CN109097308A - 高产酸性蛋白酶的诱变菌株及其用途 - Google Patents

高产酸性蛋白酶的诱变菌株及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种诱变的鼠李糖乳杆菌及其生物制剂，其中该诱变菌是鼠李糖乳杆菌KJY11(KJY‐HN001‐01‐01)，CGMCCNO.15421，保藏日期为2018年03月07日。本发明还提供该诱变菌所制备的含有酸性蛋白酶的生物制剂。本发明还提供该诱变菌单独或联合其他乳酸菌制备进行复配，以生产富含酸性蛋白酶的豆酸奶、酸奶和苗侗族酸汤、豆腐等。

Description

高产酸性蛋白酶的诱变菌株及其用途
技术领域
本发明属于生物制剂领域，具体是涉及一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus strain)诱变菌，并通过该诱变菌来高产酸性蛋白酶，以及涉及通过该酸性蛋白酶来制备用于凝固作用的生物制剂的用途。
背景技术
酸性蛋白酶，是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5～5，广泛存在于微生物、动物、植物等体内。与动植物蛋白酶相比，微生物蛋白酶的一个显著特点是具有多样性和复杂性，通常一株菌株可以分泌一种或多种酸性蛋白酶(孙俊良，2004)。不同微生物菌种分泌的酸性蛋白酶虽具有一些共同的性质，但在底物特异性、作用条件、抑制剂等方面均存在着一定的差异(魏炜，1997)。微生物蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶。根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。乞今为止，已发现不少高产酸性蛋白酶的微生物，如黑曲霉(Aspergillus niger)、大孢子黑曲霉突变株(A.niger var.microsporus)、根霉(Rhizopussp.)、微小毛霉(M.pusillus)、粘红酵母(Rhdotorula glutinis)、粟疫霉(Endothiaparasitica)、血红色陀螺孔菌(Trametes sanguinca)、芽枝霉(Cladosporium sp.)等。
酸性蛋白酶的作用机理：酸性蛋白酶根据其作用机理可分为两类:一类称为外肽酶(exopeptidase)，能从蛋白质肽链末端(N-端和C-端)逐个将氨基酸水解下来，故外肽酶又分为氨肽酶(aminopeptidase)和羧肽酶(carboxypeptidase)。氨肽酶作用于多肽链游离的N-末端，释放出单个氨基酸、二肽或三肽，还会切去异源表达蛋白质N-末端的Met。羧肽酶作用于多肽链的C-末端，释放出单个氨基酸或二肽。第二类为内肽酶(endopeptidase)，从多肽链的非末端特定部位切断多肽链，产生分子质量相对较小的肽链。在胃酸性环境下，外肽酶与内肽酶共同作用能快速有效地水解饲料蛋白质生成寡肽和氨基酸(孙俊良，2004)。
酸性蛋白酶虽然来源广泛，种类多样，但有着共同的生化特点和结构特点，如底物具有广泛性、能被胃肽酶抑制剂Pepstatin抑制，它们有着共同的结构特征，在催化机制，多肽折叠、氨基酸序列、三维结构方面都很相似。酸性蛋白酶在蛋白的代谢过程中起水解作用，并且不易引起细菌繁殖，从而不易引起所作用反应的腐败，故其在很多领域上都有广泛的用途。例如，
1、在毛皮与皮革的生产中，可软化羊毛和皮革，以及对羊毛染色预处理；
2、在非食用蛋白制造工业中，可用于废胶卷脱胶、回收银粒和片基。也可以在中性PH下，处理解冻鱼类以脱除腥臭，或处理家禽屠宰场废弃的羽毛等；
3、在啤酒酿造中降解麦芽蛋白，并防止出现不溶物的混浊；
4、在白酒黄酒酿造中，降解原料蛋白，增加酵母菌的产酒能力，提高原料中的可利用糖分等；
5、作为饲料添加剂，弥补内源酶的不足，预防和缓解幼畜禽腹泻现象，促进蛋白质的消化吸收，进而促进动物的生长发育及生产性能；
6、其具有有抗血小板凝集及抗血栓的作用，还可作为治疗支气管炎、矽肺炎和助消化的良药，以及已经用于高血压、癌症、艾滋病、阿尔茨海默氏症等病原性疾病的治疗。
研究发现，不同微生物菌种分泌的酸性蛋白酶的活性pH范围和最适作用pH、活性温度范围和最适作用温度都各有不同，同种抑制剂对不同种微生物所产的蛋白酶抑制效果不相同，甚至对同种微生物分泌的不同酸性蛋自酶的抑制都各不相同。如米曲霉所产酸性蛋自酶的活性pH值范围为3.0-6.0，最适作用pH值为30-4.0(胡稳奇，1995)；宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶的活性pH值范围为2.0-3.5，最适作用pH值为2.5(李乃强，2001)。从Hebeloma Crustuliniforme分离的一种酸性蛋白酶的活性温度范围在45-60℃之间，最适作用温度为50℃(魏炜，1997)；菌种DH-C4O所产的酸性蛋白酶的活性温度范围在35-55℃之间，最适作用温度为40℃(张扬等，2004)。
国内利用微生物生产酸性蛋白酶的报道较少，其原因主要是由于菌种产酶活力低，生产成本太高。所以近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉、微小毛霉等及它们的突变株。
早在1964年Koaze等发现大抱子黑曲霉突变株(Asergillus niger varTiegh)能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶A和酸性蛋白酶B，它们的主要区别在于后者的活性中心含有天冬氨酸残基，而前者则没有，此外，在某些动力学性质上也存在着一定的差异。
胡稳奇等(酸性蛋白酶产生菌的筛选及其生产酶条件，《湖南师范大学自然科学学报》，1992)报道了从土壤中分离得到活力强的产酸性蛋白酶的米曲霉菌株，进行了固体发酵的最佳产酶条件实验，其中，在最适条件下固体曲霉活力达到6789.6U/g。
张光伟等(酸性蛋白酶高产菌选育的研究，《江苏食品与发酵》，2005)以宇佐美曲霉2461为出发菌株，经分离纯化获得菌株UV-14-3，其摇瓶活力为7040.1u/mL。通过工艺优化和正交实验，确实了最佳培养基组成为(g/L):豆饼粉75、玉米粉11.3、磷酸氢二钠7.5、氯化钠7.5、氯化铵3、硫酸镁2.4。在起始pH5.0-5.5，摇床转速200r/min，温度30℃+0.2℃，装液量为500mL的三角瓶装50mL培养液(v/v)发酵周期为84h的条件下摇瓶产酶达到7869.2u/mL。
钱玉英等(黑曲霉菌株6042饲用酸性蛋白酶的性质及其应用研究，《浙江农业学报》，1997)用射线诱变处理黑曲霉菌株，获得突变菌株，产酶活力比出发菌株提高近5倍。
章剑林等人以黑曲霉为出发菌株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高温酸性蛋白酶的菌株S3-15，其所产酸性蛋白酶最适pH值为2.5，最适温度50℃，90℃下恒温4H的酶活性比出发菌株高64.2％，稀释100倍酶溶液在60℃下保温30min酶存活率为72.8％。从细菌菌株Bacillus sp.菌株Wp22.A1也提取出了酸性蛋白酶，分子量大约45KDa，PI为3.8对Pepstatin无反应，该酶不能被丝氨酸和半肽氨酸蛋白酶抑制剂抑制，蛋白水解最大活性在，在较稳定。
