CN102533673B - 鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株及其在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。本发明的细胞适应株为鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株的细胞适应株，命名为IBDV-G株，其菌种保藏编号为：CGMCC 5553。将本发明的IBDV-G株灭活后制备成疫苗用于动物的免疫，结果证明：本发明的疫苗安全，且对超强度IBDV-G的致死性攻击，具有100％的保护率，本发明的超强毒灭活苗抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比较的疫苗中，均居于首位。因此，本发明的推广应用将有效地预防了我国局部地区vvIBD的暴发和流行，有利地促进了免疫地区乃至我国养禽业的持续、稳定、健康地发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种超强毒株的细胞适应株及其应用，特别涉及一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株及其在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。属于生物疫苗领域。
背景技术
鸡传染性法氏囊病(IBD)是幼龄鸡的一种急性、高度接触性传染病。其病原是鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)。IBDV属双RNA病毒科，禽双RNA病毒属病毒。它有两个血清型，即血清I型和血清II型。I型毒对鸡有致病性，又分为不同亚型，如经典株、变异株、超强毒株和致弱株等。IBDV倾向于侵袭活跃的分离细胞，在鸡体内，主要侵害中枢免疫器官-法氏囊中的前体B细胞，使其发生凋亡和坏死，进而使成熟B细胞减少，导致免疫抑制，从而降低机体对其它疫病的易感性和对其它疫苗的反应性。本病现已遍布全球养禽地区，在工业化养禽业发达的国家尤为严重。
我国于1979年先后在北京、广州等地发生本病，初期病死率较低；八十年代末、九十年代初，我国开始流行鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)，使IBD的发生有了新的变化：病死率升高达100％和60％以上；雏鸡易早期感染，急性发病；原有的经典株弱毒苗不能给免疫鸡提供完全的保护；带有较低母源抗体水平的鸡群也常常不能抵抗vvIBDV的攻击。李树根等发现，TAD(德国)、D78(荷兰)、BV(美国)、CJ(北京)等弱毒疫苗对由广东分离的6株血清I型IBDV毒株GF903、GZ902、GN903、GS904、GB905、GD906等的保护率都不高。由于vvIBDV在抗原性上与经典株和经典疫苗株一致，只是在致病性上出现急剧增强的趋势，理论上讲，常规标准血清I型疫苗能够提供对vvIBDV的保护，但在临床实践中，vvIBDV却能突破母源抗体而感染雏鸡。即使不致雏鸡死亡，也使法氏囊组织受到严重损伤，导致严重后果。因此研制出能抵抗国内vvIBDV分离株、免疫原性强、安全性好的疫苗，并将其推广应用就迫在眉睫。目前认为适当提高疫苗的含毒量或选用中毒力疫苗株是提高疫苗免疫效力的两个好办法。Vandenberg等证明，D78疫苗免疫接种的规定含量较PBG98疫苗的高10倍，前者抗vvIBDV的效果就比后者好。而中毒力疫苗或残毒疫苗虽然对IBD的控制效果较好，但不免使人对其毒力和使用后果有些担心。因此本发明人认为，分离国内vvIBDV，筛选、培育出毒价高，抗原性强的毒株，研制IBD灭活苗，用于雏鸡将引起主动免疫，且无毒负作用；用于种鸡，将提高子代鸡的母源抗体水平，防制早期感染，抵抗国内vvIBDV的攻击。
近几年，本发明人将分离到的vvIBDV-Gx株，经过鉴定、筛选、培育，将其5代细胞适应株(IBDV-G)作为种毒，经鉴定后，研制了超强毒灭活疫苗，并进行了一系列实验室免疫效力试验、安全性试验、对国内vvIBDV的攻毒保护试验等，取得了良好的效果。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株。
