CN109971686A - 一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法 - Google Patents

一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细菌发酵、功能菌筛选技术领域，公开了一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法，所述增殖培养基由蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉3.0g/L、葡萄糖1.0～5.0g/L、可溶性淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、醋酸钠3.0～6.0g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、抗坏血酸0.3～1.0g/L、琼脂0.5～2.0g/L和蒸馏水组成。选择性地添加氯化血红素0.005～0.01g/L等营养物质，帮助某些极端细菌的生长分裂，提高细胞密度，扩大了己酸菌的筛选范围。中途添加乙醇和丁酸钠，促进了己酸合成。发酵容器透明，根据发酵液中产气、产酸的情况来初筛，提高了筛选效率。

Description

一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法
技术领域
本发明属于微生物发酵和功能菌筛选、鉴定技术领域，尤其涉及一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：
白酒(baijiu)是中国特有的蒸馏酒。浓香型白酒由于“泥窖固态发酵”的工艺，使之形成了“以己酸乙酯为主，混合少量乙酸乙酯、丁酸乙酯及乳酸乙酯”的主体香气。己酸作为己酸乙酯的前体物质，主要来自于窖泥中的己酸菌。己酸菌，并没有严格的分类学上的意义，是指一类能产己酸的细菌。许多酒厂之所以能产出高档次的浓香型的原浆酒，大多依赖于使用历史悠久的老窖池。老窖池中的细菌群落中，己酸菌扮演着最重要的角色之一。它们与甲烷菌、硝酸盐还原菌等共生共栖，长期生活在窖泥的深层的微生态环境中，不断地吸收和消耗来自粮食(发生糊化以及糖化)、糟赔、黄水带来的营养物质，并源源不断地产生丁酸、己酸等代谢物。己酸菌的数量，是窖泥质量优劣的重要的衡量指标之一。人们为了“增己降乳”以及“抑制乙酸乙酯的偏高”的目标，对己酸菌的发现、纯培养和开发利用投入了极大的热情。目前已知己酸菌有：克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、粪味梭菌、深红红螺菌、粘液真杆菌和艾氏巨型球菌等。中国工业微生物菌种保存中心(CICC)登记的己酸菌有：ABC-397、CICC8022、CICC8023、CICC8024等。也有人使用C.kluyveri JZZ、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、js-22-03，js-22-07，js-22-12、己酸菌(Clostridiumbutyricum)GK13、DSM555、CICC20860等制备己酸菌液。
己酸菌多为厌氧或兼性厌氧菌，对纯培养的手段有极高的要求。比如，吴衍庸等人采用液态巴氏培养基从泸州老窖窖泥中筛选出泸酒梭菌，产己酸能力为3080mg/L，从五粮液老窖中分离出的己酸菌w-1产己酸能力为10000mg/L。泸州品创科技有限公司使用了梭菌增殖培养基A、乙酸钠培养基B，湖北工业大学陈茂彬等人使用乙醇醋酸钠培养基(EAM)，安徽金种子酒业发明了不加CaCO3的己酸菌NCEAM培养基，丰谷酒业的杜礼泉等人则在乙酸钠、乙醇、硫酸铵等常用己酸菌培养液组份基础上添加了丢糟浸液、大曲粉、底锅水、黄水等酒厂中的天然物质，加入酒尾、硫酸铵、尿素和黄泥浸提液等物质。
现有技术一为一种不加CaCO3培养己酸菌的配方，使用了NCEAM培养基，该培养基中不含有葡萄糖、可溶性淀粉，缺少对还原性的L-半胱氨酸盐酸盐，这对于窖泥中很多未知的己酸菌来说有一定的营养缺陷。该培养基使用了2％的乙醇，对于不耐受乙醇的己酸菌，是无法完成发酵试验或者阻碍了某些己酸菌的指数期增殖。仅使用C.kluyveri JZZ作为唯一供试菌，使得该培养基的广泛性受到质疑。检测发酵液中的己酸时，虽然也使用了2-乙基丁酸作为内标物，但是并没有直接将乙醇溶液(含发酵液)进行气相测定，而是增加了一个发酵液、内标液和乙醚充分混合的步骤，最后取上层的乙醚层进行检测。缺陷是：乙醚气体对人体有害，不利于安全操作；发酵液前处理过程不够简便，耗费了人力和试剂；乙醚对己酸的萃取过程会受发酵液中的酸度的影响，而发酵液中没有明显的缓冲试剂，致使不同酸度的发酵液的己酸的萃取得率有差别，定量检测的效果不稳定。