中国发明专利2014103792534、“一种高活力酸性蛋白酶的制备方法”公开了利用高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉CCTCC NO：M2013601为出发菌株，根据其最适生长温度和最适产酶温度，进行培养基优化和发酵工艺改进，致使菌种的产酶能力最大限度地显现，使得本发明所产酸性蛋白酶活力高。然而，该方法需要添加中草药提取物，并使用混合酶组合物来酶解中草药提取物，因此制备的酸性蛋白酶易于混入外源性酶，影响了实际应用。
中国发明专利2009100179839、2015106776006、2017111564425公开了以黑曲霉(A.niger)为产酶菌种，以粮食加工副产物为主要原料，来制备成本较低的酸性蛋白酶及其制备方法。所得酸性蛋白酶适用于作为制革工业、医药业、饲料工业产品的制备原料或产品添加剂。中国发明专利2014103792623公开了一种以宇佐美曲霉为出发菌株，经过复合诱变后获得高产活性的酸性蛋白酶的诱变菌株，其酶活力比出发菌株提高7倍，且酶活耐受温度平均提高了8-12℃。
然而，由于现有生产酸性蛋白酶的方法，多是通过曲霉属、毛霉素等微生物生产酸性蛋白酶，这类方法所制备的产品中难以避免地存在致癌性黄曲霉毒素的副产物，因此或是酶产品多是用于化工生产，或是需要进一步精细纯化以用于医药生产，并不适宜用于需求量大、原料较为廉价且安全等级高的食品生产中。
此外，虽然上述方法制备的酶产量较高，但不能直接将发酵后的初产物直接用于食品领域中，因此需要经浸泡提取、过滤浓缩、溶析纯化、超滤、精滤的纯化步骤，导致食品领域生产步骤过于繁琐，成本难以降低。
综上，目前需要一种既能符合最低产量要求，又能满足用于食品领域的简便、廉价和食品安全的生产酸性蛋白酶的工艺。
发明内容
目前酸性蛋白酶的生产菌种多为曲霉属(如米曲霉)或黑曲霉属(如宇佐美曲霉)等，虽然其具有产量高、质量稳定等优点，但因其生长速度快、极易引起有机底物的霉腐变质，有时会产生有害的副产物(如黑曲霉属易产生致癌性黄曲霉毒素)，因此所制备的酸性蛋白酶，或是多用于非食用蛋白的用途(如软化皮革、处理废弃动物羽毛皮革等)，或者需要经过严格复杂的分离纯化去除副产物(如医药食品用途)，因而存在生产成本过高和生产过程复杂冗长的缺陷。
因此，本发明第一目的提供一种通过复合诱变技术而获得的高产酸性蛋白酶的鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
在一个实施方案中，该诱变菌株KJY11能在相比于驯化得到的出发菌株，其发酵后生产的酸性蛋白酶活力提高了近80％。在一个具体实施方案中，该诱变菌株KJY11发酵后生产的酸性蛋白酶活力是75-80U/ml。
本发明第二目的是提供诱变上述菌株KJY11的制备方法，步骤包括：
(1)将本公司冻存的鼠李糖乳杆菌株分别在MRS液体培养基中经过二次活化后，再加入含有模拟胃液的MRS液体培养基中进行5次驯化，每次驯化5h，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；
(2)选取生长旺盛的单菌落菌株进行发酵后，加入含有模拟肠液的MRS液体培养基中进行2次驯化，每次驯化3h，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；
(3)将驯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培养平板上，避光培养24h；
(4)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；
(5)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓冲液和终浓度为200μg/mL的亚硝基胍溶液后，于37℃培养箱中分别避光孵育10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，向各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导正突变；
(6)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；
(7)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏；
(8)重复复合诱变：按照以上步骤(3)-(7)，再进行微波连续诱变2代-复筛-亚硝基胍连续诱变2代-复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液；
(9)选择生长形状最良好的多个单菌落进行发酵后，分离发酵液并获得无细菌的上清液，以酪蛋白作为底物，用改进的福林法测试酸性蛋白酶的活性，其中一个突变株发酵生产的酸性蛋白酶的酶活为75-80U/ml；
(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为鼠李糖乳杆菌KJY11，并于2018年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15421。
本发明第三个发明目的是提供所述鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11生产食品用的酸性蛋白酶的方法，包括：
(1)将保藏的鼠李糖乳杆菌诱变菌株于MRS液体培养基中活化培养；
(2)将活化的培养液，以108CFU的浓度加入预先制备好的培养液中(豆浆、豆清液或米浆中)，于37℃下静置培养5-50h，获得终发酵液；
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)SDS-PAGE电泳初步验证结果，然后通过SePhadex过柱进行纯化。
在一个实施方案中，上清液经改进的福林法分析后，确定生产的酸性蛋白酶的活力为68.80U/ml，该酶活已经满足食品生产。
在另一个实施方案中，可以将终发酵液、上清液或者纯化的酶产品作为添加剂，直接加入食品原料中进行生产相关食品。
本发明第四个发明目的是提供所述诱变菌株与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产酸性蛋白酶的方法，步骤包括：
(1)将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液体培养基，其他诱变株选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)、玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae strain)、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides strain)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；
