CN108865942A - 一种不加CaCO3培养己酸菌的配方及己酸菌培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不加CaCO₃培养己酸菌的配方NCEAM及己酸菌培养方法。通过不加CaCO₃，调整pH、乙醇添加量、培养温度并检测己酸菌生长和己酸产量，最终得到己酸菌培养配方。与优化的EAM培养配方相比，本配方在不显著影响己酸菌生长的情况下，使己酸产量提高16.24%，达5.08 g/L。使用该配方，可以去除CaCO₃对后续实验的影响，有利于己酸菌的科学研究工作，此外，在酒厂生产应用中，可减少CaCO₃的积累，有利于维护和提高窖泥品质。

Description

一种不加CaCO3培养己酸菌的配方及己酸菌培养方法

技术领域

本发明涉及白酒功能微生物培养领域，具体是一种不加CaCO₃培养己酸菌的配方及己酸菌培养方法。

背景技术

浓香型白酒是中国产销量最大的白酒。在发酵生产浓香型白酒的过程中，窖泥具有重要作用。窖泥中栖息大量微生物，对白酒品质和风格具有重大影响。己酸菌作为窖泥中一类重要功能微生物已被广泛研究，它可利用乙醇产生己酸，继而转化成浓香型白酒的风味物质—己酸乙酯。生产中，人们常常往窖泥中添加富含己酸菌的营养液，以提高浓香型白酒的品质。

为了扩增菌体，人们对己酸菌的培养条件进行了大量研究。截至目前，人们所使用的经典培养基为EAM (Ethanol Acetic acid-Na Medium)。然而，该培养基中含有CaCO₃，不利于相关研究工作的开展，如菌体生长监测、己酸产量检测、菌体收集及后续DNA、RNA的提取等。此外，将己酸菌液添加至窖泥时，过多的CaCO₃容易引起窖泥钙化，导致窖泥老化。

为了解决这一问题，人们尝试了不加CaCO₃来培养己酸菌。刘复金等人对分离出的己酸菌L-Ⅱ菌株研究后发现，不加CaCO₃也能产己酸。然而，该菌株己酸产量很低（在EAM培养基中己酸产量为0.17 g/L）。在前期研究中，本课题组从浓香型白酒窖泥中分离到一株己酸高产菌株C. kluyveri JZZ。研究表明，在EAM培养基的基础上，通过优化培养配方（优化后培养基pH为6.5，接种量为5% ），JZZ己酸产量达4.36 g/L，应用于白酒生产中已取得良好效益。然而，该配方仍含有CaCO₃，不利于后续工作的开展。针对己酸菌高产菌株，建立不加CaCO₃的培养方法，在科学研究和白酒生产中具有重要意义。

发明内容 本发明的目的是提供一种不加CaCO₃培养己酸菌的配方及己酸菌培养方法，以解决现有技术培养己酸菌需要加入CaCO₃的问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种不加CaCO₃培养己酸菌的配方NCEAM（None-CaCO₃ EAM），其特征在于：包括以下含量的培养组分：

NaAc 0-30 g/L，

Yeast extract 0-20 g/L，

MgSO₄•7H₂O 0-10 g/L，

K₂HPO₄ 0-10 g/L，

(NH₄)₂SO₄ 0-10 g/L；

将上述组分在相应体积的蒸馏水中混合均匀后，利用盐酸将pH调整至4.5-9.0；并在110-130 ℃灭菌5-30分钟，使用前加入培养基体积0-8%的乙醇。

所述的一种不加CaCO₃培养己酸菌的配方NCEAM，其特征在于：各组分的最优用量如下：

NaAc 5 g/L，

Yeast extract 1 g/L，

MgSO₄•7H₂O 0.2 g/L，

K₂HPO₄ 0.4 g/L，

(NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L；

将上述组分在在相应体积的蒸馏水中混合均匀后，利用盐酸将pH调整至7.0；121 ℃灭菌20分钟，使用前加入培养基体积2%的乙醇。

一种所述不加CaCO₃培养己酸菌的配方NCEAM的己酸菌培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）、配制培养基：

称取符合要求用量的NaAc、Yeast extract、MgSO₄·7H₂O、K₂HPO₄、 (NH₄)₂SO₄，在相应体积的蒸馏水中混合均匀后，利用盐酸将pH调整至7.0，然后在121℃灭菌20分钟，得到培养基；