本发明的目的之二在于提供所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物。
本发明的目的是通过以下技术手段实现的：
本发明人从广西某地IBD免疫后发病鸡群采取法氏囊组织，经标准化方法处理后，得到IBDV-Gx株。对Gx株进行了致病性试验，克隆其主要保护性抗原基因VP2，并进行了序列分析和比较。结果表明，其与欧洲标准超强毒UK661的亲缘关系较近，主要结构蛋白核苷酸同源性为99％，氨基酸同源性为100％，其对SPF鸡胚半数感染量(EID50)为106.25/0.2ml，以2×103EID50/只的剂量接种9～11日龄的SPF鸡，死亡率达40％，以2×103EID50/只的剂量接种4周龄SPF鸡，死亡率达64％。从而证实传染性法氏囊病病毒Gx为一株符合欧洲超强毒标准和特点的国内超强毒株。
对该Gx毒株经SPF鸡胚连续传代5代后，又经SPF鸡胚成纤维细胞连续传代25代，结果表明病毒在细胞上稳定地大量增殖。其中细胞5代毒在接种后72小时，毒价可达4.0×108pFU/ml，病毒对SPF鸡胚半数感染量(EID50)为108.10/0.2ml，以2×103EID50/只的剂量接种4周龄SPF鸡，死亡率达60％，进而筛选得到了本发明的一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株，其为鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株的细胞适应株，命名为IBDV-G株，分类命名为：鸡传染性法氏囊病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5553，保藏日期为2011年12月5日。
将本发明的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株IBDV-G以同步接毒的方式进行批量培养，收获病毒，经甲醛灭活，以矿物油为佐剂制成油乳剂灭活苗。疫苗接种10日龄及36周龄SPF鸡，注苗后均无不良反应。雏鸡免疫后7天开始产生抗体，14天时对超强毒IBDV-G(vvIBDV-G)的致死性攻击，具有100％的保护率。免疫种鸡后，28天后直至8-10个月，子代鸡均可获得被动保护，10日龄时对vvIBDV-G的致死性攻击的保护率为100％，同国内外部分同类疫苗进行的比较研究中，本超强毒灭活苗抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比较的疫苗中，均居于首位。
因此，本发明提出了所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
本发明的一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物中，其有效成分包含灭活后的本发明所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株。
在本发明的研究中将致死率作为本发明的疫苗免疫保护性的可靠性依据及判定标准。鸡传染性法氏囊超强毒株在我国的出现，使病死率已升高到60～100％，由于vvIBDV在致病性上出现了急剧增强的趋势，使得传染性法氏囊病具备了高死亡率的特征，所以使用严重发病及致死率作为免疫保护性指标，可以客观地评价鸡传染性法氏囊病超强毒灭活疫苗对鸡群遭受vvIBDV致死性攻击时的保护效率，具有极大的可靠性；免疫攻毒保护的鸡应临床不死亡、不发病、无精神沉郁、食欲废绝现象。
