CN111235117B

CN111235117B - 一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株及其应用

Info

Publication number: CN111235117B
Application number: CN202010090643.5A
Authority: CN
Inventors: 祁小乐; 王笑梅; 高玉龙; 高立; 李凯; 崔红玉; 刘长军; 潘青; 张艳萍
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-02-13
Filing date: 2020-02-13
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2040-02-13
Also published as: CN111235117A

Abstract

本发明公开了一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株及其应用。所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株命名为IBD17JL01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.19291。该病毒株为本发明首次分离鉴定的一株自然适应DF1和CEF体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典毒株，该株病毒能够直接在体外传代细胞系DF1细胞、CEF细胞或DT40细胞上增殖。将该毒株灭活后制备成灭活疫苗，可使免疫雏鸡对强毒攻击产生100％的保护效果。因此，该病毒株(IBD17JL01株)可以作为天然适应体外细胞培养的疫苗候选株，用于IBDV的免疫防控。

Description

一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株及其应用

技术领域

本发明涉及一株新型的鸡传染性法氏囊病病毒株及其应用，特别涉及一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株及其应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是鸡的一种重要的免疫抑制病，其病原是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)。IBDV有两个血清型：血清I型和血清II型。血清I型对鸡致病，血清II型对鸡不致病。血清I型分为经典株、超强毒株和变异株，经典株和超强毒株的抗原性一致。IBDV经典株引起的传染性法氏囊病首次于1957年在美国爆发。上世纪80年代末，IBDV变异株和超强毒相继出现并迅速传遍全球。目前这三种毒株在我国均流行。

IBDV对养禽业的危害分直接危害和间接危害。直接危害：摧毁中枢免疫器官法氏囊，且能直接致死。间接危害：IBDV感染耐过的鸡免疫力低下，造成禽流感、新城疫等其它重要疫病的疫苗免疫失败，且易造成继发感染，影响鸡群生产性能，造成严重经济损失。总之，IBD严重影响养禽业的健康发展，其防控形势十分严峻。

IBDV的基因组由A、B两个节段组成。A节段全长约3200bp，编码多聚蛋白(PP，VP2-VP4-VP3)和VP5蛋白，PP进一步自剪切成熟为VP2、VP3、VP4。其中，VP2和VP3是IBDV重要的结构蛋白。VP2是组成病毒衣壳的重要成分，其位于病毒粒子的最外侧，是关键的宿主保护性抗原。B节段全长约2800bp，编码具有RNA依赖的RNA聚合酶活性的VP1蛋白，其在病毒基因的转录和翻译中发挥重要作用。

疫苗免疫是IBD防控的重要手段。是否能够获得适应体外细胞培养的疫苗株是疫苗研制和生产的关键瓶颈。然而，自然界中尚未发现能够适应鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)及其传代细胞系DF1等体外细胞培养的IBDV野毒株，所以目前市场上的IBDV全病毒疫苗株均是来源于人工传代。传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)的人工传代技术存在如下缺点：①该过程费时费力，研发成本高，时效性差。②传代过程中，毒株的抗原性有可能发生变异，进而造成疫苗株与流行毒株的抗原匹配性差。③传代结果具有随机性，不一定每个传代试验都能获得理想的毒株。

本发明首次分离鉴定了一株自然适应DF1和CEF等体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典毒株(IBD17JL01株)，通过基因扩增和测序确定了病毒的全基因组，此外还检测了该病毒株的细胞嗜性，评估了其致病力，以期为鸡传染性法氏囊病疫苗的研制提供一种新的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株及其在制备鸡传染性法氏囊病灭活疫苗中的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明分离得到的一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株，命名为IBD17JL01，分类命名为鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal D iseaseVirus，IBDV)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19291，保藏时间为2020年01月08日。

进一步的，本发明还提出了所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。

其中，优选的，所述的疫苗为灭活疫苗。

更进一步的，本发明还提出了一种培养所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株的方法，包括以下步骤：

