CN101736034A - 深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物发酵方法技术领域，特指一种深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法。该制备方法为：A、菌种采用红曲菌T6611菌株；B、菌种培养基为：(1)分离培养基PDA；(2)分离培养基CYA；(3)斜面培养基KMA；C、菌种的选育：通过基因工程技术或紫外诱变或者化学诱变；D、发酵培养基：以大米为主要原料(碳源)，黄豆、蛋白胨、玉米浆等为辅料(氮源)、乳酸调节pH值；E、发酵：采用液态发酵罐发酵，发酵的温度为32～36℃，通风比为1∶0.3～0.6，罐压0.4～0.7MPa，时间65～85H；F、提取红曲红色素。通过本发明制备的红曲红色素色价高，而桔霉素含量则始终处于非常低的水平，甚至不含桔霉素。
Description
技术领域：
本发明涉及生物发酵方法技术领域，特指一种深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法。
背景技术：
红曲属曲霉科真菌紫色红曲霉，又称红曲菌，是用红曲菌在大米中培养发酵而成。传统上，红曲广泛应用在黄酒、食醋等食品领域。近代医学研究报告认为，红曲具有降血压、降血脂的作用，所含红曲菌素K可阻止生成胆固醇。红曲色素也是我国的传统产品，其是通过微生物发酵法生产并得到广泛应用的最为成功的天然色素之一。但是，在制备红曲色素的过程中，通常会产生一种生物毒素——桔霉素。桔霉素具有致癌、致畸作用，并具有基因毒性这对红曲产品向全球的推广产生严重的负面影响。
目前，大多数红曲菌都产桔霉素，即色素红曲产品中大都含有桔霉素。红曲菌产桔霉素的多少，除了和菌种有关外，与发酵工艺条件也有着密切的关系。不同厂家使用相同的红曲菌种，但红曲产品中桔霉素含量有显著差别，说明桔霉素的含量与各厂的生产工艺有关。本发明人就是通过优化发酵工艺条件等方法制备低桔霉素或者不含桔霉素的红曲红色素。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题就在于克服目前红曲红色素制备方法中的不足，提供一种采用深层发酵、不含桔霉素或低桔霉素红曲红色素的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：该方法是通过基因敲出代谢工程、传统工艺优化技术、膜分离技术等，得到工业化生产的无桔霉素红曲红产品，其制备方法包括：A、菌种采用天益公司生产的红曲菌株T6611；B、菌种培养基为：(1)分离培养基PDA、CYA；(2)斜面培养基KMA；C、菌种的选育：选择培养好的菌种通过基因工程技术或经紫外诱变或者化学诱变；D、发酵培养基：以大米为主要原料作为碳源，黄豆、蛋白胨、玉米浆为辅料作为氮源、乳酸调节PH值；E、发酵：采用液态发酵罐发酵，发酵的温度为32～36℃，通风比为1∶0.3～0.7，罐压0.4～0.7MPa，时间65～85H；F、提取：采用纳滤、超滤集成技术，在提取精制过程中，有效地将大分子蛋白、小分子有机酸、糖与天然色素分离开，使产品的纯度显著提高，去除部分桔霉素，红曲色素纯度和稳定性显著提高。
所述的菌种培养基为：(1)分离培养基PDA：20％马铃薯浸汁1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g；(2)分离培养基CYA：蔗糖3％，酵母膏5.0％，KH2PO40.1％，NaNO30.3％，MgSO4·7H2O0.05％，FeSO4·7H2O0.001％，蒸馏水1000ml，1.5％琼脂；(3)斜面培养基KMA：可溶性淀粉3％，麦芽糖3％，蛋白胨2％，琼脂2％。
所述育种中的通过基因工程技术为突变的生产性能及桔霉素水平评价；紫外诱变方法为：将已培养好的试管斜面种，挑入内装有30～50ml的无菌水的三角瓶，置于摇床振荡30～40ml过滤，取10ml孢子悬浮液，加到Φ9ml的带磁力棒的培养皿内，在磁力搅拌下进行紫外照射2～10min，涂平板，用黑布包扎，于温度32～35℃下培养6～8天；所述的化学诱变方法为：制备孢子悬浮液，用0.01～0.1MH2NO3和1M pH4.5的醋酸处理，震荡摇匀5～30分钟，再用0.05MNaH2PO4作缓冲液，至pH8.0终止反应，涂布平板培养，其温度32～35℃、时间6～8天。