自1962年Cosgrove首次报道鸡传染性法氏囊病的流行以来，世界各国相继开展了IBD疫苗免疫方面的研究，油佐剂灭活疫苗具有免疫保护期长、免疫效果确实等优点，目前各国使用较多的油佐剂疫苗的毒株包括IBDV的标准毒株和变异株。其对种鸡的免疫可将母源免疫力提供给后代，这些母源抗体能保护鸡免受早期感染而引起的免疫抑制，世界各国鸡传染性法氏囊病油乳剂灭活苗的研制成功和应用在对传染性法氏囊病的控制上发挥了巨大的作用。在本研究中将本产品与部分国内外同类疫苗，包括已批准的鸡传染性法氏囊灭活苗(CJ-801-BKF株)在内进行了比较，结果表明，本疫苗抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比较的疫苗中，居于首位，已批准的CJ-801株鸡传染性法氏囊灭活苗的各项指标与超强毒灭活苗相比基本相同，但超强毒灭活苗有着免疫剂量小(超强毒灭活苗成鸡免疫剂量为0.6ml/只，CJ-801株法氏囊病灭活苗成鸡免疫剂量为1.2ml/只)的明显优势，分析其原因，可能是本灭活苗的毒种具有超强毒的特性，同时能在细胞中适应并大量增殖，易于提高疫苗中的抗原量。
因此，与现有技术相比，采用本发明的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株制成的疫苗具有如下优点：
1、本发明的一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株具有超强毒的特性，能在细胞中适应并大量增殖，易于提高疫苗中的抗原量；
2、本发明的疫苗组合物其抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率高；
3、本发明的超强毒灭活苗有着免疫剂量小(超强毒灭活苗成鸡免疫剂量为0.6ml/只，CJ-801株法氏囊病灭活苗成鸡免疫剂量为1.2ml/只)的明显优势；
4、本研究结果表明，鸡传染性法氏囊病超强毒灭活苗具有免疫原性好、免疫保护持续期长、免疫剂量小等优点。
IBDV流行与分布较广，加之病毒本身对外界抵抗力较强，感染舍的彻底消毒也十分困难，因此使用能够抵抗国内vvIBDV流行的高效疫苗对易感鸡群进行免疫预防，减少甚至避免其对养禽业造成的危害势在必行。本研究结果表明，鸡传染性法氏囊病超强毒灭活苗具有免疫原性好、免疫保护持续期长、免疫剂量小等优点，它的的推广应用将有效地预防了我国局部地区vvIBD的暴发和流行，给免疫场带来了明显的经济效益和社会效益，有利地促进了免疫地区乃至我国养禽业的持续、稳定、健康地发展。
附图说明
图1为IBDV-G在CEF上的生长曲线；
图2为种毒IBDV-G的电镜照片。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1鸡传染性法氏囊病超强毒灭活苗制苗用种毒IBDV-G的鉴定
1、材料和方法
1.1疫苗用种毒的鉴定
1.1.1种毒的培养及毒价测定
以10日龄SPF鸡胚制备鸡胚成纤维细胞，以同步接毒方式接种5代细胞毒，即本发明的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株IBDV-G，37℃培养。不同时间收集病毒培养物，以病毒蚀斑形成方法测定病毒含量，绘制病毒生长曲线，并确定收毒时间和种毒毒价。
1.1.2电镜观察
种毒细胞培养物冻融后，直接负染法做电镜观察；经不连续蔗糖梯度离心纯化后，抽取40％蔗糖段的病毒带，加PBS超速离心(27000rpm，2.5小时)，少量TNE悬浮后，直接负染法做电镜观察。
1.1.3外源病毒检查
IBDV-G培养物，稀释至1×104PFU/ml，将其与超强毒IBDV-G单特异血清等量混合并经37℃1小时中和后，取10日龄SPF鸡20只，以滴鼻、点眼的途径进行接种，每只鸡接种0.2ml(1.0×103PFU/只)，20天后，采集血清，分别使用血凝抑制(HI)、琼扩(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验(VN)、免疫荧光(IFA)等方法，检测血清中鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡马立克病毒(MDV)、鸡新城疫病毒(NDV)、禽网状内皮组织增殖征病毒(REV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(LLV)、鸡传染性喉气管炎病毒(LTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、鸡痘病毒(POX)的抗体阳性率。
