CN108034621A - 一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法 - Google Patents

一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108034621A
CN108034621A CN201810093550.0A CN201810093550A CN108034621A CN 108034621 A CN108034621 A CN 108034621A CN 201810093550 A CN201810093550 A CN 201810093550A CN 108034621 A CN108034621 A CN 108034621A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clostridium
pit mud
anaerobism
enrichment
pit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810093550.0A
Other languages
English (en)
Inventor
王艳丽
何宏魁
葛向阳
刘国英
王录
李安军
周庆伍
孟雅静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Ruisiweier Technology Co Ltd
Original Assignee
Anhui Ruisiweier Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Ruisiweier Technology Co Ltd filed Critical Anhui Ruisiweier Technology Co Ltd
Priority to CN201810093550.0A priority Critical patent/CN108034621A/zh
Publication of CN108034621A publication Critical patent/CN108034621A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，是将采集的窖泥样品置于选择性培养基中富集培养，可以快速简单地分离窖泥中的梭菌，进而为后续对窖泥梭菌的应用提供菌源。本发明方法可以快速、经济、特异的从窖泥中实现对厌氧梭菌的富集，采用此方法不仅可以快速简便地富集出厌氧梭菌，而且富集的窖泥厌氧梭菌可作为一种功能菌液应用于的灌窖、窖池保养、人工窖泥培养、酯化液的制作等，从而提高浓香型白酒的质量。

Description

一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法
技术领域
本发明涉及一种厌氧细菌的富集方法，具体地说是一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，属于生物技术领域。
背景技术
我国酿酒历史悠久，酒文化源远流长，传统工艺精湛，产品风格独特，在世界蒸馏酒中独树一帜，其中浓香型白酒在所有香型白酒的生产及销售比例中占70％，其产量和品质明显影响着中国白酒行业的发展。
浓香型白酒的生产是以窖池和酒醅为基础，环境微生物、大曲微生物和窖泥微生物复杂的物质能量代谢过程。窖泥作为浓香型白酒功能菌生长繁殖的主要载体，其微生物在发酵过程中产生的有机酸和酯类等代谢产物是浓香型白酒窖香的基础。且有研究表明，对浓香型白酒香气贡献最大的是梭状芽孢杆菌，其主要代谢产物是己酸、丁酸和氢，并指出己酸菌和甲烷菌共生时能促进己酸生成。且厌氧梭菌作为一种重要的功能菌，其培养液广泛应用于的灌窖、窖池保养、人工窖泥培养、酯化液的制作等。
对窖泥功能菌研究发现，其群落结构组成非常复杂，包括厌氧异养菌、甲烷菌、梭菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌等，利用传统的方法想要快速分离厌氧梭菌存在一定的难度，需要反复涂布、分离、纯化，工作量较大，不利于厌氧梭菌的分离。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，可以快速简便地富集出厌氧梭菌，进而对改善浓香型白酒的质量具有重要意义。
本发明窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，包括如下步骤：
步骤1：窖泥样品的采集
从窖龄≥30年且一直在连续使用的窖池中采集池底的新鲜窖泥，采集的窖泥样品装入大口径螺口瓶或自封袋中密闭保存，并迅速带回实验室接种。
步骤2：配制厌氧梭菌富集的选择性培养基
选择性培养基为强化梭菌培养基，只要适合厌氧梭菌生长的培养基即可，优选配制方法如下：
将蛋白胨10.0g、牛肉粉10.0g、酵母粉3.0g、葡萄糖5.0g、可溶性淀粉1.0g、氯化钠5.0g、乙酸钠3.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂0.5g、刃天青(0.1％，厌氧指示剂)1.5mL混合，加超纯水定容至1L，混合均匀后调节pH值为6.7-6.9(厌氧梭菌最适生长pH值范围)，获得厌氧梭菌富集的选择性培养基。配制好后装入厌氧瓶中密闭储存，厌氧瓶的装液量在50-80％。
步骤3：液体培养基除氧
向装有步骤2获得的选择性培养基的厌氧瓶中通入氮气，至选择性培养基的颜色由蓝色变为浅粉红色或无色，再拧紧瓶口使其在密闭条件下高压灭菌；高压灭菌的温度为121℃，时间为20min。
步骤4：窖泥的厌氧接种
