委员会采用。1958年,Schaaf第一次报道通过免疫成功控制了本病。1960年Calnek等阐明了AE的流行病学,随后开发出了口服疫苗,成为当今世界商品鸡群控制AE的基础。该病现已遍布世界各地,很多国家和地区都有该病发生的报道。
我国许多省市,均有发生本病的报道,已给养禽业造成多方面的损失。1980年张泽纪首先在广东的雏鸡群中发现疑似AE。1982年李心平通过病理组织学确诊该病。1983年毕英佐通过流行病学、病理组织学确诊此病。姚大明、秦爱建、赵振华、姚永秀等相继进行了AEV的分离和鉴定工作及疫苗的研制与应用试验。近年来辽宁、江苏、黑龙江、河北、山东、内蒙古、福建、上海、河南、江西、陕西等地陆续出现AE的报道。黄骏明等用鸡脑敏感试验检测了哈尔滨市17个蛋鸡群,发现这些蛋鸡群对AE的污染率为95.1%。由此可见,该病在我国是广泛存在的。
对急性暴发AE的雏鸡没有有效的治疗方法,在育成期接种疫苗,能控制种鸡群在性成熟后不再发生感染,同时也能防止病毒经蛋途径扩散。此外,母源抗体能保护雏鸡在最易感的头2~3周抵抗AEV感染。商品产蛋鸡群也可以进行免疫接种,以防止由AE引起的一过性产蛋下降。但活疫苗制备中最关键的是获得低毒且具有免疫原性的疫苗株。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽脑脊髓炎病毒弱毒疫苗株,用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对AEV的攻击能提供良好的免疫保护效力。
本发明的禽脑脊髓炎病毒YBF02株(禽脑脊髓炎病毒AvianEncephalomyelitis virus),该病毒株于2013年11月08日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.8505。
本发明筛选的弱毒疫苗株用来制备用于预防禽脑脊髓炎的疫苗。
本发明筛选的禽脑脊髓炎病毒弱毒疫苗株通过水平传播感染在鸡体连续传代,均未见毒力返强现象,遗传性稳定,符合禽脑脊髓炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准,制成的疫苗能提供有效的免疫保护,具有很好的商品化开发前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。
一、禽脑脊髓炎病毒株的选育
取患有禽脑脊髓炎雏鸡的脑、胰腺和十二指肠,在无菌条件下研磨,用灭菌生理盐水作1:5稀释、反复冻融3次、4000rpm离心30分钟,取上清液滤器过滤后,脑内接种1日龄SPF雏鸡10只,0.1ml/只,待出现运动失调、头颈震颤等症状后采血致死,无菌取病雏鸡的脑、胰腺和十二指肠,在无菌条件下研磨,用灭菌生理盐水作1:5稀释,反复冻融3次、4000rpm离心30分钟,取上清液作为第1代分离毒(F1)保存备用。取F1代同上方法脑内接种1日龄SPF雏鸡传代,制备第2代分离毒(F2)。如此连传4代。鸡胚致病性试验表明分离毒为一株非鸡胚适应性的禽脑脊髓炎病毒弱毒。取1日龄SPF雏鸡传代的F4代种毒,10倍稀释后,卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚,继续在37~38℃孵育至16日龄收毒:吸取胚液,观察胚体活动和发育情况,称胚体重和脑重,检查胚体,胚脑病变(出血,积水,萎缩等);并取胚脑,胃,肠,胰腺,用胚液作1:5稀释,加双抗,研磨,反复冻融3次,4000rpm离心30分钟,制成悬液备用。这样连续传至第18代。选取作为疫苗研制的候选毒株,命名为AEV YBF02株,并于2013年11月08日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.8505。
二、AEV YBF02株的安全性检测
AEV YBF02株毒种安全性试验:分别将基础种子的第5、7、10代毒种稀释,取1~10周龄SPF鸡各10只,每只刺种或口服104EID50的YBF02株病毒,观察28日,并记录结果。结果表明:AEV YBF02株基础种子第5、7、10代毒种对1~10周龄SPF鸡是安全的,无任何禽脑脊髓炎特异性症状,不影响生长发育。
