CN110066887A - 一种病毒运送培养基及其配制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种病毒运送培养基及其制备方法，病毒运送培养基包括溶剂；以及分散在该溶剂中的浓度为15g/L—25g/L的牛血清白蛋白、浓度为5mL/L～15mL/L的非必需氨基酸、浓度为80000～120000单位/L的青霉素、浓度为80000～120000单位/L的链霉素、浓度为0.1～0.5mg/L的两性霉素B。其制备方法：1.根据设定的配制体积，按剂量称取各组份，用hanks溶液配制，混匀，最后以hanks溶液定容预设配制体积；2.在万级净化车间百级操作台内依次经MILLIPORE、0.4μm及0.22μm膜过滤，然后分装入采样管内。
Description
技术领域
本发明属于本发明涉及病毒采样及检测领域，特别涉及用于病毒采样后的保存及运送的病毒运送培养基及其配制方法。
背景技术
病毒是非细胞型微生物，须在活细胞内寄生并复制,具有高度的寄生性，它个体微小、无完整细胞结构，主要由核酸和蛋白质外壳组成。
随着社会的发展和环境变化，研究疾病病因、病理，以及预防疾病、研究各类健康及危险评估等工作对人类的医学实践有着重要的意义。早在公元1400年就有了关于病毒的记载，对其的发现和研究对人类的生存有着重大意义。病毒的检测涉及病毒的分离与鉴定、感染单位的测定、颗粒的检测、血清学检测以及核酸的检测，而病毒的采样和运送则是这些检测前期非常重要的一个环节，对病毒样本的质量有着重要的影响。
常规的病毒采样方法是用采样拭子对病毒进行采样后，放入hanks液或其他缓冲液中，待后续实验。该法需要低温保存以免杂菌滋生，而低温保存运送成本较高，且该法没有解决在采样运送时间间隔中病毒活性易下降、病毒核酸、抗原等遭降解的问题。
发明内容
本发明是为解决上述问题而进行的，通过提供一种病毒运送培养基及其制备方法来实现病毒的有效保存和运送。为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种病毒运送培养基，包括溶剂；以及分散在该溶剂中的浓度为15g/L—25g/L的牛血清白蛋白、浓度为5mL/L～15mL/L的非必需氨基酸、浓度为80000～120000单位/L的青霉素、浓度为80000～120000单位/L的链霉素、浓度为0.1～0.5mg/L 的两性霉素B。
优选的，在本发明提供的病毒运送培养基中，溶剂为hanks溶液。
优选的，在本发明提供的病毒运送培养基中，溶剂中分散有浓度为20g/L的牛血清白蛋白、浓度为10mL/L的非必需氨基酸、浓度为100000单位/L的青霉素、浓度为100000 单位/L的链霉素、浓度为0.25mg/L的两性霉素B。
本发明的第二方面，提供了病毒运送培养基的制备方法，包括如下步骤：根据设定的配制体积，按剂量称取各组份，用hanks溶液配制，混匀，最后以hanks溶液定容预设配制体积；步骤2，在万级净化车间百级操作台内依次经MILLIPORE、0.4μm及0.22μm膜过滤，然后分装入采样管内。
使用时，在采样拭子采样后，将采样拭子放入采样管内，然后将拭子折断，对采样管进行封存。
本发明根据美国invitrogen公司hanks液，在其配方基础上(1)加入三抗(青霉素，链霉素，两性霉素B)，以克服常温运输下运送培养基中易滋生杂菌的问题。青霉素对大多数革兰氏阳性菌和少数的革兰氏阴性菌有效，而链霉素对革兰氏阴性菌和少数的革兰氏阳性菌有效，两性霉素B则对大多数真菌如念珠菌、曲菌、隐球菌等有效；(2)加入牛血清白蛋白提供生长因子，加入非必需氨基酸补充营养，减少病毒体外的生物合成的负担，以此克服病毒采样后运送过程中活性易下降、病毒核酸、抗原等遭降解的问题。
配制好的培养基在万级净化车间百级操作台内经MILLIPORE，0.4及0.22μm膜过滤分装，改变传统采样液与采样管同时在Y射线上灭菌工艺，避免了采样液内三抗及主要成分裂变使活性消失的问题，有效提高所检病毒的阳性率。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
发明的作用与效果
根据本发明提供的病毒运送培养基及其配制方法，由于加入了三抗(青霉素，链霉素，两性霉素B)，克服了常温运输下运送培养基中易滋生杂菌的问题；由于加入了牛血清白蛋白提供生长因子，加入非必需氨基酸补充营养，减少病毒体外的生物合成的负担，克服了病毒采样后运送过程中活性易下降、病毒核酸、抗原等遭降解的问题，因此，本发明的病毒既克服了现有技术中运送培养基需要低温保存所导致的运送成本较高的缺陷，又解决了采样运送时间间隔中病毒活性易下降、病毒核酸、抗原等遭降解的问题。
此外，本发明的病毒运送培养基配制方法简单，易掌握，有利于降低制备成本。
附图说明
图1为本发明实施例一中的分别含有三抗、双抗、单抗以及空白对照转运培养基的抑菌效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所使用的试剂和原料均可通过商业途径购买获得。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例一 病毒运送培养基的制备
步骤1，根据设定的配制体积，按剂量浓度为20g/L的牛血清白蛋白、浓度为10mL/L的非必需氨基酸、浓度为100000单位/L的青霉素、浓度为100000单位/L的链霉素、浓度为0.25mg/L的两性霉素B，用hanks溶液配制，混匀，最后以hanks溶液定容预设配制体积；步骤2，在万级净化车间百级操作台内依次经MILLIPORE、0.4μm及0.22μm膜过滤，然后分装入采样管内。
