CN104877936A - 一株从传统豆豉中分离得到产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌菌株 - Google Patents

一株从传统豆豉中分离得到产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌菌株 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一株从传统豆豉中分离得到产纤溶酶(Fibrinolytic enzyme)的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株，属生物工程技术领域。该菌从传统豆豉中分离纯化获得，经分类学鉴定命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），已于2014年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2014638。本发明筛选的产纤溶酶解淀粉芽孢杆菌菌株容易培养，生产安全性高，遗传稳定性好，菌株液体发酵培养酶活达到324.6~410.2 IU/mL，其代谢产物纤溶酶容易分离纯化，该菌株的分离为传统豆豉工业实现科学化的纯种培养奠定了基础。

Description

一株从传统豆豉中分离得到产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌菌株
技术领域
本发明涉及微生物和生物工程技术领域，特别是涉及一种从传统豆豉中分离纯化的解淀粉芽孢杆菌菌株：Jxnuwx-1，该菌株对于本传统豆豉工业实现科学化的纯种培养有着重要的意义。
背景技术
心脑血管栓塞性疾病已经成为危害人类健康的主要原因之一，据统计，全世界范围内血栓疾病患者超过1500万，每年约有300万患者死亡。其病因是纤维蛋白聚集于动脉管壁所导致(详见参考文献1：罗明典.微生物制药研究新进展[J].微生物学通报,1998,01:61-62.)，治疗血管栓塞类疾病目前最为有效的方法是溶栓疗法。现在医学临床上治疗心脑血管栓塞性疾病常用的溶栓药物(如尿激酶、链激酶和纤溶酶原激活剂)存在着半衰期短、易出血、价格昂贵或生产成本高，因此研究开发天然来源的纤溶酶具很大的发展潜力和应用前景。由芽孢杆菌产生的纤溶酶比现在临床使用的溶栓药物类有着很大的优势。我国的研究人员已从豆豉中分离得到了豆豉纤溶酶。有研究表明，豆豉纤溶酶是豆豉在发酵制曲过程中由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生的一种丝氨酸蛋白酶。2002年，彭勇等(详见参考文献2：彭勇,张义正.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DC-4产豆豉溶栓酶发酵条件的优化[J].食品与发酵工业,2002,04:19-23.)从传统豆豉中筛选到了一株能产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DC-4，此纤溶酶产生菌为国内首次报道。本发明也是从传统豆豉中筛选到了一株能产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Jxnuwx-1，Jxnuwx-1菌株产生纤溶酶的分子质量为26kD，比彭勇等从DC-4所产生纤溶酶的分子质量28kD要小，这与菌株的不同有关。
发明内容
本发明的目的是提供一株从传统豆豉中分离纯化产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌菌株，可通过液态发酵生产纤溶酶。
本发明的从传统豆豉中分离纯化产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，从传统豆豉中利用分离纯化技术分离获得，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年12月10日，保藏号为：CCTCC M 2014638。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens Jxnuwx-1)固体培养特征为：
固体培养为琼脂肉汤培养基，37±1℃培养24h，菌落直径3～6mm。呈白色不透明菌落，表面光滑，反正面颜色一致，菌落边缘为隆起规则锯齿状，中间有褶皱，在多种培养基上均不产色素。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌的显微形态特征为：
菌体呈为短杆，芽孢中生，呈椭圆状，菌体多成对或链状。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌的液体培养条件为：
①培养基按照100mL水中含有葡萄糖1.5g、蛋白胨2.5g、淀粉1.5g、黄豆饼粉1.5g、磷酸氢二钠0.3g、磷酸二氢钠0.1g、氯化钙0.02g、硫酸镁0.05g、pH为7.0；培养时间为72h；培养温度为36～37℃；培养转速为200r/min。
②解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)液体发酵72h，对发酵液进行分离、提取可得到粗纤溶酶。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌菌株的基因登录号为KP419724，16S rDNA碱基序列为：
AATTGCGCGTGCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGGAACAAGG。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，经发酵可得纤溶酶，其工艺包括菌种活化、种子培养、发酵培养、发酵产物的分离及相对分子质量的测定这四个步骤。
其中，菌种活化采用平板培养，培养基为肉汤培养基，培养原料为：按照100mL水中含有牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂1.5g、pH为7.2～7.4；培养时间为24h；培养温度为36～37℃。
种子培养基：按照100mL水中含有葡萄糖1g、蛋白胨1g、磷酸氢二钠0.2g、磷酸二氢钠0.1、氯化钙0.02、硫酸镁0.05g、pH为7.0；培养时间为24h；培养温度为36～37℃；培养转速为200r/min。
发酵培养：按照100mL水中含有葡萄糖1.5g、蛋白胨2.5g、淀粉1.5g、黄豆饼粉1.5g、磷酸氢二钠0.3g、磷酸二氢钠0.1g、氯化钙0.02g、硫酸镁0.05g、pH为7.0；培养时间为72h；培养温度为36～37℃；培养转速为200r/min。
发酵产物的相对分子质量的测定：发酵完毕，转速10000r/min下离心10min，获得粗酶提取液，再进行硫酸铵盐析、脱盐、真空冷冻干燥后将所得的纤溶酶进行SDS-PAGE电泳用以测定该纤溶酶的相对分子质量。
本发明从传统豆豉中获得一株生长快、产纤溶酶活力高的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，通过液体发酵能够产生纤溶酶，该菌株容易培养，生产安全性高，遗传稳定性好，筛选所得菌株液体发酵培养酶活达到324.6～410.2IU/mL，其代谢产物纤溶酶容易分离纯化且酶活性较高。该菌株的获得为传统豆豉工业实现科学化的纯种培养奠定了基础。
附图说明：