1.1.4生物学特性
以1.0×103PFU/只剂量的IBDV-G接种12只10日龄SPF鸡，于接种后3、5、7、10天，各剖检3只鸡，观察剖检变化和病理组织学变化，并用ELISA方法检测组织中的IBDV。
1.2疫苗用种毒的特异性及免疫原性
1.2.1特异性
取培养24小时的2个100ml方瓶CEF，将种毒稀释至1×104PFU/ml后与vvIBDV-G单特异血清等量混合并经37℃1小时中和后，每瓶接种0.2ml，培养5日，观察细胞病变；IBDV-G病毒培养物经27000转/分，2.5小时超速离心后，80倍浓缩，与鸡传染性法氏囊病(IBD)、鸡传染性贫血病(CIA)、鸡马立克病(MD)、鸡新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)、禽流感(AI)、鸡传染性喉气管炎(ILT)等阳性血清作琼扩试验。
1.2.2免疫原性
将毒价达4.0×108PFU/ml的IBDV-G病毒培养物，经0.2％甲醛溶液灭活48小时后，与白油佐剂按1∶1.5混合，制成油乳剂，分别以0.05ml/只、0.1ml/只、0.2ml/只剂量肌肉注射接种20只10日龄SPF鸡，免疫后14天和28天分别以4.0×104EID50/只vvIBDV-G株进行攻毒，确定超强毒攻毒保护率并分别在免疫后7、14、21、28天采血，检测AGP和ELISA抗体，计算免疫后不同时间的血清抗体阳性率。
2.结果
2.1疫苗用种毒鉴定
2.1.1种毒的培养及毒价测定
IBDV-G在CEF上可稳定而有规律地增殖，图1从一定程度上反应出病毒增殖状态。接种后72小时左右，培养液中的病毒量最多，毒价达4.0×108PFU/ml以上，因而，收毒时间定为72小时。
2.1.2电镜观察
种毒细胞培养物冻融后，直接负染法做电镜观察，可见视野中大量散在的、典型的IBDV粒子，未见其它病毒粒子，如图2所示。
2.1.3外源病毒检查
以IBDV-G培养液经单特异血清中和，接种SPF鸡后，血清中除检测到传染性法氏囊病毒抗体外，无其它病毒抗体，证明种毒较纯，无其它外源病毒的污染；使用SPF鸡进行实验，结果可靠(见表1)。
表1种毒的外源病毒检查
2.1.4生物学特性
试验结果显示，IBDV-G能在体内靶器官中有效增殖。接种3天后，即可在法氏囊组织中检到IBDV抗原(见表2)。
表2接种后不同时间组织中IBDV的ELISA检测结果
注：表中数字为ELISA检测阳性结果。
2.2疫苗用种毒的特异性及免疫原性
2.2.1特异性
细胞培养结果表明，细胞均未产生细胞病变，毒种可被鸡传染性法氏囊病毒的特异性阳性血清中和。IBDV-G病毒培养物经琼扩试验，与IBD阳性血清出现清晰致密的、肉眼可见的沉淀线，而与CIA、MD、ND、IB、AI、ILT等阳性血的检测试验均清呈阴性反应。
2.2.2免疫原性
以4.0×108PFU/ml的IBDV-G乳化成疫苗后，以0.05ml/只(0.8×107PFU/只)、0.1ml/只(1.6×107PFU/只)、0.2ml/只(3.2×107PFU/只)的免疫剂量分别对20只10日龄SPF鸡进行免疫，其中0.1ml/只(1.6×107PFU)剂量免疫组，在免疫后7天即产生琼扩抗体，在免疫14天以后，对超强毒的保护率就达100％(10/10)，对照鸡全部死亡，免疫后14天、21天、28天的抗体阳性率分别为80％(16/20)、100％(10/10)、100％(10/10)，而0.05ml/只(0.8×107PFU/只)剂量免疫组，不能对超强毒的攻击提供良好的保护，因此以4.0×108PFU/ml IBDV-G种毒株病毒经灭活和乳化后，其最小免疫剂量为0.1ml/只(1.6×107PFU/只)(见表3)。
表3IBDV-G接种鸡后的超强毒攻毒保护率和免疫后不同时间的抗体阳性率
实施例2疫苗的制备及免疫效力实验
1、材料和方法
1.1SPF鸡及饲养
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供的SPF鸡并在澳大利亚进口负压隔离器中饲养和进行试验。
1.2比较试验所用疫苗
