CN106754581B - 可同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

可同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了可同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的芽孢杆菌包括地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis CGMCC NO.3963、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CCTCC NO:M 2013369、迟缓芽孢杆菌Bacillus lentus CCTCC NO:M 2013370；甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus CCTCC NO:2013371。这些芽孢杆菌与酿酒酵母混合培养后，能够提高酒精产量20％以上，同时提高酿酒酵母代谢醛类、醇类、酯类、酸类、及其它风味物质。将这些芽孢杆菌应用于酿造酒生产中，可以提高出酒率，同时酿造酒的风味品质显著提高。

Description

可同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的芽孢杆菌及其应用
本申请是申请号为：201410747485.0，申请日为：2014年12月9日，申请名称为：可同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的芽孢杆菌及其应用的分案申请。
技术领域
本发明涉及可同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
酿造酒行业是我国的优势民族传统制造业，也是食品工业的重要组成部分。2013年生产总值达6000亿元以上，占食品工业总值约6-7％。因此酿造酒行业的发展对于我国食品行业甚至国民经济的发展都具有重要的意义。
中国白酒是酿造酒的典型代表。但是，与国际酿造酒制造行业相比，存在如下问题：首先，生产效率偏低，即白酒出酒率低。白酒固态酒醅中乙醇最高浓度仅为7％左右，最高原料出酒率仅50％(小曲清香)，最低仅35％左右(浓香)，远低于理论出酒率(65％)；其次，白酒风味代谢不可控，重要风味物质合成代谢较弱，导致优质品率偏低，目前每年生产的优质白酒仅占全国白酒产量的5～10％。例如，清香型白酒的优质品率仅6％(代表性企业内部数据)，无法满足人民群众对优质产品的消费需求。因此，提高白酒的出酒率以及优质品率是白酒产业可持续发展的必然要求。
酿酒酵母是白酒生产的重要微生物，不仅提供了酒精，而且提供了重要的风味物质，因此提高酿酒酵母的酒精代谢及风味代谢是白酒发酵需要调控的重要内容。但是由于白酒生产属于敞开式自然发酵，酿酒酵母菌株及其代谢都难以控制，尽管在白酒生产中采用了一定的方法，但是都收效甚微。例如，在白酒生产中添加代谢活性更强的酵母，但是既能够满足酒精活力高，又能够满足风味代谢活性高的酵母较少，且很多酵母都难以适应白酒发酵的恶劣环境，并且，强化的酿酒酵母在数量上并没有优势，也不能取代本土的酿酒酵母，因此，直接强化优质酿酒酵母的方式效果并不明显。因此，如果能够直接调控实际生产环境中酿酒酵母的代谢是一种更为有效的途径。但是不同于可控发酵，白酒生产的自然发酵决定了其代谢调控的困难性。另外，目前白酒生产中，出酒率与风味提升很难同时能够满足，一般出酒率提高时风味则会下降，而风味提高时，出酒率则会下降。除了以上困难外，还难以同时提高酵母乙醇与风味代谢。
本发明发现了4株芽孢杆菌，能够有效调控酿酒酵母的酒精代谢与风味代谢能力，由于上述菌株来自于白酒酿造中，因此适合于白酒酿造环境，将其应用于白酒生产中，可同时以有效提高生产体系中酿酒酵母的酒精与风味代谢能力，最终同时提高白酒的出酒率与品质，解决目前白酒生产中存在的出酒率与风味品质难以同时提高的困难。符合白酒产业可持续发展的要求。同时，本发明可以应用于其它酿造食品领域，对于促进酿造食品的高效与优质生产具有重要实践意义。
发明内容
本发明提供提高酿酒酵母代谢酒精及风味物质的芽孢杆菌，及其应用于白酒生产中提高白酒出酒率与品质的方法。
本发明的第一个目的是提供4株能同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的芽孢杆菌。
所述芽孢杆菌为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis CGMCC NO.3963；蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus BC-1，即B.cereus CCTCC NO:M 2013369；迟缓芽孢杆菌Bacilluslentus BL-1，即B.lentus CCTCC NO:M 2013370；甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus BM-1，即B.methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371。
所述地衣芽胞杆菌B.licheniformis CGMCC NO.3963，于2010年6月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.3963；所述蜡样芽孢杆菌B.cereusCCTCC NO:M 2013369，于2013年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2013369；所述迟缓芽孢杆菌B.lentus CCTCC NO:M 2013370，于2013年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013370；所述甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371，于2013年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013371。
