CN109652348A - 一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌及在山西老陈醋生产中的应用 - Google Patents

一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌及在山西老陈醋生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，提供一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌及在山西老陈醋生产中的应用。从山西老陈醋发酵过程中分离、筛选出1株耐受性强、产乙偶姻、产酸能力均较强的巴氏醋杆菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 15730。用巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，得到的新淋醋中总酸含量为6.03g/100mL，川芎嗪含量为184.89μg/mL，总酯含量为5.04g/100mL，与对照相比分别提高了60.37%、111.61%、70.27%，另外，有机酸中的乙酸含量显著提高，还丰富了挥发性香气谱图及含量。

Description

一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌及在山西老陈 醋生产中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌及在山西老陈醋生产中的应用。
背景技术
醋酸菌是陈醋醋酸发酵过程中的主要菌种，可以通过产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶催化反应将醇代谢为酸。醋酸菌在工业生产中主要用于酿造食醋及果醋饮料。目前，我国酿醋用的主要菌种为巴氏醋杆菌（A.pasteurianus）沪酿1.01和恶臭醋杆菌（Acetobacterrancens）中科AS1.41。
对醋酸菌除了高产酸的筛选外，还主要集中在具有耐酸、耐高温、耐高醇等特性的筛选上。公布号为CN106167780A公布了从醋醅中分离出的一种耐热、耐乙醇、耐乙酸的醋酸菌Acetobacter pasteurianusZJ17，该菌在乙醇4%，37℃和42℃时乙醇-乙酸转化率分别为96.2%和62.5%。醋酸菌在酿醋过程中除了产酸和风味物质外，还产乙偶姻等功能性物质，乙偶姻是山西老陈醋重要功能成分川芎嗪的前体物质，食醋酿造行业急需开发具有优良风味特性的乙偶姻生产菌株，为了提高陈醋中川芎嗪的含量，一些学者进行了产乙偶姻菌种的筛选工作。Xu Wei等在镇江香醋醋醅中筛选到了l株产乙偶姻的醋酸菌，Danilo等报道了一株Acetobacter hansenii产乙偶姻量达到8.93g/L。2014年，赵爽从四川麸醋中筛选出耐酒精度高、耐底酸浓度高、温度适应范围广、产酸快且连续发酵能力强、产有机酸总量高的巴氏醋杆菌A30.16和C9.4，并将其应用在液态陈醋生产中，得到的陈醋中共检测到20种挥发性风味物质和17种游离氨基酸，氨基酸总量为805.29mg/100mL；其品质明显优于工厂生产的食醋。
本发明从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌，并将其制备成直投式发酵剂应用在传统食醋生产中，对于提高山西老陈醋的生产效率，和丰富风味具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌及在山西老陈醋生产中的应用。
本发明的技术方案如下：
高产酸、乙偶姻及耐受性强的醋酸菌的筛选：对山西老陈醋醋酸发酵过程中醋醅样品分离出的30株醋酸菌进行产酸、产乙偶姻能力的测定；再对产酸、产乙偶姻能力最强的醋酸菌进行酒精度、酸、温度的耐受性测定以及采用HPLC和GC-MS法对有机酸和挥发性香气成分的种类和含量进行了系统测定。从中筛选出一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的醋酸菌2416，其总酸产量为30.65g/L，经过优化培养基培养5天后，总酸量可高达75.2g/L，乙偶姻的含量为18.3g/L，可耐受12%的酒精度、pH=4的酸度、55℃的温度。
醋酸菌2416的鉴定：对醋酸菌2416进行形态学和16 S rDNA测序鉴定，采用的引物为：上游：5′-AGCGGATCACTTCACACAGCA-3′下游：5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGA
-3′，经鉴定为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）。将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月7日，保藏编号：CGMCC 15730。
巴氏醋酸菌CGMCC 15730的菌落及细胞形态特征为：在醋酸菌平板培养基上形成菌落直径0.8mm，规则圆形，乳白色，半透明，光滑，有光泽，表面很平的菌落；其细胞形态：革兰氏染色呈G-，呈小短杆状。
巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂的制备方法：将活化后的巴氏醋杆菌CGMCC15730按照3%的接种量接入到MRS液体培养基中，30℃，180 r/min培养2天后，菌体浓度达到108cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩巴氏醋杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v）混合，低温喷雾干燥（进风温度为120℃，出风温度为55℃），至水分含量为≤5%时，真空包装即巴氏醋杆菌直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
将巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中的具体方法为：
高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵；酒精度为6%时，加入200公斤麸皮和160公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅），再加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂（1g直投式发酵剂溶解到10mL无菌水中，30℃活化30min后备用），控制发酵罐内温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标，有机酸及挥发性香气成分。
采用巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，最终新淋醋中总酸含量为6.03g/100mL，川芎嗪含量为184.89μg/mL，总酯含量为5.04g/100mL，与对照相比分别提高了60.37%、111.61%、70.27%，另外，有机酸中的乙酸含量显著提高，还丰富了挥发性香气谱图及含量。
附图说明
图1为不同酒精度、pH、温度对醋酸菌2416生长的影响结果图；图中：A为不同酒精度对醋酸菌2416生长的影响结果；B为不同pH值对醋酸菌2416生长的影响结果；C为不同温度对醋酸菌2416生长的影响结果；
图2为巴氏醋杆菌CGMCC 15730的菌落形态和细胞形态图；图中：A为巴氏醋杆菌CGMCC15730的菌落形态图；B为巴氏醋杆菌CGMCC 15730在1000×下的细胞形态图；
图3为巴氏醋杆菌CGMCC 15730的16SrDNA系统发育树。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：高产酸、乙偶姻和耐受性强的醋酸菌的筛选
（1）高产酸、乙偶姻醋酸菌的筛选：采集山西老陈醋醋酸发酵阶段醋醅样品，采用醋酸菌固体培养基进行稀释涂布，最终共分离出30株醋酸菌，采用氢氧化钠滴定法对其产酸能力进行测定，采用Voges-Proskauer(V-P)反应和分光光度法对其产乙偶姻能力进行测定，最终筛选出1株高产酸和乙偶姻的醋酸菌2416，其总酸产量为30.65g/L，经过优化培养基培养5天后，总酸量可高达75.2g/L，乙偶姻的含量为18.3g/L。
上述醋酸菌固体培养基的制备方法为：葡萄糖20g，酵母膏10g，无水碳酸钙10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调pH6.2‒6.6，121℃灭菌20min，冷却至60℃加入4%的无水乙醇备用。
上述优化培养基的制备方法为：乙醇9 .8 %、葡萄糖2.7 %、谷氨酸钠0 .4 %、酵母粉1 %、乙酸1 %、蛋白胨0 .2%、KH2PO4 0.1%、K2HPO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0 .02%，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min。
上述氢氧化钠滴定法测定总酸的具体方法为：将活化菌株按照2%的接种量接种于醋酸菌液体培养基，30℃，180 r/min培养2天后，取菌株发酵液3mL，加入27mL蒸馏水稀释10倍，用0.05 %的NaOH溶液滴定至pH为8.2，记录下消耗的NaOH溶液体积。
上述测定乙偶姻的Voges-Proskauer(V-P)反应原理为：乙偶姻在碱性条件下可被氧化为2,3-丁二酮，2,3-丁二酮与带有胍基的肌酸反应，可产生粉红色复合物，该粉红色复合物在波长516nm处有最大吸收峰。
上述测定乙偶姻的Voges-Proskauer(V-P)反应具体方法为：
乙偶姻标准曲线制作：称取乙偶姻1g，溶于100 mL蒸馏水中，即得1.0 mg/mL乙偶姻溶液，吸取0.0，0.6，1.2，1.8，2.4mL于10 mL试管中，编号，补加蒸馏水至3.0mL，加入3.0 mL改良O’Meara (含3%肌酸、0.5%蛋白胨的40%NaOH水溶液)试剂，振荡2 min，37℃条件下反应60min后，充分振荡均匀后测定516 nm处的吸光值，并绘制标准曲线。
菌株产乙偶姻能力的测定：将活化菌株按照2%的接种量接种于Voges-Proskauer(V-P)培养基，30℃，180 r/min培养2天后，将发酵液8000 r/min离心10 min，取菌株发酵上清液3.0mL，加入3.0 mL改良O’Meara试剂，充分震荡均匀，于37℃条件下反应60 min后，摇匀，用比色法测定各反应液在516 nm处吸光值。
上述Voges-Proskauer(V-P)培养基的制备方法为：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO45 g，加水至1000 mL，pH调至7.0，于121℃湿热灭菌20 min。
（2）高产酸、乙偶姻的醋酸菌2416耐受性：对高产酸和乙偶姻的醋酸菌2416进行酒精、酸和温度的耐受性测定，醋酸菌2416耐受12%的酒精度、pH=4的酸度、55℃的温度。
高产酸、乙偶姻的醋酸菌2416耐受性能的具体测定方法为：将活化的醋酸菌2416按2%接种量分别接种到不同酒精浓度（2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%）、不同pH梯度（3、4、5、6、7）的醋酸菌液体培养基中，分别于（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）180 r/min培养24h后，测OD 600nm 菌体浓度，比较菌株的耐受性。