图1为本发明所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌落形态；
图2为本发明所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)用孔雀绿和番红染色后在油镜观察到的芽孢形态(×1000倍)；
图3为本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)革兰氏染色后在油镜下观察到的菌体形态(×1000倍)；
图4为本发明所述的菌株Jxnuwx-1依据16S rDNA序列建立的遗传进化树示意图；
图5为本发明所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的纤溶酶的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明进行细说明。
实施例1：本发明解淀粉芽孢杆菌株的制备或筛选
步骤一、样品采集：在豆豉制作工厂内采集制曲过程中的豆豉，然后用样品袋封装，低温保藏。
步骤二、富集培养：取样品1g于灭菌试管中，加无菌生理盐水9mL，封口，用漩涡振荡器振荡5min，吸取1mL菌液置于装有30mL肉汤培养基(按照100mL水中含有牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂1.5g、pH为7.2～7.4)的250mL三角瓶中，再放置在36～37℃，200r/min的摇床中培养72h。
步骤三、菌株初筛：采用平板稀释法，取富集培养出来的菌液200μL涂布在灭菌脱脂奶粉筛选培养基(按照100mL水中含有脱脂奶粉1g、磷酸氢二钠0.2g、氯化钠0.5g、琼脂2g、pH为7.2)上，在36～37℃培养48h，挑出能产生透明圈的菌株。
步骤四、菌株复筛：将初筛平板上有产生透明圈的单菌落用接种针点到灭菌脱脂奶粉筛选培养基中，选择透明圈直径(D)与菌落直径(d)比值(D/d比值)较大的几个菌落。
步骤五、菌株分离纯化：将复筛出来的菌株，接种于肉汤培养基上平板划线，在置于37℃的恒温培养箱中培养24h，重复划线三次以上，连续在显微镜下观察到形态单一的菌体为纯菌种。
步骤六、目的菌株的获得：将步骤五得到的菌株分别进行摇瓶发酵，测相应发酵液的纤溶酶的酶活力，选择酶活力最大的菌株作为目的菌株：Jxnuwx-1。
实施例2：本发明解淀粉芽孢杆菌株的显微形态和分子生物学鉴定
取所得到菌株Jxnuwx-1进行显微形态和分子生物学方法鉴定，具体过程如下：
(1)采用固体平板培养法：固体培养为肉汤培养基，37±1℃培养24h，菌落直径3～6mm。呈白色不透明菌落，表面光滑，反正面颜色一致，菌落边缘为隆起规则锯齿状，中间有褶皱，在多种培养基上均不产色素。
解淀粉芽孢杆菌的显微形态特征为：菌体呈为短杆，芽孢中生，呈椭圆状，菌体多成对或链状。解淀粉芽孢杆菌菌落形态见说明书附图1，用番红和孔雀绿染色后在1000倍显微油镜下观察到的芽孢形态和革兰氏染色后在1000倍显微油镜下观察到菌体形态图见说明书附图2和附图3。
(2)分子生物学采用16S rDNA鉴定，取培养1天的发酵液，离心收集菌体，把所得的菌体用试剂盒提取总DNA，利用细菌16S rDNA通用引物通过扩增保守序列，将所得的序列胶回收、纯化、克隆，再送到华大基因测序，所得16S rDNA碱基序列如下：
AATTGCGCGTGCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGGAACAAGG
实施例3：本发明所述的用于产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌菌株16S rDNA序列分析实施过程如下：
依据细菌16S rDNA中最保守的序列设计引物，其中正向引物为F:5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物为R:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR反应体系20μL。热循环参数94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃延伸7min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物是一条大小约1.4kb的特异性条带。扩增获得的序列经测序，菌株Jxnuwx-1的16S rDNA核苷酸序列大小为1451bp，将序列同GenBank数据库中的10个菌株的16S rDNA核苷酸序列进行比较，采用MEGA6软件对菌株的测序结果进行了系统发育分析，采用Nerghbour-joining方法构建系统发育树，并进行Bootstrap分析，重复次数为1000次。构建的系统发育树，结果显示菌株Jxnuwx-1的16S rDNA核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens(登记号为JN999865.1)的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性达到100％。综合Jxnuwx-1菌株的形态学特征、生理生化特征及同源性和系统发育分析，将菌株Jxnuwx-1鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌依据16S rDNA序列建立的遗传进化树示意图见附图4。
将分离纯化的菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2014年12月10日，保藏号为：CCTCC M 2014638。
实施例4：本发明所述的用于产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌菌株的纤溶酶酶活性检测的实施过程如下：
将发酵液在10000r/min离心10min，保留上清液。酶活性用双层纤维蛋白平板法测定：取10μL离心后的发酵液加入双层纤维蛋白平板的小孔(直径3mm)内，于37℃温育18h，测定水解圈垂直直径，得到其乘积。参照绘制尿激酶标准曲线，计算出发酵液的纤溶酶活性。
配制成双层纤维蛋白平板:移取约10mL2％琼脂溶液于平板中,冷却凝固后形成第一层。将25mL3.6mg/mL纤维蛋白原溶液与40mL1％的无菌琼脂糖溶液(0.4g琼脂糖溶解于40mL巴比妥钠一HCl缓冲液)中，于48℃充分混合，迅速加入500μL20IU/mL人凝血酶,混匀后向每个琼脂平板移15mL，形成双层纤维蛋白平板。该配制方法能够确保每个平板的厚度均一，从而减少实验误差。
通过该方法测得发酵液的酶活为324.6～410.2IU/mL。
实施例5：本发明解淀粉芽孢杆菌株发酵所得的纤溶酶进行相对分子质量的测定
(1)取本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，在无菌条件下，用接种环挑取少量菌落，接入已灭菌的肉汤培养基平板，于36～37℃活化培养24h；
(2)取活化培养后的菌种，无菌条件下，转接入已灭菌的种子培养基中，36～37℃下200r/min摇床培养24h；
(3)将种子培养基中的菌液按5％的接种量接种到发酵培养基中，36～37℃下200r/min摇床培养72h。
(4)发酵完毕，转速10000r/min下离心10min，获得粗酶提取液，再进行硫酸铵盐析、脱盐、真空冷冻干燥后将所得的粗纤溶酶进行SDS-PAGE电泳用以测定该纤溶酶的相对分子质量。解淀粉芽孢杆菌产生的纤溶酶的SDS-PAGE电泳图见附图5。