所述的发酵培养基为：米粉7～9％，KH2PO40.3～0.5％，NaNO30.2～0.4％，MgSO40.2～0.4％，黄豆0.2～0.5％，蛋白胨0.2～0.5％，玉米浆0.2～0.5％，并通过乳酸调节PH值。
所述的提取红曲红色素过程为：采用纳滤、超滤集成技术，发酵液滤渣经酒精萃取、纳滤、超滤浓缩及真空浓缩，喷雾干燥得到红曲红粉。
本发明通过基因敲出代谢工程、传统工艺优化技术、膜分离技术等，得到工业化生产的无桔霉素红曲红产品，通过本发明制备的红曲红色素发酵液色价高，而发酵液中桔霉素含量则始终处于非常低的水平，甚至不含桔霉素。最后发酵液经过酸化处理、酒精萃取、纳滤、超滤浓缩、真空浓缩、喷雾干燥等后处理工序得到红曲红粉，其桔霉素均处于极低、甚至不含的水平。
具体实施方式：
下面是本发明的具体实施方式
本发明是通过基因敲出代谢工程、传统工艺优化技术、膜分离技术等，得到工业化生产的无桔霉素红曲红产品，其制备方法包括：
1、菌种采用红曲菌T1166菌株；红曲菌优良菌种的选育，本发明所采用的红曲菌是TII66菌株，这是东莞天益生物工程有限公司提供。
2、培养基，菌种培养基可采用以下培养基。
(1)分离培养基PDA，其成份为：20％马铃薯1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g；
(2)分离培养基CYA，其成份为：蔗糖3％，酵母膏5.0％，KH2PO40.1％，NaNO30.3％，MgSO4·7H2O0.05％，FeSO4·7H2O0.001％，蒸馏水1000ml，1.5％琼脂。
(3)斜面培养基KMA，其成份为：可溶性淀粉3％，麦芽糖3％，蛋白胨2％，琼脂2％.
二、发酵培养基
以大米为主要原料(碳源)，黄豆、蛋白胨、玉米浆等为辅料(氮源)，其配方为：米粉7～9％，KH2PO40.3～0.5％，NaNO30.2～0.4％，MgSO40.2～0.4％，黄豆0.2～0.5％，蛋白胨0.2～0.5％，玉米浆0.2～0.5％、乳酸调节PH值。
三、发酵工艺条件的优化
本发明采用发酵罐深层发酵。其中发酵管采用30M3发酵罐：初定容有效体积为22.0M3，发酵时生长温度32～36℃，通风比为1∶0.3～0.7，罐压0.4～0.7MPa，时间65～85H。
1)有机氮源的改变(黄豆、蛋白胨比例适量减少0.2～0.5％)，发酵浓度比的调整(适量增大浓度比7～9％)；
2)不同发酵时期生长温度的控制，在发酵旺盛期适量升高发酵温度(35～36℃)可以缩短发酵时间、降低次代谢物桔霉素的产生和提高设备利用率、降低生产成本；
3)不同发酵时期的风量控制(分三个时期：前期、中期、后期1∶0.3～0.7)。
本发明重点是生产的原料配方的调整和改变、浓度比及在不同时期的温度、通风量比有不同。
四、红曲色素的提取
发酵液通过压滤、酒精萃取、超滤、纳滤、真空浓缩、喷雾干燥处理工序得到红曲红粉。
对采用本发明制作的红曲红色素样品进行检测，检测结果如下：
| 样品种类 | 色价(U/g，1％) | 样品重量(g) | 稀释倍数 | 峰面积 | 桔霉素含量(mg/kg) | 备注 |
| 红曲红(液) | 20 | 5 | 10 | 0 | 未测出 | |
| 红曲红(液) | 20 | 5 | 10 | 0 | 未测出 | |
| 红曲红 | 100 | 2 | 25 | 0 | 未测出 | |
| 红曲红 | 100 | 2 | 25 | 10.9 | 3.03 | 0.15ppm |
| 红曲红 | 100 | 2 | 25 | 5.7 | 1.59 | 0.08ppm |
| 红曲红 | 100 | 2 | 25 | 18.3 | 5.10 | 0.02ppm |
| 红曲红 | 100 | 2 | 25 | 3.9 | 1.09 | 0.06ppm |
| 红曲红 | 100 | 2 | 25 | 8.5 | 2.37 | 0.12ppm |
红曲红样品桔霉素含量的测定结果：
样品编号 桔霉素含量(mg/kg)
080118 未测出
080204 未测出
080305 0.08
080313 未测出
080322 未测出
080330 未测出
080407 0.12
080414 未测出
080418 未测出
080422 未测出
080430 未测出