均购自各生产厂家或代理商。
1.3效检用毒株及攻毒剂量
国内标准超强毒分离株vvIBDV-G，其EID50为106.25/0.2ml，以4×104EID50/只的剂量，经点眼、滴鼻等途径接种10只4周龄SPF鸡，感染鸡至少应死亡8只。
2疫苗的制备
2.1培养及毒价测定
首先制备鸡胚成纤维细胞(CEF)，以与CEF同步接毒方式批量培养5个批次病毒，接种后72小时，收集病毒培养物，以病毒蚀斑形成方法测定病毒含量。
2.2灭活及安检
培养的病毒经无菌检验后，用最终含量为0.2％的甲醛溶液，37℃灭活48小时，取5批次灭活病毒培养液，按细胞培养液量0.5％同步接种于制备好的CEF细胞上，37℃培养，观察细胞病变，每24小时至少观察2次，连续盲传2代，进行灭活病毒培养液的安全性检验。
2.3制苗及性状
灭活病毒培养液辅以白油佐剂，制成批号为199901、199902、199903、200001、200002五个批次的油乳剂灭活苗，进行性状检验。
3、疫苗的免疫效力实验
3.1免疫剂量测定
3.1.1对雏鸡的最小免疫剂量
以199901、199902、199903、200001、200002等5批次灭活疫苗测定雏鸡最小免疫剂量。每批次疫苗分别以0.1、0.2、0.3、0.4ml/只的剂量免疫四组10日龄SPF雏鸡，40只/组。免疫后7、14、21、28天各组分别取出10只鸡，采血后，以4.0×104EID50/只的vvIBDV-G攻毒，以攻毒保护率确定最小免疫剂量，血清用于琼扩抗体的检测，并以此为基础确定使用剂量。
3.1.2对成鸡的最小免疫剂量
本试验中使用199901、199902、199903、200001、200002五个批次灭活苗分别以0.3、0.5、0.8、1.0ml/只的剂量，肌肉接种20只36周龄SPF成鸡，免疫后14、28、42、64天分别收集种蛋、采血，测定各组收集种蛋的卵黄抗体以及成鸡血清中的琼扩抗体，孵化不同组别、不同时间种蛋，得到子代雏鸡，在10日龄时以4.0×104EID50/只的vvIBDV-G攻毒，以攻毒保护率确定对成鸡的最小免疫剂量，并确定其使用剂量。
3.2免疫期的测定
3.2.1对雏鸡的免疫期测定
以199901、199902、199903、200001、200002五个批次灭活苗，测定灭活苗对雏鸡的免疫产生期和持续期。各批次疫苗，分别以对雏鸡的使用剂量免疫三组10日龄SPF雏鸡，60只/组。免疫后7、14、28、42、56天分别取出10只采血后以4.0×104EID50/只的vvIBDV-G攻毒，血清用于琼扩抗体的检测，确定免疫产生期和免疫持续期。
3.2.2对成鸡免疫期的测定
使用199901、199902、199903、200001、200002五批次灭活苗，测定对成鸡的免疫产生期和持续期。以对成鸡的使用剂量免疫36周龄10只SPF鸡。免疫后14天、28天、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月采血、收集种蛋、孵化子代鸡雏，子代鸡10日龄时使用4.0×104EID50/只的vvIBDV-G攻毒，检测免疫后不同时间的血清和卵黄中的琼扩抗体，确定免疫产生期和免疫持续期。
3.3子代鸡母源抗体消长规律的测定
使用成鸡免疫产生期和持续期测定试验中199901、199902、199903、200001、200002五个批次疫苗免疫后第4个月所产种蛋，分别孵化的30只子代鸡，在7、14、21日龄分别取出10只采血后攻毒，确定子代鸡母源抗体消长规律及其攻毒保护率。
3.4攻毒保护率的测定
3.4.1对雏鸡的保护率测定
199901、199902、199903、200001、200002等批次疫苗分别以使用剂量免疫五组10日龄SPF雏鸡，40只/组。免疫后14、28、42、56天，每组取10只，以4.0×104EID50/只的vvIBDV-G经滴鼻点眼途径攻毒，攻毒后观察7天，记录病死率。
3.4.2对子代鸡被动保护率测定
根据对成鸡免疫期的测定试验结果计算被动保护率。
4、疫苗的安全性检验
以199901、199902、199903、200001、200002五个批次灭活苗进行安全性试验。各批次疫苗，均以使用剂量的倍量，2-3点肌肉注射免疫10日龄SPF雏鸡，免疫后3周内观察临床症状、剖检变化和组织学变化。