现有技术二为一种窖泥己酸菌的培养技术，以乙酸钠培养基为基础，成分多为无机物，酵母膏0.1％；乙酸钠0.5％；磷酸氢二钾0.04％；硫酸铵0.05％；硫酸镁0.02％，不能涵盖靠葡萄糖、蛋白胨等有机物进行能量代谢的己酸菌，适用范围太窄。培养基中含碳酸钙，会产生一定的CO2气泡，带来了干扰，不利于辨别待测细菌发酵产气的根源。培养基在接种待试菌之前，便添加了2～3％乙醇，这可能会限制了某些菌(尤其是乙醇耐受性较差的一类己酸菌)的生长。此专利中0.1％L-半胱氨酸是灭菌后完成添加的，而本专利是高压灭菌之前便已经加入。此专利每天分时间段摇匀培养基，没有静置发酵液的深层的低氧环境，以及不同深度的发酵环境的多样性，而且不利于某些己酸菌在固液的界面进行附着生长和代谢。该方法没有采取密封隔绝氧气的措施，发酵液中溶解氧DO值无法保持在很低的水平，一些严格厌氧菌的发酵效率将会大打折扣。己酸的检测方法使用硫酸铜比色法，繁琐且准确性差。其原理是一定量的己酸与Cu2+反应形成己酸铜沉淀(蓝色)，它能被乙醚萃取，通过检测乙醚层的己酸铜(OD660)，对应制作的标准曲线，最终完成己酸的定量(同DOI：10.16442/j.cnki.qlgydxxb.2018.03.003)。缺陷是：该反应因受到溶液pH(碱性时易产生氢氧化铜)和酵母提取物中脂溶性物质(易出现在乙醚层)的干扰，而且标准曲线制作过程中，因己酸标准品必需溶解到有一定浓度乙醇的稀释液中，而乙醇对显色效果(光吸收)有负面的影响，导致保真性较差。
现有技术三为复合己酸菌液扩大培养方法，使用的培养基A缺少血红素、抗坏血酸等维生素有机物，且为固体培养基，仅用于斜面培养以活化某一种己酸菌(纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis))。液体培养基B为乙醇乙酸钠培养基(EAM)，用于扩大培养，以及随后与优质窖泥富集液、酒糟发酵液等混合使用。发酵用的培养基成分复杂，混菌培养，且使用了不锈钢罐等大容积的设备，其意义在于将已有的己酸菌置于一个半自然的液体环境中，慢慢过渡转移到窖池中。缺陷是：由于该体系属于天然培养基，本身就含有己酸等物质，无法鉴别发酵液中的己酸是来自初始培养基还是待试菌的合成代谢；该专利中包括了多种细菌，甚至酵母菌，其发酵液成分更加复杂，是由多菌种共同作用的结果，不利于对单一的纯菌的代谢谱进行解析。
现有技术四为一种复合己酸菌液的富集培养方法，使用了超浓缩己酸菌液，添加了生香酵母、大曲粉、老窖泥、酯化红曲、尾酒、黄浆水等物质，培养基成分复杂且含有己酸(来自外界环境)，这对于产己酸菌的鉴别和筛选是一个严重的干扰。
现有技术五为一种己酸发酵菌种及己酸提取方法，对己酸发酵菌种js-22-03，js-22-07，js-22-12进行了培养和紫外线诱变，并提取其产物己酸。使用了液体深层厌氧发酵方式，但是液体培养基中没有还原性的添加物，以消除氧对微生物生长的负作用，也没有油封等隔绝空气的措施。缺少简便的发酵液样品制备、气相色谱、内标法等精确便捷的己酸定量手段。
现有技术六为一种己酸菌和液体窖泥混合菌液的培养方法，该发明与CN108102965A，复合己酸菌液扩大培养方法，思路相似，使用了卡氏罐、不锈钢发酵罐等大型设备富集己酸菌。己酸菌培养液是在EAM的基础上，不添加乙醇和碳酸钙，但是补充了4.29％的丢糟浸液；液体窖泥培养基则添加了丢糟浸液、大曲粉、底锅水、K2HPO4、NaAC、黄水及乙醇等物质。这些培养方式不像透明的厌氧瓶内发酵那么容易观察发酵的进程以及待试菌的发酵特性，培养基成分因来自于自然界的混合物而难以精确分析细菌的代谢物种类(特别是己酸的合成)；发酵容器大、占地大，这在场地和耗材方面对同一时间内进行高通量筛选工作提出了很高的要求。
现有技术七为一种己酸菌，以梭状芽孢杆菌，短杆端生芽孢，呈鼓锤状的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13为例，制备了复合己酸菌菌系ZC-21，发酵后产己酸和丁酸均达到很高的水平。然而，并未涉及发酵液中关键因子对己酸合成的影响，以及没有提出快速定量检测己酸的先进的手段。
现有技术八为一种含有白酒发酵过程原料的己酸菌培养基及其应用，培养基含有大曲浸提液、酒尾和黄泥浸提液；浓香型白酒窖泥己酸菌增殖培养基及其制备方法中，己酸菌增殖培养基包含有四川黄土、酒糟浸出液、高粱粉、大曲粉等天然物质，以上培养基的固形物比较多(黄土)，制备澄清的发酵液的难度大，不利于直接进入后续的气相色谱分析；初始培养基的成分复杂，特别是其成分之一酒糟浸出液可能含有己酸，这不适合用于细菌是否产己酸的分析鉴定。
现有技术九为一种己酸培养基及其己酸菌酯化液的制备方法，一种新型的己酸培养基，包括以下组分：牛肉膏2～5份、NaCl 1～3份、葡萄糖1～3份、乙酸钾10～20份、CaCO35～10份、无水乙醇20～30份。此培养基的缺陷在于不含有酵母提取物，因此缺少生物素、必要的氨基酸和维生素，对一些特殊的己酸菌的生长是不利的，甚至导致待试菌无法正常生长繁殖或浓度过低，检测不到其代谢物。在借助还原性物质消除液体中的溶解氧等方面，该培养基配方也有不足之处，组份中不含有巯基等还原性基团(比如抗坏血酸、半胱氨酸)。
