CN112251379B - 一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌dqa21及应用 - Google Patents
一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌dqa21及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌DQA21及应用，该保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020360，保藏日期为2020年7月27日。通过对该菌株的发酵条件进行优化，最佳发酵条件为：葡萄糖浓度80g/L，pH 5.46，温度37.31℃，装液量49.17mL，接种量5％，转速210r/min。在此条件下菌株摇瓶发酵乙偶姻平均产率为25.60g/L，比优化前菌株产率18.37g/L提高了39.36％。该菌株具有乙偶姻产量高，发酵速度快等优点，可用于白酒生产中，提高白酒中乙偶姻的含量，改善口感和风味，增强白酒品质。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说，它涉及一种耐酸产乙偶姻(Acetoin，ACT)的贝莱斯芽孢杆菌DQA21(Bacillus velezensis DQA21)及应用。
背景技术
曲为酒之骨，酒曲质量的好坏直接影响着白酒的质量、产量和风格。中高温大曲是酿造浓香型白酒的糖化发酵剂，含有酵母、霉菌、细菌等多种微生物，这些微生物在浓香型白酒的酿造过程中共酵生成复杂的白酒成分，赋予了浓香型白酒独特的风格特征。中高温大曲在制曲培菌过程中最高品温可达62℃，由于芽孢杆菌存在利用芽孢应对胁迫环境的特性，因此在大曲制备的高温条件下芽孢杆菌成为其中的优势细菌之一。芽孢杆菌不但能够代谢产生ACT、2，3-丁二醇以及吡嗪类物质等风味物质作为浓香型白酒的主要呈香物质，还可以代谢产生淀粉酶、蛋白酶等多种酶类，推动大曲及白酒酿造过程中的各种生化反应进行。
ACT学名3-羟基丁酮，是一种具有特殊奶油香味的挥发性化合物，也有类似蜂蜜的甜味，是酒类调香中一个极其重要的物质，也是白酒风味物质中的重要香味成分，在名优酒中含量尤为突出。ACT同时也是一种重要的高附加值化学品，广泛用于食品、烟草、化妆品、洗涤剂、化学合成、植物生长促进剂和生物害虫防治中。
近些年ACT合成方式的研究越来越受关注，ACT生产方法主要有化学合成法、酶转化法和微生物合成法。由于能源消耗、温室效应、污染排放等因素的制约，化学合成法逐步被微生物合成法取代。微生物合成法是根据微生物的生理特性和其自身的代谢特点，以廉价碳源为底物，在一定条件下通过发酵获得ACT的一种良好方法，具有安全、经济、绿色、高效、可持续的特点，越来越受到各国研究者的关注。在微生物发酵法中，筛选更高效、稳定的ACT生产菌株，优化其发酵工艺，对提高ACT产量有至关重要的作用。
目前已检索到授权公告号为CN110283735A的专利，该技术公开了一株从果树土壤中分离到的产ACT的菌株，并通过分光光度法测定了液态发酵后的ACT产量。检索到授权公告号为CN102634563A的专利，该技术公开了一株从酒作坊附近土壤中筛选到的产ACT的解淀粉芽孢杆菌，并通过液相色谱法测定了液态发酵后的ACT产量。然而，上述现有技术中未提及在酿造过程的偏酸性条件下菌株是否仍适于生长、产香，且均未提及在固态发酵的条件下菌株所产生的风味与液态发酵的区别。此外，菌株的ACT产量有待进一步提升。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐酸产ACT的贝莱斯芽孢杆菌DQA21及应用。该菌株具有耐酸、耐乙醇等特性，非常利于后期进行代谢工程改造，使其ACT产量大幅提升，为ACT微生物合成的工业化奠定基础，且该菌株具有ACT产量高，发酵速度快等优点，可用于中高温大曲的制备工艺，提高白酒中ACT的含量，改善口感和风味，增强白酒品质。
本发明的技术目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，提供了一种耐酸产ACT的贝莱斯芽孢杆菌DQA21，所述菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020360，保藏日期为2020年7月27日。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌DQA21的pH耐受性为pH 3.5-7，在pH 4.5-7生长良好，在pH 5时菌株生长繁殖最快。
第二方面，所述贝莱斯芽孢杆菌DQA21的筛选包括以下步骤：
1)初筛：a、从大曲中筛选芽孢杆菌；b、采用肌酸显色法筛出能合成ACT的芽孢杆菌，具体方法为：将1g 1-萘酚、0.1g肌酸、4g NaOH配制成100mL肌酸混合液，将筛选得到的芽孢杆菌菌株轻刮一环菌于盛有1mL混合液的试管内；
