CN117487664B - 双歧杆菌分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了双歧杆菌分离培养方法，涉及生物医药技术领域。所述的方法包括以下步骤：（1）将成人粪便样本加入富集培养基，厌氧培养，得到富集培养液；（2）将富集培养液进行梯度稀释，得稀释液；（3）将稀释液涂布于筛选培养基中，厌氧培养，得初筛菌；（4）挑取双歧杆菌单菌落，接种于液体增菌培养基中，厌氧培养，得双歧杆菌；步骤（3）中所述的筛选培养基按照重量份数计包括蛋白胨20‑30份、可溶性淀粉0.1‑10份、氯化钠1‑10份、琼脂5‑15份、5‑15无菌脱纤维羊血和0.01‑1份盐酸头孢吡肟；步骤（3）中所述厌氧培养的时间为48‑72h。本发明的方法分离双歧杆菌的效果较好。

Description

双歧杆菌分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及双歧杆菌分离培养方法。
背景技术
双歧杆菌（Bifidobacterium）属于放线菌门双歧杆菌科，是革兰氏阳性，厌氧，最适生长环境为37℃，pH为6.0-7.0。双歧杆菌在显微镜下，常为弯曲的杆状、L、V或者Y型等多种形态，末端常常分叉，其菌落呈光滑、瓷白色或白色凸起。目前研究较为广泛的双歧杆菌主要包括两双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）、婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）以及动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）。
双歧杆菌具有严格厌氧的特性，使其在实验室中的培养并不理想，从自然环境、益生菌食品、动物、人体中分离双歧杆菌具有几种常见的培养基类型，包括：（1）MRS培养基，其为双歧杆菌菌株常规培养和复苏的首选培养基。（2）TPY培养基，是用途广泛的商业培养基，其允许大多数双歧杆菌物种生长，被推荐作为已知双歧杆菌物种的选择性培养基。（3）BL培养基可以对乳制品和肠道中的双歧杆菌进行非选择性计数，但是非选择性意味着能分离出其他细菌，对双歧杆菌的筛选有一定的困难。（4）TOS-MUP是商业上可用的双歧杆菌选择性琼脂培养基，可以选择性地计数发酵牛奶中常用的双歧杆菌。
中国专利CN115216410A中公开了一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，采用的培养基是以TPY培养基为基础进行改良的选择性培养基。所述的改良TPY包括抗生素莫匹罗星、生物调控因子A、显色剂X-Gal和生长调控因子B。该发明的改良TPY能选择性地抑制粪便样品中的革兰氏阴性菌，且对双歧杆菌的生长具有促进作用，使得其在平板表面生长出显蓝色的典型菌落，可显著降低复杂混合样品中双歧杆菌的分离难度，对双歧杆菌的筛选培养具有实用价值。
中国专利CN109136145A中公开了一种从兔粪中分离双歧杆菌及其纯化方法，包括以下步骤：步骤一：制备样品液；步骤二：稀释样品液；步骤三：分离培养；步骤四：制备纯化培养基；步骤五：纯化培养。该发明通过分离培养提高了菌种的纯化，解决了现有分离出的双歧杆菌活菌量较低的问题；通过对纯化培养基进行优化，有效的缩短了培养时间，解决了现有培养时间较长成本高，效率较低的问题。
双歧杆菌难以从人体肠道中分离出的原因是肠道微生物是一个复杂而庞大的系统，微生物的种类非常多，使用非选择性的培养基不但可以分离出双歧杆菌属的细菌，还能够分离出大量不属于双歧杆菌属的细菌，使得工作量较大但分离效果较差，并且其他微生物可能与双曲杆菌属的细菌争夺营养物质，导致双歧杆菌属的细菌的存活率下降。并且，双歧杆菌属的细菌对氧气非常敏感，使得其在常规大气条件下的存活时间较短。因此，目前需要一种分离双歧杆菌效果较高的分离方法。
发明内容
本发明的目的是提供双歧杆菌分离培养方法，具有较好的分离效果。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种从成人粪便中分离双歧杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）将成人粪便样本加入富集培养基，厌氧培养，得到富集培养液；
（2）将富集培养液进行梯度稀释，得稀释液；
（3）将稀释液涂布于筛选培养基中，厌氧培养，得初筛菌；
（4）挑取双歧杆菌单菌落，接种于液体增菌培养基中，厌氧培养，得双歧杆菌；