所述风味物质包括：醛类的乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚，醇类的2-甲基丙醇、3-甲基丁醇，芳香族类的苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、异丁酸苯乙酯，酮与呋喃类的2,3-二氢苯并呋喃，酸类2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸，以及法呢醇、β-香茅醇。
所述地衣芽胞杆菌B.licheniformis CGMCC NO.3963，其特征在于，将其与酿酒酵母混合发酵，可以提高酿酒酵母酒精代谢能力；同时增加酿酒酵母代谢风味物质的能力，包括乙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、异丁酸苯乙酯、2,3-二氢苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、反式-橙花叔醇、法呢醇、四甲基吡嗪。
所述的蜡样芽孢杆菌B.cereus CCTCC NO:M 2013369，其特征在于，将其与酿酒酵母混合发酵，可以提高酿酒酵母酒精代谢能力；同时增加酿酒酵母代谢风味物质的能力，包括乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、异丁酸苯乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、2,3-二氢苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、反式-橙花叔醇、法呢醇、β-香茅醇、β-大马酮。
所述的迟缓芽孢杆菌B.lentus CCTCC NO:M 2013370，其特征在于，将其与酿酒酵母混合发酵，可以提高酿酒酵母酒精代谢能力；同时增加酿酒酵母代谢风味物质的能力，包括乙醛、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、异丁酸苯乙酯、癸酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、2,3-二氢苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、反式-橙花叔醇、法呢醇、β-香茅醇。
所述的甲基营养型芽孢杆菌B.Methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371，其特征在于，将其与酿酒酵母混合发酵，可以提高酿酒酵母酒精代谢能力；同时增加酿酒酵母代谢风味物质的能力，包括乙醛、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、2-甲基丙醇、2-甲基-4-戊烯-1-醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、异丁酸苯乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、2,3-二氢苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、法呢醇、β-大马酮。
所述的4株芽孢杆菌都具有以下微生物学特征：革兰氏阳性、兼性厌氧，可水解酪蛋白、明胶和淀粉；可直接在高粱固体培养基中生长，其特点在于不需要对高粱固体培养基进行糖化处理，能直接利用高粱淀粉而生长与代谢；能耐受60℃高温生长，耐受15～18％的NaCl和KCl，在pH3.8～4可以生长，可以耐受10～12％的乙醇。以上特征使其能够存活于白酒酿造复杂的环境，并对酿酒酵母代谢形成促进作用。同时，由于该菌长期在白酒酿造环境中与酿酒酵母共同生存，进化使其能够与酵母产生相互作用，并促进酿酒酵母的生长与代谢。
本发明的第二个目的是提供一种同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的方法，是将酿酒酵母与以下至少一种芽孢杆菌进行混合培养：地衣芽胞杆菌B.licheniformisCGMCC NO.3963、蜡样芽孢杆菌B.cereus CCTCC NO:M 2013369、迟缓芽孢杆菌B.lentusCCTCC NO:M 2013370、甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371。
所述酿酒酵母是任意一种酿酒酵母。
所述方法具体是：将酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，按照接种后菌体数量比为0.001:1000至1000：0.001接种于培养基中，于25℃至40℃、0rpm至200rpm培养16h至72h。
所述方法，对培养基无要求。在本发明的一种实施方式中，所述培养基为高粱液体培养基。
本发明的第三个目的是提供所述芽孢杆菌在酿酒方面的应用。
所述应用是将芽孢杆菌应用于酿造酒生产中提高酿造酒出酒率与品质。
所述应用是将芽孢杆菌液体菌剂或固体菌剂，与酿酒酒曲种或发酵原料混合后，进行发酵，酿造酒的出酒率以及品质均明显提高。
所述应用，在本发明的一种实施方式中是所述芽孢杆菌在酿造酒生产中的强化应用，采用液体菌剂或固体菌剂的方式接种于生产体系中，提高出酒率与产品风味物质种类与含量。
所述液体菌剂制作方式，在本发明的一种实施方式中，是将活化的种子液按1～5％(w/w)的接种量(即每100g液态培养基接种种子液1-5g)接种于灭菌的液态培养基中，25～40℃培养24h～72h。
所述液态培养基，在本发明的一种实施方式中，为高粱液体培养基，制作方法为：20～200g高粱样品经粉碎后，加mL/g计1～4倍的水，蒸煮1-5h，呈糊状，冷却后加入10～50单位/g的糖化酶，于40～100℃保持2～10h，过滤、离心所得滤液，糖度为10～15°Bx。
