CN111793588A - 一种厌氧菌培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于微生物培养的技术领域，尤其涉及一种厌氧菌培养基及其制备方法。本申请提供了一种厌氧菌培养基，包括：基础液体培养基、半胱氨酸、树脂天青和促进剂；所述半胱氨酸与所述基础液体培养基的质量体积比为1/500～1/50；所述树脂天青的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/500～1/50；所述树脂天青的水溶液的浓度为0.2‑1g/L。本申请提供了一种厌氧菌培养基及其制备方法，能有效分离培养对氧极端敏感的厌氧菌，适用于临床分离使用。

Description

一种厌氧菌培养基及其制备方法
技术领域
本申请属于微生物培养的技术领域，尤其涉及一种厌氧菌培养基及其制备方法。
背景技术
近年来，厌氧菌(anaerobic bacteria)引起的感染越来越受到重视，厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，而不能在空气(18％氧气)和/或10％二氧化碳浓度下的培养基生长的细菌。
随着微生物培养基及检验技术的提高，厌氧菌的培养方法也在不断改进。在培养厌氧细菌的过程中，除严格的无氧环境外，培养基也是影响厌氧菌分离成功与否的重要因素。根据对氧气的耐受程度，厌氧菌分为三大类，分别为对氧极端敏感的厌氧菌、中度厌氧菌和耐氧厌氧菌。其中，对氧极端敏感的厌氧菌，这类厌氧菌对氧极为敏感，对厌氧条件要求很高，临床上很难分离。目前普通的厌氧菌培养基很难对该类厌氧菌进行分离培养。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种厌氧菌培养基及其制备方法，能有效分离培养对氧极端敏感的厌氧菌，适用于临床分离使用。
本申请第一方面提供了一种厌氧菌培养基，包括：
基础液体培养基、半胱氨酸、树脂天青和促进剂；
所述半胱氨酸与所述基础液体培养基的质量体积比为1/500～1/50；
所述树脂天青的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/500～1/50；所述树脂天青的水溶液的浓度为0.2-1g/L。
优选的，所述树脂天青的水溶液的浓度为0.2-0.8g/L；最优选的，所述树脂天青的水溶液的浓度为0.2g/L。
次优选的，所述半胱氨酸与所述基础液体培养基的质量体积比为1/300～1/200，更优选的，所述半胱氨酸与所述基础液体培养基的质量体积比为1/260～1/240，最优选的，所述半胱氨酸与所述基础液体培养基的质量体积比为1:250。
次优选的，所述树脂天青的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/250～1/150，更优选的，所述树脂天青的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/210～1/190，最优选的，所述树脂天青的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1:200。
作为优选，所述基础液体培养基选自脑心浸液培养基、胰蛋白胨大豆肉汤和LB培养基中的一种或多种。
作为优选，所述促进剂选自氯化血红素、维生素K3和维生素K1中的一种或多种。
作为优选，所述氯化血红素的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/500～1/50；所述氯化血红素的水溶液的浓度为5×10-4g/mL～5×10～5g/mL；更优选的，所述氯化血红素的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/150～1/50，最优选的，所述氯化血红素的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/110～1/90；