现有技术十为“窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的研究”(doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2016.05.009)，所使用的发酵培养基为EAM液体培养基，发酵容器为15mL的试管(装样量90％)，最适pH为6.5，硫酸铜显色法进行初筛，复筛时采用了气相色谱。其缺陷是：EAM液体培养基的能源物质较少，难以达到较高的细胞密度；发酵过程没有采用除氧和隔绝等厌氧手段；将发酵液直接(未制备成乙醇溶液)进入气相色谱检测，样品运输过程中容易染杂菌；初筛使用了乙醚硫酸铜法，耗时，且易污染(不如本发明中的发酵液产气变黑以及酸指示剂初筛法直观便捷)；使用试管发酵，不便于生长缓慢的待试菌的延长发酵，由于发酵液的水分蒸发流失，己酸浓度的定量检测会有一定的误差。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有技术多侧重对己酸菌的富集，甚至使用混菌的液体培养，目的是制备己酸菌护窖液，来加快新窖泥的老熟。制得的护窖液虽然含有较高的己酸，然而如何快速筛选己酸菌，证明某菌株是己酸菌，此类方法并不适合；
(2)现有技术中所使用的培养基成分复杂，不利于纯种的细菌代谢的分析筛选。检测样品制备过程中，前处理操作复杂，使用了乙醚等有害气体，不利于大量的筛选工作；
(3)现有技术的己酸检测方法，灵敏度、准确性和稳定性比较一般；使用硫酸铜比色法，繁琐且误差大；发酵容器大、占地大导致了很难同一时间对很多不同的细菌(菌株)进行高通量筛选。
(4)现有技术的己酸菌筛选环节，有些己酸发酵条件存在缺陷，导致某些己酸菌只能产生丁酸、戊酸、异丁酸(中间代谢物)或异己酸等，而无法完成终端的己酸合成，这一定程度上会造成己酸菌的漏筛。
解决上述技术问题的难度：
成功分离出窖泥中的厌氧细菌是一回事，而能否分辨出哪些细菌属于己酸菌，该菌种资源是否有潜在的开发价值，这是一项复杂的任务。因为这不仅需要使待测细菌能够短时间内适应人工培养基，能够在实验室条件下实现增殖，而且还必需满足它们合成己酸所需的发酵环境。有些己酸菌在窖泥的天然状态下可以合成己酸，但是一旦离开了原生态地，进入人工培养条件下，便无法正常完成己酸代谢途径。作为一种筛选技术，要求简便快捷而且准确，不要因发酵条件不充分而遗漏一些能产己酸的候选菌。
解决上述技术问题的意义：
目前人们通过宏基因组学手段，已经能探测到窖泥环境中含有优势菌——梭菌属厌氧菌，依据OTU情况鉴别某一个属(种)的分布和丰度，而且能够对老窖泥进行人工富集，培养成多菌并存的较稳定的细菌群落。无论是从理论研究和应用研究都有长足的发展。然而，一些对培养条件要求苛刻的极端细菌仍很难分离到，即使分离到也没有及时地被成功鉴定为己酸菌，从而严重阻碍了这一类己酸菌的应用转化的速度。该技术则填补了从纯种未知菌的分离到优质护窖液的制备这一中间环节的技术空白，可从菌种库、新分离到的大量细菌中，快速筛选出己酸菌，再以此作为核心功能菌进行强化培养液的制备，创造出己酸产量更高、生态适应能力更强的己酸菌复合液类型，为浓香型白酒酒厂窖池质量的优化和优质酒出酒率的提升提供强有力的工具和技术支撑。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵方法和己酸菌快速筛选方法。
本发明是这样实现的，一种己酸菌增殖培养基，所述己酸菌增殖培养基由蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉3.0g/L、葡萄糖1.0～5.0g/L、可溶性淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、醋酸钠3.0～6.0g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、抗坏血酸0.3～1.0g/L、琼脂或卡拉胶0.5～2.0g/L和蒸馏水1000mL组成。
进一步，所述己酸菌增殖培养基pH值6.8±0.1。
本发明的另一目的在于提供一种使用所述己酸菌增殖培养基的己酸菌的发酵方法，所述己酸菌的发酵方法包括：
第一步，将液体培养基分装至100mL容积的厌氧瓶；选择性地添加维生素B1 0.5g/L，维生素K1 0.0005g/L或氯化血红素0.005～0.01g/L；
第二步，高压灭菌121℃，20min，冷却到50～70℃，添加预先灭菌好的液封油以隔绝空气；
第三步，接种0.5～5.0％己酸菌液或者使用接种环挑入单菌落；在瓶盖和封口膜之间，插入灭菌好的针头；
第四步，置于30～37℃恒温培养，静置培养6～10天，观察培养液的浑浊程度及产气情况；