2)复筛：a、将步骤1)中初筛获得的产ACT的芽孢杆菌菌株接种于含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃、180r/min条件下摇床培养12h；b、以5％的接种量接种至含有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，每株3个平行，准备一个空白对照，在37℃、180r/min条件下摇床培养72h后，结束发酵，离心取上清液，以比色法测定发酵液的OD值，获得ACT产量为18.37g/L的菌株，将该菌株保藏于甘油管中；
步骤2)中种子培养基为：葡萄糖3％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠0.05％，pH6.0；
步骤2)中发酵培养基为：葡萄糖8％、蛋白胨1％、酵母粉1％、氯化钠0.05％、七水硫酸镁0.03％、二水氯化钙0.1％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸铵0.03％，pH 6.0。
第三方面，提供了如第一方面所述的一种耐酸产ACT的贝莱斯芽孢杆菌DQA21在发酵生产ACT中的应用。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌DQA21发酵生产ACT的发酵条件为：葡萄糖浓度40-120g/L、pH 5.0-7.0、温度31-43℃、装液量30-70mL、接种量3-11％、转速120-240r/min。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌DQA21发酵生产ACT的发酵条件为：葡萄糖浓度80g/L、pH 5.46、温度37.31℃、装液量49.17mL、接种量5％、转速210r/min。
第四方面，提供了如第一方面所述的一种耐酸产ACT的贝莱斯芽孢杆菌DQA21在固态发酵中的应用，所述菌株在固态发酵中还产生了2-甲基吡嗪，以及苯乙醇、甲酸乙酯、正己酸乙酯、苯乙酸乙酯风味物质。
保藏说明：
保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；
保藏日期：2020年7月27日；
菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus velezensis
菌株编号：DQA21
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO:M 2020360。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明从浓香型大曲中筛选获得一株Bacillus velezensis DQA21，由于生长环境长期驯化，具有耐酸等特性，非常利于后期进行代谢工程改造；
(2)Bacillus velezensis DQA21在乙醇浓度5％时仍能生长，可用于白酒酿造中，提高白酒中ACT、四甲基吡嗪等风味物质的含量，改善口感和风味；
(3)该菌株具有ACT产量高，发酵速度快等优点，可用于中高温大曲的制备，增加白酒中风味物质，提高白酒品质；
(4)通过对Bacillus velezensis DQA21发酵条件进行优化，结果表明，最佳发酵条件为：葡萄糖浓度80g/L，pH 5.46，温度37.31℃，装液量49.17mL，接种量5％，转速210r/min，在此条件下菌株摇瓶发酵ACT平均产率为25.60g/L，比优化前菌株产率18.37g/L提高了39.36％；
(5)本发明通过微生物发酵法获得高产ACT的一种方法，具有安全、经济、绿色、高效、可持续的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中ACT标准曲线图；
图2是本发明实施例中Bacillus velezensis DQA21生长曲线；
图3是本发明实施例中Bacillus velezensis DQA21的形态学特征实物图，a为革兰氏染色结果，b为芽孢染色结果，c为电镜图；
图4是本发明实施例中Bacillus velezensis DQA21的pH耐受性效果图；
图5是本发明实施例中Bacillus velezensis DQA21的乙醇耐受性效果图；
图6是本发明实施例中Bacillus velezensis DQA21发酵产ACT的单因素实验结果效果图，a是葡萄糖浓度，b是pH，c是温度，d是接种量，e是转速，f是装液量；
图7是本发明实施例中响应面分析因素间交互作用对ACT产量的影响效果图，a为温度和pH，b为装液量和pH，c为装液量和温度。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图1-7及实施例1-3，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1：Bacillus velezensis DQA21的分离与筛选
一)样品处理
称取大曲1g，放入盛有99mL无菌水且含有无菌玻璃珠的三角烧瓶中，振荡使大曲分散均匀，制备样品悬浮液。悬浮液在85℃水浴加热10min，淘汰非芽孢细菌，再吸取1mL悬浮液于富集培养基中，过夜富集培养。
