CN113717867B - 一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母及其应用，菌株名为库德里阿兹威毕赤酵母Pichia Kudriavzevii，已于2021年08月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 23130；所述的库德里阿兹威毕赤酵母作为发酵菌种在食品发酵不产乙醇产香中的应用。本发明的酵母具有较好的耐酸性、耐糖性和耐酒精性，适应环境的能力较强；与商业安琪生香酵母对比，由本发明菌株发酵的芒果汁可产生较多香气物质，如具有玫瑰、蜂蜜香气的苯乙醇，具有果香的乙酸乙酯，具有白兰地香气的辛酸乙酯，具有花香、果香和甜香的乙位紫罗兰酮等，有效改善了发酵芒果汁的风味。

Description

一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母及其应用。

背景技术

芒果是主要的热带和亚热带水果之一。它富含维生素(A，C，E)，膳食纤维以及矿物质镁和钾。它还包含植物化学物质酚酸、类胡萝卜素和胆碱，它们可以为人类带来除微量和大量营养素之外的健康益处。芒果的收获期短，易损坏且易腐烂。为了减少损失，已经开发了果汁，果脯，罐头食品和果酒等一系列产品。益生菌是活的微生物，当以足够的量使用时，可以为宿主带来健康益处。自现代文明开始以来，人们已经食用了发酵食品，并且被认为是向肠道提供有益益生菌的理想方法。芒果汁因其令人愉悦的感官品质和丰富的营养价值而成为消费者最喜欢的产品。当前，具有新口味，新口味和高营养价值的发酵果汁产品正在引领市场的发展。

香气对芒果汁产品的质量和可接受性起着至关重要的作用。发酵的芒果汁，香气物质种类少，缺乏风味。近年来，非酿酒酵母发酵果汁备受关注，与酿酒酵母相比，其发酵果汁的乙醇较少，香气浓郁，并可以抑制不良微生物的生长。毕赤酵母在非酿酒酵母中具有较大的优势，比如库德里阿兹威毕赤酵母(P.kudriavzevii)在小米固体培养基中能产生大量乙酸乙酯，占总风味物质的37.71％,产生较低量的乙醇(3.94％),且对环境耐受性良好；Nuttaporn等人分离纯化出的菌株P.kudriavzevii RZ8-1可在高达45℃的条件下生长并可耐受较高浓度的乙酸[Nuttaporn C,Sudarat T,Preekamol K,et al.The potential ofthe newly isolated thermotolerant yeast Pichia kudriavzevii RZ8-1 for high-temperature ethanol production[J].Brazilian Journal of Microbiology,2018,49(2).]。目前，还没有报道过不产乙醇的生香库德里阿兹威毕赤酵母菌株及其应用于发酵芒果汁。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种不产乙醇，高产苯乙醇并能产生乙位紫罗兰酮的产香库德里阿兹威毕赤酵母Pichia Kudriavzevii，该发酵菌种在食品发酵不产乙醇产香中的应用，尤其是发酵芒果汁中的应用，可有效改善发酵芒果汁的风味。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母，所述库德里阿兹威毕赤酵母的菌株名为库德里阿兹威毕赤酵母PichiaKudriavzevii，已于 2021年08月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCC 23130，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步地，所述的库德里阿兹威毕赤酵母Pichia Kudriavzevii菌落呈奶白色，微微凸起，边缘整齐，表面哑光不透明，菌体细胞呈椭圆形。

所述的库德里阿兹威毕赤酵母作为发酵菌种在食品发酵不产乙醇产香中的应用。

进一步地，所述的产香代谢产物为具有玫瑰、蜂蜜香型的苯乙醇，具有果香的乙酸乙酯和具有花香和具有果香、甜香的乙位紫罗兰酮。

进一步地，所述的芒果汁来源于小台芒、玉文芒、澳芒、贵妃芒或凯特芒。

进一步地，所述食品发酵为芒果汁的发酵。

作为优选方案，所述的芒果汁发酵为将库德里阿兹威毕赤酵母PichiaKudriavzevii活化后接种于芒果汁中30℃恒温静置发酵36h。

作为优选方案，所述库德里阿兹威毕赤酵母Pichia Kudriavzevii活化方法为：毕赤酵母菌接种于YPD液体培养基中于30℃，150r/min活化24h，于无菌环境中转移至无菌离心管， 8000r离心10min，继续于无菌环境中以无菌水冲洗三次后以适量无菌水混匀。