将DF1细胞按1MOI的量接种所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株IBD17JL01；接毒后补加含2％v/v胎牛血清的DMEM培养基，继续置于37℃培养，接毒后60h，将细胞反复冻融三次，收集细胞悬液即为所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株的病毒液。

更进一步的，本发明还提出了一种鸡传染性法氏囊病灭活疫苗，所述的灭活疫苗中含有灭活后的鸡传染性法氏囊病病毒经典株。

其中，优选的，所述的灭活是将所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株的生产用毒置冰上使其缓慢融化，加入甲醛溶液至终浓度为0.2％v/v，混匀后，置于37℃灭活48h，期间不断摇匀，得到灭活后的鸡传染性法氏囊病病毒经典株的病毒液。

其中，优选的，灭活完成后，将灭活后的病毒液与白油佐剂混合后进行乳化，按照体积比计算，白油：病毒液：吐温＝50：25：1，使用乳化器乳化，直到混合物外观呈乳白色乳剂。

其中，优选的，所述的灭活苗中，每羽份含抗原量为不低于8×10⁷PFU。

更进一步的，本发明还提出了所述的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)IBD17JL01株为首个鉴定的能够适应DF1和CEF体外细胞培养的IBDV天然野毒株，之前未见报道。

(2)该毒株不经传代即可适应体外细胞培养，解决了IBDV疫苗株的细胞培养的瓶颈问题。

(3)该毒株制备疫苗时未经任何分子修饰，抗原性与野毒株完全一样，免疫保护效果良好。

附图说明

图1为IBDV基因组核苷酸序列遗传演化分析；

A.基因组A节段编码的多聚蛋白(PP)；B.基因组B节段编码的VP1蛋白；

图2为IBDV特征性氨基酸比对；

注：VV、C、AT分别表示IBDV超强毒株、经典株和弱毒株。与IBD17JL01株一致的氨基酸用星号表示；

图3为IBD17JL01株感染DF1细胞和DT40细胞；

A.IBD17JL01在DF1细胞上引起的CPE；B.IFA鉴定IBD17JL01感染DF1和DT40细胞；

图4为IBD17JL01株对SPF鸡的致病性；

A.IBD17JL01攻毒组BBIX；B.IBD17JL01攻毒后7天法氏囊病理变化；

图5为IBDV灭活苗(IBD17JL01株)免疫组的囊重指数(BBIX)；

图6为免疫鸡的IBDV抗体滴度；

图7为攻毒7d后免疫组鸡囊重指数(BBIX)。

具体实施方式

为了能够更清楚的解释本发明，下面会结合具体的实施例对本发明进行详细说明，但本发明不仅局限于以下实施例。

实施例1IBD17JL01株的分离和鉴定

1.试验材料和方法

1.1临床样品采集及处理

2017年9月，吉林省扶余市某蛋鸡场25日龄蛋鸡出现疑似IBD的临床症状。患病鸡表现为精神不振，剖检发现其法氏囊严重萎缩、腿肌及法氏囊可见出血点。将患病鸡法氏囊样品加入适量PBS，研磨后反复冻融三次，制备成的混悬液于4℃、5000g离心5min，取上清用于后续检测。

1.2主要试剂及材料

Prime STARTM HS DNA Polymerase、pMD18-T vector、RNAiso Plus、DL2000DNAMarker均购于大连宝生物工程有限公司(Takara)；核酸凝胶回收试剂盒、小提质粒试剂盒均为AxyPrep公司产品；DMEM培养基购于北京全式金生物有限公司。抗IBDV VP2蛋白单克隆抗体由本实验室制备和保存。

DF1细胞及DT40细胞由本实验室保存；原代鸡胚成纤维细胞(CEF)按常规方法用无特定病原体(Specific-pathogen-free，SPF)鸡胚制备；三种细胞均在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养。SPF鸡及SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心提供，SPF鸡饲养于负压隔离器中。