(2)将活化的诱变菌株培养液，加入预先制备的培养液(豆清液或豆浆)中，于37℃下静置培养5-50h，获得终发酵液，其中鼠李糖乳杆菌的加入量为108CFU的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度。
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)SDS-PAGE电泳初步验证结果，然后通过SePhadex过柱进行纯化；
在一个实施方案中，上清液经改进的福林法分析后，确定生产的酸性蛋白酶的总活力为104.34U/ml，该酶活已经满足食品生产。
在另一实施方案中，诱变的鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、玉米乳杆菌、植物乳杆菌和肠膜状明串珠菌，其发酵液生产的酸性蛋白酶的活力分别为68.80、14.11、14.74、5.42、1.27U/ml。
在一个具体实施方案中，所述鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCCNo.15421，保藏日期为2018年03月07日。
在另一具体实施方案中，所述植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日。
在一个具体实施方案中，所述玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCCNo.15423，保藏日期为2018年03月07日。
在另一具体实施方案中，所述干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacillus caseistrain)KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
在其他具体实施方案中，所述肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides strain)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
本发明第五个目的是提供诱变的鼠李糖乳杆菌和/或多种诱变乳酸菌株用于制备食品凝固剂的方法，步骤包括：
(1)将鼠李糖乳杆菌诱变株在MRS液体培养基扩大培养后，获得为活菌密度为108-109CFU/mL的种子培养液；
(2)将种子培养液按3％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵12-24h，获得液体凝固剂。
在一个实施方案中，步骤还包括：(3)将所述液体凝固剂进行冷冻干燥处理，获得粉状的固体凝固剂。
在另一个实施方案中，所述食品是酸豆奶、酸奶豆腐或酸豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15。在一个具体实施方案中，鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为(1-10):1:1:1:1。在优选的实施方案中，当所述接种比例为(5-10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于制备富含酸性蛋白酶的保健食品。在上述的任一方案中，其中除鼠梨糖乳杆菌之外，可任选一种或多种其他诱变乳酸菌进行复配，且接种比例保持不变。
本发明第六个目的是提供上述方法所制备的食品凝固剂。
本发明第七个目的是提供上述食品凝固剂用于凝固液体食品的方法，步骤包括：
(1)将豆浆或牛奶于65-72℃下进行加热，然后冷却至36-40℃；
(2)加入1-5％(v/v)液体凝固剂或0.01-0.05％(m/m)的固体凝固剂，以80-100r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物或胶凝状物，从而制备酸豆奶、酸奶豆腐或酸豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤。
在一个实施方案中，还包括步骤(3)根据所制备的凝固食品类型，选择凝固深化的持续时间，如豆腐的持续时间为20-30min，酸汤的持续时间为72小时。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15。在一个具体实施方案中，鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为(1-10):1:1:1:1。在优选的实施方案中，当所述接种比例为(5-10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于制备富含酸性蛋白酶的保健食品。
原理和定义
乳酸菌就分类学而言属于非正式名称。目前从自然界中已经发现该细菌在分类学上至少可划分23个属，涉及的种属则更多。代表性的种属有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、气球菌属、肉杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、酒球菌属等(JE Christensen,1999)。
作为益生菌的一种，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus strain)，从属于乳杆菌属，质粒，不能利用乳糖，可代谢单糖，是人体正常菌群之一。鼠李糖乳杆菌形态呈双杆状，短小的杆菌；不运动，无芽孢，革兰氏染色阳性；兼性厌氧菌，生长温度范围2～53℃，最适温度一般是30～40℃；耐酸，最适pH通常为5.5～6.2；一般在pH5或更低的情况下可生长。
鼠李糖乳杆菌对于人体健康具有显著功能，可归纳为以下八方面：
①平衡肠道菌群，改善胃肠道功能。益生菌只有黏附于宿主的肠上皮细胞，进而定植、繁殖，才能发挥其维护微生态系群落结构及功能平衡，保护生物屏障作用。鼠李糖乳杆菌LGG可以耐胆酸和暂时有效的黏附于肠道中。
②增强肠道粘膜屏障。Oberbelman等对营养不良的儿童腹泻进行了15个月的研究，发现鼠李糖乳杆菌对于腺病毒引起的腹泻具有明显预防效果。鼠李糖乳杆菌对18～29个月的孩子腹泻的预防是十分有效的，而且，它主要对非母乳喂养的孩子腹泻的预防更为有效。
③预防和治疗腹泻。1998年，Kaila Minna等在治疗轮状病毒引起的5～28月大的婴幼儿腹泻时，给29名患婴分别口服含鼠李糖乳杆菌的制剂和普通牛乳，结果在服用鼠李糖乳杆菌婴儿的粪便中检出鼠李糖乳杆菌菌株，说明即便是在宿主患急性胃肠炎期间，鼠李糖乳杆菌仍能够促进肠道菌群的平衡。
④提高机体免疫力。Miettinen等在实验中发现，通过鼠李糖乳杆菌等乳酸菌与血液中细胞因子的反应，能够抑制食物中革兰阴性致病菌引起的免疫功能失调，并能诱导产生较多的TNF-α、IL-6和IL-10。Jeremy等报道了鼠李糖乳杆菌能够调节TNF-α等细胞因子的分泌。其进行的鼠肠道微生物菌群体外实验结果显示，鼠李糖乳杆菌能够防止巨噬细胞分泌过量的TNF-α，起到预防和治疗结肠炎的作用。但未发现对IL-10有明显影响。