所述维生素K3的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/500～1/50；所述维生素K3的水溶液的浓度为1×10-4g/mL～1×10-5g/mL；更优选的，所述维生素K3的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/150～1/50，最优选的，维生素K3的水溶液的加入比例为1/110～1/90；
所述维生素K1的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/500～1/50；所述维生素K1的水溶液的浓度为1×10-4g/mL～1×10-5g/mL，更优选的，所述维生素K1的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/150～1/50，最优选的，所述维生素K1的水溶液的加入比例为1/110～1/90。
本申请第二方面提供了所一种厌氧菌培养基的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将基础液体培养基、半胱氨酸和树脂天青混合，得到混合物1；
步骤2、将所述混合物1通入厌氧瓶中，对所述厌氧瓶通入不含有氧气的气体，并使得所述厌氧瓶为常压状态，然后密封所述厌氧瓶，得到厌氧菌培养基混合物1；
步骤3、将所述厌氧菌培养基混合物1进行灭菌，得到厌氧菌培养基混合物2；
步骤4、将所述厌氧菌培养基混合物2与促进剂混合，制得厌氧菌培养基。
作为优选，步骤1中，还包括加热处理，将基础液体培养基、半胱氨酸和树脂天青混合加热，得到混合物1；所述加热的温度为80～100℃，优选的，所述加热的温度为85～95℃，最优选的，所述加热的温度为90～92℃。
作为优选，步骤2中，所述不含有氧气的气体为氮气或/和二氧化碳。
作为优选，步骤2中，还包括加热处理，将所述混合物1通入厌氧瓶中，对所述厌氧瓶加热至90～92℃后，通入不含有氧气的气体，并使得所述厌氧瓶为常压状态，然后密封所述厌氧瓶，得到厌氧菌培养基混合物1。
作为优选，所述厌氧瓶包括瓶体、瓶盖和橡胶瓶塞；
所述瓶体设有瓶口，所述橡胶瓶塞设置在所述瓶口中；
所述瓶盖盖合在所述瓶口上。
具体的，所述厌氧瓶包括瓶体、瓶盖和橡胶瓶塞；
所述瓶体设有细瓶口，所述细瓶口的外壁设有外螺纹，所述瓶盖设有内螺纹；
所述橡胶瓶塞设置在所述细瓶口中；
所述瓶盖的内螺纹与所述细瓶口的外螺纹螺纹连接。
作为优选，步骤3中，所述灭菌为高压蒸汽灭菌、电热烤箱干热灭菌中的一种。
作为优选，步骤3之后还包括步骤4，步骤4为将所述厌氧菌培养基置于恒温培养箱中静置，观察无杂菌后进行厌氧菌的培养。
更优选的，步骤4中，静置时间为8小时以上。
具体的，本申请的厌氧菌培养基中没有氧气，厌氧菌培养基呈淡黄色，步骤4中，在厌氧瓶中注射基础液体培养基、半胱氨酸、树脂天青和促进剂的过程中会带入微量空气至厌氧瓶的溶液中，因此，加入了促进剂的培养基不能马上使用，需要静置，待其氧气消耗殆尽，厌氧菌培养基中没有氧气，即肉眼观察培养基不显粉红色，呈淡黄色可进行接菌的操作。因此，步骤4的静置消耗微量氧气和观察是否有杂菌的作用。
本申请第三方面公开了所述厌氧菌培养基或所述厌氧菌培养基的制备方法制得的厌氧菌培养基在培养对氧极端敏感的厌氧菌中的应用。
其中，对氧极端敏感的厌氧菌选自艰难梭菌(ATCC 43255)、牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)、Solobabacterium moorei(JCM 10645)；兼性厌氧菌选自伴放线放线杆菌(即伴放线聚集杆菌，ATCC 29253)、大肠杆菌O157:H7(ATCC 43888)。
本申请的目的针对现有的厌氧菌培养基难以分离培养对氧极端敏感的厌氧菌的技术问题，本申请创造性的发现了在基础液体培养基中添加特定浓度的半胱氨酸和特定浓度的树脂天青，使得本申请的厌氧培养基在接种对氧极端敏感的厌氧菌时，能消除接种时带入的少量氧气，可以通过半胱氨酸和树脂天青的颜色判断本申请的厌氧培养基内的氧气状态，保证专性厌氧菌正常的生长，此外，添加促进剂能促进对氧极端敏感的厌氧菌的生长。