1.3.RNA的提取及IBDV的RT-PCR检测

取200μL上述病料混悬液，按照RNAiso Plus产品说明书分别提取样品总RNA，再根据M-MLV反转录试剂盒提供的操作步骤合成cDNA。以cDNA为模板，利用上游引物2U和下游引物2L(表1)进行检测。PCR程序为：95℃5min，95℃30s、56℃30s、72℃45s，35个循环；72℃5min。运用1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR结果，扩增预期长度为930bp。

1.4病毒的分离

随机挑选一个经RT-PCR检测为阳性的样品进行病毒分离。取200μL病料混悬液，经绒毛尿囊膜途径以接种9日龄SPF鸡胚，每代接种5个鸡胚，对照3个，观察5d。置37℃恒温箱中培养，每天观察鸡胚的临床症状及死亡情况，24h内的死胚弃去。接种后第5天，将期间死亡的鸡胚和耐过鸡胚剖检，采集法氏囊、肝脏和尿囊液混合研磨制成混悬液，进行RT-PCR检测，并在新的9日龄SPF鸡胚上进行传代，盲传三代。收集第三代鸡胚的法氏囊、肝脏和尿囊液混悬液，进行特异性和纯净性鉴定，即为分离得到了IBDV(鸡胚毒)，命名为IBD17JL01株。

1.5病毒全基因组的扩增及测序

利用引物AU/A1542L和A1421U2/AL2(表1)分两段扩增IBDV基因组A节段(两段RT-PCR产物相互重叠)；利用引物BU/B1344L和B1344U/BL(表1)分两段扩增IBDV基因组B节段(两段RT-PCR产物相互重叠)。将RT-PCR产物纯化后分别克隆至pMD18-T载体中，将重组质粒送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。

表1引物

1.6病毒遗传演化分析

基于A节段编码的多聚蛋白(PP)核苷酸序列和B节段编码的VP1核苷酸序列，运用序列分析软件MEGA 6和Clustal X program(version 2.0)进行序列比对和遗传演化分析。本研究选取了25个代表毒株包括IBDV经典毒、超强毒、变异株、弱毒疫苗株、中毒力疫苗株以及血清II型毒株(表2)。

表2遗传演化分析所用参考毒株信息

1.7病毒的细胞嗜性检测

为了确定IBD17JL01株IBDV的细胞嗜性，本研究运用细胞病变(Cytopathiceffect，CPE)观察、间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescent assay，IFA)、RT-PCR等三种方法检测IBD17JL01株IBDV在DF1细胞、CEF细胞和DT40细胞三种细胞上的增殖情况。将细胞培养于六孔板中，待细胞铺满80％左右时，按1MOI的量接种IBD17JL01；另设接种20μL PBS的细胞孔作为对照孔。接毒后将细胞在37℃温箱吸附1h，之后补加细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养基)，继续置于37℃温箱，逐日观察CPE情况。接毒后60h，将细胞反复冻融三次，收集细胞悬液即为IBD17JL01株细胞毒。按1.3方法进行RT-PCR检测。

间接免疫荧光试验(IFA)：接种病毒后48h，吸净细胞培养液，将细胞用PBS洗涤3次，用4％甲醛固定30分钟，然后与抗IBDV VP2的单克隆抗体(MAb)(1：2000稀释)于37℃孵育1小时。随后用PBS洗涤细胞3次，然后与异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠抗体(1：200)37℃避光孵育1小时。最后将细胞洗涤3次，利用荧光显微镜观察细胞感染情况。

1.8病毒致病性试验

首先检测IBD17JL01株IBDV对SPF鸡胚的致病性，并滴定IBD17JL01株的效价——鸡胚半数致死量(virus titer of 50％embryo lethal doses，ELD₅₀)。将病毒悬液进行10倍比稀释，然后经绒毛膜尿囊膜途径接种到9日龄的SPF鸡胚(0.1毫升/胚，5个鸡胚/稀释度)。48h内的死胚弃去。连续培养7天，直至无鸡胚死亡，同时设PBS阴性对照组。记录每天各稀释度组死亡鸡胚的数量。最后，根据Reed-Muench公式(Reed et al，1938)的方法计算病毒ELD₅₀。