将步骤1采集的窖泥样品以1-5％的接种量(质量体积比1-5％，如100mL培养基接种窖泥1-5g)加入步骤3获得的除氧、灭菌后的液体培养基中，拧紧瓶盖使其密闭后混匀。
步骤5：厌氧梭菌的富集培养
将步骤4获得的接种窖泥后的厌氧瓶置于恒温培养箱中，34℃下恒温培养7天，观察产气情况，按照相同的培养条件重复富集培养3-5次。
步骤6：高通量测序比较富集前后的梭菌含量
通过高通量测序的方法(该方法是一种广泛应用的检测基因核酸序列的测定方法。要求提供检测样品的基因组DNA，且基因组DNA的OD值260/280须大于1.8，无蛋白质，或无肉眼可见的污染杂质，还应完整、无降解，电泳结果基因组DNA主带最大条带23Kb以上且主带清晰、无弥散。)比较富集前后样品中的梭菌比例，检验富集效果。由图1、图2对比可知，经本发明方法富集后富集液中的厌氧梭菌(Clostridium)在Genus分类水平占比由富集前窖泥样品的0.27％提高到74.16％，表明富集效果较好，达到了富集的目的。
本发明提供的窖泥厌氧梭菌(Clostridium)的富集方法，可以快速、经济、特异的从窖泥中实现对厌氧梭菌的富集，采用此方法不仅可以快速简便地富集出厌氧梭菌，而且富集的窖泥厌氧梭菌可作为一种功能菌液应用于的灌窖、窖池保养、人工窖泥培养、酯化液的制作等，从而提高浓香型白酒的质量。
附图说明
图1是窖泥样品Genus分类水平中物种profiling柱状图(富集前)。
图2是梭菌富集液Genus分类水平中物种profiling柱状图(富集后)。
具体实施方式
体现本发明特征与优点的典型实施例将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施例上，具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明用，而非用以限制本发明。
下述实施例中，富集前及富集后对样品中的厌氧梭菌在总群落结构中的比例，可经高通量测序检测得出，当富集后富集液中的厌氧梭菌(Clostridium)在Genus分类水平占比由富集前窖泥样品的0.27％提高到74.16％，表明富集效果较好，达到了富集的目的，如图1和图2所示。
本实施例中窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法如下：
1、窖泥样品的采集
采用池底五点采样法，从窖龄≥30年且一直在连续使用的窖池中采集池底的新鲜窖泥，采集的窖泥样品装入大口径螺口瓶或自封袋中密闭保存，并迅速带回实验室接种。采集时可以采用本领域技术人员所公知的窖泥采样器采集，或者其他方法，本发明并不限制，但是一般应该在窖池出完池子清扫后立即对池底窖泥进行采集，以免敞口太久部分厌氧菌失活。
2、配制厌氧梭菌富集的选择性培养基
将蛋白胨10.0g、牛肉粉10.0g、酵母粉3.0g、葡萄糖5.0g、可溶性淀粉1.0g、氯化钠5.0g、乙酸钠3.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂0.5g、刃天青(0.1％，厌氧指示剂)1.5mL混合，加超纯水定容至1L，混合均匀后调节pH值为6.7-6.9(厌氧梭菌最适生长pH值范围))，获得厌氧梭菌富集的选择性培养基，装入厌氧瓶中密闭储存，厌氧瓶的装液量在50-80％。
3、液体培养基除氧
在未灭菌之前，向装有步骤2获得的选择性培养基的厌氧瓶中通入氮气(纯氮为佳)，至选择性培养基的颜色由蓝色变为浅粉红色或无色，再拧紧瓶口使其在密闭条件下高压灭菌；然后待培养基冷却至40～50℃之后，在厌氧工作站中分装至除氧后的200mL无菌厌氧瓶中备用。高压灭菌的温度为121℃，时间为20min。
4、窖泥的厌氧接种
将步骤1采集的窖泥样品置于于厌氧工作站中放置30～60min除氧，然后以1-5％的接种量加入步骤3获得的除氧、灭菌后的液体培养基中，每个样品三个平行，拧紧瓶盖使其密闭后混匀。
5、厌氧梭菌的富集培养
将步骤4获得的接种窖泥后的厌氧瓶置于厌氧工作站(或三气恒温培养箱或恒温生化培养箱)中培养，34℃下恒温培养7天，观察产气情况，按照相同的培养条件重复富集培养3-5次。采用此方法可以简便有效的对窖泥中的厌氧梭菌进行富集。
6、高通量测序比较富集前后的梭菌含量
通过高通量测序的方法比较富集前后样品中的梭菌比例，检验富集效果。由图1、图2对比可知，经本发明方法富集后富集液中的厌氧梭菌(Clostridium)在Genus分类水平占比由富集前窖泥样品的0.27％提高到74.16％，表明富集效果较好，达到了富集的目的。
综上所述，本发明提供的对窖泥中厌氧梭菌(Clostridium)的富集方法，根据实验表明，本发明对窖泥中厌氧梭菌的富集方法，一般可在20～30天左右完成。由此可见其不仅可以快速、经济、特异的从窖泥中实现对厌氧梭菌的富集，采用此方法还可以快速简便地富集出厌氧梭菌，而且富集的窖泥厌氧梭菌可作为一种功能菌液应用于的灌窖、窖池保养、人工窖泥培养、酯化液的制作等，从而提高浓香型白酒的质量。
虽然已参照几个典型实施例描述了本发明，但所用的术语是说明和示例性，而非限制性的术语。由于本发明能够以多种形式具体实施而不脱离发明的精神或实质，所以应当理解，上述实施例不限于任何前述的细节，而应在随附权利要求所限定的精神和范围内广泛地解释，因此落入权利要求或其等效范围内的全部变化和改型都应为随附权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：窖泥样品的采集
从窖龄≥30年且一直在连续使用的窖池中采集池底的新鲜窖泥，采集的窖泥样品装入大口径螺口瓶或自封袋中密闭保存；
步骤2：配制厌氧梭菌富集的选择性培养基
选择性培养基为强化梭菌培养基；
步骤3：液体培养基除氧
向装有步骤2配制的选择性培养基的厌氧瓶中通入氮气，至选择性培养基的颜色由蓝色变为浅粉红色或无色，再拧紧瓶口使其在密闭条件下高压灭菌；