本申请还提供了厌氧菌培养基的制备方法，首先是半胱氨酸和树脂天青溶解在基础液体培养基中，转移至厌氧瓶中不断通入不含有氧气的气体，使得含有混合物1的厌氧瓶处于厌氧环境中，混合物1的颜色从红色(有氧环境)变成淡黄色(厌氧环境)，将厌氧瓶处于常压下，对厌氧瓶进行灭菌，然后在无菌环境下，对厌氧瓶注射促进剂，通过本申请的方法制得的厌氧菌培养无菌、且厌氧瓶中完全为厌氧状态。在接种对氧极端敏感的厌氧菌后，半胱氨酸和树脂天青能消除接种时带入的少量氧气，还可以通过半胱氨酸和树脂天青的颜色判断本申请的厌氧培养基内的氧气状态。实验证明了，当半胱氨酸和树脂天青处于特定浓度范围内，本申请的厌氧菌培养基能成功培养对氧极端敏感的厌氧菌，但是超出半胱氨酸和树脂天青处于特定浓度范围，对氧极端敏感的厌氧菌无法生长，说明了半胱氨酸和树脂天青处于特定浓度范围内可保持厌氧瓶的厌氧状态。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例1制得的产品1培养艰难梭菌的生长曲线图；
图2为本申请实施例2制得的产品2培养艰难梭菌的生长曲线图；
图3为本申请实施例3制得的产品3培养艰难梭菌的生长曲线图；
图4为本申请实施例4制得的产品4培养艰难梭菌的生长曲线图；
图5为本申请实施例5制得的产品5培养艰难梭菌的生长曲线图；
图6为本申请实施例1制得的厌氧菌培养基培养艰难梭菌生长24h后厌氧菌培养基的实物图；
图7为本申请实施例1制得的产品1培养艰难梭菌生长24h后的亮场图；
图8为本申请实施例1制得的产品1培养艰难梭菌生长24h后在270nm紫外下的荧光图；
图9为本申请实施例1制得的产品1培养艰难梭菌生长24h后取菌液在培养专性厌氧细菌艰难梭菌的固体培养基中培养48h的平板图；
图10为本申请实施例1所用的厌氧瓶的结构；
图11为本申请对比例1制得的对照产品1培养艰难梭菌的生长曲线图；
图12为本申请对比例2制得的对照产品2培养艰难梭菌的生长曲线图；
图13为本申请对比例3制得的对照产品3培养艰难梭菌的生长曲线图。
具体实施方式
本申请提供了一种厌氧菌培养基及其制备方法，用于解决现的厌氧菌培养基难以分离培养对氧极端敏感的厌氧菌的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用原料均为市售或自制，以下实施例所用的厌氧瓶为细口厌氧瓶，细口厌氧瓶的结构如图10所示，细口厌氧瓶包括瓶体3、瓶盖1和橡胶瓶塞2；瓶体设有细瓶口，细瓶口的外壁设有外螺纹，瓶盖1设有内螺纹；橡胶瓶塞2塞置在细瓶口中；瓶盖1的内螺纹与细瓶口的外螺纹螺纹连接。
实施例1
本申请实施例提供了第一种厌氧菌培养基，具体步骤如下：
1、在烧杯中添加脑心浸液培养基(即BHI液体培养基)、半胱氨酸和树脂天青，根据树脂天青溶液：脑心浸液培养基为1:200(v/v)的比例加入树脂天青溶液(树脂天青溶解在去离子水中，树脂天青的浓度为0.2g/L)，再根据半胱氨酸：脑心浸液培养基为1:250(w/v)的比例加入半胱氨酸。
2、然后加热至80℃，搅拌溶解后分装到厌氧瓶中，分装的体积需明确。
3、加热厌氧瓶，待温度到达90℃，通入15min高纯度氮气，此时厌氧瓶中的混合物1的颜色从红色变为淡黄色后，继续维持氮气1min，然后迅速塞上橡胶瓶塞，拧紧瓶盖。此步骤中需维持加热。
4、接着，将厌氧瓶静置冷却至室温，同时用气球收集高纯度二氧化碳，注射器的非针部密封有气球，将注射器的针部扎入橡胶瓶塞，橡胶瓶塞的针孔会自动闭合，橡胶瓶塞耐高温，往厌氧瓶内通入二氧化碳，使瓶内恢复常压，得到厌氧菌培养基混合物1。
5、将厌氧菌培养基混合物1放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟，得到厌氧菌培养基混合物2。
6、灭菌结束后，将含有厌氧菌培养基混合物2的厌氧瓶放入烘箱烘干，取出使其恢复至常温。
7、在超净工作台内，按照脑心浸液培养基的比例，通过注射器往厌氧瓶内加入5×10-4g/mL氯化血红素的水溶液和1×10-4g/mL维生素K3的水溶液，比例为1:100(v/v)，制得产品1。