步骤（3）中所述的筛选培养基按照重量份数计包括蛋白胨20-30份、可溶性淀粉0.1-10份、氯化钠1-10份、琼脂5-15份、5-15份无菌脱纤维羊血和0.01-1份盐酸头孢吡肟；
步骤（3）中所述厌氧培养的时间为48-72h。
优选地，步骤（3）中所述的筛选培养基按照重量份数计包括蛋白胨23份、可溶性淀粉1份、氯化钠5份、琼脂10份、5份无菌脱纤维羊血和0.02份盐酸头孢吡肟。
进一步地，所述的蛋白胨为特殊蛋白胨。
根据本发明的一些实施方式，所述的筛选培养基包括特殊蛋白胨23g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、琼脂10g、5%无菌脱纤维羊血和0.02mg盐酸头孢吡肟。
进一步优选地，步骤（1）中所述的成人粪便样本的接种量为1.5-2%。
进一步优选地，步骤（1）中所述的富集培养基按照重量份数计包括：蛋白胨5-15份、葡萄糖10-30份、酵母浸粉1-10份、牛肉膏5-15份、K2HPO41-5份、柠檬酸二铵1-5份、乙酸钠1-10份、MgSO4·7H2O 0.1-1份、MnSO4·4H2O 0.1-1份、吐温80 1-10份和0.1-5份L-半胱氨酸。
再进一步优选地，所述的富集培养基包括蛋白胨10份、葡萄糖20份、酵母浸粉5份、牛肉膏10份、K2HPO42份、柠檬酸二铵2份、乙酸钠5份、MgSO4·7H2O 0.58份、MnSO4·4H2O0.25份、吐温80 1份和0.5份L-半胱氨酸。
优选地，所述的富集培养基的pH为6-8。
进一步优选地，所述的富集培养基的pH为7.0±0.1。
优选地，步骤（1）中所述的厌氧培养的时间为18-24h。
进一步优选地，步骤（1）中所述的厌氧培养的时间为24h。
优选地，步骤（2）中生理盐水的配制包括以下步骤：称取氯化钠8.5g，加热溶解于1L蒸馏水中，分装于试管中，121℃高压灭菌20min。
优选地，步骤（2）中所述的梯度稀释具体为：吸取1份富集培养液加入9份生理盐水，混匀，记为10-1稀释梯度，从10-1梯度中吸取1份混合液加入9份生理盐水，记为10-2稀释梯度，重复上述稀释步骤，依次得到10-3、10-4、10-5、10-6稀释液。
优选地，步骤（3）中厌氧的条件为90%N2、5%CO2、5%H2。
优选地，步骤（3）中厌氧培养的时间为72h。
优选地，步骤（3）中厌氧培养的温度为30-38℃。
进一步优选地，步骤（3）中厌氧培养的温度为36-38℃。
优选地，步骤（3）中所述的筛选培养基的pH为6-8。
进一步优选地，步骤（3）中所述的筛选培养基的pH为7.3±0.2。
进一步地，步骤（4）中所述的液体增菌培养基包括：脑心浸液肉汤粉末30-40份、0.01-1%的氯化血红素和0.01-1%的维生素K1。
更进一步地，步骤（4）中所述的液体增菌培养基包括：脑心浸液肉汤粉末38.5份、0.01%的氯化血红素和0.01%的维生素K1。
优选地，步骤（3）得到初筛菌后还包括菌株纯化的步骤。
进一步优选地，所述的菌株纯化为：从计数范围在30-300的培养基平板上，挑取双歧杆菌单菌落，分别三区划线于筛选培养基平板上，放置于30-38℃条件下厌氧培养48-72h。
优选地，所述的双歧杆菌包括但不限于长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、两双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌亚种、假小链双歧杆菌。
进一步优选地，所述的双歧杆菌包括但不限于长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、两双歧杆菌。
优选地，所述的双歧杆菌的活化包括：按1-10%接种量将双歧杆菌接种至液体增菌培养基进行活化。
进一步地，所述的接种量为5%。
根据本发明的一些实施方式，从成人粪便中筛选双歧杆菌的方法包括以下步骤：
（1）富集培养：将成人粪便样本加入到MRS液体培养基中，于36-38℃条件下厌氧培养18-24h，得到富集培养液；
（2）梯度稀释：吸取1份富集培养液加入9份生理盐水，混匀，记为10-1稀释梯度，从10-1梯度中吸取1份混合液加入9份生理盐水，记为10-2稀释梯度，重复上述稀释步骤，依次得到10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；
（3）涂布培养：吸取步骤（2）中的稀释液涂布于筛选培养基中，36-38℃条件下厌氧培养48-72h；
