CN113122470A - 一种高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株筛选和应用 - Google Patents

一种高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株筛选和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株，分类名称为Trichomonascus ciferrii，命名为WLW，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年11月26日，保藏号为：GDMCC No 61319。利用该菌株进行纯种发酵豆豉时，豆豉样品挥发性成分经SPME萃取，GC‑MS鉴定，共检出41种成分，通过分析发现，豆豉中苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的含量分别占总风味物质的42.76％和42.36％，二者之和超过总风味物质的85％。酯类的形成往往能赋予豆豉花香、甜香、水果香、脂香等良好风味，而本发明中的菌株在纯种发酵豆豉中能产生高含量的苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯，赋予了产品浓郁的依兰依兰花香和茉莉花香，为豆豉生产及后续风味产品开发提供新的途径。

Description

一种高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株筛选和应用
技术领域
本发明属于微生物育种领域，涉及一种高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株筛选和应用，该菌株对挖掘传统曲霉型豆豉发酵中核心功能微生物及后续风味产品开发有着重要意义。
背景技术
豆豉是我国的一种传统特色调味食品，因其风味独特、营养丰富而广受人们喜爱。与纳豆、天培等世界著名发酵豆制品齐名，豆豉具有多种功效，如降血压、促消化、抗氧化、降血糖等。豆豉是以精选黑豆为原料，经过微生物群落共同作用发酵而成的食品。豆豉主要分为霉菌型和细菌型两大类，而霉菌型豆豉根据制曲过程中的优势微生物又可划分为曲霉型、毛霉型和根霉型，不同类型豆豉风味特征存在较大差异。其中曲霉型豆豉是我国南方地区销售量最大、食用范围最广的一类豆豉，其生产工艺主要包括制曲和发酵两个阶段。参与豆豉发酵的微生物资源丰富，本课题组对豆豉发酵微生物进行分离纯化培养，并已筛选获得高产脂肪酶、高产蛋白酶、产乳酸及高产酒精的菌株，但尚未获得该豆豉风味相关的高产菌株。
基于以上研究进展，对自然发酵曲霉型豆豉中微生物进行分离纯化鉴定，利用分离获得菌株进行纯种培养，接入经蒸煮的豆豉中模拟后发酵条件进行纯种发酵，再采用固相微萃取装置(solid phase micro-extraction，SPME)对纯种发酵豆豉进行风味物质萃取，结合气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)进行风味物质成分分析，研究纯种发酵豆豉发酵过程中风味物质变化。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株筛选和应用。该菌株是从曲霉型豆豉中分离得到的，该菌株可以应用于豆豉生产及后续风味产品开发。
本发明是从曲霉型豆豉中分离得到一种高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株，分类名称为Trichomonascus ciferrii，命名为WLW，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年11月26日，保藏号为：GDMCC No 61319，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。
本发明所述的Trichomonascus ciferrii WLW菌株固体培养特征为：固体培养为YPD固体培养基，培养温度为：30±1℃，培养24～36h，菌落直径1～2mm，菌落呈奶油色，半球状，大而隆起，表面较光滑，湿润，不易挑起，有大量向下生长的假菌丝，嵌入固体培养基中使菌落和培养基连接紧密,无向上生长的气生菌丝。
本发明所述的Trichomonascus ciferrii WLW菌株在革兰氏染色后的显微形态特征为：长大的子细胞仍不与母体脱落分离，并继续出芽，细胞成串排列，形成较长的藕节状假菌丝。
所述的Trichomonascus ciferrii WLW菌株的基因登陆号为：MW509947，ITS序列为：
CAAAGAACATGCTCAGTACGGCGAGCGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCGTGTCGGCGTCCGAGTTGTAATTTGAAGATGGCAACTTTGGGAATGGCTCTCGCATATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAACCCCGTTCATGGCGAGATGACCCAGTCCTATGTAAAGTGCTTTCTAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAAGTCAGACATGGTATTCAGTGATCAACTGTCTTTCGGGACTGTGCACTCGCTGTTTACTGGGCCAGCATCGGTTTAGGCGGTGAGATAAATGCAAAAGAATGTGGCTCCGCTTTCGGGTGGAGTGTTATAGCTTTTGTTCATATCACCAGCTTGGACCGAGGACCGCGCTTCGGCTAGGATGCTGGCGTAATGACTTTAAGCCACCCGTCTTGAACCACGGACCCAAAA。