8、最后将产品1放入37℃恒温培养箱中24小时，观察无杂菌后可进行厌氧细菌的培养。
实施例2
本申请实施例提供了第二种厌氧菌培养基，具体步骤如下：
本申请制得产品2的方法与实施例1类似，区别仅在于，添加的半胱氨酸和树脂天青的浓度不同，本申请实施例2树脂天青溶液的添加量，根据树脂天青溶液：脑心浸液培养基为1:500(v/v)的比例加入树脂天青溶液(树脂天青溶解在去离子水中，树脂天青的浓度为0.2g/L)。本申请实施例2半胱氨酸的添加量，再根据半胱氨酸：脑心浸液培养基为1:500(w/v)的比例加入半胱氨酸。
实施例3
本申请实施例提供了第三种厌氧菌培养基，具体步骤如下：
本申请制得产品3的方法与实施例1类似，区别仅在于，添加的半胱氨酸和树脂天青的浓度不同，本申请实施例3树脂天青溶液的添加量，根据树脂天青溶液：脑心浸液培养基为1:250(v/v)的比例加入树脂天青溶液(树脂天青溶解在去离子水中，树脂天青的浓度为0.2g/L)。本申请实施例3半胱氨酸的添加量，再根据半胱氨酸：脑心浸液培养基为1:300(w/v)的比例加入半胱氨酸。
实施例4
本申请实施例提供了第四种厌氧菌培养基，具体步骤如下：
本申请制得产品4的方法与实施例1类似，区别仅在于，添加的半胱氨酸和树脂天青的浓度不同，本申请实施例4树脂天青溶液的添加量，根据树脂天青溶液：脑心浸液培养基为1:210(v/v)的比例加入树脂天青溶液(树脂天青溶解在去离子水中，树脂天青的浓度为0.2g/L)。本申请实施例4半胱氨酸的添加量，再根据半胱氨酸：脑心浸液培养基为1:260(w/v)的比例加入半胱氨酸。
实施例5
本申请实施例提供了第五种厌氧菌培养基，具体步骤如下：
本申请制得产品5的方法与实施例1类似，区别仅在于，添加的半胱氨酸和树脂天青的浓度不同，本申请实施例5树脂天青溶液的添加量，根据树脂天青溶液：脑心浸液培养基为1:100(v/v)的比例加入树脂天青溶液(树脂天青溶解在去离子水中，树脂天青的浓度为0.2g/L)。本申请实施例5半胱氨酸的添加量，再根据半胱氨酸：脑心浸液培养基为1:100(w/v)的比例加入半胱氨酸。
实施例6
本申请实施例提供了第六～九种厌氧菌培养基，具体步骤如下：
制备方法与实施例1的制备方法类似，区别在于调整树脂天青的浓度，将树脂天青的浓度调整为0.1g/L、0.4g/L、0.8g/L和1g/L，其余步骤如实施例1一致，发现树脂天青的浓度为0.2-1g/L时，可根据培养基的颜色判断培养基内的氧气状态，在0.2g/L时显色程度最佳，树脂天青的浓度为0.1g/L时，制得的培养基颜色过浅，无法辨别培养基的氧气浓度，当树脂天青的浓度超过1g/L时，培养基遇到氧气使得培养基变色严重不利于观察艰难梭菌的培养情况。
对比例1
本申请对比例提供了第一种对照产品1，具体步骤如下：
本申请制得对照产品1的方法与实施例1类似，区别仅在于，添加的半胱氨酸和树脂天青的浓度不同，本申请对比例1树脂天青溶液的添加量，根据树脂天青溶液：脑心浸液培养基为1:700(v/v)的比例加入树脂天青溶液(树脂天青溶解在去离子水中，树脂天青的浓度为0.2g/L)。本申请对比例1半胱氨酸的添加量，再根据半胱氨酸：脑心浸液培养基为1:700(w/v)的比例加入半胱氨酸。
对比例2
本申请对比例提供了第二种对照产品2，具体步骤如下：
本申请制得对照产品2的方法与实施例1类似，区别仅在于，添加的半胱氨酸和树脂天青的浓度不同，本申请对比例2树脂天青溶液的添加量，根据树脂天青溶液：脑心浸液培养基为1:20(v/v)的比例加入树脂天青溶液(树脂天青溶解在去离子水中，树脂天青的浓度为0.2g/L)。本申请对比例2半胱氨酸的添加量，再根据半胱氨酸：脑心浸液培养基为1:20(w/v)的比例加入半胱氨酸。
对比例3
本申请对比例提供了第三种对照产品3，具体步骤如下：
本申请制得对照产品3的方法与实施例1类似，区别仅在于，不添加促进剂，即不添加5×10-4g/mL氯化血红素和1×10-4g/mL维生素K3溶液。
实施例7
本申请实施例为验证产品1-5和对照产品1-3是否能培养对氧极端敏感的厌氧菌，步骤如下：
