CN113957016A9 - 一种枯草芽孢杆菌及利用枯草芽孢杆菌制备奶香型冬虫夏草发酵液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了枯草芽孢杆菌，该菌株名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Imau 4-9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021776。本发明公开了一种可以制备奶香型冬虫夏草发酵液的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Imau 4-9，填补了奶香型冬虫夏草发酵液制备的技术空白。本发明的菌株可以在葡萄糖培养基或冬虫夏草培养基中生产香兰素。

Description

一种枯草芽孢杆菌及利用枯草芽孢杆菌制备奶香型冬虫夏草发酵液的方法

技术领域

本申请涉及微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌以及利用该枯草芽孢杆菌制备奶香型冬虫夏草发酵液的方法。

背景技术

香兰素(Vanillin)，化学名称为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛(3-methoxy-4-hy droxybenzaldehyde)，在秘鲁香脂、丁子香芽油、香子兰、咖啡、葡萄和白兰地中有发现，具有香子兰气味，味甜。作为赋香剂、矫味剂、协调剂、增香剂应用于食品、烟草、日化和农业。因其用途广泛，每年的需求量以10％的速度增长。

目前常用的香兰素生产方法有植物原料提取法、化学合成法和生物合成法。香兰素在豆荚兰豆中含量约为15-20g/kg，且香荚兰种植受到地域和气候环境的限制，植物中提取的天然香兰素产量远不能满足市场的需求。而化学合成法则存在分离过程复杂、收率低、环境污染严重、原料消耗高等问题。

香兰素的生物合成方法主要有微生物发酵、酶工程、细胞工程等，与化学合成相比，生物法合成香兰素反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品可靠等优点。并且，国外的立法机构，也认可采用生物活细胞或其中的组成部分(例如酶)所生产的物质为天然产物，由此，利用微生物发酵法生产的香兰素即属于天然香兰素。综合考虑技术可行性、经济性、安全性等因素，微生物发酵法被认为是目前最实际的天然香兰素制取方法。

冬虫夏草是冬虫夏草真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫上形成的菌核和子座复合物。但自然界的资源十分有限,而人工培养的子实体生产又受栽培技术及工艺的影响成本高、周期长,其液体发酵的菌丝体和发酵液的成分可与子实体相媲美。其营养含量非常丰富，富含10多种氨基酸、多肽类及虫草素、甘露醇、多糖等活性成分。近年来随着对它的功能成分的深入研究以及大量的药理试验证明,它有多种药理功能,如抗病毒、降血压、降血脂以及降血糖等,并具有滋补疗效和提高人体免疫的功能。但目前未有关于冬虫夏草产品气味与味道方面的改进，应用于卷烟时单纯的冬虫夏草产品风味不足。

葡萄糖是微生物合成香兰素的底物之一，具有价格低，较为常见等优点，但未发现以葡萄糖作为底物通过微生物法合成香兰素的菌株。目前仅在重组大肠杆菌中有相关研究，通过补料发酵法，利用重组大肠杆菌生物发酵将葡萄糖先转化成香兰素酸，再经粗脉胞菌中分离的芳醛脱氢酶催化还原成香兰素。因此筛选出以葡萄糖为底物微生物转化合成香兰素的菌株具有极其重要的研究价值。本研究通过筛选获得一株以葡萄糖为底物发酵生产香兰素的枯草芽孢杆菌，填补了香兰素微生物合成研究的空白。

冬虫夏草本身具有菌味、腥味和酥油味，在工业应用中通常需要添加一定量的香料香精进行调香，以掩盖冬虫夏草的味道。作为常见的香味剂香兰素的奶香味浓郁，可以综合冬虫夏草的味道。但目前仍未有研究将香兰素加入冬虫夏草中增加其香气，本发明为冬虫夏草香气改进提供了新思路。

发明内容

本发明的目的是提供一株制备奶香型冬虫夏草发酵液的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)Imau 4-9，及其可以生物转化葡萄糖生产香兰素。该菌具有对外抵抗能力强，生长繁殖快，具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性等优点，十分适用于奶香型冬虫夏草发酵液及香兰素的生产，并填补了奶香型冬虫夏草发酵液制备用菌方面的技术空白。

一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Imau 4-9，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021776(保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2021年6月25日)。菌落颜色为不透明乳白色，圆形菌落边缘整体中间略有拱起。