从以上表中检测结果可以看出，红曲红色素中的桔霉素含量是很低的，基本上符合国际最低限量标准。说明通过对红曲菌的改造选育，在特定的工艺条件下，是完全可以控制红曲红产品中的桔霉素含量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法，其特征在于：通过基因敲出代谢工程、传统工艺优化技术、膜分离技术等，得到工业化生产的无桔霉素红曲红产品，其制备方法包括：
A、菌种采用天益公司生产的红曲菌株T6611；
B、菌种培养基为：(1)分离培养基PDA、CYA；(2)斜面培养基KMA；
C、菌种的选育：选择培养好的菌种通过基因工程技术或经紫外诱变或者化学诱变；
D、发酵培养基：以大米为主要原料作为碳源，黄豆、蛋白胨、玉米浆为辅料作为氮源、乳酸调节PH值；
E、发酵：采用液态发酵罐发酵，发酵的温度为32～35℃，通风比为1∶0.3～0.7，
罐压0.4～0.7MPa，时间65～85H；
F、提取：采用纳滤、超滤集成技术，在提取精制过程中，有效地将大分子蛋白、小分子有机酸、糖与天然色素分离开，使产品的纯度显著提高，去除部分桔霉素，红曲色素纯度和稳定性显著提高。
2.根据权利要求1所述的深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法，其特征在于：所述的菌种培养基为：
(1)分离培养基PDA：20％马铃薯浸汁1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g；
(2)分离培养基CYA：蔗糖3％，酵母膏5.0％，KH2PO40.1％，NaNO30.3％，MgSO4·7H2O0.05％，FeSO4·7H2O0.001％，蒸馏水1000ml，1.5％琼脂；
(3)斜面培养基KMA：可溶性淀粉3％，麦芽糖3％，蛋白胨2％，琼脂2％。
3.根据权利要求1所述的深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法，其特征在于：所述育种中的基因工程技术是：通过突变的生产性能及桔霉素水平评价；紫外诱变方法为：将已培养好的试管斜面种，挑入内装有30～50ml的无菌水的三角瓶，置于摇床振荡30～40ml过滤，取10ml孢子悬浮液，加到Ф9ml的带磁力棒的培养皿内，在磁力搅拌下进行紫外照射2～10min，涂平板，用黑布包扎，于温度32～35℃下培养6～8天；
所述的化学诱变方法为：制备孢子悬浮液，用0.01～0.1MH2NO3和1M pH4.5的醋酸处理，震荡摇匀5～30分钟，再用0.05MNaH2PO4作缓冲液，至pH8.0终止反应，涂布平板培养，其温度32～35℃、时间6～8天。
4.根据权利要求1所述的深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法，其特征在于：发酵培养基为：米粉7～9％，KH2PO40.3～0.5％，NaNO30.2～0.4％，MgSO40.2～0.4％，黄豆0.2～0.5％，蛋白胨0.2～0.5％，玉米浆0.2～0.5％，并通过乳酸调节PH值。
5.根据权利要求1所述的深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法，其特征在于：所述的提取红曲红色素过程为：采用纳滤、超滤集成技术，发酵液滤渣经酒精萃取、纳滤、超滤浓缩及真空浓缩，喷雾干燥得到红曲红粉。
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|---|---|---|---|---|
| CN102061268A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-05-18 | 湖南农业大学 | 一种产天然紫红色素菌株l4 |
| CN102924964A (zh) * | 2012-10-24 | 2013-02-13 | 江南大学 | 一种不含桔霉素的红曲红色素提取纯化生产工艺 |
| CN104195051A (zh) * | 2014-08-04 | 2014-12-10 | 东莞市天益生物工程有限公司 | 一种功能火龙果红曲的制备方法及其制品 |
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2009
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