（3）高产酸、乙偶姻的醋酸菌2416有机酸及挥发性香气成分的测定：将高产酸和乙偶姻的醋酸菌2416按3%的接种量接入醋醅模拟培养基中，30℃，180 r/min培养6天，采用HPLC和GC-MS法测定其有机酸和挥发性香气的种类和含量。
上述醋醅模拟固体培养基的制备方法为：取自山西老陈醋醋酸发酵第0天的醋醅。
上述HPLC和GC-MS的具体测定方法如下：
HPLC法测定有机酸含量：取上述培养6天的样品5g，用超纯水定容至50mL，12000r/min离心5min取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，上样。色谱测定条件为：液相系统UItimate3000；色谱柱C18 4.6×150mm，5μm；流动相20mmol/L NaH2PO4，pH=2.7；进样量20μL；流动速度0.8mL/min；检测器UV210nm；柱温：室温。
GC-MS法测定挥发性香气成分：采用顶空固相微萃取对上述培养6天的样品进行萃取，并采用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量。色谱条件：色谱柱为VF-5MS（30×0.25mm×0.25mm），载气：氦气，纯度99.999%，流量1mL/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持3min，以4℃/min的速度升至160℃，保持1min。再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。质谱条件：接口温度280℃，离子源温度280℃，电子能量70eV，扫描质量范围41‒500amu。
醋酸菌2416的有机酸测定结果如表1所示，其在醋醅模拟培养基的有机酸含量达到2.2832g/L，其中有机酸中的乙酸含量最高，为1.0496g/L；醋酸菌2416的挥发性香气成分测定结果如表2所示，其在醋醅模拟培养基中共检测出20种挥发性香气成分，其中酸类总含量为0.1935g/100mL、醇类总含量为0.0485g/100mL、酮类总含量为0.0062g/100mL；而主要的酸类物质为异丁酸、乙酸，含量都达到0.05g/100mL以上。
表1：醋酸菌2416在醋醅模拟培养基中有机酸的测定结果
表2：醋酸菌2416在醋醅模拟培养基中挥发性香气的测定结果
实施例2：耐受性强、高产酸和乙偶姻醋酸菌2416的菌株鉴定
形态学鉴定：用接种环挑取醋酸菌2416少许后在醋酸菌平板培养基上形成菌落直径0.8mm，规则圆形，乳白色，半透明，光滑，有光泽，表面很平的菌落；其细胞形态：革兰氏染色呈G-，呈小短杆状，见图2。
16Sr DNA测序：用试剂盒提取醋酸菌2416的基因组，进行16Sr DNA测序及菌种鉴定，引物为：上游：5′-AGCGGATCACTTCACACAGCA-3′下游：5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCA
CGA-3′，采用BLAST软件经同源性比较，结果表明醋酸菌2416与已报道的Acetobacter pasteurianus AAB3(KT724709.1)菌株的同源性在99.9%以上。确定其为巴氏醋杆菌，并构建系统进化树，见图3。并将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 15730。
实施例3：巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂的制备
将活化后的巴氏醋杆菌CGMCC 15730按3%的接种量接入到MRS培养基中，30℃，180 r/min培养2d后，此时菌体浓度达108cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩巴氏醋杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v）混合，通过低温喷雾干燥对发酵液进行处理后，真空包装即得巴氏醋杆菌直投式发酵剂。
上述采用的MRS固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，K2HPO4 2g，乙酸钠2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.05g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调pH6.2‒6.6，121℃灭菌20min备用。
上述的保护剂制备方法为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。
上述的低温喷雾干燥工艺参数为：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间6min，水分含量为≤5%。制备的巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂，活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
实施例4：利用巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂强化山西老陈醋
具体方法为：高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入200公斤麸皮和160公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅），控制发酵罐内温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标（pH、总酸、还原糖、总酯、不挥发酸、氨基氮、波美度、川芎嗪）（结果见表3），有机酸（结果见表4）及挥发性香气成分（结果见表5）。