作为优选方案，所述的芒果汁甜度为16°Brix。

作为优选方案，所述芒果汁由芒果浆和无菌水制备，具体方法为：成熟完好的芒果清洗去皮，果肉切块于破壁机制成芒果浆，芒果浆与无菌水等体积充分混匀制成芒果汁，于88℃，巴氏杀菌15min，迅速冷却至30℃。

本发明具有以下优点：本发明从芒果果皮中筛选获得一株不产乙醇的酵母菌株，通过形态观察以及分子生物学鉴定为Pichia kudriavzevii，该酵母具有较好的耐酸性、耐糖性和耐酒精性，适应环境的能力较强；与商业安琪生香酵母对比，由本发明菌株发酵的芒果汁可产生较多香气物质，如具有玫瑰、蜂蜜香气的苯乙醇，具有果香的乙酸乙酯，具有白兰地香气的辛酸乙酯，具有花香、果香和甜香的乙位紫罗兰酮等，有效改善了发酵芒果汁的风味。

附图说明

图1为本发明库德里阿兹威毕赤酵母与商业安琪产香酵母在预发酵过程中的可溶性固形物和活菌数变化图；

图2为本发明库德里阿兹威毕赤酵母在WL培养基上的菌落形态图；

图3为本发明库德里阿兹威毕赤酵母光学显微镜下的细胞形态图；

图4为本发明库德里阿兹威毕赤酵母的耐受性特征图，其中图4-a为不同葡萄糖浓度下的生长特征，图4-b为不同pH条件下的生长特征，图4-c为不同酒精浓度下的生长特征；

图5为芒果汁发酵前后的主成分分析图，其中图5-a为MJ与MJFP、MJFA的得分散点图，图5-b为不同组样品间的主成分分析图；

图6为芒果汁发酵前后的热图分析。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：本发明产香非酿酒酵母的分离鉴定与筛选

1.菌株分离

于2020年5月在中国海口超市购买小台芒、玉文芒、澳芒、贵妃芒、凯特芒。土壤取自中国海南省的长江红玉芒果种植园。将10克芒果皮或土壤加入富集YPD液体培养基(使用前于121℃，灭菌15min)中，该培养基含有1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖和0.5％硫酸链霉素，28℃、150r/min培养2天。

将0.1mL 10倍梯度稀释的培养液涂在YPD琼脂平板表面，28℃培养2天。挑取特征菌落并在赖氨酸培养基上进一步划线，在28℃下孵2天。挑取可在赖氨酸培养基上生长的纯化菌落于显微镜下观察菌体，并在4℃下储存备用。

2.菌株优选

为了评估非酿酒酵母菌的发酵性能，进行预发酵实验。活化菌株制得的发酵剂浓度为 1×10^7.5CFU/mL，预发酵实验使用的芒果汁是通过将新鲜成熟的凯特芒榨汁并与40％(v/v) 无菌水充分混合而获得的，以蔗糖将可溶性固形物调节至22.3°Brix，然后在88℃下灭菌15 分钟，于30℃下发酵48h。分析和比较不同菌株之间的可溶性固形物含量和活细胞数(采用平板计数法)，可反映菌株的发酵能力。

如图1所示，发酵48h后X1发酵的芒果汁(MJFP)可溶性固形物含量明显低于商业安琪产香酵母(MJFA)，这说明菌株X1的糖利用性更好；在发酵过程中，X1比商业安琪产香酵母更快进入对数生长期，且MJFP的活菌数比MJFA的更高，说明X1更能适应芒果汁中的环境。

3.分子生物学鉴定

将酵母菌X1送青岛鹏翔生物科技有限公司进行基于ITS序列的分子鉴定。

提取酵母菌X1总DNA后，通过通用引物如S

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID NO.1)

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)(SEQ ID NO.2) 获得其ITS序列(如SEQ IDNO.3所示)，对其进行测序后，在NCBI数据库中进行BLAST 比对，结果表明，该菌与Pichiakudriavzevii的序列同源性最高，相似度达到99％。