（2）、在正式采用步骤（1）配置的培养基进行己酸菌生长前，向培养基中加入培养基体积2%的乙醇；

（3）、在25-43 °C条件下对步骤（2）加入乙醇后的培养基进行厌氧培养48-360 小时，以使己酸菌发酵得到己酸菌菌液。

所述的己酸菌培养方法，其特征在于：步骤（3）中，厌氧培养的最佳温度为37 °C，最佳时间为192小时。

所述的己酸菌培养方法，其特征在于：步骤（3）中，采用分光光度法检测己酸菌发酵液的OD值，将己酸菌发酵液摇匀后，利用比色皿在紫外分光光度计600 nm波长下检测发酵液OD值，测定3次，取平均值。

所述的己酸菌培养方法，其特征在于：步骤（3）中，己酸菌己酸产量检测过程如下：

1）、摇匀己酸菌发酵液；取1 mL，10000 g离心1 min；用孔径0.22 μm水相滤膜过滤；

2）、称取0.372 g 2-乙基丁酸，用无水乙醇定容至1 ml；混合均匀后全部移入10mL容量瓶中，用75%乙醇定容，制成0.2%的2-乙基丁酸单内标液；

3）、取500 μL过滤后的发酵液和500 μL单内标液，移入5 mL容量瓶中，用乙醚进行定容至5 mL；

4）、上下颠倒容量瓶，使发酵液、内标液和乙醚充分混合，25 ℃静置5 min；

5）、取上层液体1 mL，移入洁净色谱瓶中，垫上密封垫，旋紧瓶盖；

6）、利用气相色谱仪测定己酸含量；气相色谱条件：进样口温度240℃；柱箱起始温度100 ℃，持续时间1 min；升温速率10 ℃/min；柱温最终温度220 ℃，持续时间2 min；检测器温度250 ℃；气体流量：氢气40 mL/min，空气400 mL/min，尾吹气30 ml/min；进样方式：分流进样，分流比20：1；进样体积：1μL。

与现有技术相比，本发明的优点为：

1、本发明可不加CaCO₃，有利于己酸菌的科学研究和酿酒窖泥维护、优化。

2、本发明所使用的培养配方，在不显著影响菌体生长的情况下，己酸产量达5.08g/L，产量比优化的EAM培养配方提高16.24%。

附图说明

图1为不添加CaCO₃对C. kluyveri JZZ生长(A)和己酸产量(B)的影响，图1中：每个样品所对应的数据为三组实验的平均值。

图2为pH对C. kluyveri JZZ生长(A)和己酸产量(B)的影响，图2中：μ，比生长速率；每个样品所对应的数据为三组实验的平均值。

图3为乙醇浓度对C. kluyveri JZZ生长(A)和己酸产量(B)的影响，图3中：μ，比生长速率；每个样品所对应的数据为三组实验的平均值。

图4为培养温度对C. kluyveri JZZ生长(A)和己酸产量(B)的影响，图4中：μ，比生长速率；每个样品所对应的数据为三组实验的平均值。

图5为两种培养配方对C. kluyveri JZZ生长(A)和己酸产量(B)的影响，图5中：EAM，优化的EAM培养配方；NCEAM，NCEAM培养配方；每个样品所对应的数据为三组实验的平均值。

具体实施方式

实施例1 不加CaCO₃的己酸菌培养配方

1. 不加CaCO₃能培养己酸菌的原理

之前的理论认为，CaCO₃可以中和生成的己酸，同时释放出CO₂，有利于己酸菌生长，有促进己酸生成的效果。然而，从理论上来说，己酸菌高产菌株完全有可能在不加CaCO₃的培养基中生长，因为己酸高产菌株理论上具有较强的己酸耐受能力和相应的耐受机制，不借助于钙离子的作用仍然能耐受己酸；另一方面，CaCO₃反应生成的CO₂也不一定是己酸高产菌株生长所必须的，之前的理论认为需要CO₂，可能是因为有些己酸菌很难纯培养，需要与甲烷菌共培养才能长得较好，而CO₂有利于甲烷菌生长。因此，可纯培养的己酸高产菌株有可能在不加CaCO₃的培养基中也能生长。