步骤4：窖泥的厌氧接种
将步骤1采集的窖泥样品加入步骤3获得的除氧、灭菌后的液体培养基中，拧紧瓶盖使其密闭后混匀；
步骤5：厌氧梭菌的富集培养
将步骤4获得的接种窖泥后的厌氧瓶置于恒温培养箱中，34℃下恒温培养7天，观察产气情况，按照相同的培养条件重复富集培养3-5次。
2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
步骤2中选择性培养基的配制方法如下：
将蛋白胨10.0g、牛肉粉10.0g、酵母粉3.0g、葡萄糖5.0g、可溶性淀粉1.0g、氯化钠5.0g、乙酸钠3.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂0.5g、0.1％的刃天青1.5mL混合，加超纯水定容至1L，混合均匀后调节pH值为6.7-6.9，获得厌氧梭菌富集的选择性培养基。
3.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
步骤3中，高压灭菌的温度为121℃，时间为20min。
4.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
步骤4中，窖泥样品的接种量为1-5％。
CN201810093550.0A 2018-01-31 2018-01-31 一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法 Pending CN108034621A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810093550.0A CN108034621A (zh) 2018-01-31 2018-01-31 一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810093550.0A CN108034621A (zh) 2018-01-31 2018-01-31 一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108034621A true CN108034621A (zh) 2018-05-15

Family

ID=62096950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810093550.0A Pending CN108034621A (zh) 2018-01-31 2018-01-31 一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108034621A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108690772A (zh) * 2018-06-29 2018-10-23 安徽瑞思威尔科技有限公司 一种提高浓香型白酒固态发酵过程中己酸乙酯含量的混菌制剂的制备方法
CN108753668A (zh) * 2018-07-26 2018-11-06 安徽瑞思威尔科技有限公司 一种模拟老窖微生态功能菌液的制备方法
CN109055284A (zh) * 2018-10-11 2018-12-21 青岛琅琊台集团股份有限公司 一种酿酒用海洋产酸菌株及其应用
CN111500507A (zh) * 2020-05-28 2020-08-07 江南大学 一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法及其应用
CN111793588A (zh) * 2020-08-19 2020-10-20 广东工业大学 一种厌氧菌培养基及其制备方法
CN112029682A (zh) * 2020-08-31 2020-12-04 四川轻化工大学 一种窖泥功能菌液、功能菌及其制备方法
CN112812997A (zh) * 2021-01-12 2021-05-18 江南大学 快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用
CN113106032A (zh) * 2021-03-17 2021-07-13 湖北工业大学 一种筛选葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的培养基及其应用
CN115161242A (zh) * 2022-07-26 2022-10-11 宜宾五粮液股份有限公司 定向富集培养梭菌属微生物的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274002A (zh) * 2015-11-23 2016-01-27 桂林理工大学 一种厌氧微生物的富集培养方法
CN106167778A (zh) * 2016-08-22 2016-11-30 南京工业大学 一种柔嫩梭菌及其培养方法与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274002A (zh) * 2015-11-23 2016-01-27 桂林理工大学 一种厌氧微生物的富集培养方法
CN106167778A (zh) * 2016-08-22 2016-11-30 南京工业大学 一种柔嫩梭菌及其培养方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QI YIN ET AL.: "Clostridium liquoris sp. nov., isolated from a fermentation pit used for the production of Chinese strong-flavoured liquor", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY》 *