4.菌落及菌体形态观察

Pichia kudriavzevii HDX1于WL培养基中，30℃恒温倒置培养48h，观察其菌落为菌落呈奶白色，微微凸起，边缘整齐，表面哑光不透明，如图2所示。

挑取单菌落于载玻片上，滴加一滴1％美兰染液染色，先低倍镜观察，后使用油镜观察其菌体特征，该菌体细胞呈椭圆形，如图3所示。

该生物菌株HDX1于2021年08月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 23130，分类命名为：库德里阿兹威毕赤酵母Pichiakudriavzevii。

实施例2：库德里阿兹威毕赤酵母HDX1对糖、酸、酒精的耐受性

将菌株X1活化，以2％接种量分别接种到正常YPD液体培养基和不同葡萄糖浓度(15％， 25％，35％)、不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5)、不同酒精含量(体积分数为2％、4％、6％、8％) YPD液体培养基中，置于30℃恒温培养箱中摇床培养24h，观察菌株生长情况。以未接种的原YPD液体培养基作为空白对照，测定不同条件下各菌株的OD600值，每个样品重复测定三次。

结果如图4所示，随着葡萄糖浓度的升高，X1的生长速度显著降低(p<0.05)，但依然可以正常生长；在pH降为4.5时，X1收到的抑制作用不明显，之后随着pH的降低，X1的生长均受到不同程度的抑制(与对照组相比)；在酒精浓度低于4％时，X1的生长表现为受到促进，当随着酒精浓度继续升高，X1的生长受到了显著抑制，这表明X1对少量的酒精具有一定的耐受性。综合来看，所筛选的毕赤酵母X1可以较好的适应发酵环境。

实施例3：发酵芒果汁的香气组成分析

1.芒果汁样品的准备

凯特芒果浆与无菌水等体积(v/v＝1:1)充分混匀制成芒果汁，于88℃，巴氏杀菌15min，迅速冷却至30℃。不接菌的芒果汁为空白对照组，发酵芒果汁接种量为4％，于30℃发酵36h。

2.香气组分分析

将各组样品一式三份，进行香气分析。

HS-SPME提取香气成分：取样品100uL置于20mL萃取瓶中，加入丁位辛内酯作为内标物(0.5mg/mL,取100uL加入),密封,置于60℃水浴中，平衡20min后，插入萃取针萃取30min。萃取针使用前，在气质进样口活化20min(250℃)。

GC-MS分析：GC条件：进样口温度250℃，气质接口温度250℃，载气流速1.5mL/min。升温程序：初始50℃，保持1min，以5℃/min升温到100℃保持2min；4℃/min升温到180℃保持3min；5℃/min升温到250℃保持5min。MS条件：离子源温度230℃，四级杆温度150℃， EI电离70eV,全扫描35-550da。结果如表1和图5所述：

表1香气物质归类表

“n.d.”,表示未检出；RT.为保留时间；a–c表示同一行在p<0.05(n＝3)上的显著差异性。

从表1可以看出，芒果汁(MJ)和发酵芒果汁(FMJ)的基本主要挥发成分大致相同，共有41种挥发成分，包括9种醇类、12种酯类、9种烯烃、3种酮类、2种醛类、3种烷烃、其他物质3种。MJ的香气成分包括2.87％的醇、6.03％的酯、69.78％的烯烃、5.12％的酮、0.60％的醛、2.05％的烷烃和2.09％的其他物质。然而，在FMJP中，总醇和酯的含量分别显着增加至48.49％和31.73％。尽管MJFP中的总酒精含量降低，但与一种MJFA相比，苯乙醇(20.43％，蜂蜜和玫瑰味)和异戊醇(26.98％，类似苹果香)有所增加。值得关注的一点是，与其它研究里的库德里阿兹威毕赤酵母菌株不同，P.kudriavzevii HDX1不产生乙醇，降低了酒精味和辛辣味。同样，在FMJ中，乙酸乙酯显着增加，这是两种FMJ中最主要的香气成分。乙酸乙酯可产生强烈的类似乙醚气味、清澈而轻微的果味和酒香。MJ 的主要香气成分是烯烃，占其挥发性化合物总量的69.90％，主要包括丁位-3-蒈烯(DELTA-3-Carene)、柠檬烯(DL-Limonene)、α-松油烯(alpha-terpinolene)和反式石竹烯 (trans-Caryophyllene)。特别是丁位-3-蒈烯，其相对含量分别从58.03％显着下降到5.38％ (MJFA)和4.60％(MJFP)(p＜0.05)。尽管两种FMJ中的总酮都减少了，但MJFP含有 1.01％的β-紫罗兰酮(花香、果味和甜味)，增加了其香气典型性。