另一方面，包含所述枯草芽孢杆菌的菌剂。

另一方面，所述的枯草芽孢杆菌和/或所述的菌剂在生产香兰素中的应用。

进一步的，所述应用，利用葡萄糖和/或冬虫夏草作为生产香兰素的发酵底物。

另一方面，利用所述的枯草芽孢杆菌制备奶香型冬虫夏草发酵液的方法，包括如下步骤：

配制冬虫夏草料液，灭菌，接种所述的枯草芽孢杆菌，恒温培养发酵，获得所述奶香型冬虫夏草发酵液。

进一步的，所述的方法，所述枯草芽孢杆菌采用枯草芽孢杆菌种子液，所述枯草芽孢杆菌种子液的浓度为10万～100万cfu/mL，优选为60～70万cfu/mL；接种量为5％～15％，优选8％～12％，更优选9％～11％，更优选9.6％～10.7％。

进一步的，所述的方法，所述冬虫夏草料液由冬虫夏草粉末和水混合制成，料液比为(1：20)～(1:60)，优选(1：28)～(1:33)，更优选1:30；装液量为15％～30％，优选20％。

进一步的，所述的方法，所述恒温培养发酵的步骤包括：于转速150～250 r/min、温度40℃～45℃条件下发酵8～10天，优选的，于转速200r/min、温度 43℃条件下发酵9天。

另一方面，所述的方法制备获得的冬虫夏草发酵液，所述冬虫夏草发酵液中的香兰素含量不低于3.9mg/L，优选不低于4.1mg/L，更优选不低于4.4 mg/L。

另一方面，所述的冬虫夏草发酵液在烟草产品中的应用。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明公开了一种可以制备奶香型冬虫夏草发酵液的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)Imau 4-9，在本发明之前，未有报道显示枯草芽孢杆菌可以在冬虫夏草培养液中发酵制备奶香型冬虫夏草发酵液，本发明为奶香型冬虫夏草发酵液的制备提供了一种新的途径，填补了奶香型冬虫夏草发酵液制备的技术空白。

2、本发明的菌株可以在葡萄糖、冬虫夏草培养基等多种培养基中生产香兰素。为香兰素的提取和生产提供了新的工程菌株。所生产的香兰素不仅充分保持了香兰素的天然性，还有效解决了植物原料提取法产量低，化学合成香兰素存在的原料毒性大，生产过程中产生的废弃物对环境污染严重，以及香兰素的纯度低、安全性低等诸多缺点。

3、本发明中枯草芽孢杆菌参与的制备奶香型冬虫夏草发酵液及生产香兰素应用途径具有原料丰富易得、生产成本低、生产工艺简单、安全清洁、无污染等优点。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是香兰素标准曲线图；

图2是香兰素标品液相色谱图；

图3是菌株Imau 4-9发酵产生香兰素液相色谱图；

图4是菌株Imau 4-9平板培养菌落形态图；

图5是菌株Imau 4-9镜检形态图；

图6是菌株Imau 4-9PCR产物电泳图，其中4-9指Imau 4-9泳道，M指 2000bp Marker泳道；

图7是菌株Imau 4-9系统发育树图，其中4-9指Imau 4-9菌株；

图8是奶香型冬虫夏草发酵液发酵时间单因素试验图；

图9是奶香型冬虫夏草发酵液接种量单因素试验图；

图10是奶香型冬虫夏草发酵液料液比单因素试验图；

图11是接种量和料液比对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响响应面立体图；

图12是接种量和料液比对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响响应面等高线图；

图13是接种量和发酵时间对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响响应面立体图；

图14是接种量和发酵时间对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响响应面等高线图；

图15是料液比和发酵时间对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响响应面立体图；

图16是料液比和发酵时间对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响响应面等高线图；

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

其中：葡萄糖、磷酸氢二铵，氯化钠由天津市智远化学试剂有限公司提供；胰蛋白胨，酵母提取粉，琼脂，Na₂EDTA·H₂O，结晶紫，Tris-base由广东桓凯微生物科技有限公司提供；甲醇(HPLC)，三氟乙酸(HPLC)由天津市广大化学试剂有限公司提供；香兰素、香草酸(色谱纯)由上海麦克林生化科技有限公司提供；Agar Powder由北京康倍斯科技有限公司提供；冬虫夏草由青海三神牛商贸有限公司提供；洁净工作台HCB-1300V由上海一恒科学仪器有限公司提供；恒温振荡器THZ-98C由上海一恒科学仪器有限公司提供；全自动高压灭菌锅SX-500由上海新普仪器设备有限公司提供；电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9053A由上海一恒科学仪器有限公司提供；真空抽滤装置由天津津腾实验设备有限公司提供；Sigma高速离心机3-18KS由上海成贯仪器有限公司提供；液相色谱仪U3000由上海赛默飞世尔科技提供；气相色谱质谱联用仪7890 安捷伦科技有限公司提供；PCR仪Veriti96由上海赛默飞世尔科技提供；酶标仪Synergy H1由美国伯腾仪器有限公司提供；细菌基因组DNA抽提试剂盒由赛默飞世尔科技公司提供。

