CN109554318A - 一种红茶菌中的葡糖酸醋杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一种红茶菌中的葡糖酸醋杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明一方面提供了一种新的葡糖酸醋杆菌，另一方面提供了该葡糖酸醋杆菌的应用及应用方法。本发明从红茶菌中筛选出来的葡糖酸醋杆菌C2能够在含糖的茶汤中合成β‑葡萄糖苷酶，并促进香气物质形成；通过两段式的发酵策略实现酿酒酵母和葡糖酸醋杆菌分别在各自最适宜条件下的培养，可大幅度缩短发酵周期，并大量积累具有生理功能的次生代谢物，而且能有效避免杂菌污染、品质不稳定等问题。通过本发明能够快速、稳定制备出风味宜人且具有保健功能的红茶菌饮料。

Description

一种红茶菌中的葡糖酸醋杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种红茶菌中的葡糖酸醋杆菌及其应用。

背景技术

茶叶主要香气组分单萜烯醇类和芳香醇类化合物在茶鲜叶中主要是以糖苷形式存在。茶叶中含有的β-葡萄糖苷酶、β-樱草糖苷酶等内源糖苷酶，可将这些香气前提物水解并释放出香气物质，如芳樟醇、香叶醇等。通过添加外源糖苷酶或能合成糖苷酶的微生物作用亦可促进香气物质的形成。

红茶菌饮料是一种传统的功能性发酵饮料，以茶、糖、水为原料，接入菌种发酵后生成的健康饮品。红茶菌不仅酸甜可口、风味宜人，而且富含果糖、维生素、茶多酚、醋酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸-1，4-内酯（DSL）等营养物质，具有降低血糖、调节肠道菌群、抗衰老、防癌抗癌等生理功能。红茶菌是一种共生的混合菌群，主要包括醋酸菌和酵母菌，还有少量乳酸菌，它们在红茶菌培养中会形成类似海蜇皮的菌膜。传统红茶菌培养是通过多菌种混杂一起发酵，所用的微生物种类及活力难以控制，产品中的营养物种类和浓度、乃至卫生安全都无法保证。

本发明从传统红茶菌中筛选出了一株产β-葡萄糖苷酶的优良葡糖酸醋杆菌，可在发酵中促进香气物质形成。结合实验前期从红茶菌中分离获得的酿酒酵母T3，通过特定的发酵条件实现这两种菌快速生长并大量积累次生代谢物，可快速、稳定获得风味宜人且具有保健功能的红茶菌饮料。本发明使用的原料价格低廉，产品品质稳定，适宜于规模化生产。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种红茶菌中的葡糖酸醋杆菌及其应用的技术方案。

所述的葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinum）C2，保藏单位 ：中国典型培养物保藏中心，地址 ：中国武汉大学，保藏日 ：2018年11月5日，保藏号：CCTCC NO：M2018745。

所述的葡糖酸醋杆菌C2在制备红茶菌饮料中的应用。

所述的利用葡糖酸醋杆菌C2发酵制备红茶菌饮料的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）种子液培养：取葡糖酸醋杆菌C2，按0.1%接种量接于醋酸菌培养基中，在20～26℃下静置培养34～38 h；取菌种保藏号为CCTCC NO：M 2017624的酿酒酵母T3，按0.1%接种量接于PDA培养基中，在28～34℃、150 rpm下振荡培养34～38 h；

2）发酵培养基的制备：将茶叶、白砂糖与水按0.5～2﹕5～20﹕100的质量比例在80～100℃保温2～4 h，得到发酵培养基；

3）两阶段发酵：第一阶段，在发酵培养基中按0.5～2%的接种量接入酿酒酵母T3的种子培养液，在28～34℃、150 rpm下振荡培养1～2天；第二阶段，在上述培养液中按2～5%的接种量接入葡糖酸醋杆菌C2的种子培养液，在20～26℃下静置培养2～3天。