第五步，补添0.2～1.0g/L生物素，0.01％～0.09％m/Vol的偏重亚硫酸钾或钠，1.0％～3.0％v/v乙醇，以及柠檬酸铁铵或硫酸亚铁0.5～1.0g/L；制备成FRCM液体发酵培养基；
第六步，筛选厌氧瓶中发酵液出现变黑，并记录变黑的发酵时间和变黑程度；至培养时间为14～20天，发酵液的变化趋于平稳后，结束发酵。
进一步，所述己酸菌的发酵方法液封油的组分是：液体石蜡和凡士林的混合物；液体石蜡和凡士林比例3:1～6:1。
本发明的另一目的在于提供一种由所述己酸菌的发酵方法得到的己酸菌发酵液。
本发明的另一目的在于提供一种所述己酸菌发酵液中的己酸菌检测方法，所述己酸菌检测方法包括：
第一步，取1.5mL发酵液，离心；取3～5滴上清液，滴加若干滴1mL的1.6～2.0％的酸度指示剂刃天青或者溴甲酚紫，检查变色情况；
第二步，取1mL上清液，加入0.4～0.6比例的无水乙醇，混匀；加入二乙基丁酸，使用极性柱的气相色谱-质谱联用法测定己酸的含量。
进一步，所述第二步使用极性柱的气相色谱-质谱联用法测定己酸的含量：安捷伦气相色谱TG-WAXMS A柱长60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；分流比20:1，载气高纯氦气，流速1ml/min；程序升温条件：开始温度为40℃，以40℃/min升高至245℃，保持4.8min。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、本发明使用一种新型的液体培养基，即己酸菌增殖培养基LRCM为：酵母粉3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉粉10.0g/L，葡萄糖1.0～5.0g/L，可溶性淀粉1.0g/L，氯化钠5.0g/L，醋酸钠3.0～6.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，抗坏血酸0.3～1.0g/L，琼脂(或卡拉胶)0.5～2.0g/L，蒸馏水1000mL，pH值6.8±0.1。常规的EAM巴氏培养基因不含有葡萄糖、蛋白胨，有机成分少，主要用于选择性地富集己酸菌，适于从复杂环境中分离培养己酸菌。而本发明中的LRCM培养基是对已有的纯种己酸菌能最大程度地繁殖，并且完成己酸代谢。该培养基中的醋酸钠一定的pH缓冲作用，而不需要碳酸钙来及时消除H+离子；L-半胱氨酸盐酸盐和抗坏血酸具有还原性，是溶液中的氧气对厌氧菌的毒害作用降低。可溶性淀粉和少量的琼脂，是一些细菌可以附着，有助于一些非悬浮生长的细菌或黏连增殖的细菌快速达到一定浓度，加快了后续的代谢分析。
本发明选择性添加营养物质，可以提高细菌密度。根据不同的细菌的来源和分离过程，选择性地添加维生素B10.5g/L，维生素K10.0005g/L或氯化血红素0.005～0.01g/L，可以帮助其生长分裂，避免了由菌的浓度过低导致其代谢物(己酸)在检测水平之下。
本发明的培养和发酵同在一个100mL容积的厌氧瓶。厌氧瓶玻璃质透明便于观测，且配套以油封措施，是极好的小体积发酵设备。液封油：凡士林和液体石蜡3:1～6:1的混合物。不低于50度的条件下完成油封，以尽可能减少培养基中的溶解氧。待冷却至30度以下，进行接种。为防止发酵过程中，产气造成爆炸，在厌氧瓶的顶部插入无菌的针头，针头由透气但杂菌无法自由穿梭的封口膜使之与外界隔离。
2、本发明的发酵条件的控制和优化
“两步法”中所使用的发酵培养基FRCM，其成分与前者LRCM基本相同，且处于同一容器，不需要转接菌种。符合了发酵过程中指数增长期之后(细胞生长密度达到一定值)才进入合成代谢的规律。根据第一阶段增殖时期的细菌密度来判定何时进入发酵环节。转换的时机是，待培养基能肉眼可见浑浊，有悬浮或絮状的菌体，此时葡萄糖大致消耗殆尽。控制这一转折点的措施是，补加偏重亚硫酸钾(钠)0.05～0.95g/L，以及1.0％～3.0％(v/v)乙醇，同时加入柠檬酸铁铵或硫酸亚铁1.0g/L作为指示剂。
本发明发酵阶段加入氧化还原指示剂柠檬酸铁铵或硫酸亚铁，在发酵液的深层容易变黑，这是由于该处细菌容易产生H2，发生氧化还原作用。不仅可以检测发酵过程中细菌的繁殖情况，还能对产气荚膜梭状菌(可能产己酸)快速鉴别。
本发明的酸度指示剂刃天青或溴甲酚紫的作用：吸取部分发酵培养基FRCM，进行酸度检测。己酸菌不仅可以产己酸，往往还伴随着产生乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等有机酸。发酵正常的体系中，酸度会持续下降，直至稳定在一定的水平。这可以肉眼直观地鉴别该发酵体系(细菌)是否产酸，发酵是否接近尾声。
进入发酵阶段，除了补加0.01％～0.09％偏重亚硫酸钾(钠)和1.0％～3.0％(v/v)乙醇，还选择性地添加0.2～1.0g/L生物素，或者丁酸钠，不仅创造了己酸代谢所需的氧化还原环境，提高了细菌的活力，还相当于添加了一些己酸合成途径的中间代谢物，这有助于发现己酸合成末端的代谢酶的作用。