2. 培养基配制

称取5 g NaAc、1 g yeast extract、0.2 g MgSO₄·7H₂O、0.4 g K₂HPO₄、0.5 g (NH₄)₂SO₄，在1L蒸馏水中混合均匀；用盐酸将培养基pH调整至6.5；121℃灭菌20分钟。使用前加入培养基体积2.0%的乙醇。

3. 己酸菌活化、培养

（1）活化：取出保存在-80℃冰箱的菌种C. kluyveri JZZ，80 ℃水浴5min。接种于100mL培养基中，接种量为1%，在37℃静置厌氧培养。

（2）培养：待种子液OD₆₀₀值达到0.4时，把种子液接种到新鲜的培养基中，接种量为5%，在37℃静置厌氧培养。

4. 己酸菌生长监测及己酸产量检测

从接种到第48 h，菌体浓度缓慢增加，第48 h时发酵液OD₆₀₀为0.037；第48 h到144 h处于指数生长期，菌体浓度迅速增加，第144 h时OD₆₀₀达0.33；第192 h菌体浓度达到最高，OD₆₀₀达0.36（图 1A）。同时，己酸产量在第192 h时达到最高，达4.28 g/L（图 1B）。该实验结果表明，C. kluyveri JZZ在该培养基中可以生长并能产己酸。

实施例2 培养配方优化

1. pH对C. kluyveri JZZ生长和产己酸的影响

pH对菌株生长和代谢可能具有重要影响。配置培养基时设计不同初始pH值，研究pH对菌株生长和己酸产量的影响。

结果显示，当pH≤3.0时，C. kluyveri JZZ几乎不生长；随着pH的升高，菌体比生长速率迅速增加； pH =7.0时达到最高，比生长速率达0.026 h^-1；pH＞7.0，比生长速率迅速下降，菌株生长受到抑制（图2A）。己酸产量方面， pH≤3.0时，己酸产量为0；随着 pH的升高，己酸产量迅速增加； pH=7.0时己酸产量最高，达5.03 g/L；pH＞7.0，己酸产量迅速下降（图2B）。上述实验结果表明，培养基初始pH调到7.0时，最有利于C. kluyveri JZZ的生长和产己酸。

2. 乙醇浓度对C. kluyveri JZZ生长和产己酸的影响

设置不同乙醇浓度，研究乙醇对菌株生长和己酸产量的影响。结果显示，不添加乙醇时，C. kluyveri JZZ不能生长；当乙醇浓度为2.0%时，比生长速率最高；当乙醇浓度＞2.0%，比生长速率逐渐降低，菌株生长逐渐受到抑制；乙醇浓度达到10.0%时，C. kluyveri JZZ无法生长（图3A）。己酸产量方面，乙醇浓度为2.0%时，己酸产量达到最高，达5.11 g/L；乙醇浓度10.0%时，几乎不产己酸（图3B）。上述实验结果表明，向培养基中添加2.0%乙醇时，最有利于C. kluyveri JZZ的生长和产己酸。

3. 培养温度对C. kluyveri JZZ生长和产己酸的影响

设置不同培养温度，研究温度对菌株生长和己酸产量的影响。结果显示，25℃到37℃时，C. kluyveri JZZ比生长速率逐渐上升，37℃达到最高，为0.027 h^-1；温度超过37℃，比生长速率迅速下降；温度45℃时，JZZ不能生长（图4A）。己酸产量方面，25-37℃时己酸产量逐渐增加；37℃己酸产量最高，达5.01 g/L； 37℃-45℃时己酸产量迅速下降；45℃己酸产量为0（图4B）。上述实验结果表明，培养温度为37℃时，最有利于C. kluyveri JZZ的生长和产己酸。

经过上述研究，我们得到NCEAM培养配方：NaAc 5 g/L、 yeast extract 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L、 K₂HPO₄ 0.4 g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L，在相应体积的蒸馏水中混合均匀后，利用盐酸将pH调整至7.0，121℃灭菌20分钟，使用前加入培养基体积2.0%的乙醇，培养时采用37°C厌氧培养。

实施例3 两种培养配方对C. kluyveri JZZ生长和己酸产量的影响

使用NCEAM配方与优化的EAM培养配方（将EAM培养基pH调整为6.5）分别培养己酸菌，检测C. kluyveri JZZ生长情况和己酸产量。结果表明，C. kluyveri JZZ在两种培养条件下菌体浓度并无明显差异（图5A）。己酸产量方面，NCEAM配方对应己酸产量最高为5.08 g/L，优化的EAM培养配方对应己酸产量最高为4.37 g/L，前者比后者提高了16.24%（图5B）。