⑤结合并排除毒素。Carolyn等通过酶联免疫吸附实验证实鼠李糖乳杆菌能够吸附黄曲霉毒素B1。进一步的实验表明，在与人体内环境相似的条件下(4～37℃,PH2～10)，利用高压和超声波降解法都不能使黄曲霉毒素B1从LGG菌体表面脱离。
⑥减少受感染的几率。2002年，Vanderhoof等人研究了经过器官移植的病人在器官移植后口服LGG产品以预防和治疗一些肠道疾病，整个研究过程没有发现鼠李糖乳杆菌有任何不利影响，也没有菌血症发生。
⑦减少食物过敏产生，加速过敏后的恢复过程。
⑧预防龋齿。龋齿是儿童的常见病和多发病，而95％的蛀牙是由一种名为突变链球菌(streptococcus Mutans)的细菌引起的。实验表明，对于1～6岁的儿童，服用含益生菌鼠李糖乳杆菌的乳制品7个月后，其牙垢和唾液中的突变链球菌总数显著降低，说明鼠李糖乳杆菌具有预防龋齿的功效。
综上，目前国内尚未报道通过益生菌尤其是鼠李糖乳杆菌来生产酸性蛋白酶的报道。
微生物诱变指通过人为措施诱导微生物的基因产生变异或突变，从而筛选符合需要性状的微生物。对于微生物进行诱变的方法主要包括物理诱变(辐射或照射法)、化学诱变(化学诱变剂)、生物诱变(基因工程突变)。
物理诱变以紫外照射为主，即将微生物悬浮液在搅拌的情况下，置于紫外灯下短时间照射，并迅速置于低温中水浴。通过低温抑制微生物的自身修复，以增加突变几率。而后，多次照射后，与野生菌落对照同时进行培养，观察不同照射时间和照射强度的平板的菌落数，计算诱变后的菌株致死率。
除了放射性辐射诱变外，物理诱变还包括微波辐射法，即通过微波辐射进行诱变该方法能引起细胞壁分子间的强烈震动，通过摩擦改变其通透性，使细胞内含物迅速向胞外渗透。利用微波辐照改变细胞壁通透性，让微波作用于微生物DNA、RNA从而引起变异，以达到研究目的。相比于放射性辐射诱变，虽然诱变时间较长、处理样本量小，但其具有安全可靠、易于精细化控制和成本低廉、操作便利的优点，因此成为微生物诱变的研究热点。
常用的化学诱变剂包括亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等。均是直接将诱变剂以不同浓度梯度加入微生物悬浮液中，进行不同时间的培养。培养结束后，用生理盐水或其他终止剂终止诱变反应，并迅速置于低温中水浴。多次诱变后，与野生菌落对照同时进行培养，观察不同时间和诱变浓度的平板的菌落数，计算诱变后的菌株致死率。
技术效果
1、由于鼠李糖乳杆菌属于人体益生菌之一，分离自健康人的胃肠道，不会传递或产生疾病，并能够耐受人体消化道环境，不会分泌有害人体的产物，因此本发明创造性设想将鼠李糖乳杆菌作为生产酸性蛋白酶的生产菌，通过耐酸性驯化以初筛高产酸性蛋白酶的菌株，而后通过诱变获得高产酸性蛋白酶的诱变菌株，在保障一定程度提高酸性蛋白酶产量的同时，还能发挥乳杆菌自身有益于人体的代谢产物的协同作用，从而可将发酵初产物直接用于食品等领域，从而避免了除去副产物和纯化产物工艺过于复杂的缺陷。
2、本发明针对工业生产中常见的廉价发酵原料(如豆浆、豆清液等)，在上述高产酸性蛋白酶的诱变菌株的基础，通过实验摸索优化发酵工艺条件，从而获得适宜的发酵方法，
3、本发明可以将终发酵液、上清液或者纯化的酶产品作为添加剂，直接加入食品原料中进行生产相关食品。
4、本发明首次发现，鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、玉米乳杆菌、植物乳杆菌和肠膜状明串珠菌均属于乳酸菌类别的菌株，在理化特性和耐受机制存在相似之处。由此，摸索出以上5种菌株都类似的复合诱变方法，并首次尝试将5种诱变菌株混合发酵以生产酸性蛋白酶，取得良好的技术效果，并能发挥5种益生菌对人体有益的协同效应。
5、本发明的诱变菌种，还能用于作为(复合)凝固剂来生产酸奶、酸豆浆、豆花、酸奶豆腐等。该食用级凝固剂能够避免传统凝固剂中的氯化镁、氯化钙、硫酸钙的食品残留，提高口感，并能发挥(复合)凝固剂中益生菌的有益作用，以及酸性蛋白酶的预防和治疗疾病的作用，符合绿色天然、安全健康的食品发展趋势。
附图说明
图1：微波辐照诱变时间与致死率变化曲线图；
图2：微波辐照诱变时间与突变率变化关系图；
图3：亚硝基胍诱变时间与致死率变化曲线图；
图4：酸性条件下，鼠李糖乳杆菌诱变株在豆清液中发酵的生长曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属技术领域的技术人员而言，从对本发明的详细说明中，本发明的特征和优点将显而易见。
实施例1、实验材料
出发菌株：
1、鼠李糖乳杆菌为本公司冻藏菌株LR20160820。
2、植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCC No.15422，保藏日期为2018年03月07日。
3、玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018年03月07日。
4、干酪乳杆菌诱变菌株KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
5、肠膜状明串珠菌诱变菌株KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
实施例2、菌种的模拟胃液的驯化
鉴于鼠李糖乳杆菌直接分离自人体酸性环境的胃肠道，同时所生产的酸性蛋白酶包含能耐强酸环境的胃蛋白酶和肠道酸性蛋白酶，因此在诱变前对出发菌株进行模拟消化道的酸性条件驯化，有利于活化或提高出发菌株高产酸性蛋白酶的活性。
将本公司冻存的鼠李糖乳杆菌株分别在MRS液体培养基中经过二次活化后，再加入含有模拟胃液的MRS液体培养基中放置5h，每隔1h取样检测活菌数。然后用浓度梯度法在MRS固体培养基上进行涂布。37℃下厌氧培养20-30h，在进行平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化。共驯化5次，最后得到的单个菌落纯化3代。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，吐温-80 1g/L，柠檬酸三钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH值为6.6～6.8；121℃，15min灭菌备用，
MRS固体培养基：即MRS液体培养基中加入2％琼脂粉；
模拟胃液为34.8mEq的HCL溶液，其中模拟胃液：发酵液＝8-9：1(V/V)。
结果发现，第一次驯化中，菌体存活率不足10％。随着驯化次数的增加，菌株对胃液耐受能力逐渐增强，经过5次驯化，菌体存活率逐步提高至48.93％，已经符合驯化要求。
实施例3、菌种的模拟肠液的驯化
按照实施例2的方法选取生长旺盛的单菌落菌株进行发酵后，加入含有模拟肠液的MRS液体培养基中进行2次驯化，每次驯化3h，每隔1h取样检测活菌数，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代。
模拟肠液：用0.5L水溶解6.8g KH2PO40，调解pH至6.8，然后加入10g胰蛋白酶，定容至1L，其中模拟肠液：发酵液＝8-9：1(V/V)；