该菌株名为枯草芽孢杆菌Imau 4-9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021776(保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2021年6月25日)。菌落颜色为不透明乳白色，圆形菌落边缘整体中间略有拱起。

下述实施例所涉及的培养基具体成分比配比如表1所示。

表1培养基成分表

实施例1菌株的筛选分离

取样：在无菌操作台中，采用四分法称取酱香大曲20g。用研钵研磨样品后，180mL生理盐水洗涤，振荡培养箱150rpm混匀30min，样品混合均匀后在80℃水浴锅中恒温水浴30min。

菌种富集培养：水浴后吸取5mL曲液接种于富集培养液基中，37℃、150 rpm摇床中富集培养24h。

稀释涂布：富集培养后，移液枪吸取1mL菌悬液至9mL生理盐水的试管中稀释。吸取100μL稀释倍数为10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液涂布于平板分离培养基中。

分离：于37℃培养箱中培养24h，培养结束后观察菌落形态，挑取单一菌落用划线法接种于平板培养基中分离纯化。

培养基具体配比见表1中富集培养基、平板分离培养基、试管斜面培养基。

实施例2菌株生物转化葡萄糖生产香兰素的发酵方法

S1：将保藏菌株接种到活化培养基上，35～40℃下静置培养12～24h。

S2：种子培养基接种菌株后，在温度为35～40℃、转速为150r/min培养条件下，培养12～24h得到种子液。

S3：葡萄糖发酵培养基接种种子液后，在温度为35～40℃、转速为100～180 rpm培养条件下，发酵100～150小时。

菌株生物转化葡萄糖产香兰素过程中所需活化培养基及葡萄糖发酵培养基如表1所示。

实施例3菌株产香兰素能力试验

本实验对菌株进行初步筛选，得到了19株产香兰素能力较强的菌株，具体结果见表2。

表2产量较高菌株筛选

以香兰素含量(x,mg/L)为横坐标，OD280(y)为纵坐标绘制香兰素标准曲线，结果见图1。由图1可知，标准曲线回归方程为y＝71.716x+13.049，相关系数R²＝0.9999。香兰素含量与吸光度值呈现良好的线性关系。

本试验参照赵建芬等人所用的高效液相色谱法对香兰素标品进行HPLC检测(参考文献：赵建芬,韦寿莲,张素斌.HPLC法监测香兰素的发酵合成[J].食品工业科技,2009(05):332-333.)。得到的液相色谱图如图2所示，香兰素标品的保留时间为11.680min。对菌株Imau 4-9发酵后发酵液中的香兰素进行HPLC 检测，得到的得到的液相色谱图如图3所示，香兰素的保留时间为11.736min。

进一步测定发酵液检测香兰素的浓度。菌株Imau 4-9是19株待测菌株中香兰素产量最高的菌株，因此选择菌株Imau 4-9作为下一步的试验菌株。

实施例4菌株的鉴定

观察菌株Imau 4-9在平板分离培养基上的生长情况，菌落形态与颜色，观察结果如图4所示，由图可得，菌落颜色为不透明乳白色，圆形菌落边缘整体中间略有拱起。对菌株Imau 4-9进行芽孢染色，镜检结果如图5所示，菌体为单细胞杆状，芽孢为椭圆或卵圆形。

对株菌Imau 4-9进行鉴定。使用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，用通用引物进行PCR，PCR结果如图6所示，后送上海生工进行测序，通过NCBI序列比对，确定所筛菌株的种属为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌。

采用多种生物学软件对测得的序列进行分析，构建系统发育树，构建结果如图7所示，系统发育学分析显示菌株Imau 4-9与Bacillus subtilis subsp.sterc oris strain EGI132(MN704439.1)聚为单独的一支。

通过微生物形态学、生理生化、16S rDNA序列鉴定，系统发育学分析Imau 4-9号菌为芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌。

实施例5发酵时间对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响

以发酵时间作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：配制料液比为1:40、装液量为20％冬虫夏草料液，调pH至7后121℃灭菌15min，接种10％的种子发酵液，200r/min恒温震荡培养箱中43℃条件下发酵，每隔一天取样测定发酵液中香兰素的含量。