在超净工作台内，收集艰难梭菌菌液(浓度为3ⅹ108CFU/mL)后，利用注射器，通过瓶盖中间的小孔扎入瓶塞，往厌氧培养瓶的瓶内注入艰难梭菌菌液，然后每隔2h收集产品1-5检测其吸光度OD612，绘制产品1-5的生长曲线，结果如图1-5和图11-13所示。
在树脂天青和半胱氨酸的浓度范围内选取了几个合适的浓度，进行实施例的制备。
图1为本申请实施例1制得的产品1培养艰难梭菌的生长曲线图，从图1可知，产品1为树脂天青和半胱氨酸二者最优选的浓度制备的产品，以此培养的艰难梭菌在6h左右进入指数生长期，最终在18h左右达到平台期，其细菌浓度是实施例中最高的。
图2为本申请实施例2制得的产品2培养艰难梭菌的生长曲线图，从图2可知，产品2的树脂天青和半胱氨酸选取的浓度是优选范围内最低的，制备的产品用来培养的艰难梭菌，进入指数期的时间和达到平台期的时间跟产品1的差不多，但是达到平台期的细菌浓度没有产品1的高，因为半胱氨酸的浓度相较而言低了一倍，消耗氧气的所需的时间较长，在消耗氧气的时间窗口内，细菌活力会减弱。
图3为本申请实施例3制得的产品3培养艰难梭菌的生长曲线图，从图3可知，产品3的树脂天青和半胱氨酸选取的浓度比产品2的高，因此细菌活力受到的影响小了一些，故最终达到平台期的细菌浓度比产品3的高。
图4为本申请实施例4制得的产品4培养艰难梭菌的生长曲线图，从图4可知，产品4的树脂天青和半胱氨酸选取的浓度是最优选范围内最低的，因此细菌活力比较好，最终达到平台期的细菌浓度接近产品1。
图5为本申请实施例5制得的产品5培养艰难梭菌的生长曲线图，从图5可知，产品5的树脂天青和半胱氨酸选取的浓度是最优选范围内最高的，细菌生长情况跟产品4的相近。
图11为本申请对比例1制得的对照产品1培养艰难梭菌的生长曲线图，从图11可知，对照产品1的树脂天青和半胱氨酸选取的浓度比优选范围最低的低了一半左右。树脂天青没办法起到很好的指示作用，因此很难判断瓶内氧气剩余的情况；而且半胱氨酸的浓度较低，在制备中可能消耗完了，也可能剩的不多，在加入促进剂时没办法快速消耗氧气，可能瓶内还有微量氧气存在。消耗氧气的时间窗口特别大，所以以此制备的产品培养的艰难梭菌，进入指数期的时间推迟了6小时左右。但是，指数期持续的时间并没有受到影响。只是最后达到平台期细菌的浓度比较低，说明细菌活力受到了影响。
图12为本申请对比例2制得的对照产品2培养艰难梭菌的生长曲线图，从图12可知，对照产品2的树脂天青和半胱氨酸选取的浓度比优选范围的高了10倍左右。高浓度的树脂天青几乎对艰难梭菌的生长没有影响。高浓度的半胱氨酸消耗氧气速度很快，对艰难梭菌进入指数期的时间没有影响，但是达到平台期时细菌的浓度非常低，而且指数期持续的时间缩短了4小时左右。这种结果说明高浓度的半胱氨酸无可避免地对艰难梭菌产生了毒性，抑制了细菌的生长活力，甚至致使细菌死亡。
图13为本申请对比例3制得的对照产品3培养艰难梭菌的生长曲线图，从图13可知，对照产品3为未添加促进剂氯化血红素和维生素K3基础液体培养基，艰难梭菌在24小时内并不进入指数生长期，而且生长速度十分缓慢。结果说明基础培养基并不能提供艰难梭菌生长所需的营养物质，长时间的饥饿状态致使细菌活力降低，沉淀现象十分明显。
然后，收集产品1培养艰难梭菌24h后的菌液，结果如图6-7所示，图6为本申请实施例1制得的厌氧菌培养基培养艰难梭菌生长24h后厌氧菌培养基的实物图；图7为本申请实施例1制得的产品1培养艰难梭菌生长24h后的亮场图。图6～7可知，正常生长的艰难梭菌会使培养液浑浊，而且沉淀现象不明显，因为细菌富有活力，呈运动状态。而且，培养基显一点红色，并不是瓶内有氧气的原因，而是促进剂加入后会呈一点淡红色。浑浊培养基还显淡红色，说明细菌还没有消耗完营养物质，仍在生长状态。
然后对产品1培养艰难梭菌24h后的菌液在270nm紫外下进行检测，结果如图8所示，图8为本申请实施例1制得的产品1培养艰难梭菌生长24h后在270nm紫外下的荧光图，本申请实施例的艰难梭菌在270nm和366nm处可见黄绿色荧光，符合文献报道，说明产品1培养的艰难梭菌可正常生长，瓶内并不是其他污染的厌氧菌。