结果发现，第一次驯化中，菌体存活率为58.61％，表明该菌种对肠液耐受能力较好，可减少驯化次数，第二次驯化后菌体存活率逐步提高至78.23％，已经符合驯化要求。
实施例4、微波诱变植物乳杆菌
收集驯化的菌种，并稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，避光4℃冷藏12h后，涂布MRS固体培养基平板上，37℃培养24h，进行菌落计数，计算致死率。
采用500功率照射乳杆菌的菌悬液，致死率与照射时间的关系如图1所示。
致死率(％)＝(未诱变处理的总菌数－诱变处理后的存活菌数)/未诱变处理的总菌数×100
可以看出，随着微波时间的增加，致死率逐渐增大，当微波处理50s时，致死率为88.7％，而当微波辐照处理60s时，致死率接近100％。
统计出发菌株(圆形，边缘整齐，表面光滑，中心突起，乳白色，质地均匀，平均直径3mm)和诱变菌株的菌落平均直径和形状不规则性，确定比出发菌株的菌落直径增加且出现不规则圆形但颜色不变的诱变菌株为正突变株，从而确定菌落直径比例变大且形状出现不规则的诱变株为正向突变株。由此计算对于不同微波诱变时间下植物乳杆菌的正突变的研究。
由图2可知，当微波辐照50s时，正突变率较大，有利于诱变的菌株的筛选。
因此，根据诱变机制，强烈的诱变剂和较高的剂量处理诱变菌株，菌株突变可能性大，因此选用50s为下一步试验诱变辐射时间。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行微波辐照处理50s，然后取辐照菌液1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于37℃培养1天。选取生长迅速、边缘圆滑、相对较厚处生长的乳白色单菌落置于MRS液体培养基进行培养。
实施例5、亚硝基胍诱变
亚硝基胍(NTG)：取0.1g亚硝基胍加入10mL丙酮作为助溶剂，完全溶解后取1mL亚硝基胍丙酮溶液加入9mL磷酸钠缓冲液(pH7.4，0.02mol/L)配制成NTG浓度为1mg/mL的亚硝基胍母液。
收集培养的驯化菌种，并稀释成108/ml的菌悬液。然后取8mL菌悬液，加入亚硝基胍母液2mL，NTG终浓度为200μg/mL，同时设置未诱变原液作为对照。
将上述菌液置三角瓶中，摇床振荡37℃培养分别避光孵育10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，分别加入生理盐水终止反应；诱变处理后的菌液冰浴2～3h以诱导正突变后，于4000r/min室温离心15min。取菌体沉淀，用pH 6.0磷酸缓冲液离心洗涤2次后，用冷生理盐水十倍梯度稀释菌体沉淀至7倍梯度，分别取0.1mL涂布于含2％(质量分数)碳酸钙的MRS固体培养基上，37℃恒温避光静置培养48h。观察各梯度培养皿菌落数，计算NTG诱变的致死率。
结果图3所示：当菌悬液用NTG 100μg/mL的NTG诱变处理不同时间，随诱变处理时间的延长，致死率不断增加，在处理35min时，致死率达到83.7％。
按照实施例4的方法，统计出发菌株和诱变菌株的菌落平均直径和明显溶钙圈的平均直径，确定比出发菌株的菌落直径和明显溶钙圈有增加但颜色不变的诱变菌株为正突变株。
综合致死率和正突变率的实验结果，选择200μg/mL和诱导35min作为亚硝基胍的最佳诱导参数。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行200μg/mL亚硝基胍的诱导35min，然后取辐照菌液1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于30℃培养2-3天。
选取生长迅速、边缘圆滑、相对较厚处生长的乳白色单菌落置于MRS液体培养基进行培养。然后取对数生长期的菌液，离心收集后，再置于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选，挑选生长迅速、明显溶钙圈有增加但颜色不变的单菌落，以完成复筛。以此方法，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏。
按照以上方法，再进行微波连续诱变2代-复筛-亚硝基胍连续诱变2代-复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，虽然微波诱变率较高，但二次诱变对菌株致死率大，因此微波重复诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液。
实施例6、改进的福林法检测酸性蛋白酶的酶活
1、试剂配制：
①福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内，加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g,蒸馏水700ml,85％磷酸50ml,浓盐酸100ml,文火沸腾回流l0h。取下回流冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mI,混匀，加入几滴液体溴(99％)，再煮沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000ml，用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，制得的试剂应呈金黄色。置于棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液放置过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。
福林试剂使用溶液:一份福林试剂与二份水混合，摇匀即得。
②0.4mol/L碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2C03)42.4g，定容至1 000mI；
0.4mol/L三氯乙酸溶液:称取三氯乙酸(CCLl3COOH)65.4g，定容至1000ml。
③不同pH值的缓冲液的配制:
I 0.05mol/L pH3.0乳酸-乳酸钠缓冲液:
A液:80％～90％乳酸10.6g,蒸馏水定容至1000ml
B液:50％～60％乳酸钠20g,蒸馏水定容至1000ml
A液8ml和B液1ml，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.05mol/L pH3.0乳酸-乳酸钠缓冲液。
II 0.1mol/L pH5.6乙酸-乙酸钠缓冲液:
A液:乙酸(CH3CHOOH)12g,蒸馏水定容至I 000ml。
B液:乙酸钠(CH3CHOONa.3H2O)27.2g,蒸馏水定容至1 000ml
A液4.8ml和B液45.2ml，再用蒸馏水稀释I倍，即成0.1mol/1乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
III 0.Imol/L pH6.0、0.lmol/L pH6.4、0.1mol/I pH7.2磷酸盐缓冲液:
A液:磷醉二氢钠(NaH2PO4.2H2O)156g,蒸馏水定容至1000mI。
B液:磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)358g,蒸馏水定容至1000ml。
a、0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液:取A液12.0ml，B液88.0ml即成。
b、0.1mol/L pH6.4磷酸盐缓冲液:取A液25.5ml，B液74.5ml即成。
C、0.1mol/1pH7.2磷酸盐缓冲液:取A液68.4ml，B液31.6ml即成。
④100ug/ml L-酪氨酸标准溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6ml 1mol/L的盐酸使之溶解，用0.2mol/L的盐酸定容至100ml，其浓度为1000ug/ml再吸取次溶液10ml，以0.2mol/L盐酸定容至100ml，即配成100ug/ml的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用，或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。
⑤2％酪蛋白溶液:
a、用于中性蛋白酶作用的2％酪蛋白溶液:
准确称取干酪素2.000g,称准至0.002g,加入10ml 0.1mol/LNaOH溶液湿润,再加入适量的适宜pH的缓冲液约80ml,在水浴中加热使其溶解(必要时用小火加热煮沸),冷却后用相应的缓冲液定容至100ml即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
b、用于酸性蛋白酶作用的2％酪蛋白溶液:
准确称取干酪素2.000g，称准至0.002g，加入2～3滴浓乳酸湿润后，加入适量的适宜pH的缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用相应的缓冲液定容至100ml即成。保存方法同上。
C、不同浓度酪氨酸溶液的配制
表1 配制不同浓度的酪氨酸溶液
Tab1.Preparation different concentration of tvrosine aqueous solution
2、标准曲线的绘制
①配制浓度为0ug/mL,20ug/mL,40ug/mL,60ug/mL,80ug/mL,100ug/mL的酩氨酸溶液。
②测定步骤:将1mL不同浓度酪氨酸溶液分别装入6支10x100mm试管中，各加入0.4mol/L碳酸钠5.00mL，福林试剂使用液1.00mL，摇匀，置于水浴锅中，40℃保温显色20min。用分光光度计于680nm进行测定，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定吸光度。结果见表1。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线，此线应通过零点。要做平行实验，一般测三次，取平均值。
③以酪氨酸的浓度为横坐标，净OD值为纵坐标，绘制成标准曲线。并计算出OD为1时的每毫升酪氨酸溶液中含有的酪氨酸量(ug)，即为吸光常数K值。
3、样品测定步骤:
样品的测定要进行3次平行实验。取10x100mm试管3支，编号1,2,3每管内加入样品酶液1ml,置于40℃水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白溶液1ml,精确保温20min,时间到后，立即再各加入0.4mol/ml的三氯乙酸溶液2.00ml，以终比反应，继续置于水浴中保温l0min，先将酪素溶液放入40℃的恒温水浴中，预热2min；取2支试管分别装入1ml酶液，40℃恒温水浴2min:然后室温12000Xg离心5min，取上清，并放入标有相同编号的另外3支试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml，福林试剂使用液1.00mI,摇匀，40℃保温显色20min后，将其装入l0mm比色皿中，于680nm波长测其吸光度(OD值)。
空白试验也取试管3支，编号(1)、(2)、(3)，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加入0.4mol/L三氯乙酸溶液2.00mL，使酶失活，再加入酪蛋白。
净OD值＝样品的平均吸光度(OD)-空白的平均吸光度(OD)
4、酶活力的计算方法
在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。
X＝AxKx4/20xn＝1/5xAxKxn
式中:X--样品的酶活力，u/ml；
A--样品平行实验的平均吸光度；
K--吸光常数；
4--反应试剂的总体积，ml；
20--反应时间20min，以lmin计；
n--稀释倍数。
5、前后共进行3组实验，从中选择生长形状最良好的10个菌落，将上述保藏的多个菌株分别单一接种于MRS液体培养基中，37℃下活化培养48h。
6、分离发酵液并获得无细菌的上清液，以酪蛋白作为底物，用改进的福林法测试酸性蛋白酶的活性。10株诱变菌株的发酵上清液中酸性蛋白酶的酶活如下：另设未诱变菌株为对照
诱变株 U/ml 诱变株 U/ml
IR-NTG-1-02 45.42 IR-NTG-1-16 60.21
IR-NTG-2-04 61.56 IR-NTG-2-19 59.88
IR-NTG-2-26 55.56 IR-NTG-2-33 66.82
IR-NTG-3-07 62.65 IR-NTG-3-14 79.58
IR-NTG-3-22 69.56 IR-NTG-3-33 41.54
未诱变对照 43.53
如上表2可知，诱变株IR-NTG-3-14，其发酵生产酸性蛋白酶的能力明显高于其他诱变株，其相比于未诱变的出发菌株，酶活量提高了79.58％。
实施例7、诱变株的生理生化特性测试和分子鉴定
(一)生理生化特性测试
挑取单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代，并通过表观判断与镜检确定其菌落形态和菌体形态，并进行4℃菌种斜面保存。
生理生化特性测试结果如下表3：
(二)分子鉴定
提取菌株细胞总DNA，以通用引物扩增菌株的16S rRNA的部分基因片段，插入测序载体后进行测序，并于NCBI数据库进行比对。
比对结果如下表4：
另外，基于16S rRNA基因序列构建的菌株系统发育树如下表5：
根据上述测定结果，表明其与上述多个鼠李糖乳杆菌的部分序列均保持一致，且与生理生化特征结果相一致，故将该诱变菌株定名为(Lactobacillus rhamnosus strain)KJY11，简写为KJY11。2018年03月07日，将该KJY12进行保藏，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
(三)菌种在豆清液中的生长
在酸性条件(pH2.5-5.0)下，将诱变菌种在豆清液中进行发酵培养，每2h检测OD值，以确定菌种活菌数。