使用时，在采样拭子采样后，将采样拭子放入采样管内，然后将拭子折断，对采样管进行封存。
实施例二 病毒运送培养基放置3天后的染菌量对比观察实验
采用PCR产物检测实验的方法，对实施例一(C+++组)与添加二抗(C++组)、添加一抗(C+组)、不添加抗生素(C组)的运送培养基放置3天后的染菌量进行对比观察。
本实验中所用主要试剂由上海试一化学试剂有限公司、Sigma公司提供。
本实验的原理为利用聚合酶链反应(PCR)来扩增运送培养基中感染细菌的DNA片段，再对其进行琼脂凝胶电泳，通过比较得到的电泳条带大小可看出细菌DNA含量的多少，可间接显示染菌量的多少。染菌量越少对采样后期的实验检测影响越小，即运送培养基能保存高质量样本的条件则越好。
本实施例的实验分组如表1所示：
表1四组病毒运送培养基的组成
以上各组均按配制方法配制好，其中C+++组即为实施例一涉及的配方。各组以相同密封条件在室温下放置3天后取样进行PCR产物检测实验，实验结果见图1。
如图1所示：电泳条带大小比较为C、C+>C++>C+++，说明C、C+、C++、C+++ 各组细菌DNA含量依次递减，即染菌量依次递减，其中C+++组无条带，即无菌。
实施例三 运送培养基保存流感病毒H1N2和肠道病毒71型(EV71)的效果观察实验
本实施例中所用流感病毒H1N2和肠道病毒71型(EV71)由上海市徐汇区疾病预防控制中心提供，所用293T细胞来自ATCC(CRL-3216)，所用肠道病毒(EV71)双重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)由深圳生科原生物股份有限公司提供。
(1)将流感病毒H1N2用实施例一的运送培养基保存，共设6组，在室温条件和2℃～8℃条件下分别放置0、1d、2d，将样品加入准备好的宿主细胞293T细胞孔中，每孔100ul, 在37℃、5％CO2培养箱培养3d，用显微镜观察细胞病变(CPE)，计算细胞培养半数感染量(TCID50)。以hanks缓冲液为对照组进行相同实验。结果见表2：
表2流感病毒H1N2在病毒运送培养基保存一定时间后的TCID50
(2)将肠道病毒71型(EV71)用实施例一的运送培养基保存，共设6组，在室温条件和2℃～8℃条件下分别放置0、1d、2d，分别取样使用肠道病毒(EV71)双重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)检测样品中肠道病毒71型(EV71)RNA的浓度，按每毫升样品中病毒RNA拷贝数(copies/ul)计，数值越大说明病毒RNA浓度越高，即保存效果越好。以hanks缓冲液为对照组进行相同实验。结果见表3：
表3肠道病毒71型在病毒运送培养基保存一定时间后的TCID50
以上三个实施例以本发明的最优实施例为例对本发明的病毒转运培养基的配制方法以及效果进行了描述。
在本发明中，分散在hanks溶液中的各组分的浓度可以在一定范围内，如本发明的病毒转运培养基包括hanks溶液，以及分散在该溶剂中的浓度为15g/L～25g/L的牛血清白蛋白、浓度为5mL/L～15mL/L的非必需氨基酸、浓度为80000～120000单位/L的青霉素、浓度为80000～120000单位/L的链霉素、浓度为0.1～0.5mg/L的两性霉素B。在使用时，可根据实际情况选择合适的浓度。
牛血清白蛋白的浓度选择在15g/L～25g/L的目的是，低于15g/L无法提供足够的生长因子，易造成病毒活性下降，高于25g/L容易出现生长因子过剩的情况，造成浪费；
非必需氨基酸的浓度选择在5mL/L～15mL/L，低于5mL/L无法提供足够的营养，易造成病毒无法正常新陈代谢，加重病毒体外的生物合成的负担，高于15mL/L容易出现营养过剩的情况，不仅造成浪费，而且可能会对病毒正常新陈代谢起反作用；
青霉素的浓度为80000～120000单位/L、链霉素的浓度为80000～120000单位/L、两性霉素B的浓度为0.1～0.5mg/L，浓度过低难以起到相应的杀菌作用，过高则有可能对病毒产生不利影响。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (4)
1.一种病毒运送培养基，其特征在于，包括：
溶剂；以及分散在所述溶剂中的浓度为15g/L—25g/L的牛血清白蛋白、浓度为5mL/L～15mL/L的非必需氨基酸、浓度为80000～120000单位/L的青霉素、浓度为80000～120000单位/L的链霉素、浓度为0.1～0.5mg/L的两性霉素B。
2.根据权利要求1所述的病毒运送培养基，其特征在于：
其中，所述溶剂为hanks溶液。
3.根据权利要求1所述的病毒运送培养基，其特征在于：
其中，所述溶剂中分散有浓度为20g/L的牛血清白蛋白、浓度为10mL/L的非必需氨基酸、浓度为100000单位/L的青霉素、浓度为100000单位/L的链霉素、浓度为0.25mg/L的两性霉素B。
4.一种权利要求1～3任一项所述的病毒运送培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，根据设定的配制体积，按剂量称取各组份，用hanks溶液配制，混匀，最后以hanks溶液定容预设配制体积；
步骤2，在万级净化车间百级操作台内依次经MILLIPORE、0.4μm及0.22μm膜过滤，然后分装入采样管内。
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