根据所述WLW菌株的形态特征和生理生化特征及ITS序列在NCBI数据库中Blast检索比对，应用MEGA 6.0软件采用NJ法绘制系统进化树，鉴定该菌株为Trichomonascusciferrii。
富集培养使用的培养基为：
脑心浸液肉汤培养基(BHI)：葡萄糖2.0g，蛋白胨10.0g，脱水小牛脑浸粉12.5g，脱水牛心浸粉5.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠2.0g，蒸馏水1L。
菌株使用的固体培养基为：
YPD培养基：蛋白胨2％，酵母浸粉1％，葡萄糖1％，固体培养基则加2％琼脂。
本发明还提供一种关于上述高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的Trichomonascus ciferrii菌株在食品生产开发方面的应用。
本发明还提供一种关于上述高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的Trichomonascus ciferrii菌株在菌种发酵剂的制备中的应用。
本发明还提供一种关于上述高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的Trichomonascus ciferrii菌株在纯种发酵豆豉的应用：用移液枪取2ml所述WLW菌株接种到装有100ml YPD液体培养基的锥形瓶中，30℃、170r/min恒温摇床培养36h，再按10％接种量接种到经121℃、20min蒸熟的黑豆中，30℃恒温培养箱培养19d；纯种发酵豆豉样品挥发性成分经SPME萃取，GC-MS鉴定，共检出41种成分，分别包括呋喃4种，吡嗪5种，醛6种，醇2种，酮2种，酸4种，酯4种，酚4种，其他10种。
本发明的优点和积极效果如下：
1.本发明的菌株适应期短，生存能力强，生长速度快。
2.本发明的菌株进行纯种发酵豆豉时，苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的含量分别占总挥发物的42.76％和42.36％，二者之和超过总挥发物的85％。而在传统豆豉生产过程中酯类虽然是后发酵过程中形成最多的一类物质，其占总风味物质也仅25.4％，且苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯在传统生产豆豉中未能检测到。酯类的形成往往能赋予豆豉花香、甜香、水果香、脂香等良好风味，而本发明中的菌株在纯种发酵豆豉中能产生高含量的苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯，赋予了产品浓郁的依兰依兰花香和茉莉花香，为豆豉生产及后续风味产品开发提供新的途径。
附图说明
图1为本发明所述菌株的菌落形态。
图2为本发明所述菌株革兰氏染色后再400倍显微镜下观察到的菌体形态。
图3为本发明所述菌株ITS序列的PCR电泳图谱。
图4为本发明所述的菌株依据ITS序列建立的系统进化树。
图5为本发明所述的菌株生长曲线。
图6为本发明所述的菌株纯种发酵豆豉的风味物质基峰图(Base PeakChromatogram，BPC)。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明。
实施例1：本发明所述菌株筛选：
步骤一、菌株来源：江西某调味食品有限公司发酵池中的曲霉型豆豉，每次取样时，在同一发酵池的上、中、下三层取样后充分混匀，装入同一个无菌塑封袋，保存在4℃冰箱中备用。
步骤二、富集培养：取样品5g加入到装有10mL生理盐水的无菌试管中，涡轮振荡5min，吸取1mL菌液接入装有100mL BHI培养基的250mL锥形瓶中，30℃、170r/min摇床培养24～48h。
步骤三、菌株筛选：采用平板稀释法，分别取上述培养基中的菌液稀释至10-4～10-7，取100μL分别涂布到YPD培养基中，于30℃培养24～48h，挑取不同菌落形态且能产香的菌株至斜面上，于4℃冰箱中保存。
步骤四、分离纯化：将筛选得到菌株在YPD平板上划线分离，在30℃恒温培养箱培养24h，重复划线三次以上，在显微镜下观察到形态单一的菌体则说明菌株已经分离纯化。
实施例2：本发明菌株的显微形态和分子生物学鉴定
取所筛选得到的菌株进行显微形态和分子生物学方法鉴定，具体过程如下。
(1)采用固体平板培养法：固体培养为YPD培养基，培养温度为：30±1℃，培养24～36h，菌落直径1～2mm，菌落呈奶油色，半球状，大而隆起，表面较光滑，湿润，不易挑起，有大量向下生长的假菌丝，嵌入固体培养基中使菌落和培养基连接紧密,无向上生长的气中菌丝，该菌株的菌落图片见说明书附图1。
本发明所述菌株在革兰氏染色后的显微形态特征为：
革兰氏染色后再在400倍显微镜下观察到的菌体形态：长大的子细胞仍不与母体脱落分离，并继续出芽，细胞成串排列，形成较长的藕节状假菌丝，该菌株的显微图片见说明书附图2。
(2)分子生物学鉴定
①用接种环从斜面上挑适量菌体接种到YPD液体培养基中，30℃、170r/min培养24h，取2～3mL发酵液，10000转离心1min收集菌体。
②把离心获得的菌体用OMEGA公司的Yeast基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，具体步骤参照试剂盒内说明书。
③将提到的总DNA进行ITS序列PCR扩增，选用真菌通用引物ITS 1和ITS 4进行扩增。PCR反应体系50μL：Premix rTaq 25μL；ITS1 1μL；ITS4 1μL；模板1μL；ddH2O 22μL。热循环参数95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，72℃延伸5min。反应结束后取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件为100V，50mA，30min，PCR扩增结果见说明书附图3，然后再将产物送至上海生工进行测序。