表1:毒种安全性试验
毒力返强试验:将YBF02株F5代基础毒种通过3~8周龄的SPF鸡同居感染途径连传5代,取各代次病毒分别脑内接种1日龄SPF雏鸡、刺种接种28日龄SPF雏鸡和高峰产蛋鸡,观察传代后的各代次毒对1、28日龄SPF鸡及产蛋鸡的致病性。结果表明:各代次的毒力基本相同,毒力没有返强,仍为非鸡胚适应的弱毒。符合禽脑脊髓炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准,可以作为疫苗毒株进行商品化开发。基因分析表明,本发明筛选的YBF02株与已报道的禽脑脊髓炎病毒存在着遗传上的差异,为一新型的禽脑脊髓炎病毒。
上述毒种安全性试验结果和毒力返强试验结果说明:本发明筛选的禽脑脊髓炎病毒弱毒疫苗株YBF02株是安全的,可以用来制备疫苗。
三、AEV YBF02株的免疫效力检测
分别将AEV YBF02株的第1、7、10、14、18代毒种稀释,取1~10龄SPF鸡各10只,每只刺种103.0EID50的病毒,28日后,与10只同日龄、同条件下饲养的SPF对照鸡,脑内接种VR株禽脑脊髓炎强毒,103.0EID50/只,观察28日。结果表明:AEV YBF02株第1、7、10、14、18代毒种的免疫效力差异不显著,具有良好的免疫保护性,10只免疫鸡均保护至少9只,而10只对照鸡9只发病。说明AEV YBF02株毒种在18代以内其免疫原性基本一致,具有良好免疫保护性。
表2:毒种免疫效力检测试验
用YBF02株制成的活疫苗的实际免疫效果表明,用YBF02株接种后14日检测到ELISA抗体,28日抗体100%阳性,80%以上抗体阳性可维持到53周。同时在免后14日、21日、28日用禽脑脊髓炎病毒强毒VR株进行脑内攻毒,结果保护率达到100%,证明AEV YBF02株能有效的对雏鸡进行免疫,具有制备疫苗的应用前景。而且,当用分离YBF02株制备禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗同英特威、意大利等生产的二联活疫苗进行免疫效果对比试验,用爱德士ELISA试剂盒检测血清抗体,阳性率分别为100%、90%、80%,用YBF02株制备的二联活疫苗效果最好。
本发明的弱毒株还可以与其它病毒一种制备二联或多联疫苗,具体如下:
禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗
1 材料
1.1 毒种 制造禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗用的鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株由中国兽医药品监察所鉴定、保存和供应;也可以用其它的鸡痘病毒弱毒株,但禽脑脊髓炎病毒选用分离的保藏编号为:CGMCC No.8505的弱毒YBF02株。
1.2 种蛋及试验鸡
1.2.1 SPF种蛋 购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.2.2 7~14日龄SPF鸡 SPF种蛋购北京梅里亚维通实验动物技术有限公司,购回后自行孵化,出雏后负压隔离器饲养。
1.3 制苗用其它仪器、试剂 均由青岛易邦生物工程有限公司提供。
2 方法
2.1 制苗材料选择 选择发育良好的6日龄SPF鸡胚;选择发育良好的11~12日龄SPF鸡胚或鸡胚成纤维细胞作为制苗材料。
2.2 制苗用毒液的制备
2.2.1 禽脑脊髓炎病毒液的制备 取毒种,用无菌生理盐水或PBS作100倍稀释,卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚,每胚0.2ml,接种后密封针孔,置37℃继续孵育至16日龄收毒。收毒前将鸡胚置2~8℃冻死,检查鸡胚病变,收取鸡胚胚液、脑、胃肠、胰腺,称重后用胚液1:5稀释,匀浆冻融3次,4000r/min离心30分钟,取上清混合分装于无菌容器中,置2~8℃保存,不超过20日。同时取样进行半成品检验。