所述固体菌剂的制作方式，在本发明的一种实施方式中，是将活化的种子液接种(一级种子)高粱固体培养基中(接种量为1～5％，w/w)，在25～40℃环境中固态发酵32～72h，制成固态菌制剂。高粱固体培养基制作方式：将高粱粉碎，按1：1～1：2的比例加水后，蒸煮30－60min即可。
本发明的芽孢杆菌是从中国酱香型白酒酿造环境中筛选获得的，由于酱香型白酒酿造具有高温、高酸、高乙醇浓度等特征，赋予了以上芽孢杆菌不同于常规的芽孢杆菌，具有独特的耐受高温、高酸及高乙醇浓度的特征，可以适应酿造酒恶劣的酿造环境，并促进酿酒酵母的代谢作用。同时，混合发酵中酵母风味代谢的提高并不是由芽孢杆菌自身代谢的物质，首先混合发酵后，芽孢杆菌的生长受到了一定的抑制，同时酵母提高的代谢物质绝大部分并不是芽孢杆菌所能代谢产生的，因此，所述芽孢杆菌与酵母混合可以提高酿酒酵母的代谢能力。
本发明发现了4株芽孢杆菌，能够同时有效提高生产体系中酿酒酵母的酒精与风味代谢能力，最终同时提高白酒的出酒率与品质，解决目前白酒生产中存在的出酒率与风味品质难以同时提高的困难，符合白酒产业可持续发展的要求。
生物材料保藏
蜡样芽孢杆菌Bacillus.cereus BC-1，于2013年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2013369；
迟缓芽孢杆菌Bacillus.lentus BL-1，于2013年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2013370；
甲基营养型芽孢杆菌Bacillus.methylotrophicus BM-1，于2013年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013371。
附图说明
图1：单独培养与混合培养后酿酒酵母的生长，A，酿酒酵母，□，单培养；●，添加地衣芽胞杆菌；△，添加蜡样芽孢杆菌；▼，添加迟缓芽孢杆菌；◇，添加甲基营养型芽孢杆菌。
具体实施方式
风味物质检测：运用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)方法对挥发性产物进行分析，取8mL样品，放入装有3g NaCl的顶空进样瓶中，加入10μL浓度为42.60mg·L-1的4-甲基-2-戊醇为内标。将顶空瓶于50℃恒温萃取45min。萃取完后进行GC-MS分析。
实施例1酿酒酵母与芽孢杆菌的混合培养
酿酒酵母种子液：挑取一环酿酒酵母菌泥接种于YEPD液体培养基，30℃，200rpm培养16h。芽孢杆菌种子液：挑取一环芽孢杆菌菌泥接种于LB液体培养基，37℃，200rpm培养16h。配制高粱浸出汁，接种酿酒酵母种子液与芽孢杆菌种子液，两者终浓度均为1×106cfu/mL。在30℃，200rpm培养。取样通过平板涂布的方法测定菌体浓度；培养24～48h，菌液于8000rpm离心10min，测定乙醇浓度与风味物质成分及含量。酿酒酵母菌体浓度随时间的变化曲线见图1，乙醇浓度变化见表1，风味成分变化见表2至表3。
通过测定发酵过程中芽孢杆菌和酵母菌的菌体浓度，发现芽孢杆菌的生长会降低，酿酒酵母的生长与单独培养相比变化不大。
从表1可以看出，与芽孢杆菌混合培养后，酿酒酵母的产乙醇能力提高17％-40.2％。
从表2至表3可以看出，芽孢杆菌与酵母混合培养后，风味物质含量都有提高的包括：所述风味物质包括：醛类的乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚，醇类的2-甲基丙醇、3-甲基丁醇，芳香族类的苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、异丁酸苯乙酯，酮与呋喃类的2,3-二氢苯并呋喃，酸类2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸，以及法呢醇、β-香茅醇。
实验证明，芽孢杆菌是不产或极低产醇、酸、酯的。由于混合培养时芽孢杆菌生长降低、酵母生长，而风味物质的种类及其浓度会提高，表明了并非芽孢杆菌自身具有高产乙醇以及重要醇、酸、酯类风味物质的代谢能力，而是芽孢杆菌促进了酿酒酵母的代谢能力。
表1添加不同芽孢杆菌酿酒酵母产生乙醇浓度(g/l)
表2添加不同芽孢杆菌后醛类、醇类及芳香族风味物质的变化(μg/L)
表3添加不同芽孢杆菌后酯类、酸类及其他风味物质的变化(μg/L)
实施例2芽孢杆菌应用于酿造酒生产中提高酿造酒出酒率与品质
将本发明的芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013369和CCTCC NO:M 2013370分别制成液体菌剂或固体菌剂，与酿酒酒曲种或发酵原料混合后进行发酵。
所述液体菌剂制作方式：将活化的种子液按1～5％(w/w)的接种量(即每100g液态培养基接种种子液1-5g)接种于灭菌的液态培养基中，25～40℃培养24h～72h。
所述液态培养基为高粱提取物培养基，制作方法为：20～200g高粱样品经粉碎后，加mL/g计1～4倍的水，蒸煮1-5h，呈糊状，冷却后加入10～50单位/g的糖化酶，于40～100℃保持2～10h，过滤、离心所得滤液，糖度为10～15oBx。
所述固体菌剂的制作方式是将活化的种子液接种(一级种子)高粱固体培养基中(接种量为1～5％，w/w)，在25～40℃环境中固态发酵32～72h，制成固态菌制剂。
高粱固体培养基制作方式：将高粱粉碎，按1：1～1：2的比例加水后，蒸煮30－60min即可。
在酱香型白酒生产中分别应用这两种芽孢杆菌，对应用生产的白酒进行感官品评，结果如表4所示，可以看出，应用芽孢杆菌后白酒质量得到提高。其中，根据芽孢杆菌与酵母风味代谢特征，芽孢杆菌产酸、醇、酯的能力很低，白酒中所提高的醇香、甜度、酸感主要为酵母代谢的醇类物及酸类物质贡献，放香强度主要为酵母代谢产生的酯类物质贡献。结果表明，白酒中酸、醇、酯等重要的风味是有芽孢杆菌促进酿酒酵母代谢产生。
表4应用关键细菌组合生产白酒品评结果