3、本发明的发酵液的组分分析
检测样品的制备，取1.5mL的发酵液，离心，取上清液，加入同等体积的乙醇。加内标物2-乙基丁酸2uL。由于己酸呈油滴状，微溶于水，而在一定酒精度的溶液中，能较好地溶解，进入色谱柱。这种样品处理方式，省去了乙醚提取，更为安全和快捷。
气相色谱的检测方法：采用极性柱，更有利于有机酸的检测。具体方法是：TG-WAXMS A柱长60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm。程序升温条件：开始温度为40℃，以40℃/min升高至245℃，保持4.8min。每个样品的检测时间不超过15min，该检测方法不仅灵敏，可定量，还高效快速。
通过观察玻璃瓶中的发酵现象进行初筛，以能产还原性气体氢气而使得含铁Fe的物质变黑，发酵液呈现酸性(低于5.0或4.5)，以及发酵液会释放类似老窖泥的酸臭味，淘汰一批现象相反的待试菌，提高筛选效率(成功率)，进一步用于大规模、高通量的己酸菌筛选。
附图说明
图1是本发明实施例提供的己酸菌增殖的发酵方法流程图。
图2是本发明实施例提供的步骤六，培养时间至第14～20天，有些待试菌的发酵液明显变黑，且多呈絮状于瓶底或下部；
图中：(a)待试菌a没有产气，发酵液浑浊，但不变黑；(b)待试菌b在厌氧发酵时能够产气泡，并使发酵液变黑，黑色沉淀多位于底部。
图3是本发明实施例提供的己酸菌的厌氧培养、发酵及细胞显微结构示意图；
图中：(a)待试菌YL-19的细胞显微结构；(b)待试菌XL-48a的细胞显微结构；(c)待试菌XL-34a的细胞显微结构，以上均为梭状芽孢杆菌，放大倍数均为1000倍。
图4是本发明实施例提供的己酸菌发酵液的气相色谱、质谱分析结果示意图；
图中：(a)发酵液的有机酸使用TG-WAX柱子的气相色谱分离示意图；(b)己酸菌发酵液中的己酸的质谱分析(结构式)；(c)发酵液的不同有机酸使用Hp-5柱子的气相色谱分离出峰示意图。
图5是本发明实施例提供的两步法”己酸筛选体系的增殖、发酵及检测的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明在实验室条件下，对大量可培养的纯菌进行“是否产己酸”进行快速又准确的鉴别。本发明由细菌液体培养、液体发酵“两步法”完成，通过中途添加偏重亚硫酸钾(钠)和乙醇作为“两步法”转换的开关，既减少其对生长的抑制，而又能促进细菌的己酸合成，发酵体系的体积小，取少量发酵液，配制成乙醇溶液，进行气相色谱-质谱检测；节省时间，准确性高，适用范围广。可以对来自平皿或者干粉，或者甘油保菌液，或者菌悬液等任一形式的纯种菌进行产己酸的筛选和鉴定。只要该菌能在厌氧下生长代谢，便能对其发酵液中的酸性成分(分子量小于己酸)进行气相色谱的测定。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明的实施例提供的己酸菌增殖培养基为LRCM培养基(含抗坏血酸)；LRCM培养基成分是：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉10.0g/L，酵母粉3.0g/L，葡萄糖1.0～5.0g/L，可溶性淀粉1.0g/L，氯化钠5.0g/L，醋酸钠3.0～6.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，抗坏血酸0.3～1.0g/L，琼脂(或卡拉胶)0.5～2.0g/L，蒸馏水1000mL，pH值6.8±0.1。
将液体培养基分装至100mL容积的厌氧瓶。根据不同的细菌，选择性地添加维生素B10.5g/L，维生素K10.0005g/L或氯化血红素0.005～0.01g/L。
如图1所示，本发明实施例提供的己酸菌的发酵方法包括：
S101：将液体培养基分装至100mL容积的厌氧瓶；根据不同的细菌，选择性地添加维生素B10.5g/L，维生素K10.0005g/L或氯化血红素0.005～0.01g/L；
S102：高压灭菌(121℃，20min)，冷却到50～70℃时，添加预先灭菌好的液封油以隔绝空气；液封油的组分是：液体石蜡和凡士林的(比例在3:1～6:1之间)混合物；
S103：接种0.5～5.0％己酸菌液，或者使用接种环挑入单菌落；在瓶盖和封口膜之间，插入灭菌好的针头，以防止发酵时产气造成的爆炸；
S104：置于30～37℃恒温培养，静置培养6～10天，观察培养液的浑浊程度及产气情况；
S105：待细菌的生长密度达到一定值，补添0.2～1.0g/L生物素,0.01％～0.09％(m/Vol)的偏重亚硫酸钾(钠)，1.0％～3.0％(v/v)乙醇,以及柠檬酸铁铵(或硫酸亚铁)0.5～1.0g/L；制备成FRCM液体发酵培养基；