2.2.2 鸡痘病毒液的制备
2.2.2.1 鸡胚的接种、收获 取毒种,用灭菌生理盐水稀释100~1000倍,接种于绒毛尿囊膜上0.2ml或接种于尿囊腔内0.1m1,接种后封闭针孔,置35~37℃继续孵育,不必翻蛋,每日照蛋1次。将96小时前死亡的鸡胚废弃,取96~120小时死胚及120小时活胚,每若干个胚为一组,无菌收集有水肿或痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜,置无菌容器内结冻保存,同时取每胚尿囊液等量混合,作无菌检验和鸡红细胞凝集试验。
2.2.2.2 细胞的接种、收获 选取生长良好的单层细胞瓶,按培养液量的0.1%~0.3%接入毒种,将pH值调至7.2,继续培养。接种后观察细胞病变,待75%以上的细胞出现特异性病变时,将细胞培养液全部弃去,按10000ml细胞瓶加新鲜的含3%~5%血清的乳汉液150~200m1或将原培养液留下150~200ml或全部留下,加玻璃珠将细胞单层摇下,收获于灭菌容器内,在-15℃以下保存,应不超过1个月。
2.3 半成品检验
2.3.1 无菌检验 按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。
2.3.2 病毒含量测定 将禽脑脊髓炎病毒液用无菌生理盐水或PBS作10倍系列稀释,取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度,各卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚10枚,每胚0.2ml,另取10枚同批次SPF鸡胚不接种作为对照。37℃继续孵育至正常出雏日的3日后,统计其未出壳胚数、特异性死亡雏数及有禽脑脊髓炎特异性临床症状的雏鸡数,按照Reed-Muench法计算EID50。病毒含量应≥105.5EID50/0.2ml,对照鸡胚应至少8枚按时出雏,且出雏鸡均无禽脑脊髓炎的特异性临床症状。
2.3.3 鸡痘细胞毒液毒价测定 将收获的细胞毒混合,用灭菌生理盐水或PBS作10倍系列稀释,取10-5、10-6、10-73个稀释度,各绒毛尿囊膜接种11日龄鸡胚5枚,0.2ml/胚,接种后96~120小时,鸡胚绒毛尿囊膜水肿、增厚或有痘斑,判为感染,按照Reed-Muench法计算EID50。病毒含量应≥106.0EID50/0.2ml,方可用于配苗。
2.4 配苗及分装 将检验合格的两种病毒液按一定比例混合于同一容器内,按规定羽份加入5%蔗糖明胶作稳定剂(蔗糖含量为5%,明胶含量为1%),同时加入适宜的抗生素(青霉素、链霉素终浓度均为200单位/ml),充分摇匀,定量分装。每羽份病毒含量:禽脑脊髓炎病毒YBF02株≥103.5EID50;鸡痘病毒≥103.5EID50。
对于禽脑脊髓炎和鸡痘病毒液的比例,只要能够保证对这两种疾病产生免疫效果即可。
2.5 冻干 分装后迅速进行冷冻真空干燥。
2.6 成品检验
2.6.1 性状 观察疫苗的外观颜色、性状、与瓶壁脱离情况及加稀释液后溶解情况。
2.6.2 无菌检验 按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。
2.6.3 支原体检验 按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。
2.6.4 外源病毒检验 按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。
2.6.6 安全检验 用7~14日龄SPF鸡10只,各肌肉注射疫苗0.2ml(含10羽份)观察21日,应全部健活,无任何局部或全身不良反应。
2.6.7 效力检验 下列方法任择其一。
2.6.7.1 禽脑脊髓炎部分