（4）菌株纯化：从计数范围在30-300的培养基平板上，挑取双歧杆菌单菌落，分别三区划线于筛选培养基平板上，放置于36-38℃条件下厌氧培养48-72h；
（5）单菌扩大培养：挑取单菌落，接种于液体增菌培养基中，36-38℃厌氧培养24-48h，得双歧杆菌。
优选地，所述的双歧杆菌的鉴定方法选自ITS、18S、28S、测序、PCR鉴定中的任意一种。
进一步地，所述的双歧杆菌的鉴定方法为PCR鉴定。
优选地，所述的PCR鉴定包括使用双歧杆菌特异性引物进行菌落PCR。
进一步地，所述的特异性引物包括Bif164-F和Bif662-R；所述的Bif164-F的序列如SEQ ID NO:1所示，所述的Bif662-R的序列如SEQ ID NO:2所示。
具体地，SEQ ID NO:1的序列为GGGTGGTAATGCCGGATG；SEQ ID NO:2的序列为CCACCGTTACACCGGGAA。
优选地，所述的PCR的反应体系为25μL反应体系，包括DNA模板1μL、PCR预混液12.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL，加水至25μL。
优选地，所述的PCR的反应程序为：94℃，5min，循环1次；94℃，30s，54℃，40s，72℃，90s，循环35次；72℃，10min，循环1次。
又一方面，本发明提供了上述的方法在鉴定、分析双歧杆菌中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供的从成人粪便中筛选双歧杆菌的方法解决了从人体粪便中筛选双歧杆菌困难的问题，提高了人体粪便中筛选双歧杆菌的效率。
附图说明
图1为PCR的试验结果图。
图2为实施例1的筛选培养基的筛选、分离效果图。
图3为实施例2的筛选培养基的筛选、分离效果图。
图4为对比例1的筛选培养基的筛选、分离效果图。
图5为对比例2的筛选培养基的筛选、分离效果图。
图6为对比例3的筛选培养基的筛选、分离效果图。
图7为对比例4的筛选培养基的筛选、分离效果图。
图8为对比例5的筛选培养基的筛选、分离效果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实施例1筛选培养基的配置
1. 维生素K1溶液配制方法：称取维生素K1 0.1g，加入无水乙醇99ml，过滤除菌，于4℃冰箱保存。
2. 氯化血红素溶液配制方法：称取氯化血红素0.1g溶于1mL浓度为1mol/L氢氧化钠液中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，于4℃冰箱保存。
3. 筛选培养基的配置：取特殊蛋白胨23g、可溶性淀粉1g、氯化钠5.0g、琼脂10.0g、0.02mg盐酸头孢吡肟溶于1L蒸馏水中，调节pH7.3±0.2，121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至50℃左右，加入5%的无菌脱纤维羊血倾入无菌平皿，备用。
4. BHIS液体培养基的配置：称取脑心浸液肉汤粉末38.5g，加入0.01%的氯化血红素及0.01%的维生素K1，加热溶解于1L蒸馏水中，分装至试管中，121℃高压灭菌15min，备用。
筛选培养基用于双歧杆菌的初筛，BHIS液体培养基用于初筛所得双歧杆菌的扩大培养。
实施例2
1. 维生素K1溶液配制方法：称取维生素K1 0.1g，加入无水乙醇99ml，过滤除菌，于4℃冰箱保存。
2. 氯化血红素溶液配制方法：称取氯化血红素0.1g溶于1mL浓度为1mol/L氢氧化钠液中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，于4℃冰箱保存。
3. 筛选培养基的配置：取特殊蛋白胨23g、可溶性淀粉1g、氯化钠5.0g、琼脂10.0g、0.05mg盐酸头孢吡肟溶于1L蒸馏水中，调节pH7.3±0.2，121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至50℃左右，加入5%的无菌脱纤维羊血倾入无菌平皿，备用。
4. BHIS液体培养基的配置：称取脑心浸液肉汤粉末38.5g，加入0.01%的氯化血红素及0.01%的维生素K1，加热溶解于1L蒸馏水中，分装至试管中，121℃高压灭菌15min，备用。
筛选培养基用于双歧杆菌的初筛，BHIS液体培养基用于初筛所得双歧杆菌的扩大培养。
对比例1 改良TPY培养基的配置