S106：筛选哪些厌氧瓶中发酵液出现变黑？并记录变黑的发酵时间和变黑程度；至培养时间为14～20天，发酵液的变化趋于平稳后，结束发酵。
本发明实施例提供的己酸菌检测方法包括：
第一步，取1.5mL发酵液，离心。取3～5滴上清液，滴加若干滴1mL的1.6～2.0％的酸度指示剂刃天青或者溴甲酚紫(50％乙醇溶液)，检查变色情况。
第二步，取1mL上清液，加入0.4～0.6比例的无水乙醇，混匀。加入适量内标物——二乙基丁酸，使用极性柱的气相色谱-质谱联用法测定己酸的含量。方法是：安捷伦气相色谱TG-WAXMS A柱长60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；分流比20:1，载气高纯氦气，流速1ml/min；程序升温条件：开始温度为40℃，以40℃/min升高至245℃，保持4.8min。
本发明的工艺流程：100mL的LRCM培养基(含抗坏血酸)的配制→高压灭菌(121℃，20min)→冷却到50～70℃时，添加液封油隔绝空气→接种0.5～5.0％己酸菌液→选择性地添加适量生物素、维生素B1、维生素K1、氯化血红素以满足比较难培养的细菌→30～37℃恒温静置深层培养7～10天，待细胞的密度足够大，添加偏重亚硫酸钾(钠)或乙醇、丁酸钠等中间物质制备成——FRCM发酵培养基→添加1mL的1.0～2.5％的酸度指示剂刃天青或者溴甲酚紫→静置培养至第14～20天→结束发酵，取1.5mL发酵液→离心，取上清液→加入0.4～0.6的比例95％乙醇，混匀→加入适量内标物二乙基丁酸→气相色谱-质谱法测定己酸的含量(见图5)。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1：
本发明实施例提供的己酸筛选体系的增殖、发酵及检测方法具体包括：
步骤一，配制LRCM培养基(含抗坏血酸)。LRCM液体培养基成分是：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉10.0g/L，酵母粉3.0g/L，葡萄糖5.0g/L，可溶性淀粉1.0g/L，氯化钠5.0g/L，醋酸钠3.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，抗坏血酸0.3g/L，琼脂0.5g/L，蒸馏水1000mL，pH值6.8±0.1。将液体培养基分装至100mL容积的厌氧瓶。
步骤二，高压灭菌(121℃，20min)，冷却到50～55℃时，添加预先灭菌好的液封油以隔绝空气(见图2a)。液封油组分：液体石蜡和凡士林(比例3:1)。
步骤三，接种1mL的待测菌株YL-19培养液(见图3a)。在瓶盖和封口膜之间，插入灭菌好的针头，以防止发酵时产气造成的爆炸(见图2b)。
步骤四，置于32℃恒温培养，培养7天，直至培养液出现浑浊程度，不断有气泡生成。
步骤五，待细菌的生长密度达到一定值，补添0.03％(m/Vol)的偏重亚硫酸钾(钠)，1.0％(v/v)乙醇以及柠檬酸铁铵0.5g/L。制备成FRCM发酵培养基。
步骤六，培养时间至第14天，发酵液明显变黑，且多呈絮状于瓶底或下部(见图2b)，结束发酵。
步骤七，取1.5mL发酵液，离心，4000rpm，5min。取3～5滴上清液，滴加若干滴0.004％％的刃天青(50％乙醇溶液)，呈现黄色。
步骤八，取0.75mL上清液，加入同等体积的95％乙醇，混匀。加入2uL的0.1mg/uL二乙基丁酸作为内标。使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法测定样品(见图4a,4b)。方法是：安捷伦气相色谱TG-WAXMS A柱长60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；分流比20:1，载气高纯氦气，流速1ml/min；程序升温条件：开始温度为40℃，以40℃/min升高至245℃，保持4.8min。最终测得正己酸的浓度为120mg/L，丁酸的浓度为1040mg/L。
实施例2：
本发明实施例提供的己酸筛选体系的增殖、发酵及检测方法包括：
步骤一，配制100mL的LRCM培养基。LRCM液体培养基成分是：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉10.0g/L，酵母粉3.0g/L，葡萄糖1.0g/L，可溶性淀粉1.0g/L，氯化钠5.0g/L，醋酸钠5.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，抗坏血酸1.0g/L，琼脂1.0g/L，蒸馏水1000mL，pH值6.8±0.1。将液体培养基分装至100mL容积的厌氧瓶。
步骤二，高压灭菌(121℃，20min)，冷却到60～70℃时，添加维生素B10.5g/L，氯化血红素0.01g/L。添加预先灭菌好的液封油以隔绝空气。液封油的组分是：液体石蜡和凡士林(5:1)。
