CN106591243B - 一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，该技术方案以去除作为抗原制备的初始毒种中所存在的支原体或鸡网状内皮组织增生症病毒为目的，先将毒种回归鸡体，经传代后接种于CEF细胞驯化，而后再通过蚀斑克隆法纯化病毒；在此基础上，本发明针对传染性法氏囊病病毒的自身特性以及外源病毒的特点设计了具体的操作工艺。本发明利用鸡体回归和蚀斑克隆法纯化病毒，去除了原有疫苗株存在的外源病毒污染，获得了病毒增殖力强、纯度高、效价稳定性好的纯净疫苗株。利用本发明制备的半成品不同批次间病毒效价浮动为100.1～ 0.3TCID50/0.1mL，提高了病毒效价的准确性和稳定性。

Description

一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法
技术领域
本发明涉及生物制品制备技术领域，进一步涉及以提升抗原效价稳定性为目的工艺改良，具体涉及一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法。
背景技术
传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒引起的一种急性、高度接触性传染病。该病现已呈现全球性流行，一直威胁着禽业的发展，特别是超强毒株的出现，使得该病的防控形势更加严峻。疫苗的接种是防控该病的一种有效途径。
疫苗毒株的质量决定着疫苗的有效性和疫苗制备过程的简便性。因此抗原的纯化至关重要，现有技术中以疫苗生产为目的的抗原制备过程中，抗体效价随代次和生产批次的差异而严重不稳定的现象时有发生。针对这一问题现有技术研究发现，除了工艺操作的偏差之外，初始毒株遭到其他外源病毒的污染是重要的原因。若疫苗毒株存在支原体、鸡网状内皮组织增生症等的污染，则会大大影响病毒的增殖，从而使病毒的效价呈现严重的不稳定性，给病毒的增殖和疫苗的制备带来极大的不便。因此，如果能在疫苗制备前先对抗原进行前处理以保证没有外源病毒的污染，则有望显著疫苗效价的稳定性。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，以解决现有技术中疫苗效价不稳定的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中因初始毒株中污染有其他外源病毒而导致疫苗效价不稳定。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中因初始毒株中污染有支原体或鸡网状内皮组织增生症病毒而导致疫苗效价不稳定。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，包括以下步骤：
1)取传染性法氏囊病病毒接种15～30日龄SPF鸡，72～96小时后剖检取出法氏囊组织，研磨，对研磨液进行10-1～10-3倍稀释；
2)以步骤1)所得产物作为步骤1)所述传染性法氏囊病病毒，再重复步骤1)2～4次，得到病毒组织液；
3)取以9～11日龄的SPF鸡胚所制备的CEF细胞，以2×106～3.0×106细胞量/mL的接种量接种至含有5～10％(v/v)胎牛血清的M199培养基中培养过夜；
4)取步骤2)所得的病毒组织液稀释10-2～10-3倍后接种于步骤3)所得产物中，培养48～72小时后收获病毒液；
5)以步骤4)所得产物作为步骤4)所述病毒组织液，再重复步骤4)1～2次，得到CEF驯化种毒；
6)对步骤5)所述CEF驯化种毒进行蚀斑纯化。
作为优选，步骤1)中接种前先对传染性法氏囊病病毒进行10-1～10-3倍稀释，而后再接种。
作为优选，步骤3)中所述培养及步骤4)中所述培养，均是在37℃下进行的。
作为优选，步骤4)中接种前，步骤3)所得产物的CEF细胞已长满培养基单层。
作为优选，步骤6)具体包括以下操作：
A)取步骤5)所述CEF驯化种毒，进行梯度稀释后分别接种于铺满DF-1细胞单层的细胞培养板，于35～40℃吸附1h，弃去病毒液，加入含琼脂糖的病毒维持液，35～40℃条件下倒置培养72～96小时，挑取稀释倍数最大孔的蚀斑，将其溶于不含血清的病毒培养液，即得到蚀斑病毒；
B)以所述蚀斑病毒作为步骤A)所述CEF驯化种毒，再重复步骤A)2～4次，收获病毒。更优的：其中所述细胞培养板是六孔板；琼脂糖的加入量为2mL，更优的，所述琼脂糖是低熔点琼脂糖。
作为优选，步骤A)所述梯度稀释的稀释倍数分别为：10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍。
作为优选，步骤A)中DF-1细胞是利用以下成分的培养基培养的：含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
作为优选，步骤A)中所述病毒维持液是含有2％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
作为优选，步骤6)完成后继续执行以下步骤7)：