为了进一步评估IBD17JL01对SPF鸡的致病性，20只14日龄SPF鸡被平均分为两组(攻毒组与对照组)。利用上述已知效价的IBD17JL01病毒液，采用滴鼻点眼的方式对攻毒组的10只鸡进行攻毒，攻毒剂量为1.12×10²ELD₅₀/只；对照组以相同的方式接种等体积(200ul)的PBS。攻毒后连续观察7d，观察期间记录统计各组SPF鸡的临床症状。最后对存活的鸡称重，安乐处死，剖检观察每只鸡的各脏器的病变情况，采集法氏囊并称重，计算囊重比(Bursal of fabricius weight/Body weight ratio,F/B)和囊指数(Bursa:bodyweight index,BBIX)。F/B＝(法氏囊重/体重)X 1000；BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡囊肿比。根据BBIX评价法氏囊的萎缩程度，当IBBX低于0.7时，说明法氏囊萎缩。同时，利用10％甲醛溶液固定部分法氏囊制备病理切片，进行病理组织学分析。

2.结果

2.1病毒的分离与基因组的克隆

RT-PCR检测结果显示采集到的法氏囊样品为IBDV阳性。利用SPF鸡胚成功分离到一株IBDV并将其命名为IBD17JL01株，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19291，保藏时间为2020年01月08日。成功克隆了该毒株的全基因组。测序结果显示，IBD17JL01株的A节段全长3260bp，由5’端非编码区(96bp)、3’端非编码区(91bp)和2个部分重叠的开放性阅读框组成。其中小开放性阅读框(450bp)编码非结构蛋白VP5，大开放性阅读框(3039bp)编码多聚蛋白(PP)VP2-VP4-VP3。B节段由5’端非编码区(111bp)、3’端非编码区(79bp)和1个编码VP1的开放性阅读框(2637bp)组成。将IBD17JL01基因组序列上传GenBank，其A、B节段序列登录号分别为：MN604241和MN604242。

2.2IBD17JL01基因组遗传演化分析

基于病毒A节段编码的多聚蛋白(PP)核苷酸序列遗传进化树显示，血清I型IBDV明显分为四个分支，分别为经典毒、超强毒、变异株和弱毒株分支(图1A)。IBD17JL01株与经典毒代表毒株F52/70和IM处于同一分支。基于VP1基因核苷酸序列遗传进化树显示，血清I型IBDV分为超强毒和非超强毒两个大的分支；IBD17JL01处于非超强毒分支(图1B)。这些数据说明，IBD17JL01株属于IBDV经典毒株。

基于多聚蛋白(PP)氨基酸序列的同源性比对结果显示，IBD17JL01株与IBDV经典的同源率较高(97.3％-97.7％)，但与IBDV超强毒、变异株和弱毒株的同源率分别为94.9％-95.6％、96.2％-96.5％、97.0％-97.2％；基于VP1氨基酸序列同源性比对结果显示，IBD17JL01株与非超强毒的同源率为97.5％-99.7％，而与超强毒的同源率仅为88.9％-89.7％。

与IBDV经典毒代表毒株(F52/70和IM)氨基酸比对结果显示，IBD17JL01株VP2高变区拥有五个独特的氨基酸位点，分别为222L、249H、256A、284A和286I(图2)。据报道，这五个氨基酸位点与IBDV的致病力和抗原变异有密切关系。其中，284A氨基酸位点是决定IBDV细胞嗜性的关键位点之一。

由于IBD17JL01株分离自免疫鸡群，本研究进一步分析了IBD17JL01株与IBDV商品疫苗株的关系。本研究分析的IBDV疫苗株包括弱毒株10株和中毒力疫苗株2株，其中3株弱毒疫苗株(B87、D78和Gt)和2株中毒力疫苗株(W2512和MB)在我国应用相对比较普遍。遗传进化树显示，IBD1701株与IBDV两种类型的疫苗株均处于不同的分枝，亲缘关系较远(图1)。在特征性氨基酸比对中，与弱毒疫苗株(B87、D78和Gt)相比，IBD17JL01的多聚蛋白(PP)存在12个独特的氨基酸位点，分别为49R,78F,129P,222L,242I,249H,253Q,256A,279D,286I,330S,981P；与中毒力疫苗株(W2512和MB)相比，IBD17JL01的多聚蛋白(PP)分别有7个和11个独特的氨基酸位点差异(图2)。这说明，IBD17JL01株不是现有商品疫苗株。