步骤三，接种2.0mL的待测菌株XL-48a培养液。在瓶盖和封口膜之间，插入灭菌好的针头，以防止发酵时产气造成的爆炸。
步骤四，置于35℃恒温培养，培养10天，观察到培养液逐渐变浑浊。
步骤五，此时，补添0.2g/L生物素，0.05％(m/Vol)的偏重亚硫酸钠，2.0％(v/v)乙醇，以及硫酸亚铁1.0g/L。制备成FRCM发酵培养基。
步骤六，培养时间至第13天，发酵液明显变黑，待其产气情况趋于平稳后，第20天结束发酵。
步骤七，取1.5mL发酵液，离心，4000rpm，5min。取3～5滴上清液，滴加若干滴1.6％的溴甲酚紫(乙醇溶液)，检查酸指示剂的变色情况，变为黄色。
步骤八，取0.75mL上清液，加入同等体积的无水乙醇，混匀。加入2uL的0.1mg/uL二乙基丁酸作为内标。使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法：安捷伦气相色谱TG-WAXMS A柱长60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；分流比20:1，载气高纯氦气，流速1ml/min；程序升温条件：开始温度为40℃，以40℃/min升高至245℃，保持4.8min。最终测得正己酸的浓度为20mg/L。
实施例3：
本发明实施例提供的己酸筛选体系的增殖、发酵及检测方法包括：
步骤一，配制11.5L的LRCM液体培养基。LRCM培养基成分是：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉10.0g/L，酵母粉3.0g/L，葡萄糖5.0g/L，可溶性淀粉1.0g/L，氯化钠5.0g/L，醋酸钠6.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，抗坏血酸0.5g/L，卡拉胶1.0g/L，蒸馏水1000mL，pH值6.8±0.1。将液体培养基分装至115个100mL容积的厌氧瓶。
步骤二，高压灭菌(121℃，20min)，冷却到50～70℃时，添加预先灭菌好的液封油以隔绝空气。液封油组分是：液体石蜡和凡士林(6:1)。
步骤三，使用接种环挑入XL-34a己酸菌(见图3b,3c)等单菌落，共制得115个发酵体系(见图2a)。在瓶盖和封口膜之间，插入灭菌的针头，以防止发酵时产气造成的爆炸。添加维生素B10.5g/L，维生素K10.0005g/L、氯化血红素0.005g/L。
步骤四，置于30～37℃恒温静置培养，培养12天，观察到个别的培养液非常浑浊，产气泡基本停止，细菌的生长密度达到一定值。
步骤五，补添0.08％(m/Vol)的偏重亚硫酸钾(钠)、3.0％(v/v)乙醇以及柠檬酸铁铵1.0g/L。制备成FRCM液体发酵培养基。
步骤六，培养至第18天，某些厌氧瓶中发酵液出现变黑(比如XL-34a、XL-48a等)，发酵液的变化趋于平稳，结束发酵。
步骤七，取1.5mL发酵液，离心。每个样品取8～10滴上清液，滴加0.5mL的1.0％的刃天青(50％乙醇溶液)，26个发酵体系呈微红色，48个发酵体系的上清液变成黄色，其余的呈中间过渡性颜色。基于初筛结果，对48个酸指示剂呈黄色的发酵体系(酸性)，进行下一步的己酸检测。
步骤八，取0.75mL上清液，加入等体积的无水乙醇，混匀，得1.5mL的待测液体。加入2ul的0.1mg/uL内标物——二乙基丁酸，使用极性柱的气相色谱-质谱联用法测定己酸的含量。方法是：安捷伦气相色谱TG-WAXMS A柱长60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；分流比20:1，载气高纯氦气，流速1ml/min；程序升温条件：开始温度为40℃，以40℃/min升高至245℃，保持4.8min。最终测得4个细菌能产正己酸(见表1)。
表1有代表性的发酵液中的有机酸(己酸为终端代谢物)
本发明由细菌的液体培养、液体发酵“两步法”完成，通过中途添加偏重亚硫酸钾(钠)以及乙醇，作为“两步法”转换的开关，既减少接种后初期这两种添加物对细菌生长繁殖的抑制，而又能在达到较高细胞密度时促进细菌的己酸合成。发酵容器透明，便于实时跟踪观测。可根据不同待试菌的发酵产酸、产气情况、以及氧化还原指示剂的变色情况进行初筛；发酵体系体积小，仅取少量发酵液，配制成乙醇溶液，无需乙醚萃取，直接进行气相色谱-质谱检测；使用TG-WAX柱进行分离，同时对发酵液中的己酸及其他的有机酸进行定性定量检测，最终完成己酸菌的复筛。便于操作，节省时间，准确性高，适用范围广。