④扩增获得的序列经测序，菌株WLW的ITS核苷酸序列约为600bp，将测序获得的ITS基因序列(MW509947)提交到NCBI，利用Blast进行同源性比较。利用MEGA 6.0软件进行多序列比对分析，并用Neighbor-Joining法构建系统发育树，构建好系统发育树见说明书附图4。结果显示菌株WLW与Trichomonascus ciferrii(KY109915.1)的同源性达99％以上。综合WLW菌株的形态学特征、生理生化特征及同源性和系统发育分析，将菌株WLW鉴定为Trichomonascus ciferrii。
⑤将该菌株保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年11月26日，保藏号为：GDMCC No 61319，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。
实施例3：生长曲线的测定
用接种环取适量实施例1中所获得菌株接种到装有10ml YPD液体培养基的锥形瓶中，30℃、170r/min恒温摇床培养12h，再按1％接种量接种到装有100ml YPD液体培养基的锥形瓶中，每隔6h取样，在600nm波长进行光电比浊测定该菌株生长曲线。本发明所述的菌株生长曲线见说明书附图5。
由图5可以看出，0～6h为该菌株的适应期，6～36h为该菌株的对数生长期，36～72h为该菌株的稳定期。
实施例4：本发明所述的菌株纯种发酵的豆豉风味物质测定
(1)纯种发酵：用接种环取适量实施例1中所获得菌株接种到装有100ml YPD液体培养基的锥形瓶中，30℃、170r/min恒温摇床培养36h，再按10％接种量接种到经121℃、20min蒸熟的市售黑豆中，30℃恒温培养箱培养19d。培养结束后，成分分析前取适量豆豉粉碎过40目筛。
(2)挥发性成分萃取
取3g过筛样品，加入到置于水浴中的15mL样品瓶中，采用恒温装置加热，60℃平衡20min，将SPME装置置于样品瓶上方，60℃恒温萃取30min，采用GC-MS分析。
(3)气相色谱-质谱条件
色谱条件：Agilent 19091S-433毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，载气He，流速1.0mL/min，分流进样；升温程序：起始40℃，保持5min，5℃/min升至85℃，10℃/min升至250℃，保持5min。
质谱条件：离子源EI，电离电压70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃；全扫描模式，质量扫描范围35～400amu。
(4)挥发性成分鉴定与含量计算
采用NIST08质谱库检索，相似度在80％以上作为有效峰面积进行分析处理，根据保留时间确定纯种发酵豆豉样品挥发性成分，以质谱峰面积考察各组分相对含量。
本发明所述的菌株纯种发酵后风味物质的基峰图(Base Peak Chromatogram，BPC)见说明书附图6。利用本发明的菌株进行纯种发酵豆豉时，豆豉样品挥发性成分经SPME萃取，GC-MS鉴定，共检出41种成分，分别包括呋喃4种，吡嗪5种，醛6种，醇2种，酮2种，酸4种，酯4种，酚4种，其他10种。表1中仅展示相对含量前15的挥发性成分。通过分析发现，豆豉中苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的含量分别占总风味物质的42.76％和42.36％，二者之和超过总风味物质的85％。
表1纯种发酵豆豉样品挥发性成分(top15)
Figure BDA0002995337220000061
序列表
<110> 江西师范大学
<120> 一种高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株筛选和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 592
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
caaagaacat gctcagtacg gcgagcgagc ggcaaagctc aaatttgaaa tctggcgtcg 60
tgtcggcgtc cgagttgtaa tttgaagatg gcaactttgg gaatggctct cgcatatgtt 120
ccttggaaca ggacgtcata gagggtgaga accccgttca tggcgagatg acccagtcct 180
atgtaaagtg ctttctaaga gtcgagttgt ttgggaatgc agctctaagt gggtggtaaa 240
ttccatctaa ggctaaatat tggcgagaga ccgatagcga acaagtacag tgatggaaag 300
atgaaaagaa ctttgaaaag agagtgaaaa agtacgtgaa attgttgaaa gggaagggct 360
tgaagtcaga catggtattc agtgatcaac tgtctttcgg gactgtgcac tcgctgttta 420
ctgggccagc atcggtttag gcggtgagat aaatgcaaaa gaatgtggct ccgctttcgg 480
gtggagtgtt atagcttttg ttcatatcac cagcttggac cgaggaccgc gcttcggcta 540