1. 抗生素溶液的配置：取5支10mg莫匹罗星里盐（青岛海博生物）过滤除菌后置于4℃冰箱备用；浓度为20mg/mL X-GAL（上海生工生物）过滤除菌后置于4℃冰箱备用。
2. 改良TPY固体培养基的配置：取酪蛋白10.0g、大豆胨5.0g、酵母粉2.0g、葡萄糖5.0g、L-半胱氨酸0.5g、磷酸氢二钾2.0g、氯化镁0.5g、硫酸锌0.25g、氯化钙0.15g、氯化铁0.0001g、琼脂20.0g和吐温80 1.0g溶于1L蒸馏水中，调节pH6.5±0.1，121℃高压灭菌15min；待灭菌后培养基降温至50-60℃左右，于超净工作台加入添加量为50mg/L莫匹罗星里盐、200μg/100mL的X-GAL，摇晃均匀后倒板待用。
3. 改良TPY液体培养基的配置：取酪蛋白10.0g、大豆胨5.0g、酵母粉2.0g、葡萄糖5.0g、L-半胱氨酸0.5g、磷酸氢二钾2.0g、氯化镁0.5g、硫酸锌0.25g、氯化钙0.15g、氯化铁0.0001g和吐温80 1.0g溶于1L蒸馏水中，调节pH6.5±0.1，再分装9mL于各个试管中，121℃高压灭菌15min；灭菌后室温放置待用，在使用前按比例加入添加量为50mg/L莫匹罗星里盐。
改良TPY固体培养基用于双歧杆菌的初筛，改良TPY液体培养基用于初筛所得双歧杆菌的扩大培养。
对比例2改良MRS培养基的配置
1. L-半胱氨酸不耐热，必须将其它物质加热溶化并灭菌后，在无菌室用灭过菌的无菌过滤器过滤后按比例加入到锥形瓶中，重新扎好口。
2. 0.05% L-半胱氨酸溶液的配置：将L-半胱氨酸溶于无菌超纯水，配制成0.05%的溶液，过滤除菌放置4℃冰箱备用。
3. 改良MRS固体培养基的配置：蛋白胨10g、葡萄糖20g、酵母浸粉5g、牛肉膏10g、K2HPO42g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐温80 1mL、L-半胱氨酸0.5g和琼脂20g溶于1L蒸馏水，调节pH7.0±0.1，121℃灭菌15min；L-半胱氨酸不能被高压灭菌且需要现配现用，将其溶于无菌蒸馏水中，配置成浓度为0.05% L-半胱氨酸，过滤除菌，待灭菌后培养基温度降至50-60℃左右加入，摇晃均匀后倒板备用。
4. 改良MRS液体培养基的配置：蛋白胨10g、葡萄糖20g、酵母浸粉5g、牛肉膏10g、K2HPO42g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐温80 1mL和L-半胱氨酸0.5g溶于1L蒸馏水，调节pH7.0±0.1，分装9mL于各个试管中，121℃高压灭菌15min；灭菌后室温放置待用，在使用前加入0.05% L-半胱氨酸。
改良MRS固体培养基用于双歧杆菌的初筛，改良MRS液体培养基用于初筛所得双歧杆菌的扩大培养。
对比例3 LBS琼脂培养基的配置
1. LBS琼脂培养基的配置：取酵母浸粉5.0g、胰酪蛋白胨10.0g、磷酸二氢钾6.0g、硫酸亚铁0.034g、硫酸镁0.575g、葡萄糖20.0g、乙酸钠25.0g、柠檬酸铵2.0g、硫酸锰0.12g、琼脂15.0g、再吸取吐温80 1mL和冰乙酸1.3mL，加热搅拌溶解于1L蒸馏水中，调节pH值5.5±0.2，118℃高压灭菌15min，冷却至一定温度后倒板待用。
在该筛选方案中，LBS琼脂培养基用于双歧杆菌的初筛，改良MRS液体培养基用于初筛所得双歧杆菌的扩大培养。
对比例4 酸性MRS固体培养基的配置
1. 酸性MRS固体培养基的配置：取蛋白胨10g、葡萄糖20g、酵母浸粉4g、牛肉膏5g、K2HPO42g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、MgSO40.2g、MnSO40.05g、吐温80 1mL和琼脂20g于1L蒸馏水中，调节pH值6.2±0.1，121℃高压灭菌15min，冷却至一定温度后倒板待用。
在该筛选方案中，酸性MRS固体培养基用于双歧杆菌的初筛，改良MRS液体培养基用于初筛所得双歧杆菌的扩大培养。
对比例5
对比例5与实施例1的区别仅在于筛选培养基中不包含盐酸头孢吡肟，其余皆相同。
试验例
1. 材料来源
成人粪便样本60份、婴儿粪便27份、母乳样品61份，样品分别加入含20%甘油的无菌2mL离心管中，进行分装，于-80℃冰箱冻存备用。
2. 富集培养
取2%接种量的样品，加入到20mL改良MRS液体培养基中，于37±1℃条件下厌氧培养24h，得到富集培养液。
3. 稀释涂布