如图4所示，随着时间的增长，诱变菌种的活菌数逐渐增加，在14h达到峰值，随后进入平稳的生长期。这表明，诱变的鼠李糖乳杆菌能够很好的酸性环境，表现出驯化的适酸能力和高产酸性蛋白酶的能力。
实施例8、诱变株生产食品用的酸性蛋白酶
将活化的培养液，以108CFU的浓度加入预先制备好的豆酸奶培养液中，于37℃下静置培养5-50h，获得终发酵液；
离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
SDS-PAGE电泳初步验证结果：将含有酶液的上清液进行SDS-PAGE胶分离(浓缩胶5，分离胶8％)，考马斯亮蓝染色30min，用脱色液过夜脱色至背景清晰，割下含有目的蛋白条带和标准蛋白的胶条，依据蛋白Marker各条带表示的分子量，粗略估计菌株所产酸性蛋白酶分子量大小。
将预期酸性蛋白酶上清液，经过硫酸铵沉淀和透析后，浓缩液加到预先用0.02M/pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液中平滑的Sephadex G-75层析柱，分离单独的洗脱峰。
收集洗脱峰的酶液并进行浓缩，按照实施例6的方法检测上清液中酶活为68.80U/ml。由于豆酸奶培养基的发酵效率低于MRS培养基，因此其上清液酶活相应下降，但该酶活值已经满足食品生产，或者可以进一步冻干浓缩，获得更高酶活的干粉制剂(U/g)。
实施例9、多种诱变菌株工业化协同生产酸性蛋白酶
复配菌株：
鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日。
玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018年03月07日。
干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides strain)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
将活化的诱变菌株培养液，分别加入预先制备的豆酸奶培养液中，于37℃下静置培养5-50h，获得终发酵液，其中鼠李糖乳杆菌的加入量为108CFU的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度。
根据实施例8的方法，测试各个菌株的单独生产酸性蛋白酶能力，结果如下表6所示。
菌株编号 HC(D/d) 活性(U/ml)
鼠李糖乳杆菌 3.42 68.80
干酪乳杆菌 1.41 14.11
玉米乳杆菌 1.28 14.74
植物乳杆菌 0.83 5.42
肠膜状明串珠菌 0.41 1.27
总酶活 7.35 104.34
按照以上方法，将复配混合菌株，分别接种到豆清发酵液、酸汤(苗侗族)中，所测得发酵液酸性蛋白酶的总酶活为87.56U/ml、94.23U/ml。配混合发酵的酸性蛋白酶产量并未呈现产量叠加的结果，可能原因是5种乳酸菌的产物之间存在竞争性，另外因酸汤的营养成分强于豆清液培养液而产量优于后者产量。
实施例10、诱变菌种生产用于食品的凝固剂
分别取鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15，接种于20mL MRS液体培养基中，37℃活化培养24h。
然后，按接种量3％(v/v)接种至500ml的MRS液体培养基中，37℃扩大培养至获得为活菌密度为108-109CFU/mL的种子培养液；
将种子培养液按1％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵12-24，而后加入无菌的醋酸，将pH调至2.5-5.0、优选3.50-4.0，即获得液体凝固剂。
考虑到种子培养液中活菌密度为108-109CFU/mL为菌种最佳生长时期，在相同培养条件下，各种诱变菌种的生长的活菌密度并不完全一致，因此调整鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为10:1:1:1:1，或1:1:1:1:1，以确保分别获得用于生产主要富含酸性蛋白酶的凝固食品的凝固剂，和生产主要富含多种益生菌的食品的凝固剂。在上述的任一方案中，其中除鼠梨糖乳杆菌之外，可任选一种或多种其他诱变乳酸菌进行复配，且接种比例保持不变。
将获得的液体凝固剂中，通过离心分离菌体，然后用适量的无菌生理盐水重悬浮后，重新分离纯化菌体后，在重悬液中加入终浓度为7.5％(m/v)的葡萄糖或麦芽糊精作为保护剂，先放入4℃平衡30min，然后放置-40℃中进行预冷冻20h。冷冻完成后放入真空冷冻干燥机中，设置温度-50℃，抽真空(20～40Pa)，干燥24h，制得粉状固体凝固剂。使用时，重新复水溶解即可。
实施例11、诱变菌种用于凝固液体食品的生产方法
1、制作豆花或酸豆浆
将优质黄豆清洗后，充分泡涨。通过使用浆渣分离器磨浆，并加热，获得熟豆浆。
熟豆浆冷却至36-40℃，然后匀速流加加入3％(v/v)液体凝固剂，以80r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物。然后降低搅拌速度，直至出现大面积的絮状物或碎花状物。低温保存，即得豆花。或持续发酵1-4小时，以制备酸豆浆。
2、制作(酸)豆腐
在方法1的基础上，继续搅拌豆浆25min以便凝固深化，直至块状增大至不变且水固分离时，保温养浆20min，再大火加热至微沸1min，用重物压制蹲脑20-30min。
然后将蹲脑后豆腐倒入铺好豆腐布的型框中，包严网布、覆平、自沥后重物压力下加压3h，确保豆腐良好的外形和质构，压制成形后即为酸奶味豆腐成品。
3、制作酸奶
将新鲜牛奶于70度左右加热杀菌后，冷却至40度，并加入5％蔗糖。
匀速流加加入0.02％(m/m)的固体凝固剂，以90r/min的速度搅拌，直至产生凝胶状物。然后降低搅拌速度，直至出现大量凝胶。低温保存，即得酸奶。
4、制作苗侗族酸汤
在方法1的基础上，将含有絮状物或碎花状物的豆浆液，于38℃下深化发酵72小时，即可得到酸汤原液。
预先制备西红柿浆、辣椒粉、食盐、白酒的混合溶液，加入适量1-5％(v/v)酸汤原液，厌氧发酵5-10天。即可制得食用的苗侗族酸汤。
相对于普通豆花、酸奶、酸豆腐等，本发明的凝固剂制备出的食品，具有保水性好、质地细腻(如酸奶豆腐)、口味清淡略带酸甜(如酸豆浆、酸奶)，香味浓厚(如酸汤)，营养丰富。
另外，由于含有多种益生菌，能够提高胃肠道的免疫力。所富含的酸性蛋白酶，能促进消化道对蛋白质的消化吸收，具有一定的预防和治疗病原性疾病的功能。
应当理解，本发明虽然已通过以上实施例进行了清楚说明，然而在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的变化和修正，但这些相应的变化和修正都应属于本发明的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种通过复合诱变技术而获得的高产酸性蛋白酶的鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
2.用于诱变上述菌株KJY11的制备方法，步骤包括：