实施例5：以实施例4为对照例，按照上述方法在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量0.5%的巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂（1g发酵剂溶到10mL无菌水中，30℃活化30min），进行醋酸发酵10‒12天。
采用巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，提高了新淋醋的总酸、川芎嗪等理化含量以及有机酸含量，实施例5显著优于实施例4（对照例）。实施例5得到的新淋醋总酸含量为6.03g/100mL，川芎嗪含量为184.89μg/mL，总酯含量为5.04g/100mL，与对照相比分别提高了60.37%、111.61%、70.27%（表3）；有机酸总含量由29.8663g/L提高为44.6714g/L，其中乙酸提高最显著，含量由19.3582g/L提高到32.6821g/L（表4）；挥发性香气成分共检测出37种（酯类17种、醇类3种、酸类3种、酮类4种、醛类7种、酚类1种、其他2种），酯类总含量为4.72g/100mL、醇类总含量为0.60g/100mL、酸类总含量为4.95g/100mL、醛类总含量为13.95g/100mL；其中具有水果香味的乙酸乙酯（1.62g/100mL）、呈蜂蜜香的苯乙酸乙酯（0.22g/100mL）含量与对照组相比均有所提高。
表3：采用巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋理化指标的测定结果
表4：采用巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋有机酸的测定结果
表5：采用巴氏醋杆菌CGMCC 15730直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋挥发性香气成分的测定结果
上述山西老陈醋的pH测定用pH计直接测定；山西老陈醋的还原糖、总酯、川芎嗪参照GBT 19777-2013《地理标志产品山西老陈醋》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的不挥发酸参照GB 18187-2000《酿造食醋》中单沸式蒸馏法进行测定；山西老陈醋的氨基氮参照GBT5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的波美度测定用波美比重计直接测定。

Claims (8)

1.一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌，其特征在于：所述巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月7日，保藏编号：CGMCC 15730。
2.根据权利要求1所述的一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌，其特征在于：所述菌株的菌落及菌体特征为：在醋酸菌平板培养基上形成菌落直径0.8mm，规则圆形，乳白色，半透明，光滑，有光泽，表面很平的菌落；其细胞形态：革兰氏染色呈G-，呈小短杆状。
3.根据权利要求1或2所述的一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌，其特征在于：所述巴氏醋杆菌CGMCC 15730耐受12%的酒精度、pH=4的酸度、55℃的温度，总酸产量高达75.2g/L，乙偶姻产量为18.3g/L。
4.利用权利要求1或权利要求2所述的一株耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌制备直投式发酵剂，其特征在于：所述直投式发酵剂的具体制备方法为：将活化的巴氏醋杆菌CGMCC 15730按照3%的接种量接入到MRS液体培养基中，30℃，180 r/min培养2d后，菌体浓度达到108cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩巴氏醋杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃进行低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，即为巴氏醋杆菌直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
5.利用权利要求4所制备的巴氏醋杆菌直投式发酵剂强化山西老陈醋，其特征在于：具体方法为：
高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入120公斤麸皮和80公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，再加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的直投式发酵剂，控制发酵罐内温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋得新淋醋。
6.根据权利要求5所述的利用巴氏醋杆菌直投式发酵剂强化山西老陈醋，其特征在于：所制备的新淋醋中总酸含量为6.03g/100mL，川芎嗪含量为184.89μg/mL，总酯含量为5.04g/100mL。
7.根据权利要求5所述的利用巴氏醋杆菌制备直投式发酵剂强化山西老陈醋，其特征在于：所述火醅为前一批发酵第2天的醋醅。
8.根据权利要求4所述的利用耐受性强、高产酸和乙偶姻的巴氏醋杆菌制备直投式发酵剂，其特征在于：所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。
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