M)以步骤6)所得产物为种毒，进行10-2～10-3倍稀释后接种于长满单层的DF-1细胞，37℃培养下培养18～30小时，收获病毒液，检测TCID50；
N)步骤M)收获的病毒液作为步骤M)所述种毒，再重复步骤M)5～9次。
作为优选，步骤M)所述检测TCID50具体包括以下操作：消化DF-1细胞并计数，以2×105细胞量/mL的密度加入到96孔细胞板，100uL/孔，37℃培养20～28小时。将待测病毒做10倍系列稀释，弃去细胞液，加入10-6、10-7、10-8稀释度病毒液，37℃条件下培养96小时，按100％细胞病变判定效价。
本发明提供了一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，该技术方案以去除作为抗原制备的初始毒种中所存在的支原体或鸡网状内皮组织增生症病毒为目的，先将毒种回归鸡体，经传代后接种于CEF细胞驯化，而后再通过蚀斑克隆法纯化病毒；在此基础上，本发明针对传染性法氏囊病病毒的自身特性以及外源病毒的特点设计了具体的操作工艺。本发明利用鸡体回归和蚀斑克隆法纯化病毒，去除了原有疫苗株存在的外源病毒污染，获得了病毒增殖力强、纯度高、效价稳定性好的纯净疫苗株。利用本发明制备的半成品不同批次间病毒效价浮动为100.1～0.3TCID50/0.1mL，提高了病毒效价的准确性和稳定性。
附图说明
图1是本发明实施例1中未处理病毒和处理后病毒传代过程不同代次病毒效价稳定性对比图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，包括以下步骤：
1)病毒的鸡体回归：取出冻存的传染性法氏囊病病毒，用PBS做10-1、10-2、10-3稀释，接种21日龄SPF鸡，每个稀释度接种10只鸡，同时5只鸡不接种作为空白对照，72小时后剖检取出法氏囊组织。研磨病变法氏囊组织，将研磨液进行10-2稀释，再次接种21日龄SPF鸡。依照上述方法连续在鸡体上繁毒5代，获得病毒组织液。
2)病毒的驯化：取9-11日龄的SPF鸡胚，制备原代鸡胚成纤维细胞，以2.0×106细胞量/mL的接种量将制备的细胞接种于含有8％胎牛血清的M199培养基中，于37℃条件下培养过夜。当细胞长满单层时，将步骤1)获得的病毒组织液进行10-2稀释，接种于CEF细胞，37℃培养48～72小时，收获病毒液。以同样的方法将种毒在CEF细胞上驯化3代，获得CEF驯化种毒。
3)病毒的蚀斑纯化：消化DF-1细胞，计数后按4×105细胞量/mL铺六孔板，每孔2mL，37℃培养24小时，细胞长成单层。将CEF细胞驯化种毒做10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释，弃去板内细胞液，将病毒稀释液接种于铺满DF-1单层的六孔板，37℃吸附1小时。弃去病毒液，加入2ml含低熔点琼脂糖的病毒维持液，37℃条件下倒置培养72～96小时。挑取稀释倍数最大孔的蚀斑，将其溶于不含血清的病毒培养液，即得到蚀斑1代毒；依照同样的方法连续纯化5代，获得纯化后种毒。
4)病毒的增殖及其效价稳定性检测：消化DF-1细胞，计数后按4×105细胞量/mL传代，37℃培养24～36小时，细胞长至单层。将蚀斑纯化后种毒和原始种毒分别按10-2稀释，接种于长满单层的DF-1细胞，37℃培养18～30小时，收获病毒液，分别进行标注；依照同样的方法连续繁殖10代，分别进行病毒含量(TCID50)测定，检验纯化前后不同代次种毒效价的稳定性。结果见表1和图1。
表1原始种毒和纯化种毒不同代次效价测定结果
病毒效价(TCID<sub>50</sub>/0.1mL) 原始种毒 纯化种毒
P1 10<sup>7.0</sup> 10<sup>7.6</sup>
P2 10<sup>6.5</sup> 10<sup>7.8</sup>
P3 10<sup>7.5</sup> 10<sup>7.8</sup>
P4 10<sup>6.5</sup> 10<sup>7.8</sup>
P5 10<sup>7.2</sup> 10<sup>7.8</sup>
P6 10<sup>6.3</sup> 10<sup>7.6</sup>
P7 10<sup>7.6</sup> 10<sup>7.8</sup>
P8 10<sup>6.8</sup> 10<sup>7.8</sup>
P9 10<sup>6.0</sup> 10<sup>7.5</sup>
P10 10<sup>7.5</sup> 10<sup>7.5</sup>
实施例2
一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，包括以下步骤：
1)取传染性法氏囊病病毒接种15日龄SPF鸡，72小时后剖检取出法氏囊组织，研磨，对研磨液进行10-1倍稀释；
2)以步骤1)所得产物作为步骤1)所述传染性法氏囊病病毒，再重复步骤1)2次，得到病毒组织液；
3)取以9日龄的SPF鸡胚所制备的CEF细胞，以2×106细胞量/mL的接种量接种至含有5％(v/v)胎牛血清的M199培养基中培养过夜；