由图8可知，随着发酵天数的不断增加，冬虫夏草发酵液中香兰素含量不断增加。当发酵到第9天时，香兰素的含量达到最大为4.3mg/L。菌体生长量随着发酵时间的增加，呈现先增加后减小的趋势，在第9天时菌体生长量达到最大。由此可知，菌株Imau 4-9在发酵到第9天时，菌活性最强，转化冬虫夏草产香兰素的能力最强，冬虫夏草发酵液中香兰素浓度最高。因此选择9天为菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的最适发酵时间。

实施例6接种量对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响

以接种量作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：配制料液比为1:40、装液量为20％冬虫夏草料液，调pH至7后121℃灭菌15min，分别接种5％、 7.5％、10％、12.5％、15％的种子发酵液，200r/min恒温震荡培养箱中43℃条件下发酵9天。

根据图9分析可知，随着接种量的不断增加，发酵液中的香兰素浓度也不断升高，当接种量为10％时，香兰素浓度达到最大为3.9mg/L，而当接种量超过10％后，发酵液中的香兰素浓度逐渐降低。菌体生长量也随着接种量的增加也呈现先增加减小的趋势，在接种量为10％时达到最大。这主要是因为菌株Imau 4-9为好氧微生物，随着接种量的不断增加，会造成培养环境中的供氧不足，进一步抑制了菌株的生长。因此选择10％为菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的最适接种量。

实施例7料液比对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响

以料液比作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：分别配制料液比为 1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、装液量为20％的冬虫夏草料液，调pH至7后 121℃灭菌15min，接种10％的种子发酵液，200r/min恒温震荡培养箱中43℃条件下发酵9天。

从图10可以看出，高浓度的料液比对Imau 4-9有一定的抑制作用，发酵液中香兰素含量和菌体生长量都较低。当料液比为1:30时，Imau 4-9生长转化旺盛，冬虫夏草发酵液中的香兰素浓度最高，为4.2mg/L；当料液比小于1:30 时，发酵液中的香兰素含量逐渐降低。由此可得，高浓度的冬虫夏草料液具有一定的抑菌作用，低浓度的料液由于所含的转化前体物和微生物生长所需营养物质含量低，所以转化生成的香兰素含量降低，菌株生长代谢缓慢。因此选择 1:30为菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的最适料液比。

实施例8菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的最佳条件

通过单因素实验确定了各因素的最佳条件，即在pH为7，发酵温度为45℃，于250mL锥形瓶中装液量为50mL，转速为200rpm,接种量为10％，料液比为1:30的条件下在冬虫夏草培养基中发酵9天，获得发酵液中香兰素平均浓度达到4.6mg/L。

实施例9菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的响应面试验

在单因素试验筛选所得的各因素最适水平的基础上，采用响应面法(RSM) 中的Box-Behnken设计原理，以影响产奶香型冬虫夏草发酵液的3个主要因素接种量(A)、料液比(B)和发酵时间(C)为自变量，以冬虫夏草发酵液中的香兰素浓度为响应值，设计3因素3水平的试验，来考察各因素对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的综合影响。响应面各因素及水平编码见表3，试验设计方案和结果见表4。

表3响应面各因素及水平编码见表

表4响应面设计试验方案和结果

利用Design Expert 10软件中的Box-Behnken设计方法对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的制备工艺试验结果进行多元回归拟合分析，其响应面二次多项回归模拟方程为：

Y＝4.58+0.064A+0.073B+0.076C+0.075AB-0.012AC+0.015BC-0.45A²-0.61B²-0.4 1C²。响应面方差分析结果如表5所示。

表5响应面设计方差分析结果

注：“**”为极显著(P<0.01)；“*”为显著(P<0.05)。

由表5可知，模型P<0.0001，表明该模型极显著；失拟项不显著 (P＝0.1782>0.05)，则表明此模型能很好地拟合试验结果，试验误差小；模型回归系数R²＝0.9917与校正系数R²Adj＝0.9810非常接近，说明该模型拟合度很好，能正确反映98.10％香兰素浓度的变化，可以用于优化菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的工艺。同时一次项A、B和C均显著；交叉项均不显著；二次项均为极显著。因此根据方差分析中P值的大小可知在本试验设计中各因素对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响大小排序为：C>B>A，即发酵时间影响最大，其次是料液比，接种量的影响最小。