(1)过滤鸡痘法检验 按瓶签注明的羽份,将疫苗用灭菌生理盐水或PBS稀释至l羽份/0.2ml,12000g2~8℃离心15分钟,经0.22um滤器过滤1次,0.10um滤器过滤2次,再作10倍系列稀释,取10-2、10-3、10-4、10-54个稀释度,分别卵黄囊内接种6日龄鸡胚10枚,每胚0.2m1,另取10枚同批次SPF鸡胚作为对照。37℃孵育(48h内死亡者弃去,不入记录)至正常出雏日的3日后,统计其未出壳胚数、特异性死亡雏数及有禽脑脊髓炎特异性临床症状雏鸡数,按Reed-Muench法计算EID50,每羽份应≥103.0EID50。对照鸡胚应至少8枚按时出雏,且出雏鸡均无禽脑脊髓炎的特异性临床症状。
(2)氯仿除鸡痘法检验 按瓶签注明羽份,将疫苗用灭菌生理盐水或PBS稀释成1羽份/0.2ml,取10ml加入等量氯仿,在旋转混合器上震荡混合两次,每次间隔30秒,600g离心10分钟,再继续做10倍系列稀释,取3个适宜稀释度,分别接种12枚6日龄SPF鸡胚,每胚AS途径接种0.2ml,另设20枚对照,48小时内死亡鸡胚不计,记录鸡胚死亡、情况,每个稀释度鸡胚分别孵化,孵化后第3天(接种后18~19日),记录未孵育鸡胚。死亡鸡胚、瘫痪鸡和共济失调鸡判为阳性。对照组至少75%出雏,每羽份疫苗≥102.5EID50。
2.3.7.2 鸡痘部分
(1)病毒含量测定 按瓶签注明羽份,将疫苗用灭菌生理盐水或PBS稀释成1羽份/0.2ml,再继续做10倍系列稀释,取3个适宜稀释度,经绒毛尿囊膜分别接种11~12日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.2m1,置37℃孵育96~120小时,鸡胚绒毛尿囊膜水肿增厚或出现痘斑判为感染,计算EID50,每羽份病毒含量应不低于103.0EID50。
(2)用鸡胚检验 按瓶签注明羽份,将疫苗用灭菌生理盐水稀释至0.01羽份/0.2ml,经绒毛尿囊膜接种11~12日龄SPF鸡胚10枚,每胚0.2ml,置37℃孵育96~120小时,所有鸡胚绒毛尿囊膜应水肿增厚或出现痘斑。
2.6.8 剩余水分测定 按2010年版《中国兽药典》附录方法进行。
2.6.9 真空度测定 按2010年版《中国兽药典》附录方法进行。
3 结果
3.1 半成品检验结果
3.1.1 无菌检验 按现行《中国兽药典》附录方法进行检验,均无菌生长。
3.1.2 病毒含量测定 禽脑脊髓炎毒液病毒含量为105.5EID50/0.2ml;鸡痘病毒毒液病毒含量为106.0EID50/0.2ml。
3.2 成品检验结果
3.2.1 性状 微黄色海绵状疏松团块,上下摇晃时,样品很容易与瓶壁脱离。加入稀释液后均迅速溶解。
3.2.2 无菌检验 疫苗随机取样10瓶,分别用无菌生理盐水或PBS恢复原量,每瓶分别按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。均无细菌、霉菌生长。
3.2.3 支原体检验 疫苗随机取样5瓶,分别用无菌生理盐水或PBS恢复原量并混合,按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。疫苗均无支原体生长。
3.2.4 外源病毒检验
3.2.4.1 鸡胚检查法 疫苗取样3瓶,用无菌生理盐水或PBS恢复原量后作适当稀释后混合,与等量抗禽脑脊髓炎病毒特异性血清混合,37℃中和l小时。接种鸡胚进行检验。结果显示,检验鸡胚每组均10/10存活,胎儿均发育正常,绒毛尿囊膜均无病变,鸡胚液对1%鸡红细胞凝集试验均为阴性。
3.2.4.2 细胞检查法
3.2.4.2.1 取处理过的样品各接种2瓶已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞各0.2ml,观察7日。检验均无细胞病变,且无红细胞吸附现象。
3.2.4.2.2 禽白血病病毒检验取处理过的样品各接种2瓶已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞各2ml,同时设阴性对照(正常细胞)和阳性病毒作对照,同样品连传3代,取3代细胞培养物(包括样品和所有对照组)冻融3次,并作上标记,用禽白血病病毒试剂盒进行ELISA检测。样品检验结果均为阴性。