2.3IBD17JL01细胞嗜性的鉴定

DF1细胞在IBD17JL01株IBDV接毒后48h，可观察到典型的细胞病变(图3A)；接毒后72h，细胞培养上清中的病毒基因组拷贝数为1.99×10⁷RNA copies/mL。DT40细胞在接毒后72h仍未观察到明显的细胞病变，然而其细胞培养上清中的病毒基因组拷贝数达到4.47×10⁷viral RNA copies/mL。间接免疫荧光试验结果显示，接毒24h后，在DF1细胞和DT40细胞中均可见绿色荧光信号，而未接毒对照组无可见荧光(图3B)。研究还显示，IBD17JL01株IBDV可以感染CEF细胞并产生CPE。试验结果证明，IBD17JL01可适应DF1细胞、CEF细胞等体外细胞培养。

2.4致病性试验

鸡胚致病性试验显示，IBD17JL01株IBDV可致死鸡胚，鸡胚毒的效价可达5.62×10²ELD₅₀/mL。SPF鸡接种IBD17JL01株后，7天内未出现明显外观临床症状。但攻毒组法氏囊严重萎缩，其BBIX为0.53±0.10，对照组未见明显异常。病理组织学检查发现，IBD17JL01攻毒组法氏囊淋巴滤泡大量坏死、崩解，滤泡周围纤维化；对照组无明显异常(图4)。

实施例2IBD17JL01株灭活疫苗的免疫效力试验

1.材料和方法

1.1主要试剂、仪器

白油佐剂购自哈尔滨维科生物技术有限公司；IBDV抗体ELISA检测检测试剂盒购自美国IDEXX公司；多功能酶标仪为美国PE公司产品。

1.2试验动物

SPF鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心；SPF鸡饲养在该中心的负压隔离器内。

1.2病毒

IBDV经典毒株IBD17JL01株(保藏编号为CGMCC No.19291)为实施例1分离、鉴定。IBD17JL01株可适应DF1等体外细胞培养。本研究在DF1细胞上扩繁了IBD17JL01株，分别制备了IBD17JL01株的生产用毒种子批和攻毒用毒种子批，经检测无支原体、无细菌、无外源病毒，纯净性良好。IBD17JL01株生产用毒种子批效价为3.28×10⁸PFU/ml。IBD17JL01株攻毒用毒种子批效价为5.62×10⁵ELD₅₀/ml。

1.3IBDV灭活疫苗的制备

将IBD17JL01株IBDV生产用毒置冰上使其缓慢融化，加入甲醛溶液至终浓度为0.2％，混匀后，置于37℃灭活48h，期间不断摇匀(4-5次)。灭活完成后，将病毒液与白油佐剂混合后进行乳化(白油：病毒液：吐温＝50：25：1)，使用乳化器乳化，直到混合物外观呈乳白色乳剂。吸取少量乳化后的乳剂滴于水表面，乳剂悬滴均匀不扩散，表明免疫用蛋白溶液乳化成功。IBDV灭活苗(IBD17JL01株)每羽份含抗原量为约8.6×10⁷PFU/羽份。

1.4免疫试验

将25只三周龄SPF鸡标记腿号后随机分为3组。第一组(10只鸡)为疫苗免疫组，免疫IBD17JL01灭活苗，剂量为0.4ml/羽份(每羽份抗原含量为约8.6×10⁷PFU)。第二组PBS组(5只鸡)，每只鸡接种0.4ml PBS。第三组(10只鸡)作为非免疫非攻毒对照。免疫后的第13d，采集分离血清，使用IBDV ELISA试剂盒(IDEXX)检测抗体效价，具体步骤参照IBDV ELISA试剂盒(IDEXX)。免疫后14d，进行攻毒保护试验。