液体富集培养基以g/L计：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠0.5g/L、酒醅浸提液，pH 6.0，121℃下灭菌20min。其中，酒醅10g置于250mL三角瓶，加水50mL，搅匀，在室温下(25℃)浸泡15min；浸泡时间内，每隔5min搅拌一次；将浸提液用双层纱布或脱脂棉过滤，定容至100mL。
二)分离纯化
在超净工作台中用移液枪吸取1mL富集液于装有9mL无菌水的试管中，梯度稀释成10-3-10-8的菌液，吸取0.2mL菌液滴于分离培养基平板中央，用涂布棒将菌悬液沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5min，使菌液浸入培养基，在37℃培养箱中倒置培养36h。根据芽孢杆菌菌落形态特征，选取菌落形态不一致的菌落，用无菌接种环分别于分离培养基平板上划线，37℃培养箱中培养，直至长出单个菌落，再挑选单菌落进行不断纯化培养。
分离、纯化培养基以g/L计：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠0.5g/L、琼脂15g/L，pH 6.0，121℃下灭菌20min。
三)高产ACT菌株的筛选
初筛：采用肌酸显色法从大曲中初筛出能合成ACT的芽孢杆菌菌株，具体为：将1g1-萘酚、0.1g肌酸、4g NaOH配成100mL肌酸混合液，将筛选得到的芽孢杆菌菌株轻刮一环菌于盛有1mL混合液的试管中，能产ACT的菌株能使混合液快速变为红色。
复筛：将初筛获得的菌株接种于含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃、180r/min条件下摇床培养12h；再以5％的接种量接种至含有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，每株3个平行，并准备一个作为空白对照，在37℃、180r/min条件下摇床培养72h；发酵结束后离心取上清液，以比色法测定菌株的OD值，获得ACT产量较高的菌株，将之保藏于甘油管中。
种子培养基以g/L计：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠0.5g/L，pH6.0，121℃下灭菌20min。
发酵培养基以g/L计：葡萄糖80g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.3g/L、二水氯化钙1g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸铵0.3g/L，pH 6.0，在121℃下灭菌20min。
实施例2：16S rDNA鉴定与生理生化实验
一)鉴定：先经过生理生化实验初步判断为革兰氏阳性短杆状芽孢杆菌，再由16SrDNA分子生物学技术鉴定确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌并命名为Bacillus velezensisDQA21。
二)ACT标准曲线绘制
分别配制浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8g/L ACT标准溶液。分别吸取0.1mL不同浓度的ACT标准溶液于试管中，加入4.5mL肌酸混合液，振荡混匀，在30℃水浴锅中反应30min，在522nm处测定其OD值。以ACT浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制ACT标准曲线。如图1所示，其回归方程为y＝5.3989x-0.0444，相关系数R2＝0.9991，表明两者之间线性关系良好。
三)Bacillus velezensis DQA21的生长曲线
在摇瓶培养的过程中，每隔2h取样测OD值，图2可知，在培养前4h生长缓慢，6h后开始进入对数生长期，12～18h处于稳定生长期，18h后进入衰亡期。
四)Bacillus velezensis DQA21的生理生化鉴定结果
经革兰氏染色后用光学显微镜观察呈现紫色，如图3a所示。通过芽孢染色实验表明该菌株含有芽孢，如图3b所示。通过电镜照片可知此菌株大小，宽0.4μm-0.8μm，长2μm-3.8μm，如图3c所示。菌株的生理生化结果见表1。
表1 Bacillus velezensis DQA21生理生化实验结果
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
五)pH耐受性
如图4所示，Bacillus velezensis DQA21是耐酸芽孢杆菌，其pH耐受性为pH 3.5-7，在pH 4.5-7生长良好，在pH 5时菌株生长繁殖最快。
六)乙醇耐受性
如图5所示，Bacillus velezensis DQA21耐受5％乙醇，在0-5％乙醇中生长良好。
实施例3：高产ACT菌株发酵条件优化
一)单因素试验