生理盐水的配置：称取氯化钠8.5g，加热溶解于1L蒸馏水中，分装于试管中，121℃高压灭菌20min，备用。
固体筛选培养基的配置分别见实施例1-2和对比例1-5。
在无菌环境中，吸取1mL富集培养液加入9mL生理盐水，斡旋均匀，记为10-1稀释梯度，从10-1梯度的试管中吸取1mL混合液于9mL生理盐水中，记为10-2稀释梯度，以此类推，操作至10-6稀释梯度。
取各个稀释梯度，各吸取100μL涂布于固体筛选培养基中，每个梯度稀释涂布1个平板，并留空白培养皿涂布生理盐水作阴性对照及取一株库中现有双歧杆菌做阳性对照，将其放入厌氧工作站（90% N2、5% CO2、5% H2）中，37±1℃条件下厌氧培养72h，观察菌落生长情况。
4. 菌株纯化
从计数范围在30-300的培养基平板上，挑取具有典型双歧杆菌特征的单菌落，分别三区划线于筛选培养基平板上，倒置平皿，放置于37±1℃条件下厌氧培养48-72h。
5. 单菌扩大培养
液体增菌培养基的配置分别见实施例1-2和对比例1-4。
挑取纯化两次后的单菌落，接种于9mL液体增菌培养基中，37±1℃厌氧培养24h。
6. 菌种保存
取菌液1600μL，加入400μL纯甘油溶液，于保菌管混匀后放置于-80℃冻存。
7. 镜检观察及菌落PCR鉴定
对上述进行扩大培养的菌株进行革兰氏染色，在普通光学显微镜下面观察，挑选出革兰氏阳性（呈紫色）、棒状、杆状或分叉状的菌株。
将观察到具有此特性的菌株使用双歧杆菌特异性引物Bif164-F/Bif662-R进行菌落PCR，其中，上游引物为Bif164-F（GGGTGGTAATGCCGGATG，序列如SEQ ID NO:1所示），下游引物为Bif662-R（CCACCGTTACACCGGGAA，序列如SEQ ID NO:2所示）。PCR采用25μL体系，以甘油管中保存的单克隆菌落为模板，加入0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，12.5μL PCR预混液，并用ddH2O补足至25μL。加好体系之后用移液枪反复吹吸混合液进行混匀，混匀后进行离心。
表1 PCR扩增体系
离心后放入梯度PCR仪上进行PCR反应，反应程序如下表2。
表2 PCR反应程序
（1）取1.0 g琼脂糖粉末到100 mL的1×电泳缓冲液中，搅拌溶解均匀后放入微波炉中加热30 s，注意观察，防止加热过程发生爆沸现象，加热后取出晃荡摇匀，确保琼脂糖完全溶解。
（2）待其冷却至40-50℃时，加入10 uL GelRed核酸染料混匀，倒入插有梳子的水平板中，待其冷却凝固制得凝胶。
（3）将凝胶板放入电泳缓冲液中，从左到右依次加入6 μL Marker、不同菌落样品的PCR反应产物、阴性对照和阳性对照。
（4）设置电压100 V开始跑电泳，20-30 min后取出凝胶板进行照胶观察，目标条带为1500 bp左右的片段，根据目标片段的有无来判断该菌株是否为双歧杆菌。
（5）PCR结果如图1所示，将获得单一明亮条带的PCR产物纯化后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果通过BLAST程序（基本的局部比对搜索工具）与GenBank（基因库）进行序列比对，进一步从种水平上面鉴定筛选菌株为具体哪一株双歧杆菌。
8. 目标菌株活化
液体增菌培养基的配置分别见实施例1-2和对比例1-4。
根据测序结果，剔除非目标菌株的甘油管，将目标菌株甘油管自菌种保藏库中取出后，于上述液体增菌培养基活化第一代，按5%接种量接种至液体增菌培养基再活化两代后，取菌液1600μL，与400μL纯甘油溶液于保菌管中混匀后放置于-80℃长期冻存。
9. 筛菌结果
不同筛选培养基的筛选、分离效果如图2-图8所示，可以看出，通过采用实施例1-2和对比例1-5的方法，发现使用本发明实施例1-2的筛选培养基筛选成人粪便中长双歧杆菌效果最好。对各样本中筛选得到的双歧杆菌进行计数，结果如下表3-5，实施例1的筛选培养基从成人粪便中共筛选出8株长双歧杆菌、6株短双歧杆菌、6株动物双歧杆菌；从婴儿粪便中共筛选出4株长双歧杆菌、3株短双歧杆菌、4株动物双歧杆菌；从母乳中共筛选出4株短双岐杆菌。实施例2的筛选培养基从成人粪便中共筛选出7株长双歧杆菌、5株短双歧杆菌、4株动物双歧杆菌；然而使用对比例1-5的筛选培养基筛选得到的双歧杆菌数量远小于实施例1中的双歧杆菌数量，说明本申请的实施例1的筛选培养基具有较好的筛选效果。
表3 成人粪便中双歧杆菌计数
表4 婴儿粪便中双歧杆菌计数
表5 母乳样本中双歧杆菌计数