发酵时间、料液比和接种量之间的交互作用对菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的影响结果可通过图11响应面立体图和图12响应面等高线图来直观的放映出来。从图中可以看出，在发酵时间为9天、冬虫夏草料液比(g/mL) 为1:30不变时，冬虫夏草发酵液中香兰素的浓度随接种量的增大先增大后减小，且接种量在9.6％～10.7％范围内，香兰素的浓度超过了4.4mg/L；在发酵时间为9天、接种量为10％的发酵条件下，随着料液比的不断减小，香兰素浓度受到先增大后减小的影响。由此可知并不是料液比越大越好，高浓度的冬虫夏草料液不仅会抑制菌株的生长代谢，同时也会增加工艺成本。

从图13和图14可以看出，AC交互作用等高线图成圆形状，接种量和发酵时间之间无交互作用。当料液比(g/mL)为1:30、发酵时间为9天不变时，发酵液中香兰素浓度随接种量的增加表现出先增加后减小的影响；当料液比 (g/mL)为1:30、接种量为10％不变时，发酵天数在8.5～9.7天范围内，香兰素浓度超过了4.4mg/L。发酵时间过短，发酵液中香兰素积累量没有达到最大；发酵时间过长，香兰素被进一步降解，不仅增加了工艺周期，同时会产生一些不愉快的风味物质，抑制香兰素的奶香风味。

图15和图16反映了在固定接种量10％时，发酵时间和料液比对冬虫夏草发酵液中香兰素含量的影响。从图中可以看到，当料液比从1:33增加到1:28 时，发酵液中香兰素含量达到了最大高原区；当发酵时间从8.4天增加至9.7 天时，发酵液中的香兰素含量达到最大高原区4.4～4.6mg/L；发酵液中香兰素含量随料液比和发酵时间的增大均表现出先增加后减小的影响。由等高线图可知，发酵时间和料液比交互作用等高线图成垂直方向椭圆形，发酵时间和料液比之间的交互作用对冬虫夏草中香兰素含量影响不显著。

从交叉项曲面图和等高线图可得，在各因素水平范围内，随着因素水平的不断增大，冬虫夏草发酵液中香兰素含量均是先增大后减小，冬虫夏草发酵液中香兰素含量有一个理论最大值。由方差分析和理论优化结果可得发酵的最佳工艺为A＝10.07％；B＝1:30.3；C＝9.1天。即菌株Imau 4-9产奶香型冬虫夏草发酵液的最佳工艺条件为：接种量10.07％，料液比1:30.3(g/mL)，发酵时间 9.1天，在此工艺条件下冬虫夏草发酵液中香兰素的理论预测值为(4.588± 0.181)mg/L。为了满足实际发酵工艺，将最优发酵条件调整成接种量10％，料液比(冬虫夏草：水g/mL)1:30，发酵时间9天。在此工艺条件做5组平行试验，得到发酵液中香兰素平均浓度达到4.6mg/L，说明该模型可以用来优化奶香型冬虫夏草发酵液制备的工艺。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)Imau 4-9，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 为CCTCC NO:M 2021776。

2.包含权利要求1所述枯草芽孢杆菌的菌剂。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌和/或权利要求2所述的菌剂在生 产香兰素中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，利用葡萄糖和/或冬虫夏草 作为生产香兰素的发酵底物。

5.利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备奶香型冬虫夏草发酵液 的方法，其特征在于，包括如下步骤：

配制冬虫夏草料液，灭菌，接种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，恒温 培养发酵，获得所述奶香型冬虫夏草发酵液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌采用 枯草芽孢杆菌种子液，所述枯草芽孢杆菌种子液的浓度为10万～100万 cfu/mL，优选为60万～70万cfu/mL；接种量为5％～15％，优选8％～12％， 更优选9％～11％，更优选9.6％～10.7％。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述冬虫夏草料液由冬 虫夏草粉末和水混合制成，料液比为(1：20)～(1:60)，优选(1：28)～ (1:33)，更优选1:30；装液量为15％～30％，优选20％。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述恒温培养发酵的步 骤包括：于转速150～250r/min、温度40℃～45℃条件下发酵8～10天，优选 的，于转速200r/min、温度43℃条件下发酵9天。

9.如权利要求5-8任一所述的方法制备获得的冬虫夏草发酵液，其特 征在于，所述冬虫夏草发酵液中的香兰素含量不低于3.9mg/L，优选不低于 4.1mg/L，更优选不低于4.4mg/L。

10.如权利要求9所述的冬虫夏草发酵液在烟草产品中的应用。

Images