选取葡萄糖浓度分别为40、60、80、100、120g/L，pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7，温度分别为31、34、37、40、43℃，接种量分别为3、5、7、9、11％，转速分别为120、150、180、210、240r/min，装液量分别为30、40、50、60、70mL/250mL三角瓶等6个因素做单因素试验，每组试验3个平行。
由图6a可知，随着发酵培养基中葡萄糖浓度的增加，Bacillus velezensis DQA21发酵生产的ACT产量明显增加。当葡萄糖浓度达到80g/L时，ACT产量达到18.372g/L。当葡萄糖浓度大于100g/L时ACT产量明显下降，可见较高糖浓度对Bacillus velezensis DQA21生长繁殖和ACT的积累有抑制作用。
由图6b可知，发酵培养基的初始pH为5.5时ACT的产量达到最大值25.059g/L，随着pH的增加ACT产量快速下降，这可能与大曲酸性环境的驯化及菌株适应性有关，所以Bacillus velezensis DQA21在pH 5.5时具有较强的生长繁殖与ACT的积累能力。
由图6c可知，当发酵温度从31℃升至37℃时ACT产量随之增加，37℃时ACT的产量达到最大值，可能是由于Bacillus velezensis DQA21在37℃时最适合其生长繁殖且其关键酶活性亦随之提高。随后ACT产量又随温度升高而降低，推测高温下Bacillusvelezensis DQA21代谢酶受到抑制，同时ACT在高温下会与氨反应生成四甲基吡嗪，造成ACT浓度下降。
由图6d可知，ACT产量随菌株接种量的增大而增加，在5％时达到最大时，随后产量有所下降，这是由于接种量过大引起发酵初期比较高的细胞浓度，进而底物大量消耗，造成产物合成阶段营养物质供应不足。
由图6e可知，ACT产量随转速增加而增大，当转速为210r/min时ACT产量达到最大值，随后开始下降。ACT的积累需要大量氧气，低转速条件下溶氧较低不利于菌体生长繁殖，但转速过高产生的剪切力会加速菌体衰亡，同时副产物2，3-丁二醇、四甲基吡嗪会加速生成。
由图6f可知，ACT产量随装液量增加而增大，当装液量为50mL/250mL时ACT产量达到最大值，随后开始下降，这是由于装液量也与溶氧有关，装液量过少时，溶氧虽然增加，但发酵后期营养不足，不利于ACT积累。
二)正交试验
设计L8(72)正交试验，考察不同因素对ACT产量影响的大小。选取pH、温度、转速、装液量、接种量、葡萄糖浓度6个因素进行考察，每个考察因素2个水平进行试验，每组试验3个平行。
在单因素试验的基础上，通过正交试验考察各因素对Bacillus velezensisDQA21的ACT产量影响的大小。正交试验设计方案及结果见表2，由极差分析可知，各因素对ACT产量的影响大小依次为pH>温度>装液量>葡萄糖浓度>接种量>转速>空列。选取对ACT产量影响前3的因素进行响应面试验，其余各因素选取最优值进行实验，葡萄糖浓度80g/L，转速210r/min，接种量5％。
表2 正交试验设计方案及结果
三)响应面试验
用软件Design Expert 8.0.6进行Box-Behnken Design(BBD)设计响应面试验，以pH，温度，装液量作为变量，以ACT产量为响应值，进行3因素3水平的响应面分析实验，每组试验3个平行。
(1)二次响应面回归模型的建立与分析
根据正交试验结果，对pH、温度、装液量做3因素3水平共17个试验(5个中心点)的响应面分析试验，设计方案及结果见表3。经多元二次回归拟合后，建立了ACT发酵条件优化模型，回归方程为：
Y＝25.39-0.72A+0.43B-0.34C-0.32AB+0.21AC+0.096BC-5.53A2-2.10B2-2.04C2。
由回归模型方差分析可知，如表4，模型P<0.0001，达到极显著水平，说明模型的预测值与实际值非常吻合。失拟项P为0.2416>0.05，失拟项差异不显著，证明模型与实验拟合程度较好，具有统计学意义。模型中一次项A、B、C对ACT产量的影响极显著，一次项影响因子的主次顺序为pH>温度>装液量，这与正交试验的结果吻合。二次项A2、B2、C2对ACT产量影响极显著。交互项AB对ACT产量的影响极显著，AC对ACT产量影响显著，BC对ACT产量影响不显著。
表3 响应面试验设计方案及结果
表4 回归模型方差分析结果
注：*差异显著(P<0.05)，**差异极显著(P<0.01)。
(2)各因子交互作用对ACT产量影响的分析
响应面图可以直观的反映出试验因素对ACT产量的影响，响应面坡度越陡峭，说明响应面值对操作条件的改变越敏感。如图6a、图6b所示，温度和pH、装液量和pH交互作用的响应曲面坡度均较为陡峭且等高线密集，呈椭圆形，表明交互作用显著；如图6c所示，装液量和温度交互作用的响应曲面坡度均较为平缓，等高线稀疏，接近圆形，表明交互作用不显著，该结果与表4方差分析结果一致。
综合分析，Bacillus velezensis DQA21发酵生产ACT的较优发酵条件为：葡萄糖浓度60-100g/L、pH5.0-6.0、温度36-38℃、装液量45-55mL、接种量4-6％、转速200-220r/min。