1.5安全性评价

为检测IBDV灭活苗的安全性，确保病毒灭活彻底，于免疫后第13天，剖检IBD17JL01灭活疫苗免疫组和空白对照组鸡各5只，观测法氏囊等组织是否有损伤。

1.6攻毒保护实验

在免疫后第14d，使用IBD17JL01毒株，采用滴鼻点眼的方式对灭活苗免疫组(n＝5)、PBS对照组(n＝5)的SPF鸡进行攻毒，每只SPF鸡的攻毒剂量为1×10³ELD₅₀/羽。攻毒后观察7d，观察期间逐日记录统计各组鸡的临床症状和发病死亡情况。攻毒后第7天，对存活的鸡称重，安乐处死，剖检观察各脏器的病变情况，采集法氏囊并称重，计算囊重比(Bursalof fabricius weight/Body weight ratio,F/B)和囊指数(Bursa:body weight index,BBIX)。F/B＝(法氏囊重/体重)X 1000；BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡囊重比。根据BBIX评价法氏囊的萎缩程度，当IBBX低于0.7时，说明法氏囊萎缩。同时，利用10％甲醛溶液固定部分法氏囊制备病理切片，进行病理组织学分析。

1.7统计分析

运用student’t检验方法对数据进行统计分析，P<0.05为差异显著。

2.实验结果

2.1疫苗安全性评价结果

免疫后，各组鸡均无见明显临床症状。免疫后13天剖检结果显示，免疫组与对照组法氏囊均无明显异常，免疫组平均BBIX为0.91(图5)。这说明，IBDV灭活苗(IBD17JL01株)对SPF鸡无致病性，安全性良好。

2.2IBDV抗体滴度测定结果

免疫后第13天，通过间接ELISA试验对全部的试验鸡的血清中抗体滴度进行检测。检测结果显示，IBDV灭活苗(IBD17JL01株)免疫后诱导鸡产生了特异性抗体，而PBS对照组和空白对照组为阴性(图6)。这说明，IBDV灭活苗(IBD17JL01株)免疫产生了良好的免疫应答。

2.3疫苗的攻毒保护效果囊重指数(BBIX)

攻毒后，所有的试验鸡未见明显外观临床症状。攻毒后第7天，进行剖检，PBS对照组法氏囊严重萎缩，平均BBIX为0.25±0.05(图7)。而IBDV灭活苗(IBD17JL01株)免疫组和空白对照组攻毒后法氏囊和各脏器均正常，免疫组的平均BBIX为0.9±0.13，与攻毒对照组的囊指数差异极显著(P<0.01)(图7)。这说明，IBDV灭活苗(IBD17JL01株)免疫对IBDV强毒株的攻击能够产生100％的保护效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株，命名为IBD17JL01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19291，保藏时间为2020年01月08日。

2.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。

4.一种培养权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将DF1细胞按1MOI的量接种权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株IBD17JL01；接毒后补加含2% v/v胎牛血清的DMEM培养基，继续置于37℃培养，接毒后60h，将细胞反复冻融三次，收集细胞悬液即为所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株的病毒液。

5.一种鸡传染性法氏囊病灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中含有灭活后的权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株。

6.如权利要求5所述的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活是将权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒经典株的生产用毒置冰上使其缓慢融化，加入甲醛溶液至终浓度为0.2% v/v，混匀后，置于37℃灭活48h，期间不断摇匀，得到灭活后的鸡传染性法氏囊病病毒经典株的病毒液。

7.如权利要求6所述的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗，其特征在于，灭活完成后，将灭活后的病毒液与白油佐剂混合后进行乳化，按照体积比计算，白油：病毒液：吐温=50：25：1，使用乳化器乳化，直到混合物外观呈乳白色乳剂。

8.如权利要求5所述的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活苗中，每羽份含抗原量为不低于8×10⁷ PFU。

9.权利要求5-8任一项所述的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。