5、其它同类疫苗的比较试验
将超强毒灭活疫苗与部分国内外同类疫苗，包括与农业部已经批准的鸡传染性法氏囊灭活疫苗(CJ-801-BKF)进行比较，按各自规定的免疫剂量分别免疫10日龄SPF雏鸡10只，免疫后不同时间采血，进行抗体检测，21天时以vvIBDV-G攻毒，观察7天，记录发病和死亡情况。
6、疫苗的保存期测定
199901、199902、199903、200001、200002各批次灭活疫苗分别取3瓶，在4℃～8℃冰箱中保存至一年，将同批次的疫苗混合，分别免疫10只10日龄的SPF鸡，免疫后14天内观察临床症状及注射局部的异常情况，采血后以4.0×104EID50/只的vvIBDV-G攻毒，测定其攻毒保护率。
7.结果
7.1疫苗的制备
结果表明，试验室试制的共计5批次疫苗毒效价均达到2.0×108PFU/ml以上，灭活彻底，制成油乳剂疫苗以后，疫苗的含毒量为0.8×108PFU/ml，5批次疫苗经3000rpm离心20分钟均不分层，均为物理性状合格产品。
表4、5个批次疫苗毒的效价
7.2疫苗的免疫效力实验
7.2.1最小免疫剂量测定
7.2.1.1对雏鸡的最小免疫剂量
五批疫苗均以0.2ml/只(1.6×107PFU/只)以上剂量免疫时，免疫后7天产生抗体，14天后，免疫剂量为0.2ml/只以上的试验组的保护率均为100％，抗体阳性率均为70％(7/10)以上，对照鸡攻毒后全部死亡或严重发病。因此，灭活疫苗的最小免疫剂量确定为0.2ml/只(1.6×107PFU/只)，使用剂量确定为0.3ml/只(2.4×107PFU/只)(见表5、6、7、8)。
7.2.1.2对成鸡的最小免疫剂量
各个批次灭活苗0.5ml/只(4.0×107PFU)以上的剂量免疫成鸡，14天产生血清抗体，子代鸡攻毒保护率均达到50％以上，28天时，子代鸡攻毒保护率均达100％，血清抗体和卵黄抗体阳性率也均达到100％(5/5、3/3)，对照鸡攻毒后全部死亡。因此，灭活苗对成鸡的最小免疫剂量为0.5ml/只(4.0×107PFU)，使用剂量确定为0.6ml/只(4.8×107PFU)(见表9、10、11、12、13)。
表5、灭活苗免疫雏鸡后7天的攻毒保护率及抗体检测
表6、灭活苗免疫雏鸡后14天的攻毒保护率及抗体检测
表7、灭活苗免疫雏鸡后21天的攻毒保护率及抗体检测
表8、灭活苗免疫雏鸡后28天的攻毒保护率及抗体检测
表9、199901批灭活苗对成鸡的最小免疫剂量的测定
*血清和卵黄试验数据为琼扩抗体阳性比例
表10、199902批灭活苗对成鸡的最小免疫剂量的测定
*血清和卵黄试验数据为琼扩抗体阳性比例
表11、199903批灭活苗对成鸡的最小免疫剂量的测定
*血清和卵黄试验数据为琼扩抗体阳性比例
表12、200001批灭活苗对成鸡的最小免疫剂量的测定
*血清和卵黄试验数据为琼扩抗体阳性比例
表13、200002批灭活苗对成鸡的最小免疫剂量的测定
*血清和卵黄试验数据为琼扩抗体阳性比例
7.1.2免疫期的测定
7.1.2.1对雏鸡的免疫期测定试验结果表明，五个批次疫苗分别以0.3ml/只(2.4×107PFU/只)的剂量免疫SPF雏鸡，均于免疫后7天开始产生抗体及攻毒保护力，14天时超强毒攻毒保护率达100％，抗体阳性率达70％以上，28天以后，抗体阳性率达100％，100％攻毒保护率可持续至56天以上，对照鸡攻毒后全部死亡(见表14)。
表14、灭活苗对雏鸡的免疫期测定
a：琼扩抗体阳性率。b：琼扩抗体平均滴度(LG2)。c：攻毒保护率。*因效价过低，未计算。
7.1.2.2对成鸡免疫期的测定
五个批次疫苗0.6ml/只(4.8×107PFU/只)的剂量免疫成鸡后14天，即可检出血清抗体和卵黄抗体，28天时，血清抗体和卵黄抗体阳性率均达100％，并可持续8～10个月，种蛋经孵化后，雏鸡在10日龄时，使用vvIBDV-G进行攻毒，免疫14天后的成鸡子代鸡即可产生攻毒保护力，免疫28天后的成鸡子代鸡的攻毒保护率达到100％，并可持续到8～10个月(见表15)。
7.1.2.3子代鸡母源抗体消长规律的测定