本发明所研究的己酸菌培养配方NCEAM，在不显著影响己酸菌生长的情况下，使己酸产量提高16.24%，达5.08 g/L。使用该配方，可以去除CaCO₃对后续实验的影响，有利于己酸菌的科学研究工作，如菌体浓度测定时更迅速准确；菌体收集、DNA和RNA提取等操作步骤减少，成功率提高。此外，在酒厂生产应用中，可减少CaCO₃的积累，有利于维护和提高窖泥品质。

Claims (6)

1.一种不加CaCO₃培养己酸菌的配方，其特征在于：包括以下含量的培养组分：

NaAc 0-30 g/L，

Yeast extract 0-20 g/L，

MgSO₄•7H₂O 0-10 g/L，

K₂HPO₄ 0-10 g/L，

(NH₄)₂SO₄ 0-10 g/L；

将上述组分在相应体积的蒸馏水中混合均匀后，利用盐酸将pH调整至4.5-9.0；并在110-130 ℃灭菌5-30分钟，使用前加入培养基体积0-8%的乙醇。

2.根据权利要求1所述的一种不加CaCO₃培养己酸菌的配方，其特征在于：各组分的最优用量如下：

NaAc 5 g/L，

Yeast extract 1 g/L，

MgSO₄•7H₂O 0.2 g/L，

K₂HPO₄ 0.4 g/L，

(NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L；

将上述组分在在相应体积的蒸馏水中混合均匀后，利用盐酸将pH调整至7.0；121 ℃灭菌20分钟，使用前加入培养基体积2%的乙醇。

3.一种基于权利要求1所述不加CaCO₃培养己酸菌的配方的己酸菌培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）、配制培养基：

称取符合要求用量的NaAc、Yeast extract、MgSO₄·7H₂O、K₂HPO₄、 (NH₄)₂SO₄，在相应体积的蒸馏水中混合均匀后，利用盐酸将pH调整至7.0，然后在121℃灭菌20分钟，得到培养基；

（2）、在正式采用步骤（1）配置的培养基进行己酸菌生长前，向培养基中加入培养基体积2%的乙醇；

（3）、在25-43 °C条件下对步骤（2）加入乙醇后的培养基进行厌氧培养48-360 小时，以使己酸菌发酵得到己酸菌菌液。

4.根据权利要求3所述的己酸菌培养方法，其特征在于：步骤（3）中，厌氧培养的最佳温度为37 °C，最佳时间为192小时。

5.根据权利要求3所述的己酸菌培养方法，其特征在于：步骤（3）中，采用分光光度法检测己酸菌发酵液的OD值，将己酸菌发酵液摇匀后，利用比色皿在紫外分光光度计600 nm波长下检测发酵液OD值，测定3次，取平均值。

6.根据权利要求3所述的己酸菌培养方法，其特征在于：步骤（3）中，己酸菌己酸产量检测过程如下：

1）、摇匀己酸菌发酵液；取1 mL，10000 g离心1 min；用孔径0.22 μm水相滤膜过滤；

2）、称取0.372 g 2-乙基丁酸，用无水乙醇定容至1 ml；混合均匀后全部移入10mL容量瓶中，用75%乙醇定容，制成0.2%的2-乙基丁酸单内标液；

3）、取500 μL过滤后的发酵液和500 μL单内标液，移入5 mL容量瓶中，用乙醚进行定容至5 mL；

4）、上下颠倒容量瓶，使发酵液、内标液和乙醚充分混合，25 ℃静置5 min；

5）、取上层液体1 mL，移入洁净色谱瓶中，垫上密封垫，旋紧瓶盖；

6）、利用气相色谱仪测定己酸含量；气相色谱条件：进样口温度240℃；柱箱起始温度100 ℃，持续时间1 min；升温速率10 ℃/min；柱温最终温度220 ℃，持续时间2 min；检测器温度250 ℃；气体流量：氢气40 mL/min，空气400 mL/min，尾吹气30 ml/min；进样方式：分流进样，分流比20：1；进样体积：1μL。