欧阳志周等: "猪源丁酸梭菌分离及其对肠道绒毛发育的影响", 《齐鲁工业大学学报》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108690772A (zh) * 2018-06-29 2018-10-23 安徽瑞思威尔科技有限公司 一种提高浓香型白酒固态发酵过程中己酸乙酯含量的混菌制剂的制备方法
CN108753668A (zh) * 2018-07-26 2018-11-06 安徽瑞思威尔科技有限公司 一种模拟老窖微生态功能菌液的制备方法
CN109055284A (zh) * 2018-10-11 2018-12-21 青岛琅琊台集团股份有限公司 一种酿酒用海洋产酸菌株及其应用
CN111500507A (zh) * 2020-05-28 2020-08-07 江南大学 一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法及其应用
CN111793588A (zh) * 2020-08-19 2020-10-20 广东工业大学 一种厌氧菌培养基及其制备方法
CN111793588B (zh) * 2020-08-19 2023-02-07 广东工业大学 一种厌氧菌培养基及其制备方法
CN112029682A (zh) * 2020-08-31 2020-12-04 四川轻化工大学 一种窖泥功能菌液、功能菌及其制备方法
CN112812997A (zh) * 2021-01-12 2021-05-18 江南大学 快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用
CN112812997B (zh) * 2021-01-12 2023-04-28 江南大学 快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用
CN113106032A (zh) * 2021-03-17 2021-07-13 湖北工业大学 一种筛选葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的培养基及其应用
CN115161242A (zh) * 2022-07-26 2022-10-11 宜宾五粮液股份有限公司 定向富集培养梭菌属微生物的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108034621A (zh) 一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法
Manginot et al. Nitrogen demand of different yeast strains during alcoholic fermentation. Importance of the stationary phase
Strobel Basic laboratory culture methods for anaerobic bacteria
CN109971686A (zh) 一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法
CN101905985B (zh) 用于畜禽粪便发酵生产生物有机肥的微生物腐熟剂的制备方法
CN103937662A (zh) 微生物分离培养装置及其方法
CN103992904A (zh) 一种提高苹果白兰地中酯类含量的方法
CN104762238A (zh) 一种不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌及其应用
CN106011002B (zh) 一种巨大芽孢杆菌t317及其菌剂和菌剂制备方法
CN111763636A (zh) 一种工业发酵生产辅酶q10的方法
JP2011224001A (ja) ペクチネータス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）属菌の培養及び識別のための培地並びに綿棒サンプルの採取方法
CN112812997A (zh) 快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用
CN112251357A (zh) 一种禽畜粪便发酵菌剂的筛选方法
CN109055284B (zh) 一种酿酒用海洋产酸菌株及其应用
CN106479932A (zh) 一种产γ‑氨基丁酸的戊糖乳杆菌
CN116376721A (zh) 一种利用淀粉糖高产柠檬酸的黑曲霉及其发酵方法和应用
CN109112078B (zh) 一株短杆菌菌株及应用
CN105385608A (zh) 一种香菇液体菌种深层发酵工艺
CN109868239A (zh) 一种阿维菌素菌株及其筛选方法
CN112724474B (zh) 一种冷水凝胶及其应用
CN205473667U (zh) 一种白酒发酵装置
CN210560461U (zh) 一种小型的需氧菌培养装置
CN202968544U (zh) 一种降低染菌概率的连续发酵扩培装置
CN201006428Y (zh) 硫酸盐还原菌测试瓶
CN106434779A (zh) 戊糖乳杆菌SS6在产γ‑氨基丁酸中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180515

RJ01 Rejection of invention patent application after publication