所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中茶叶为红茶、绿茶、乌龙茶或普洱茶。

本发明中涉及的酿酒酵母T3为现有菌株，已在公开号为 CN 107699506 A的发明专利中公开。

本发明从红茶菌中筛选出来的葡糖酸醋杆菌C2能够在含糖的茶汤中合成β-葡萄糖苷酶，并促进香气物质形成；通过两段式的发酵策略实现酿酒酵母和葡糖酸醋杆菌分别在各自最适宜条件下的培养，可大幅度缩短发酵周期，并大量积累具有生理功能的次生代谢物，而且能有效避免杂菌污染、品质不稳定等问题。通过本发明能够快速、稳定制备出风味宜人且具有保健功能的红茶菌饮料。

具体实施方式

为了使本发明更容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。而这些实施例仅为了说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例 1

取传统红茶菌培养液10 mL，加入装有90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀。然后梯度稀释至10^-3、10^-4、10^-5，取0.1 mL涂布于含有1 g/L茶多酚的醋酸菌培养基平板上，置于28 ℃培养箱中培养2～3天。挑取平板上具有圆形，突起，不透明，淡黄色典型特征的菌落，划线分离3次以上，获得75株菌。将划线分离的菌株在显微镜下进行观察，筛选出细胞呈短杆状的菌株，并进行革兰氏染色，筛选革兰氏阴性菌，获得27株菌。对每株菌的发酵液中β-葡萄糖苷酶活性进行分析，其中有1株菌产酶活性最高，为8.5 U/mL。将这株产酶最高的菌株进行下一步的菌种鉴定。

醋酸菌培养基：碳酸钙20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖10 g/L，无水乙醇20 g/L，固体培养基添加15 g/L琼脂。

实施例 2

应用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取出实施案例1中筛选出菌株的基因组DNA，并以此为模板，应用通用引物PCR扩增16s rDNA片段（序列如SEQ ID NO.1所示），并委托上海生工生物有限公司进行测序。将测序结果在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比对分析。鉴定为Gluconacetobacter xylinum，命名为Gluconacetobacter xylinum C2。将其在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国武汉大学，保藏日：2018年11月5日，保藏号：CCTCC NO：M 2018745。

实施例 3

将实施案例1筛选出的菌株与本实验室前期从红茶菌中分离获得的酿酒酵母T3（菌种保藏号为CCTCC NO：M 2017624），以红茶、白砂糖等为原料发酵制备红茶菌饮料。

首先进行种子液培养：取低温保存的葡糖酸醋杆菌C2，按0.1%接种量接于醋酸菌培养基中（碳酸钙20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖10 g/L，无水乙醇20 g/L，固体培养基添加15 g/L琼脂），在26℃下静置培养34 h；取低温保存的酿酒酵母T3，按0.1%接种量接于PDA培养基中，在34℃、150 rpm下振荡培养34 h。

再进行发酵培养基的制备：将茶叶、白砂糖与水按1﹕10﹕100的质量比例在100℃保温4 h，得到发酵培养基；茶叶为祁门红茶，购于祁门茶厂。

然后将获得的种子液接入红茶发酵培养基进行两阶段法发酵：第一阶段，在发酵培养基中按2%的接种量接入酿酒酵母T3的种子培养液，在34℃、150 rpm下振荡培养1天；第二阶段，在上述培养液中按5%的接种量接入葡糖酸醋杆菌C2的种子培养液，在26℃下静置培养2天得到成熟红茶菌原液，pH为3.11。

以分离前的传统红茶菌为对照，按10%接种量接入发酵培养基，在28℃下进行静止发酵。培养7天得到成熟红茶菌原液，pH为3.13。

通过两段式的发酵策略实现酿酒酵母和葡糖酸醋杆菌分别在各自最适宜条件下的培养，相比传统红茶菌培养大幅度缩短发酵周期，有效避免杂菌污染、品质不稳定等问题。能够快速、稳定制备出风味宜人的红茶菌饮料，具有明显的花果香。通过GC-MS对香气物质进行检测，将主要香气物质含量与对照进行比较，结果如表1所示。

表1

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实施例 4

将实施案例1筛选出的菌株与本实验室前期从红茶菌中分离获得的酿酒酵母T3，以绿茶、白砂糖等为原料发酵制备红茶菌饮料。

首先进行种子液培养：取低温保存的葡糖酸醋杆菌C2，按0.1%接种量接于醋酸菌培养基中，在20℃下静置培养38 h；取低温保存的酿酒酵母T3，按0.1%接种量接于PDA培养基中，在28℃、150 rpm下振荡培养38 h。