3.2.4.3 鸡检查法样品用无菌生理盐水或PBS作适当稀释,接种14日龄的SPF鸡各20只,每只同时点眼、滴鼻接种10羽份,肌肉注射100羽份,免后21日,按上述方法和剂量重复接种1次,第1次接种后42日采血,进行有关病原的血清抗体检测。结果显示,检验疫苗接种鸡后42日内,鸡只均健康,无因疫苗引起的局部或全身症状和不良反应或死亡。进行血清抗体检测时,除本疫苗所产生的特异性抗体外,无其他病原的抗体存在。结果见下表。
表3:疫苗外源病毒检验(鸡检查法)结果
综上所述,鸡胚检查法、细胞检查法及鸡检查法结果均说明疫苗外源病毒检验合格。
3.2.5 安全检验 疫苗取样3瓶,分别用无菌生理盐水或PBS恢复原量后作适当稀释,肌肉注射10日龄SPF鸡10只,每只0.2m1(含10羽份),观察21日。结果显示,接种鸡只均无任何不良反应,且10/10健活。
3.2.6 效力检验
3.2.6.1 禽脑脊髓炎部分
(1)过滤鸡痘法检验 按瓶签注明的羽份,将疫苗用灭菌生理盐水或PBS稀释至l羽份/0.2ml,12000g2~8℃离心15分钟,经0.22um滤器过滤1次,0.10um滤器过滤2次,再作10倍系列稀释,取10-2、10-3、10-4、10-54个稀释度,分别卵黄囊内接种6日龄鸡胚10枚,每胚0.2m1,另取10枚同批次SPF鸡胚作为对照。37℃孵育(48h内死亡者弃去,不入记录)至正常出雏日的3日后,统计其未出壳胚数、特异性死亡雏数及有禽脑脊髓炎特异性临床症状雏鸡数,按Reed-Muench法计算EID50,每羽份应≥103.0EID50。对照鸡胚应至少8枚按时出雏,且出雏鸡均无禽脑脊髓炎的特异性临床症状。检验结果:每羽份病毒含量为103.1EID50,疫苗效力检验合格。
(2)氯仿除鸡痘法检验 按瓶签注明羽份,将疫苗用灭菌生理盐水或PBS稀释成1羽份/0.2ml,取10ml加入等量氯仿,在旋转混合器上震荡混合两次,每次间隔30秒,600g离心10分钟,再继续做10倍系列稀释,取3个适宜稀释度,分别接种12枚6日龄SPF鸡胚,每胚AS途径接种0.2ml,另设20枚对照,48小时内死亡鸡胚不计,记录鸡胚死亡、情况,每个稀释度鸡胚分别孵化,孵化后第3天(接种后18~19日),记录未孵育鸡胚。死亡鸡胚、瘫痪鸡和共济失调鸡判为阳性。对照组至少75%出雏,每羽份疫苗≥102.5EID50。检验结果:每羽份病毒含量为102.9EID50,疫苗效力检验合格。
3.2.6.1 鸡痘部分
(1)病毒含量测定 按瓶签注明羽份,将疫苗用灭菌生理盐水或PBS稀释成1羽份/0.2ml,再继续做10倍系列稀释,取3个适宜稀释度,经绒毛尿囊膜分别接种11~12日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.2m1,置37℃孵育96~120小时,鸡胚绒毛尿囊膜水肿增厚或出现痘斑判为感染,计算EID50,每羽份病毒含量应不低于103.0EID50。检验结果:每羽份病毒含量为103.7EID50,疫苗效力检验合格。
(2)用鸡胚检验 按瓶签注明羽份,将疫苗用灭菌生理盐水稀释至0.01羽份/0.2ml,经绒毛尿囊膜接种11~12日龄SPF鸡胚10枚,每胚0.2ml,置37℃孵育96~120小时,所有鸡胚绒毛尿囊膜应水肿增厚或出现痘斑。检验结果:10/10鸡胚绒毛尿囊膜水肿并出现痘斑,疫苗效力检验合格。
3.2.8 剩余水分测定 疫苗取样4瓶用真空干燥法进行检验。结果检验样品剩余水分含量在2.0%~2.7%,均≤4%。说明疫苗剩余水分测定检验均合格。
3.2.9 真空度测定 疫苗分别用真空检漏仪进行检验。结果检验样品均呈紫色辉光。说明疫苗真空度测定检验均合格。
Claims (4)
1.一种禽脑脊髓炎病毒,所述的禽脑脊髓炎病毒的保藏编号为:CGMCCNo.8505。
2.权利要求1所述的病毒在制备用于预防禽脑脊髓炎的疫苗中的应用。
3.如权利要求1所述的禽脑脊髓炎病毒,为YBF02株。
4.如权利要求1所述的禽脑脊髓炎病毒的应用,其特征在于,是对雏鸡进行免疫。
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