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种从成人粪便中分离培养双歧杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将成人粪便样本加入富集培养基，厌氧培养，得到富集培养液；
（2）将富集培养液进行梯度稀释，得稀释液；
（3）将稀释液涂布于筛选培养基中，厌氧培养，得初筛菌；
（4）挑取双歧杆菌单菌落，接种于液体增菌培养基中，厌氧培养，得双歧杆菌；
步骤（3）中所述的筛选培养基由以下成分制成：特殊蛋白胨20-30重量份、可溶性淀粉0.1-10重量份、氯化钠1-10重量份、琼脂5-15重量份、2×10-5重量份或5×10-5重量份盐酸头孢吡肟和5%无菌脱纤维羊血；
步骤（3）中所述厌氧培养的时间为48-72h；
步骤（1）中所述的富集培养基按照重量份数计由以下成分制成：蛋白胨5-15份、葡萄糖10-30份、酵母浸粉1-10份、牛肉膏5-15份、K2HPO4 1-5份、柠檬酸二铵1-5份、乙酸钠1-10份、MgSO4·7H2O 0.1-1份、MnSO4·4H2O 0.1-1份、吐温80 1-10份和0.1-5份L-半胱氨酸；
步骤（4）中所述的液体增菌培养基由以下成分制成：脑心浸液肉汤粉末30-40份、0.01-1%的氯化血红素和0.01-1%的维生素K1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的成人粪便样本的接种量为1.5-2%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的厌氧培养的时间为18-24h，厌氧培养的温度为30-38℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的筛选培养基由以下成分制成：特殊蛋白胨23重量份、可溶性淀粉1重量份、氯化钠5重量份、琼脂10重量份、2×10-5重量份盐酸头孢吡肟和5%无菌脱纤维羊血。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中厌氧培养的温度为30-38℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的筛选培养基的pH为6-8。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的筛选培养基的pH为7.3。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104419744A (zh) * 2013-08-22 2015-03-18 山东鑫科生物科技股份有限公司 一种厌氧增菌培养基及其配制方法
CN108517347A (zh) * 2018-04-12 2018-09-11 江南大学 一种Bacteroides cellulosilyticus的筛选培养基及其应用
CN111793588A (zh) * 2020-08-19 2020-10-20 广东工业大学 一种厌氧菌培养基及其制备方法
CN115820458A (zh) * 2022-08-02 2023-03-21 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 具有缓解溃疡性结肠炎功效的长双歧杆菌050101及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104419744A (zh) * 2013-08-22 2015-03-18 山东鑫科生物科技股份有限公司 一种厌氧增菌培养基及其配制方法
CN108517347A (zh) * 2018-04-12 2018-09-11 江南大学 一种Bacteroides cellulosilyticus的筛选培养基及其应用
CN111793588A (zh) * 2020-08-19 2020-10-20 广东工业大学 一种厌氧菌培养基及其制备方法
CN115820458A (zh) * 2022-08-02 2023-03-21 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 具有缓解溃疡性结肠炎功效的长双歧杆菌050101及其应用

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