4)取步骤2)所得的病毒组织液稀释10-2倍后接种于步骤3)所得产物中，培养48小时后收获病毒液；
5)以步骤4)所得产物作为步骤4)所述病毒组织液，再重复步骤4)1次，得到CEF驯化种毒；
6)对步骤5)所述CEF驯化种毒进行蚀斑纯化。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中接种前先对传染性法氏囊病病毒进行10-1倍稀释，而后再接种。
步骤3)中所述培养及步骤4)中所述培养，均是在37℃下进行的。
步骤4)中接种前，步骤3)所得产物的CEF细胞已长满培养基单层。
步骤6)具体包括以下操作：
A)取步骤5)所述CEF驯化种毒，进行梯度稀释后分别接种于铺满DF-1细胞单层的细胞培养板，于35℃吸附1h，弃去病毒液，加入含琼脂糖的病毒维持液，35℃条件下倒置培养72小时，挑取稀释倍数最大孔的蚀斑，将其溶于不含血清的病毒培养液，即得到蚀斑病毒；
B)以所述蚀斑病毒作为步骤A)所述CEF驯化种毒，再重复步骤A)2次，收获病毒。
步骤A)所述梯度稀释的稀释倍数分别为：10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍。
步骤A)中DF-1细胞是利用以下成分的培养基培养的：含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
步骤A)中所述病毒维持液是含有2％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
步骤6)完成后继续执行以下步骤7)：
M)以步骤6)所得产物为种毒，进行10-2倍稀释后接种于长满单层的DF-1细胞，37℃培养下培养18小时，收获病毒液，检测TCID50；
N)步骤M)收获的病毒液作为步骤M)所述种毒，再重复步骤M)5次。
步骤M)所述检测TCID50具体包括以下操作：消化DF-1细胞并计数，以2×105细胞量/mL的密度加入到96孔细胞板，100uL/孔，37℃培养20小时。将待测病毒做10倍系列稀释，弃去细胞液，加入10-6、10-7、10-8稀释度病毒液，37℃条件下培养96小时，按100％细胞病变判定效价。
实施例3
一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，包括以下步骤：
1)取传染性法氏囊病病毒接种30日龄SPF鸡，96小时后剖检取出法氏囊组织，研磨，对研磨液进行10-3倍稀释；
2)以步骤1)所得产物作为步骤1)所述传染性法氏囊病病毒，再重复步骤1)4次，得到病毒组织液；
3)取以11日龄的SPF鸡胚所制备的CEF细胞，以3.0×106细胞量/mL的接种量接种至含有10％(v/v)胎牛血清的M199培养基中培养过夜；
4)取步骤2)所得的病毒组织液稀释10-3倍后接种于步骤3)所得产物中，培养72小时后收获病毒液；
5)以步骤4)所得产物作为步骤4)所述病毒组织液，再重复步骤4)2次，得到CEF驯化种毒；
6)对步骤5)所述CEF驯化种毒进行蚀斑纯化。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中接种前先对传染性法氏囊病病毒进行10-3倍稀释，而后再接种。
步骤3)中所述培养及步骤4)中所述培养，均是在37℃下进行的。
步骤4)中接种前，步骤3)所得产物的CEF细胞已长满培养基单层。
步骤6)具体包括以下操作：
A)取步骤5)所述CEF驯化种毒，进行梯度稀释后分别接种于铺满DF-1细胞单层的细胞培养板，于40℃吸附1h，弃去病毒液，加入含琼脂糖的病毒维持液，40℃条件下倒置培养96小时，挑取稀释倍数最大孔的蚀斑，将其溶于不含血清的病毒培养液，即得到蚀斑病毒；
B)以所述蚀斑病毒作为步骤A)所述CEF驯化种毒，再重复步骤A)4次，收获病毒。
步骤6)完成后继续执行以下步骤7)：
M)以步骤6)所得产物为种毒，进行10-3倍稀释后接种于长满单层的DF-1细胞，37℃培养下培养30小时，收获病毒液，检测TCID50；
N)步骤M)收获的病毒液作为步骤M)所述种毒，再重复步骤M)9次。
步骤M)所述检测TCID50具体包括以下操作：消化DF-1细胞并计数，以2×105细胞量/mL的密度加入到96孔细胞板，100uL/孔，37℃培养28小时。将待测病毒做10倍系列稀释，弃去细胞液，加入10-6、10-7、10-8稀释度病毒液，37℃条件下培养96小时，按100％细胞病变判定效价。
实施例4
一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，包括以下步骤：
1)取传染性法氏囊病病毒接种21日龄SPF鸡，84小时后剖检取出法氏囊组织，研磨，对研磨液进行10-2倍稀释；
2)以步骤1)所得产物作为步骤1)所述传染性法氏囊病病毒，再重复步骤1)3次，得到病毒组织液；
3)取以10日龄的SPF鸡胚所制备的CEF细胞，以2.5×106细胞量/mL的接种量接种至含有7.5％(v/v)胎牛血清的M199培养基中培养过夜；