评酒人员：国家白酒评委1名；省级白酒评委5名；酒厂评委2名。
计分方法：按排序排在第一位加权3分，第二位加权2分，第三位加权1分。
在酱香型白酒生产的出酒的1～4轮次进行了芽孢杆菌的应用，所生产白酒品质均得到提高且出酒率得到提高，结果如表5所示。
表5应用芽孢杆菌细菌生产白酒的出酒率(％)
实施例3酿酒酵母与芽孢杆菌的混合培养
将酿酒酵母与B.licheniformis CGMCC NO.3963、B.lentus CCTCC NO:M 2013370分别制成种子液。将按B.licheniformis CGMCC3963、B.lentus CCTCC NO:M 2013370按菌数1:1的比例混合后，与酿酒酵母一起接种于YPD培养基中，使接种后酵母与芽孢杆菌的菌数分别为104个/mL、1010个/mL，与30℃静置培养72h。结果发现，与单独培养相比，乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、异丁酸苯乙酯、2,3-二氢苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、法呢醇、β-香茅醇等物质含量都有一定程度的升高。
实施例4酿酒酵母与芽孢杆菌的混合培养
将酿酒酵母与B.cereus CCTCC NO:M 2013369、B.lentus CCTCC NO:M 2013370、B.methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371分别制成种子液。将按B.cereus CCTCC NO:M2013369、B.lentus CCTCC NO:M 2013370、B.methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371按菌数1:2:2的比例混合后，与酿酒酵母一起接种于培养基中，使接种后酵母与芽孢杆菌的菌数分别为108个/mL、103个/mL，与40℃100rpm培养16h。结果发现，与单独培养相比，乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、异丁酸苯乙酯、2,3-二氢苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、法呢醇、β-香茅醇等物质含量都有一定程度的升高。同时，酵母的产酒率也提高了22.3％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.能同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus BM-1，于2013年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉,武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2013371。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌与酿酒酵母混合发酵时，能够提高酿酒酵母产酒精能力和增加酿酒酵母代谢风味物质的能力；所述甲基营养型芽孢杆菌CCTCC NO: M 2013371能够提高的风味物质包括乙醛、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、2-甲基丙醇、2-甲基-4-戊烯-1-醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、异丁酸苯乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、2,3-二氢苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、法呢醇、β-大马酮。
3.一种同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的方法，其特征在于，是将酿酒酵母与B. methylotrophicus CCTCC NO: M 2013371进行混合培养；或者是将酿酒酵母、B. methylotrophicus CCTCC NO: M 2013371与B. licheniformis CGMCC NO.3963进行混合培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：将酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，按照接种后菌体数量比为0.001:1000至1000：0.001接种于培养基中，于25℃至40℃、0rpm至200rpm培养16h至72h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基为高粱液体培养基。
6.权利要求1所述芽孢杆菌在酿酒方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是将芽孢杆菌应用于酿造酒生产中提高酿造酒出酒率与品质；所述应用是将芽孢杆菌液体菌剂或固体菌剂，与酿酒酒曲种或发酵原料混合后，进行发酵。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述液体菌剂制作方式：将种子液按每100g液态培养基接种种子液1-5g的接种量接种于灭菌的液态培养基中，25~40℃培养24 h~72 h，所述液态培养基的制作方法为：20～200g高粱经粉碎后，加入1～4倍质量的水，蒸煮1-5h，呈糊状，冷却后按每g高粱加入10～50U的糖化酶，于40～100℃保持2～10h，过滤、离心所得滤液，糖度为10~15oBx；所述固体菌剂的制作方式：将种子液按每100g固体培养基接种种子液1-5g的接种量接种高粱液体培养基，在25~40℃环境中固态发酵32~72 h，制成固态菌剂。
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