再进行发酵培养基的制备：将茶叶、白砂糖与水按0.5﹕20﹕100的比例在80℃保温2h，得到发酵培养基。茶叶为龙井绿茶，购于龙冠茶叶公司。

然后将获得的种子液接入绿茶发酵培养基进行两阶段法发酵：第一阶段，在发酵培养基中按0.5%的接种量接入酿酒酵母T3的种子培养液，在28℃、150 rpm下振荡培养2天；第二阶段，在上述培养液中按5%的接种量接入葡糖酸醋杆菌C2的种子培养液，在20℃下静置培养2天得到成熟红茶菌原液，pH为3.03。

以分离前的传统红茶菌为对照，按10%接种量接入发酵培养基，在28℃下进行静止发酵。培养9天得到成熟红茶菌原液，pH为3.09。

通过两段式的发酵策略实现酿酒酵母和葡糖酸醋杆菌分别在各自最适宜条件下的培养，相比传统红茶菌培养大幅度缩短发酵周期，有效避免杂菌污染、品质不稳定等问题。能够快速、稳定制备出风味宜人的红茶菌饮料，具有明显的花果香。通过GC-MS对发酵前后香气物质进行检测，将主要香气物质含量与对照进行比较，结果如表2所示。

表2

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实施例 5

将实施案例1筛选出的菌株与本实验室前期从红茶菌中分离获得的酿酒酵母T3，以乌龙茶、白砂糖等为原料发酵制备红茶菌饮料。

首先进行种子液培养：取低温保存的葡糖酸醋杆菌C2，按0.1%接种量接于醋酸菌培养基中，在23 ℃下静置培养36 h；取低温保存的酿酒酵母T3，按0.1%接种量接于PDA培养基中，在30℃、150 rpm下振荡培养35 h。

再进行发酵培养基的制备：将茶叶、白砂糖与水按1.5﹕15﹕100的比例在90℃保温3h，得到发酵培养基。茶叶为浓香型乌龙茶，购于厦门市家乡茶业有限公司。

然后将获得的种子液接入乌龙茶发酵培养基进行两阶段法发酵：第一阶段，在发酵培养基中按1%的接种量接入酿酒酵母T3的种子培养液，在30℃、150 rpm下振荡培养1天；第二阶段，在上述培养液中按3%的接种量接入葡糖酸醋杆菌C2的种子培养液，在23℃下静置培养2天得到成熟红茶菌原液，pH为3.14。

以分离前的传统红茶菌为对照，按10%接种量接入发酵培养基，在28℃下进行静止发酵。培养8天得到成熟红茶菌原液，pH为3.15。

通过两段式的发酵策略实现酿酒酵母和葡糖酸醋杆菌分别在各自最适宜条件下的培养，相比传统红茶菌培养大幅度缩短发酵周期，有效避免杂菌污染、品质不稳定等问题。能够快速、稳定制备出风味宜人的红茶菌饮料，具有明显的花果香。通过GC-MS对发酵前后香气物质进行检测，将主要香气物质含量与对照进行比较，结果如表3所示。

表3

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实施例6

将实施案例1筛选出的菌株与本实验室前期从红茶菌中分离获得的酿酒酵母T3，以普洱茶、白砂糖等为原料发酵制备红茶菌饮料。

首先进行种子液培养：取低温保存的葡糖酸醋杆菌C2，按0.1%接种量接于醋酸菌培养基中，在25℃下静置培养35 h；取低温保存的酿酒酵母T3，按0.1%接种量接于PDA培养基中，在32℃、150 rpm下振荡培养35 h。

再进行发酵培养基的制备：将茶叶、白砂糖与水按2﹕15﹕100的比例在100℃保温4h，得到发酵培养基。茶叶为普洱茶散茶，购于勐海县春海茶厂。

然后将获得的种子液接入普洱茶发酵培养基进行两阶段法发酵：第一阶段，在发酵培养基中按1.5%的接种量接入酿酒酵母T3的种子培养液，在32℃、150 rpm下振荡培养1天；第二阶段，在上述培养液中按4%的接种量接入葡糖酸醋杆菌C2的种子培养液，在25℃下静置培养3天得到成熟红茶菌原液，pH为3.18。