ggatgctggc gtaatgactt taagccaccc gtcttgaacc acggacccaa aa 592

Claims (6)

1.一种高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株，其特征在于：分类名称为Trichomonascus ciferrii，命名为WLW，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年11月26日，保藏号为：GDMCC No 61319，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；所述WLW菌株固体培养特征为：固体培养为YPD固体培养基，培养温度为：30±1℃，培养24～36h，菌落直径1～2mm，菌落呈奶油色，半球状，大而隆起，表面较光滑，湿润，不易挑起，有大量向下生长的假菌丝，嵌入固体培养基中使菌落和培养基连接紧密，无向上生长的气生菌丝；所述WLW菌株在革兰氏染色后的显微形态特征为：长大的子细胞仍不与母体脱落分离，并继续出芽，细胞成串排列，形成较长的藕节状假菌丝；
所述WLW菌株的基因登陆号为：MW509947，ITS序列为：
CAAAGAACATGCTCAGTACGGCGAGCGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCGTGTCGGCGTCCGAGTTGTAATTTGAAGATGGCAACTTTGGGAATGGCTCTCGCATATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAACCCCGTTCATGGCGAGATGACCCAGTCCTATGTAAAGTGCTTTCTAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAAGTCAGACATGGTATTCAGTGATCAACTGTCTTTCGGGACTGTGCACTCGCTGTTTACTGGGCCAGCATCGGTTTAGGCGGTGAGATAAATGCAAAAGAATGTGGCTCCGCTTTCGGGTGGAGTGTTATAGCTTTTGTTCATATCACCAGCTTGGACCGAGGACCGCGCTTCGGCTAGGATGCTGGCGTAATGACTTTAAGCCACCCGTCTTGAACCACGGACCCAAAA。
2.根据权利要求1所述的高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株，其特征在于，筛选步骤如下：
①菌株来源：取发酵池中的曲霉型豆豉，每次取样时，在同一发酵池的上、中、下三层取样后充分混匀，装入同一个无菌塑封袋，保存在4℃冰箱中备用；
②富集培养：取样品5g加入到装有10mL生理盐水的无菌试管中，涡轮振荡5min，吸取1mL菌液接入装有100mL BHI培养基的250mL锥形瓶中，30℃、170 r/min摇床培养24～48h；
③菌株筛选：采用平板稀释法，分别取上述培养基中的菌液稀释至10-4～10-7，取100μL分别涂布到YPD培养基中，于30℃培养24～48h，挑取不同菌落形态且能产香的菌株至斜面上，于4℃冰箱中保存；
④分离纯化：将筛选得到菌株在YPD平板上划线分离，在30℃恒温培养箱培养24h，重复划线三次以上，在显微镜下观察到形态单一的菌体则说明菌株已经分离纯化。
3.根据权利要求1所述的高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株纯种发酵的豆豉风味物质测定方法，其特征在于：
①挥发性成分萃取
取3g过筛样品，加入到置于水浴中的15mL样品瓶中，采用恒温装置加热，60℃平衡20min，将SPME装置置于样品瓶上方，60℃恒温萃取30min，采用GC-MS分析；
②气相色谱-质谱条件
色谱条件：Agilent 19091S-433 毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，载气He，流速1.0mL/min，分流进样；升温程序：起始40℃，保持5min，5℃/min升至85℃，10℃/min升至250℃，保持5min；
质谱条件：离子源EI，电离电压70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃；全扫描模式，质量扫描范围35～400amu；
③挥发性成分鉴定与含量计算
采用NIST08 质谱库检索，相似度在80%以上作为有效峰面积进行分析处理，根据保留时间确定纯种发酵豆豉样品挥发性成分，以质谱峰面积考察各组分相对含量。
4.根据权利要求1所述的高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株在纯种发酵豆豉的应用，其特征在于：用移液枪取2ml菌株接种到装有100ml YPD液体培养基的锥形瓶中，30℃、170r/min恒温摇床培养36h，再按10%接种量接种到经121℃、20min蒸熟的黑豆中，30℃恒温培养箱培养19d；纯种发酵豆豉样品挥发性成分经SPME萃取，GC-MS鉴定，共检出41种成分，分别包括呋喃4种，吡嗪5种，醛6种，醇2种，酮2种，酸4种，酯4种，酚4种，其他10种。
5.根据权利要求1或2所述的高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株在食品生产开发方面的应用。
6.根据权利要求1或2所述的高产苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸甲酯的菌株在菌种发酵剂的制备中的应用。
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