如图5所示，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分别解释了模型总差异的82.44％和 17.56％，两组主成分之和为100％，可以很好的解释模型差异。两种发酵芒果汁与未发酵芒果汁之间差异显著，未发酵芒果汁位于PC1正半轴是由于烯烃类物质(如丁位-3-蒈烯)以及异佛尔酮、对伞花烃、苯乙酸异戊酯的含量较高。两种发酵芒果汁由于产生了一些新的香气物质而位于PC1负半轴上，因此通过PC2进行区分。MJFP含有较多的乙酸乙酯、苯乙醇、异戊醇，并且产生了辛酸乙酯、乙位紫罗兰酮。除异戊醇外，其它物质都对发酵香气的形成具有积极作用；MJFA产生了较多的乙醇，酯类物质较少。

对发酵前后的芒果汁进行分层聚类，结果显示在热图中，如图6所示，根据热图垂直方向将所有样本分为三类。芒果汁经过发酵后，香气成分明显变化。烯烃类物质减少，MJFP 更为明显，且产生了较多的香气物质，如乙酸乙酯、苯乙醇、β-紫罗兰酮；而MJFA的新香气物质较少，且乙醇、异戊醇较多。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母及其应用

<141> 2021-09-13

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(未知)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(未知)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 470

<212> DNA

<213> 芒果(未知)

<400> 3

aggatcatta ctgtgattta gtactacact gcgtgagcgg aacgaaaaca acaacaccta 60

aaatgtggaa tatagcatat agtcgacaag agaaatctac gaaaaacaaa caaaactttc 120

aacaacggat ctcttggttc tcgcatcgat gaagagcgca gcgaaatgcg atacctagtg 180

tgaattgcag ccatcgtgaa tcatcgagtt cttgaacgca cattgcgccc ctcggcattc 240

cggggggcat gcctgtttga gcgtcgtttc catcttgcgc gtgcgcagag ttgggggagc 300

ggagcggacg acgtgtaaag agcgtcggag ctgcgactcg cctgaaaggg agcgaagctg 360

gccgagcgaa ctagactttt tttcagggac gcttggcggc cgagagcgag tgttgcgaga 420

caacaaaaag ctcgacctca aatcaggtag gaatacccgc tgaacttaag 470

Claims (9)

1.一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母，其特征在于：所述库德里阿兹威毕赤酵母的分类命名为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia Kudriavzevii)，已于2021年08月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.23130。

2.如权利要求1所述的一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母，其特征在于：所述的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia Kudriavzevii)菌落呈奶白色，微微凸起，边缘整齐，表面哑光不透明，菌体细胞呈椭圆形。

3.如权利要求1或2所述的库德里阿兹威毕赤酵母作为发酵菌种在芒果汁发酵不产乙醇产香中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述芒果汁发酵的产香代谢产物为具有玫瑰、蜂蜜香型的苯乙醇，具有果香的乙酸乙酯和具有花香、果香、甜香的乙位紫罗兰酮。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的芒果汁来源于小台芒、玉文芒、澳芒、贵妃芒或凯特芒。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的芒果汁发酵为将库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia Kudriavzevii)活化后接种于芒果汁中30℃恒温静置发酵36h。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述库德里阿兹威毕赤酵母(PichiaKudriavzevii)活化方法为：毕赤酵母菌接种于YPD液体培养基中于30℃，150r/min活化24h，于无菌环境中转移至无菌离心管，8000r离心10min，继续于无菌环境中以无菌水冲洗三次后以适量无菌水混匀。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的芒果汁甜度为16°Brix。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述芒果汁由芒果浆和无菌水制备，具体方法为：成熟完好的芒果清洗去皮，果肉切块于破壁机制成芒果浆，芒果浆与无菌水等体积充分混匀制成芒果汁，于88℃，巴氏杀菌15min，迅速冷却至30℃。

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