试验结果表明，经灭活苗以0.6ml/只(4.8×107PFU/只)的剂量免疫后的成鸡，其子代鸡的母源抗体效价可达4log2，在14日龄前可对雏鸡产生100％的攻毒保护，抗体阳性率达100％(见表16)。
7.1.3攻毒保护率的测定
7.1.3.1对雏鸡的保护率测定
灭活疫苗以0.3ml/只(2.4×107PFU/只)的剂量免疫的雏鸡，在56天之内对国内vvIBDV不同分离株的保护率均为100％(见表17)。
7.1.3.2对子代鸡被动保护率测定
根据对成鸡免疫期的测定试验结果表明(表12)，199901、199902、199903、200001、200002各批疫苗0.6ml/只(4.8×107PFU/只)的剂量免疫SPF成鸡，在免疫14天后的SPF成鸡的子代鸡中即可产生攻毒保护力，免疫28天后的成鸡子代鸡的攻毒保护率达到100％，并可持续到8至10个月。
表15、灭活苗对成鸡免疫期的测定
表16、雏鸡母源抗体消长规律的测定
表17、灭活苗对雏鸡的保护率
7.2疫苗的安全性检验
安全性试验表明，灭活疫苗以0.6ml/只(4.8×107PFU/只)的剂量免疫后，雏鸡无IBD临床症状，注射局部无异常反应；剖检观察，各脏器无异常变化；组织学检查，免疫第二周时，法氏囊组织滤泡增生，生发中心淋巴细胞细胞增多，无其它病理变化。证明疫苗安全有效(见表18)。
表18.灭活疫苗的安全性
B：法氏囊组织 S：脾组织 K：肾组织
7.3其它同类疫苗的比较试验
超强毒灭活苗抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比较的疫苗中，居于首位，经农业部批准的鸡传染性法氏囊灭活疫苗(CJ-801-BKF)的抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率等指标等同于或略低于超强毒灭活苗，同时其规定的免疫剂量为1.2ml/只，超强毒灭活苗与之相比较，则具有免疫剂量小、免疫持续期长、抗体滴度高、攻毒保护确实等特点(见表19)。
表19、灭活疫苗与其它疫苗的比较试验
7.4疫苗的保存期测定
结果表明，所有批次疫苗保存一年，免疫鸡后均无不良反应，且对免疫鸡的保护率均在100％(见表20)。
表20、疫苗的保存期测定
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株，其特征在于所述的细胞适应株为鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株的细胞适应株，命名为IBDV-G株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.5553。
2.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
3.一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物中，其有效成分包含灭活后的权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株。
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|---|
| 祁小乐等.鸡传染性法氏囊病病毒VP2 蛋白研究进展.《中国预防兽医学报》.2008,第30 卷(第8 期),656-660. |
| 祁小乐等.鸡传染性法氏囊病病毒的反向遗传研究.《病毒学报》.2006,第22卷(第3期),237-240. |
| 鸡传染性法氏囊病病毒VP2 蛋白研究进展;祁小乐等;《中国预防兽医学报》;20080831;第30 卷(第8 期);656-660 * |
| 鸡传染性法氏囊病病毒的反向遗传研究;祁小乐等;《病毒学报》;20060531;第22卷(第3期);237-240 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102533673A (zh) | 2012-07-04 |
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