一、所使用的增殖培养基最相近的是现有技术三中的“培养基A”，其为梭菌增殖培养基，使用的方式是试管斜面培养，并非液体培养基，不适合用作发酵，目的是复苏己酸菌，然后用无菌水制成己酸菌悬液。没有添加L-抗坏血酸，且灭菌后没有选择性地添加维生素B1、维生素K1或氯化血红素等有机物质。其pH值为7.0～7.2，本专利的液体培养基初始pH为6.8±0.1。在现有技术，浓香型白酒窖泥中主要产香菌的鉴定(DOI:10.16442/j.Cnki.Qlgydxxb.2018.03.003)中，其做使用的“丁酸菌培养基”，缺少L-抗坏血酸，没有调节初始pH，其液体培养基主要用于富集和分离窖泥中产丁酸细菌，并非己酸菌，且没有进行发酵试验。本发明中LRCM培养基在高压灭菌后，接种前，选择性添加了某些极端细菌所必需的维生素，营养成分更全面，更具有针对性；基于“两步法”转换的思路，添加了偏重亚硫酸钾和乙醇，构成了FRCM液体培养基。相对于前两者的“培养基A”、“丁酸菌培养基”，本发明中的LRCM既具有培养增殖的作用，也能为发酵提供必需的物质和环境，适合基于发酵产物的窖泥中菌种资源的筛选试验。
二、发酵液中己酸的检测方法，(DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2001.07.004)有人通过生成苄酯衍生物，把酸变成酯，使用气相色谱hp-1(交联甲基硅烷)大口径毛细管柱(25m*53mm)法，加内标物2-乙基丁二酸，进行定量。其缺陷是：该法酯化反应繁琐且易造成损耗，需大量的标准物质(不同的有机酸)，不适合大批量样品的筛选。另外，现有技术一的气相色谱的检测方法，没有对所使用的分离柱的具体描述，且缺少色谱图的比较数据；现有技术十使用了DB-FFAP色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)。本发明中比较了一般中性柱(比如hp-5)与极性柱(TG-WAX柱)之间的差异。两种不同分离柱子的峰图差异见图4a和4c，己酸的出峰时间分别是6.98和9.59。图4a中的极性柱TG-WAX柱分离效果明显更优。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种己酸菌增殖培养基，其特征在于，所述己酸菌增殖培养基由蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉3.0g/L、葡萄糖1.0～5.0g/L、可溶性淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、醋酸钠3.0～6.0g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、抗坏血酸0.3～1.0g/L、琼脂或卡拉胶0.5～2.0g/L和蒸馏水1000mL组成。
2.如权利要求1所述的己酸菌增殖培养基，其特征在于，所述己酸菌增殖培养基pH值6.8±0.1。
3.一种使用权利要求1所述己酸菌增殖培养基的己酸菌的发酵方法，其特征在于，所述己酸菌的发酵方法包括：
第一步，将液体培养基分装至100mL容积的厌氧瓶；选择性地添加维生素B10.5g/L，维生素K10.0005g/L或氯化血红素0.005～0.01g/L；
第二步，高压灭菌121℃，20min，冷却到50～70℃，添加预先灭菌好的液封油以隔绝空气；
第三步，接种0.5～5.0％己酸菌液或者使用接种环挑入单菌落；在瓶盖和封口膜之间，插入灭菌好的针头；
第四步，置于30～37℃恒温培养，静置培养6～10天，观察培养液的浑浊程度及产气情况；
第五步，补添0.2～1.0g/L生物素，0.01％～0.09％m/Vol的偏重亚硫酸钾或钠，1.0％～3.0％v/v乙醇，以及柠檬酸铁铵或硫酸亚铁0.5～1.0g/L；制备成FRCM液体发酵培养基(进入己酸发酵)；
第六步，观察厌氧瓶中发酵液是否出现变黑，记录变黑的时间和变黑程度(初筛)；至培养时间为14～20天，发酵液的变化趋于平稳后，结束发酵。
4.如权利要求3所述的己酸菌的发酵方法，其特征在于，所述己酸菌的发酵方法液封油的组分是：液体石蜡和凡士林的混合物；液体石蜡和凡士林比例3:1～6:1。
5.一种由权利要求3～4任意一项所述己酸菌的发酵方法得到的己酸菌发酵液。
6.一种如权利要求5所述己酸菌发酵液中的己酸菌检测方法，其特征在于，所述己酸菌检测方法包括：
第一步，取1.5mL发酵液，离心；取3～5滴上清液，滴加若干滴1mL的1.6～2.0％的酸度指示剂刃天青或者溴甲酚紫，检查变色情况(初筛)；
第二步，取1mL上清液，加入0.4～0.6比例的无水乙醇，混匀；加入二乙基丁酸，使用极性柱的气相色谱-质谱联用法测定己酸的含量(复筛)。
7.如权利要求6所述的己酸菌检测方法，其特征在于，所述第二步使用极性柱的气相色谱-质谱联用法测定己酸的含量：安捷伦气相色谱TG-WAXMS A柱长60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；分流比20:1，载气高纯氦气，流速1ml/min；程序升温条件：开始温度为40℃，以40℃/min升高至245℃，保持4.8min。
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