以分离前的传统红茶菌为对照，按10%接种量接入发酵培养基，在28℃下进行静止发酵。培养10天得到成熟红茶菌原液，pH为3.20。

通过两段式的发酵策略实现酿酒酵母和葡糖酸醋杆菌分别在各自最适宜条件下的培养，相比传统红茶菌培养大幅度缩短发酵周期，有效避免杂菌污染、品质不稳定等问题。能够快速、稳定制备出风味宜人的红茶菌饮料，具有明显的花果香。通过GC-MS对发酵前后香气物质进行检测，对比得出主要香气物质含量提升倍数，结果如表4所示。

表4

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序列表

<110> 中国农业科学院茶叶研究所

<120> 一种红茶菌中的葡糖酸醋杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)

<400> 1

tggctcagag cgaacgctgg cggcatgctt aacacatgca agtcgcacga acctttcggg 60

gttagtggcg gacgggtgag taacgcgtag ggatctgtcc atgggtgggg gataactttg 120

ggaaactgaa gctaataccg catgacacct gagggtcaaa ggcgcaagtc gcctgtggag 180

gaacctgcgt tcgattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga tgatcgatag 240

ctggtctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300

ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga tccagcaatg ccgcgtgtgt 360

gaagaaggtt ttcggattgt aaagcacttt cagcggggac gatgatgacg gtacccgcag 420

aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg caagcgttgc 480

tcggaatgac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggttgaca cagtcagatg tgaaattcct 540

gggcttaacc tgggggctgc atttgatacg ttgagactag agtgtgagag agggttgtgg 600

aattcccagt gtagaggtga aattcgtaga tattgggaag aacaccggtg gcgaaggcgg 660

caacctggct catgactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 720

ccctggtagt ccacgctgta aacgatgtgt gctggatgtt gggtgacttt gtcattcagt 780

gtcgtagtta acgcgataag cacaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt tgaaactcaa 840

aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgc 900

agaaccttac cagggcttga catgcggagg ccgtgtccag agatgggcat ttctcgcaag 960

agacctccag cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1020

agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccttt agttgccagc acgtttgggt gggcactcta 1080

aaggaactgc cggtgacaag ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtcc tcatggccct 1140

tatgtcctgg gctacacacg tgctacaatg gcggtgacag tgggaagcca ggtagcgata 1200

ccgagccgat ctcaaaaagc cgtctcagtt cggattgcac tctgcaactc gagtgcatga 1260

aggtggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1320

tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gtttgacctt aagccggtga gcgaaccgca 1380

aggacgcagc cgaccacggt cgggtcagcg actggggtga agtcgtaaca a 1431

Claims (4)

1.葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinum）C2，保藏编号为CCTCC NO：M 2018745。

2.如权利要求1所述的葡糖酸醋杆菌C2在制备红茶菌饮料中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的葡糖酸醋杆菌C2发酵制备红茶菌饮料的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）种子液培养：取葡糖酸醋杆菌C2，按0.1%接种量接于醋酸菌培养基中，在20～26℃下静置培养34～38 h；取菌种保藏号为CCTCC NO：M 2017624的酿酒酵母T3，按0.1%接种量接于PDA培养基中，在28～34℃、150 rpm下振荡培养34～38 h；

2）发酵培养基的制备：将茶叶、白砂糖与水按0.5～2：5～20：100的质量比例在80～100℃保温2～4 h，得到发酵培养基；

3）两阶段发酵：第一阶段，在发酵培养基中按0.5～2%的接种量接入酿酒酵母T3的种子培养液，在28～34℃、150 rpm下振荡培养1～2天；第二阶段，在上述培养液中按2～5%的接种量接入葡糖酸醋杆菌C2的种子培养液，在20～26℃下静置培养2～3天。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中茶叶为红茶、绿茶、乌龙茶或普洱茶。