4)取步骤2)所得的病毒组织液稀释10-2.5倍后接种于步骤3)所得产物中，培养60小时后收获病毒液；
5)以步骤4)所得产物作为步骤4)所述病毒组织液，再重复步骤4)1次，得到CEF驯化种毒；
6)对步骤5)所述CEF驯化种毒进行蚀斑纯化。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取传染性法氏囊病病毒接种15～30日龄SPF鸡，72～96小时后剖检取出法氏囊组织，研磨，对研磨液进行10-1～10-3倍稀释；
2)以步骤1)所得产物作为步骤1)所述传染性法氏囊病病毒，再重复步骤1)2～4次，得到病毒组织液；
3)取以9～11日龄的SPF鸡胚所制备的CEF细胞，以2×106～3.0×106细胞量/mL的接种量接种至含有5～10％(v/v)胎牛血清的M199培养基中培养过夜；
4)取步骤2)所得的病毒组织液稀释10-2～10-3倍后接种于步骤3)所得产物中，培养48～72小时后收获病毒液；
5)以步骤4)所得产物作为步骤4)所述病毒组织液，再重复步骤4)1～2次，得到CEF驯化种毒；
6)对步骤5)所述CEF驯化种毒进行蚀斑纯化，驯化过程包括：
A)取步骤5)所述CEF驯化种毒，进行梯度稀释后分别接种于铺满DF-1细胞单层的细胞培养板，于35～40℃吸附1h，弃去病毒液，加入含琼脂糖的病毒维持液，35～40℃条件下倒置培养72～96小时，挑取稀释倍数最大孔的蚀斑，将其溶于不含血清的病毒培养液，即得到蚀斑病毒；
B)以所述蚀斑病毒作为步骤A)所述CEF驯化种毒，再重复步骤A)2～4次，收获病毒。
2.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤1)中接种前先对传染性法氏囊病病毒进行10-1～10-3倍稀释，而后再接种。
3.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤3)中所述培养及步骤4)中所述培养，均是在37℃下进行的。
4.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤4)中接种前，步骤3)所得产物的CEF细胞已长满培养基单层。
5.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤6A)所述梯度稀释的稀释倍数分别为：10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍。
6.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤6A)中DF-1细胞是利用以下成分的培养基培养的：含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
7.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤6A)中所述病毒维持液是含有2％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
8.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤6)完成后继续执行以下步骤7)：
M)以步骤6)所得产物为种毒，进行10-2～10-3倍稀释后接种于长满单层的DF-1细胞，37℃培养下培养18～30小时，收获病毒液，检测TCID50；
N)步骤M)收获的病毒液作为步骤M)所述种毒，再重复步骤M)5～9次。
9.根据权利要求8所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤M)所述检测TCID50具体包括以下操作：消化DF-1细胞并计数，以2×105细胞量/mL的密度加入到96孔细胞板，100μL/孔，37℃培养20～28小时，将待测病毒做10倍系列稀释，弃去细胞液，加入10-6、10-7、10-8稀释度病毒液，37℃条件下培养96小时，按100％细胞病变判定效价。
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CN104087559A (zh) * 2014-07-09 2014-10-08 江苏省农业科学院 一种传染性法氏囊病毒、灭活疫苗及其制备方法

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鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株细胞克隆化毒在回鸡过程中致病性与VP2基因变异比较;朱瑞良;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士)农业科技辑》;20031215(第04期);摘要，第59页第1段至第73页最后1段 *

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