Claims (2)

1.一株从传统豆豉中分离得到产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌菌株，其分类命名解淀粉芽孢杆菌，分类命名Bacillus amyloliquefaciens Jxnuwx-1，已于2014年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2014638；所述解淀粉芽孢杆菌菌株在固体肉汤培养基上形态特征为：呈白色不透明菌落，表面光滑，反正面颜色一致，菌落边缘为隆起规则锯齿状，中间有褶皱，在多种培养基上均不产色素；所述解淀粉芽孢杆菌菌株显微形态特征为：革兰氏染色观察，细胞形态为短杆，芽孢中生，呈椭圆状，菌体多成对或链状；所述解淀粉芽孢杆菌16S rDNA碱基序列（基因登录号KP419724）：
AATTGCGCGTGCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGGAACAAGG。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株生产纤溶酶，其特征在于：
取权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，在无菌条件下，用接种环挑取少量菌落，接入已灭菌的肉汤培养基平板，培养原料为： 按照100mL水中含有牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂1.5g、pH为7.2～7.4，于36~37°C活化培养24h；
取活化培养后的菌种，在无菌条件下，用接种环挑取少量菌落，接入已灭菌的250mL三角瓶30mL装液量的种子培养基，培养基按照100mL水中含有葡萄糖1g、蛋白胨1g、磷酸氢二钠0.2g、磷酸二氢钠0.1、氯化钙0.02、硫酸镁0.05g、pH为7.0，于36~37°C，200r/min下振荡培养24h；
③取种子培养基中的菌种，无菌条件下，按5%的接种量转接入已灭菌的250mL三角瓶30mL装液量的发酵培养基中，培养基按照100mL水中含有葡萄糖1.5g、蛋白胨2.5g、淀粉1.5g、黄豆饼粉1.5g、磷酸氢二钠0.3g、磷酸二氢钠0.1g、氯化钙0.02g、硫酸镁0.05g、pH为7.0，在36~37°C，200r/min下振荡培养72h；
④发酵完毕，转速10000r/min下离心10min，获得粗酶提取液，再进行硫酸铵盐析、脱盐、真空冷冻干燥后将所得的纤溶酶进行SDS-PAGE电泳用以测定该纤溶酶的相对分子质量。
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