接着，吸取产品1培养艰难梭菌24h后的菌液在培养专性厌氧细菌艰难梭菌的固体培养基进行验证，结果如图9所示，图9为本申请实施例1制得的产品1培养艰难梭菌生长24h后取菌液在培养专性厌氧细菌艰难梭菌的固体培养基中培养48h的平板图，图9可见，在厌氧血平板上，培养48h后，艰难梭菌会形成白色、圆形、边缘不起、表面粗糙而且不溶血的菌落。本产品培养的艰难梭菌在厌氧血平板上生长的状态与文献报道相符，证明是艰难梭菌，并不是杂菌，可见，产品1为艰难梭菌。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种厌氧菌培养基，其特征在于，包括：
基础液体培养基、半胱氨酸、树脂天青和促进剂；
所述半胱氨酸与所述基础液体培养基的质量体积比为1/500～1/50；
所述树脂天青的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/500～1/50；所述树脂天青的水溶液的浓度为0.2-1g/L。
2.根据权利要求1所述的厌氧菌培养基，其特征在于，所述基础液体培养基选自脑心浸液培养基、胰蛋白胨大豆肉汤和LB培养基中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的厌氧菌培养基，其特征在于，所述促进剂选自氯化血红素、维生素K3和维生素K1中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的厌氧菌培养基，其特征在于，包括：
所述氯化血红素的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/500～1/50；所述氯化血红素的水溶液的浓度为5×10-4g/mL～5×10-5g/mL；
所述维生素K3的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/500～1/50；所述维生素K3的水溶液的浓度为1×10-4g/mL～1×10-5g/mL；
所述维生素K1的水溶液与所述基础液体培养基的体积比为1/500～1/50；所述维生素K1的水溶液的浓度为1×10-4g/mL～1×10-5g/mL。
5.一种厌氧菌培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将基础液体培养基、半胱氨酸和树脂天青混合，得到混合物1；
步骤2、将所述混合物1通入厌氧瓶中，对所述厌氧瓶通入不含有氧气的气体，并使得所述厌氧瓶为常压状态，然后密封所述厌氧瓶，得到厌氧菌培养基混合物1；
步骤3、将所述厌氧菌培养基混合物1进行灭菌，得到厌氧菌培养基混合物2；
步骤4、将所述厌氧菌培养基混合物2与促进剂混合，制得厌氧菌培养基。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，还包括加热处理，将基础液体培养基、半胱氨酸和树脂天青混合加热，得到混合物1；所述加热的温度为80～100℃。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述不含有氧气的气体为氮气或/和二氧化碳。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，还包括加热处理，将所述混合物1通入厌氧瓶中，对所述厌氧瓶加热至90～92℃后，通入不含有氧气的气体，并使得所述厌氧瓶为常压状态，然后密封所述厌氧瓶，得到厌氧菌培养基混合物1。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述厌氧瓶包括瓶体、瓶盖和橡胶瓶塞；
所述瓶体设有瓶口，所述橡胶瓶塞设置在所述瓶口中；
所述瓶盖盖合在所述瓶口上。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3之后还包括步骤4，步骤4为将所述厌氧菌培养基置于恒温培养箱中静置，观察无杂菌后进行厌氧菌的培养。
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