(1)将冻存的鼠李糖乳杆菌株分别在MRS液体培养基中经过二次活化后，再加入含有模拟胃液的MRS液体培养基中进行5次驯化，每次驯化5h，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；
(2)选取生长旺盛的单菌落菌株进行发酵后，加入含有模拟肠液的MRS液体培养基中进行2次驯化，每次驯化3h，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；
(3)将驯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培养平板上，避光培养24h；
(4)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；
(5)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓冲液和终浓度为200μg/mL的亚硝基胍溶液后，于37℃培养箱中分别避光孵育10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，向各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导正突变；
(6)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；
(7)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏；
(8)重复复合诱变：按照以上步骤(3)‐(7)，再进行微波连续诱变2代‐复筛‐亚硝基胍连续诱变2代‐复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液；
(9)选择生长形状最良好的多个单菌落进行发酵后，分离发酵液并获得无细菌的上清液，以酪蛋白作为底物，用改进的福林法测试酸性蛋白酶的活性，其中一个突变株发酵生产的酸性蛋白酶的酶活为75‐80U/ml；
(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为鼠李糖乳杆菌KJY11，并于2018年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15421。
3.通过权利要求1所述鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，或通过权利要求2的方法所制备的鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，来生产食品用的酸性蛋白酶的方法，包括：
(1)将保藏的鼠李糖乳杆菌诱变菌株于MRS液体培养基中活化培养；
(2)将活化的培养液，以108CFU的浓度加入预先制备好的培养液中(豆浆、豆清液或米浆)，于37℃下静置培养5‐50h，获得终发酵液；
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)SDS‐PAGE电泳初步验证结果，然后通过SePhadex过柱进行纯化。
4.权利要求3所述的方法，其中将终发酵液、上清液或者纯化的酶产品作为添加剂，直接加入食品原料中进行生产相关食品。
5.通过权利要求1所述鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，或通过权利要求2的方法所制备的鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产酸性蛋白酶的方法，步骤包括：
(1)将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液体培养基，其他诱变株选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)KJY14、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae strain)KJY13、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroidesstrain)KJY15和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KJY12；
(2)将活化的诱变菌株培养液，加入预先制备的培养液(豆清液或豆浆)中，于37℃下静置培养5‐50h，获得终发酵液，其中鼠李糖乳杆菌的加入量为108CFU的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度。
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)SDS‐PAGE电泳初步验证结果，然后通过SePhadex过柱进行纯化。
6.通过权利要求1所述鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，或通过权利要求2的方法所制备的鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，和/或多种其他诱变乳酸菌株用于制备食品凝固剂的方法，步骤包括：
(1)将诱变株在MRS液体培养基扩大培养后，获得为活菌密度为108‐109CFU/mL的种子培养液；
(2)将种子培养液按3％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵12‐24h，获得液体凝固剂；其中，
其他诱变乳酸菌株选自植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15，并且鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为(1‐10):1:1:1:1，以及
所述食品是豆腐、豆花、酸奶或酸汤或酸豆奶。
7.权利要求6的方法，其中步骤还包括：(3)将所述液体凝固剂进行冷冻干燥处理，获得粉状的固体凝固剂。
8.权利要求6或7的方法，其中鼠李糖乳杆菌KJY11与其他诱变乳酸菌的接种比例为(5‐10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于制备富含酸性蛋白酶的保健食品。
9.通过权利要求8的方法所制备的食品凝固剂。
10.通过如权利要求9的食品凝固剂用于凝固液体食品的方法，步骤包括：
(1)将豆浆或牛奶于65‐72℃下进行加热，然后冷却至36‐40℃；
(2)加入1‐5％(v/v)液体凝固剂或0.01‐0.05％(m/m)的固体凝固剂，以80‐100r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物或胶凝状物，从而制备豆花、酸奶或酸豆奶、豆腐；
(3)根据所制备的凝固食品类型，选择凝固深化的持续时间，如豆腐的持续时间为20‐30min，酸汤的持续时间为72小时。
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