其中，Bacillus velezensis DQA21发酵生产ACT的最优发酵条件为：葡萄糖浓度80g/L、pH5.46、温度37.31℃、装液量49.17mL、接种量5％、转速210r/min。在此条件下菌株摇瓶发酵ACT平均产率为25.60g/L，比优化前菌株产率18.37g/L提高了39.36％。
实施例4：Bacillus velezensis DQA21发酵对比试验。
将Bacillus velezensis DQA21进行小麦固态发酵，将不加菌的小麦固态发酵作为对照组。由表5可知，Bacillus velezensis DQA21在固态发酵中对比对照组产生了2-甲基吡嗪，苯乙醇、甲酸乙酯、正己酸乙酯、苯乙酸乙酯等风味物质，2-甲基吡嗪具有果仁及可可香味；苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香；甲酸甲酯有辛辣的刺激味和菠萝样的果香香气，还有强烈朗姆酒似香气，并略带苦味；正己酸乙酯具有曲香、菠萝香型的香气；苯乙酸乙酯有浓烈而甜的蜂蜜香气等，表明该菌株在大曲制作中有应用价值。
表5 Bacillus velezensis DQA21固态发酵风味物质比较
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (7)
1.一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DQA21，其特征是，所述贝莱斯芽孢杆菌DQA21保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020360，保藏日期为2020年7月27日。
2.根据权利要求1所述的一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌DQA21，其特征是，所述贝莱斯芽孢杆DQA21的pH耐受性为pH 3.5-7，在pH 4.5-7生长良好，在pH 5时菌株生长繁殖最快。
3.根据权利要求1所述的一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌DQA21，其特征是，所述贝莱斯芽孢杆菌DQA21的筛选包括以下步骤：
1)初筛：a、从大曲中筛选芽孢杆菌；b、采用肌酸显色法筛出能合成乙偶姻的芽孢杆菌，具体方法为：将1g 1-萘酚、0.1g肌酸、4g NaOH配制成100mL肌酸混合液，将筛选得到的芽孢杆菌菌株轻刮一环菌于盛有1mL混合液的试管内；
2)复筛：a、将步骤1)中初筛获得的芽孢杆菌菌株接种于含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃、180r/min条件下摇床培养12h；b、以5％的接种量接种至含有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，每株3个平行，准备一个空白对照，在37℃、180r/min条件下摇床培养72h后，结束发酵，离心取上清液，以比色法测定发酵液的OD值，获得乙偶姻产量为18.37g/L的菌株，将该菌株保藏于甘油管中；
步骤2)中种子培养基为：葡萄糖3％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠0.05％，pH 6.0；
步骤2)中发酵培养基为：葡萄糖8％、蛋白胨1％、酵母粉1％、氯化钠0.05％、七水硫酸镁0.03％、二水氯化钙0.1％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸铵0.03％，pH 6.0。
4.如权利要求1所述的一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌DQA21在发酵生产乙偶姻中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述贝莱斯芽孢杆菌DQA21发酵生产乙偶姻的发酵条件为：葡萄糖浓度40-120g/L、pH 5.0-7.0、温度31-43℃、装液量30-70mL、接种量3-11％、转速120-240r/min。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述贝莱斯芽孢杆菌DQA21发酵生产乙偶姻的发酵条件为：葡萄糖浓度80g/L、pH 5.46、温度37.31℃、装液量49.17mL、接种量5％、转速210r/min。
7.如权利要求1所述的一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌DQA21在大曲制作中的应用，其特征是，所述贝莱斯芽孢杆菌DQA21在固态发酵中还产生了2-甲基吡嗪，以及苯乙醇、甲酸乙酯、正己酸乙酯、苯乙酸乙酯风味物质。
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